MÉLANGE DE SUBSTRATS

DOMAINE DE L'INVENTION

La présente invention concerne la culture d’ARU pour la production de biomasse en vue de la production de produits d’intérêts, comme la biomasse séchée ou des composés ou mélanges de composés d’intérêt extraits de la biomasse produite, en particulier des pigments ou colorants alimentaires. L’invention concerne plus particulièrement la production industrielle de cette biomasse, qui doit répondre à un équilibre économique de rentabilité, avec d’un côté une augmentation de la productivité (quantité de biomasse et de composés d’intérêt dans la biomasse) et de l’autre un coût de production économiquement acceptable.

ETAT DE LA TECHNIQUE

Les phycocyanines sont des pigments produits par des microorganismes unicellulaires qui peuvent être employés pour la coloration des aliments. Aujourd’hui, elles sont essentiellement produites par la culture de cyanobactéries, en bassins et en autotrophie, à faible rendement en biomasse produite. Pour augmenter la production de ces phycocyanines, on a cherché des espèces productrices de phycocyanines et capables d’être cultivées dans des conditions de fermentation en bioréacteur afin d’augmenter la quantité de biomasse produite.

Les algues rouges unicellulaires (ARU) appartenant à la classe des cyanidiophyceae comme Galdieria sulphuraria sont connues pour produire des phycocyanines (Carfagna & al., 2018 ; ) capables de se développer en conditions autotrophe, mixotrophe et hétérotrophe. L’ajout d’une ou plusieurs sources carbonées dans le milieu de culture permet d’augmenter significativement la vitesse de croissance. Ces micro-algues sont capables de consommer un nombre important de métabolites carbonés, au total plus d’une 30 ^aine ont été dénombrés (glucose, glycérol, pentose...) (Gross et al., 1995 ; Oesterhelt et al., 1999 - 2007 ; Sloth & al, 2006). Cependant, malgré une croissance plus rapide, le contenu cellulaire en phycocyanines est bien moindre en conditions hétérotrophes et mixotrophes qu’en autotrophie. L’ajout d’une source carbonée dans le milieu de culture - en présence ou non de lumière - réprime fortement la production de phycocyanines (Stadnichuk et al., 1998).

Pour compenser cette baisse de production intrinsèque de phycocyanine, des méthodes de culture ont été développées pour augmenter la densité cellulaire dans les fermenteurs et la quantité de matière sèche produite. En augmentant la matière sèche, on augmente également la quantité de phycocyanine produite (WO 2017/050917, WO 2017/093345). On peut également, selon les ARU employées, produire des phycocyanines aux propriétés nouvelles, comme celle d’avoir une meilleure stabilité à pH acide (WO 2017/050918, FR 3 064 365 & WO 2018/178334).

Une amélioration de ces procédés de production permettrait de combiner à la fois les avantages d’une production industrielle par fermentation sur substrat carboné, tout en diminuant la répression de la production des phycocyanines associée à la source de carbone.

EXPOSE DE L'INVENTION

La présente invention concerne un nouveau procédé de culture d’algues rouges unicellulaires (ARU) pour la production d’une biomasse riche en phycocyanines, comprenant les étapes (i) de cultures en mode mixotrophe ou hétérotrophe desdites ARU sur un milieu de culture comprenant une source de carbone comprenant du glucose, et (ii) de récupération de la biomasse, caractérisé en ce que l’on ajoute au milieu de culture une quantité de glycérol suffisante pour augmenter la production de phycocyanine par rapport à la culture sans glycérol.

L’invention concerne aussi un procédé de préparation de phycocyanines qui comprend la production d’une biomasse selon l’invention et une étape (iii) d’extraction des phycocyanines à partir de la biomasse préalablement récupérée.

DESCRIPTION DES FIGURES

La Figure 1 représente les courbes de suivi de croissance et de production de phycocyanines dans les conditions de culture de l’exemple 1.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION

La présente invention concerne un nouveau procédé de culture d’algues rouges unicellulaires (ARU) pour la production d’une biomasse riche en phycocyanines, comprenant les étapes (i) de cultures en mode mixotrophe ou hétérotrophe desdites ARU sur un milieu de culture comprenant une source de carbone comprenant du glucose, et (ii) de récupération de la biomasse, caractérisé en ce que l’on ajoute au milieu de culture une quantité de glycérol suffisante pour augmenter la production de phycocyanine par rapport à la culture sans glycérol.

Les ARU employées pour produire de la biomasse par fermentation et les méthodes de fermentation, en particulier pour la production de phycocyanines sont bien connues de l’homme du métier. On citera en particulier les demandes de brevet WO 2017/050917, WO 2017/093345, WO 2017/050918 et FR 1752674 déposée le 30 mars 2017.

Les ARU sont en particulier choisies parmi la sous-division des Cyanidiophytina, en particulier de la classe des Cyanidiophyceae, plus particulièrement de l'ordre des Cyanidiales, encore plus particulièrement choisies parmi les familles des Cyanidiaceae ou des Galdieriaceae. De préférence, les ARU sont choisies parmi les genres Cyanidioschyzon, Cyanidium ou Galdieria. Plus préférentiellement, les ARU employées dans le procédé selon l’invention sont choisies parmi les espèces Cyanidioschyzon merolae 10D, Cyanidioschyzon merolae DBV201 , Cyanidium caldarium, Cyanidium daedalum, Cyanidium maximum, Cyanidium partitum, Cyanidium rumpens, Galdieria daedala, Galdieria maxima, Galdieria partita ou encore Galdieria sulphuraria.

Les milieux de culture employés dans le procédé selon l’invention sont bien connus de l’homme du métier, en particulier décrits dans les demandes de brevet WO 2017/050917, WO 2017/093345, WO 2017/050918 et FR 1752674 déposée le 30 mars 2017.

Ces milieux de culture comprennent une source de carbone comprenant du glucose. Il peut s’agir de glucose ou encore de glucose sous une forme complexe comme le lactose, le fructose ou des polyosides comprenant du glucose.

Cette source de carbone peut provenir de l’industrie sucrière, de betterave ou de canne, des hydrolysats d’amidons de plantes amidonnées comme le maïs, le blé, la pomme de terre, ou encore de l’industrie laitière comme le perméat de lait (WO 2017/093345), riche en lactose, employés seuls ou en mélange.

De manière avantageuse, la source de carbone comprenant du glucose est choisie parmi le glucose et le lactose.

Le milieu de culture comprend généralement la source de carbone comprenant du glucose en une quantité comprise entre 0,05 g/L et 200 g/L, avantageusement entre 1 g/L et 150g/L, très avantageusement entre 10 g/L et 80 g/L.

Le milieu de culture peut comprendre d’autres éléments bien connus de l’homme du métier dans le domaine de la culture des microalgues par fermentation, en particulier une source de phosphore et/ou une source d’azote, et/ou une source de soufre.

Selon l'invention, les sources de phosphore peuvent être choisies parmi les espèces suivantes : l’acide phosphorique, les sels de phosphore, avantageusement de l’hydrogénophosphore de sodium (Na2HPC>4), ou du dihydrogénophosphore de sodium (NahhPCU), ou du dihydrogénophosphore de potassium (KH2PO4), ou de l’hydrogénophosphore de potassium (K ₂ HPO ₄ ), ou tout mélange, en toute proportion d'au moins deux de ces sources.

Le milieu peut aussi comprendre des macroéléments et des microéléments qui favorisent la culture de ARU.

Les conditions d’éclairage pour la culture en mode mixotrophe des ARU sont également connues de l’homme du métier, notamment décrites dans les demandes de brevet WO 2017/050917, WO 2017/050918, WO 2017/093345 et FR 1752674 déposée le 30 mars 2017.

L’éclairage peut être continu ou discontinu, notamment discontinu sous la forme de flashs. Selon un mode particulier, l’éclairage est réalisé avec une lumière bleue (WO 2017/050917), plus particulièrement sous la forme d'un rayonnement présentant un spectre étroit de longueur d’onde comprise entre 400 et 550 nm, avantageusement un spectre étroit de longueur d’onde comprise entre 420 nm et 500 nm, avantageusement entre 430 et 480 nm, très préférentiellement centré sur 455 nm.

L’invention est caractérisée par le fait que l’on ajoute du glycérol au milieu de culture en quantité suffisante pour augmenter la production de phycocyanines par rapport à la culture sans glycérol.

Cet ajout peut être fait dans le milieu de culture en début de culture, ou encore en milieux de culture, une fois que la biomasse ait atteint une densité déterminée, par exemple supérieure à 20 g/L de matière sèche dans le milieu de culture.

L’étape (i) de culture peut donc se scinder en deux sous-étapes, (ia) de croissance pour produire de la biomasse avec une source de carbone comprenant essentiellement du glucose sous une forme simple ou complexe telle que définie précédemment et (ib) d’accumulation avec l’ajout de glycérol pour favoriser la production de phycocyanine.

Les sources de glycérol industrielles pouvant être intégrées dans les procédés de production n’ont pas de restriction sur la pureté ou le raffinage (généralement compris entre 80% et 100%). De préférence elles sont de grade alimentaire. Les fournisseurs en source de glycérol sont connus, en particulier des acteurs de l’industrie du biodiesel tel que le groupe Avril avec Oléon (Glycérine 4808/ 4808K, Glycérine 4827 / 4827K ...), ou la société Cargill qui propose également un large éventail de produit à base de glycérine raffinée entre 86.5% et 99.7% possédant des certifications casher, halal, RSPO, E442 ou sans OGM, notamment.

La source de carbone comprenant du glucose est la principale source de carbone dans le milieu de culture et la quantité de glycérol suffisante pour augmenter la production de phycocyanine par rapport à la culture sans glycérol sera aisément déterminée par l’homme du métier par une simple expérimentation en fermenteurs permettant de comparer la quantité de phycocyanine produite avec ou sans glycérol comme montré dans les exemples.

L’augmentation de production de phycocyanine recherchée sera préférentiellement d’au moins 0,15 mg/g/h, plus préférentiellement d’au moins 0,30 mg/g/h, encore plus préférentiellement d’au moins 1 mg/g/h ; ou bien d’au moins 3,6 mg/g, plus préférentiellement d’au moins 7,2 mg/g, encore plus préférentiellement d’au moins 24 mg/gX.

En général, la quantité de glycérol ajoutée au milieu de culture est suffisante pour avoir un rapport pondéral glycérol /source de carbone comprenant le glucose (identifié par la suite par Gly/Glu) d’au moins 1/15. Préférentiellement le rapport Gly/Glu est d’au moins 1/14, plus préférentiellement d’au moins 1/10, encore plus préférentiellement d’au moins L’intérêt étant d’assurer une rentabilité optimum entre le coût des matières premières et la production de phycocyanine, il sera avantageux de ne pas dépasser un rapport Gly/Glu de 1/1.

Selon un mode préféré de réalisation de l’invention, le glycérol est ajouté dans le milieu de culture pour un rapport pondéral Gly/Glu de 1/10 à 1/1 , préférentiellement de 1/7 à 1/2, plus préférentiellement d’environ 1/5 à environ 1/3.

Le procédé selon l'invention peut en outre comprendre une étape de récupération de la biomasse. Ladite récupération de la biomasse peut être réalisée par toute technique permettant la récupération de la biomasse, notamment les méthodes de filtration, gravimétrique ou sous pression réduite, de décantation, ou bien encore des méthodes de précipitation suivie d’une filtration gravimétrique.

L'invention concerne également la biomasse susceptible d'être obtenue par quelconque des variantes du procédé selon l'invention.

On entend avantageusement par "biomasse" selon l’invention un ensemble de cellules de microorganismes produit par la culture de celles-ci, cellules qui peuvent avoir conservé ou non leur intégrité physique. On comprend donc que ladite biomasse peut comprendre une quantité de cellules de microorganismes dégradées allant de 0% à 100%. Par "dégradée" on entend que l’intégrité physique desdites cellules de microorganismes a pu être altérée comme par exemple des microorganismes lysés, résultant par exemple d’un procédé d’homogénéisation ou lyse enzymatique. Une fois produite, cette biomasse pourra être brute, juste séparée de son milieu de culture, séchée ou non, dégradée ou non.

La biomasse, selon qu’elle soit séchée ou non, totalement ou en partie, peut comprendre un taux d’humidité de 1 % à 90%.

Selon un premier mode de réalisation, la biomasse a un taux d’humidité de 70% à 90 %, préférentiellement 80% à 85 %. C’est en particulier le cas lorsqu’elle est essentiellement constituée de microorganismes industriels, optimisés et cultivés, après filtration du moût de fermentation pour séparer les microorganismes cultivés du milieu de culture, avant séchage.

Selon un autre mode de réalisation de l’invention, la biomasse est séchée, totalement ou en partie et présente un taux d’humidité de 1 % à 10%, préférentiellement de 2% à 7%. Selon l'invention ladite biomasse peut présenter une densité en ARUs comprise entre 20 et 200 g/l de matière sèche, préférentiellement entre 90 et 150 g/l de matière sèche.

Selon l'invention ladite biomasse peut présenter une quantité de protéines comprise entre 25% et 60%, voire jusqu’à 70 %, de préférence entre 30% et 55%, plus préférentiellement entre 40% et 50% du poids de matière sèche. Le dosage de l'azote et le calcul de la teneur en protéines brutes sont réalisés selon la méthode de digestion en bloc et distillation à la vapeur (NF EN ISO 5983-2).

Selon l'invention ladite biomasse peut présenter une teneur intracellulaire en phycobiliprotéines (phycocyanine et allophycocyanine) comprises entre 1 et 250 mg/g de matière sèche, préférentiellement entre 20 et 150 mg/g de matière sèche.

Selon l'invention encore ladite biomasse peut présenter une teneur intracellulaire en phycocyanine comprise entre 0,5 et 100 mg/g de matière sèche, préférentiellement entre 10 et 40 mg/g de matière sèche.

La biomasse pourra être conditionnée pour son stockage ou pour son utilisation en tant que telle, par exemple comme complément alimentaire ou aliment pour l’alimentation humaine ou animale.

Le tourteau susceptible d'être obtenu après extraction de la phycocyanine à partir de la biomasse d'ARUs susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'invention peut être utilisé comme complément alimentaire riche en protéines et caroténoïdes, dans l’alimentation humaine ou animale.

Selon l'invention ladite biomasse peut présenter une teneur intracellulaire en caroténoïdes comprise entre 0,1 et 10 mg/g de matière sèche, avantageusement entre 0,250 et 1 mg/g de matière sèche.

Les ARUs présentent un potentiel d'utilisation important dans beaucoup de domaines dont on citera par exemple, l'alimentation humaine ou animale, la cosmétique, la médecine.

Selon l'invention, ladite biomasse d'ARUs susceptible d'être obtenue selon l'invention peut être utilisée après récolte soit directement, éventuellement séchée, soit après transformation. En particulier ladite biomasse peut être utilisée sous la forme de farines entrant dans des compositions alimentaires ou sous forme de compléments alimentaires.

La biomasse d'ARUs susceptible d'être obtenue selon l'invention peut être transformée en farine selon tout procédé connu de l'homme du métier. On peut ainsi envisager par exemple que les ARUs puissent être séparées du milieu de culture, lysées et réduites en particules fines (diamètre moyen de 10 microns), puis séchées.

L'invention concerne également toute utilisation de la biomasse d'ARUs susceptible d'être obtenue selon l'invention dans tout domaine connu d'utilisation des ARUs, particulièrement, l'alimentation humaine ou animale, la cosmétique, la médecine. Dans les domaines de l'alimentation humaine ou animale et de la cosmétique, il s'agit bien évidement d'utilisations non thérapeutiques qui s'adressent à des animaux ou des êtres humains sains.

La biomasse obtenue après culture de ARUs selon le procédé de l'invention peut permettre d'obtenir en particulier une farine riche en agents antioxydants, en particulier en caroténoïdes (particulièrement zéaxanthine et b-carotènes) en teneurs comprises entre 0,1 et 10 mg/g de matière sèche, avantageusement entre 0,25 et 1 mg/g de matière sèche dont en particulier de la zéaxanthine en une teneur comprise entre 0,05 et 5 mg/g de matière sèche, avantageusement entre 0,1 et 1 mg/g de matière sèche, et/ou du b- carotène en une teneur 0,05 et 5 mg/g de matière sèche, avantageusement entre 0,1 et 1 mg/g de matière sèche, répondant à un besoin en particulièrement dans l’industrie alimentaire, parce que plus appétentes, ayant meilleur goût, apportant des antioxydants en quantité importante et pouvant être utilisable dans l’alimentation animale ou humaine.

L'invention concerne donc une farine susceptible d'être obtenue après transformation de la biomasse en ARUs susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'invention.

Quelle que soit la forme d'utilisation du produit susceptible d’être obtenu par le procédé selon l’invention (biomasse native ou transformée), ledit produit peut être utilisé pur ou mélangé à d’autres ingrédients classiquement utilisés, particulièrement dans des utilisations non thérapeutiques en alimentation ou en cosmétique.

L'invention concerne également tout produit pouvant comprendre au moins de la biomasse d'algues susceptible d'être obtenue selon l'invention. L'invention concerne aussi tout produit pouvant comprendre au moins de la farine issue de la transformation de la biomasse d'algues susceptible d'être obtenue selon l'invention.

Selon l'invention les phycocyanines produites par ladite biomasse peuvent être extraites pour être utilisées par exemple dans l'alimentation ou encore comme colorant. L'extraction des phycobiliprotéines, et particulièrement de la phycocyanine, à partir de ladite biomasse peut se faire selon toute technique d'extraction connue de l'homme du métier comme par exemple celle décrite par Moon & al. (2014) ou par Jaouen & al. (1999) ou dans les demandes FR 2 789 399, WO 2017/093345 et FR 1752674 déposée le 30 mars 2017.

L'invention concerne également l'utilisation de la phycocyanine susceptible d'être obtenue selon le procédé de l'invention, dans l'alimentation, animale ou humaine, comme complément alimentaire, ou encore comme colorant, particulièrement comme colorant alimentaire.

Elle concerne aussi un aliment comprenant la phycocyanine obtenue par le procédé selon l’invention, en particulier une boisson, plus particulièrement une boisson gazeuse.

EXEMPLES

Exemple 1 : Comparatif de croissance de la souche de G. sulphuraria sur glycérol, glucose et un mélange glucose-glycérol.

La croissance de la souche est réalisée par mesure de l’absorbance à 800nm au cours du temps. Le milieu de culture est celui connu pour cette souche (milieu Gross), la seule différence entre les trois milieux testés est le ou les substrat(s) carboné(s) utilisé(s).

M&M : Souche : Galdieria sulphuraria (aussi appelée Cyanidium caldarium) UTEX#2919

Milieu de culture : 30g/L de glucose ou 30g/L de glycérol (glycérine 4808 Univar) ou 25g/L de glucose + 5g/L de glycérol ; 8g/L de (NH4)2S04 ; 0,25g/L de KH2P04 ; 716mg/L de MgS04 ; 44mg/L CaCI2 ; 3ml/L de solution stock de Fe-EDTA (FeS04 à 6,9g/L et Na2-EDTA à 9,3g/L) et 4ml de solution stock de trace métal (3,09g/L de Na2- EDTA ; 0,08g/L CuS04,5H20 ; 2,86g/L H3B03 ; 0,04g/L NaV03,4H20 ; 1 ,82g/L MnCI2 ; 0,04g/L CoCI2,6H20 ; 0,22g/L ZnS04,7H20 ; 0,017g/L Na2Se03 ; 0,03g/L (NH4)6Mo7024, 4H20).

Conditions de culture : Les cultures sont réalisées sur une table d’agitation (140t/min) en enceinte thermostatée à 37°C, en milieu comme décrit ci-dessus en présence d’une source de lumière.

Suivi des cultures : Le suivi de croissance montre que l’on atteint des DO similaires quelque soit la ou les source(s) de carbone utilisée(s), les masses sèches et les dosages en phycocyanine associés au bout de 312h de culture sont décrits dans le tableau.

L’apport de glycérol dans le milieu active la production de phycocyanine malgré la présence du glucose connu comme inhibiteur de la phycocyanine.

Exemple 2 : Comparatif de croissance de la souche de G. sulphuraria sur perméat de lait et un mélange perméat de lait-glycérol.

La croissance de la souche est réalisée par mesure de l’absorbance à 800nm au cours du temps. Le milieu de culture est celui connu pour cette souche (milieu Gross), la seule différence entre les deux milieux testés est le ou les substrat(s) carboné(s) utilisé(s).

M&M : Souche : Galdieria sulphuraria (aussi appelée Cyanidium caldarium) UTEX#2919

Milieu de culture : 30g/L de perméat de lait ou 25g/L de perméat de lait + 5g/L de glycérol (glycérine 4808 Univar) ; 8g/L de (NH4)2S04 ; 0,25g/L de KH2P04 ; 716mg/L de MgS04 ; 44mg/L CaCI2 ; 3ml/L de solution stock de Fe-EDTA (FeS04 à 6,9g/L et Na2- EDTA à 9,3g/L) et 4ml de solution stock de trace métal (3,09g/L de Na2-EDTA ; 0,08g/L CuS04,5H20 ; 2,86g/L H3B03 ; 0,04g/L NaV03,4H20 ; 1 ,82g/L MnCI2 ; 0,04g/L CoCI2,6H20 ; 0,22g/L ZnS04,7H20 ; O,017g/L Na2Se03 ; 0,03g/L (NH4)6Mo7024, 4H20).

Conditions de culture : Les cultures sont réalisées sur une table d’agitation (140t/min) en enceinte thermostatée à 37°C, en milieu comme décrit ci-dessus en présence ou non d’une source de lumière.

Suivi des cultures : Les masses sèches et les dosages en phycocyanine associés au bout de 168h de culture sont décrits dans le tableau 2(A) en présence de lumière et dans le tableau 2(B) à l’obscurité.

L’apport de glycérol dans le milieu active la production de phycocyanine malgré la présence du perméat de lait inhibiteur de la phycocyanine et cette augmentation de la production se remarque même à l’obscurité.

Exemple 3 : Suivi d’un procédé de culture en bioréacteur de la souche de G.sulphuraria sur un mélange glucose-glycérol.

Le suivi de croissance de la souche est réalisé par mesure de la masse sèche au cours du temps et la consommation en substrat est identifiée par dosage HPLC. Un dosage de la phycocyanine intracellulaire est également réalisé au cours du temps. Le milieu de culture est celui connu pour cette souche (milieu Gross) avec pour substrat 1/6 de glycérol et 5/6 de glucose pour le pied de cuve et une alimentation composée de ¼ de glycérol et ¾ de glucose pour le fed-batch.

M&M : Souche : Galdieria sulphuraria (aussi appelée Cyanidium caldarium) UTEX#2919

Milieu de culture :

Pied de cuve : 25g/L glucose + 5g/L de glycérol (glycérine 4808 Univar) ; 8g/L de

(NH4)2S04 ; 0,25g/L de KH2P04 ; 716mg/L de MgS04 ; 44mg/L CaCI2 ; 3ml/L de solution stock de Fe-EDTA (FeS04 à 6,9g/L et Na2-EDTA à 9,3g/L) et 4ml de solution stock de trace métal (3,09g/L de Na2-EDTA ; 0,08g/L CuS04,5H20 ; 2,86g/L H3B03 ; 0,04g/L NaV03,4H20 ; 1 ,82g/L MnCI2 ; 0,04g/L CoCI2,6H20 ; 0,22g/L ZnS04,7H20 ; 0,017g/L Na2Se03 ; 0,03g/L (NH4)6Mo7024, 4H20).

Milieu Fed-Batch : 375g/L glucose + 125g/L de glycérol (glycérine 4808 Univar) ; 20g/L de (NH4)2S04 ; 4,17g/L de KH2P04 ; 5,96 g/L de MgS04 ; 0,37 g/L CaCI2 ; 25ml/L de solution stock de Fe-EDTA (FeS04 à 6,9g/L et Na2-EDTA à 9,3g/L) et 33ml de solution stock de trace métal (3,09g/L de Na2-EDTA ; 0,08g/L CuS04,5H20 ; 2,86g/L H3B03 ; 0,04g/L NaV03,4H20 ; 1 ,82g/L MnCI2 ; 0,04g/L CoCI2,6H20 ; 0,22g/L ZnS04,7H20 ; 0,017g/L Na2Se03 ; 0,03g/L (NH4)6Mo7024, 4H20).

Conditions de culture : Les cultures sont réalisées en bioréacteur de 2L à une température régulée à 37°C, pH 3, en présence d’une source de lumière.

Le suivi de croissance montre que l’on atteint une masse sèche de 70g/l au bout de 427h de culture et une teneur en phycocyanine intracellulaire de 45mg/gX (Fig. 1 ). La totalité du substrat carboné apportée est consommée.

Exemple 4 : Suivi d’un procédé de culture en bioréacteur de la souche de G.sulphuraria sur un mélange perméat de lait-glycérol.

Le suivi de croissance de la souche est réalisé par mesure de la masse sèche au cours du temps et la consommation en substrat est identifié par dosage HPLC. Un dosage de la phycocyanine intracellulaire est également réalisé au cours du temps. Le milieu de culture est celui connu pour cette souche (milieu Gross) avec pour substrat 1/6 de glycérol et 5/6 de lactose (apporté par le perméat de lait) pour le pied de cuve et une alimentation composée de ¼ de glycérol et ¾ de lactose pour le fed-batch.

M&M : Souche : Galdieria sulphuraria (aussi appelée Cyanidium caldarium) UTEX#2919

Milieu de culture :

Pied de cuve : 25g/L perméat de lait + 5g/L de glycérol (glycérine 4808 Univar) ; 8g/L de (NH4)2S04 ; 716mg/L de MgS04 ; 3ml/L de solution stock de Fe-EDTA (FeS04 à 6,9g/L et Na2-EDTA à 9,3g/L) et 4ml de solution stock de trace métal (3,09g/L de Na2- EDTA ; 0,08g/L CuS04,5H20 ; 2,86g/L H3B03 ; 0,04g/L NaV03,4H20 ; 1 ,82g/L MnCI2 ; 0,04g/L CoCI2,6H20 ; 0,22g/L ZnS04,7H20 ; 0,017g/L Na2Se03 ; 0,03g/L

(NH4)6Mo7024, 4H20).

Milieu Fed-Batch : 85g/L de perméat de lait ; 28,3g/L de glycérol

Conditions de culture : Les cultures sont réalisées en bioréacteur de 2L à une température régulée à 37°C, pH 3, en présence d’une source de lumière.

Le suivi de croissance montre que l’on atteint une masse sèche de 25g/l au bout de 450h de culture et une teneur en phycocyanine intracellulaire de 14mg/g.

Exemple 5 : Variation de la production de PC en fonction de la proportion Gly/GIc dans le milieu de culture.

Une gamme croisée de glucose et de glycérol a été réalisée pour permettre d'évaluer l’effet du glycérol sur la levée d’inhibition de la synthèse de phycocyanine liée à la présence de glucose dans le milieu de culture. La quantité totale de carbone organique dans chaque Erlenmeyer est de 30 g/l. Le glucose est symbolisé par la contraction « glc » et le glycérol par « gly ». La concentration de chaque élément dans le milieu est indiquée dans le tableau 3.

Production de PC selon les substrats (mg/gX/h)

Exemple 6 : Variation de la production de PC en fonction de la proportion Gly/GIc dans le milieu de culture (Concentration en glycérol inférieure à 5g/l).

Cet exemple vient compléter l’exemple 5, les conditions de culture y sont similaires la seule différence est au niveau des concentrations en glycérol testées qui sont inférieure ou égale à 5g/l afin de quantifier la concentration en glycérol limite permettant de lever l'inhibition de la synthèse de phycocyanine par le glucose dans le milieu de culture.

Productivité (mg/g/h)

Exemple 7 : Variation de la production de PC en fonction de la proportion Glycérol apporté dans un milieu contenant en début de culture 30g/l de perméat de lait.

Différentes quantités de glycérol sont apportées à un milieu composé de perméat de lait afin d’observer l’effet de celui-ci sur la synthèse de phycocyanine et la levée de l’inhibition du lactose (glucose + saccharose) sur la production de ce pigment. Le milieu de base contient 30g/l de perméat de lait. Le glycérol ajouté est symbolisé par la contraction « gly ». 6 concentrations en glycérol sont testées (0, 1 , 2, 3, 4 et 5g/l).

Productivité (mg/L/h)

Similairement, a ce qui a été décrit Stadnichuk et al., (1998), le glucose a bien un effet limitant sur la quantité de phycocyanine produite par la souche de Galdieria sulphuraria, avec une concentration de moins de 15 mg de phycocyanine par g de matière sèche en fin de croissance (15 mg PC/g de MS). A l’opposé, la souche ayant poussée en présence de glycérol uniquement, accumule environ 40 mg PC/g de MS, pour le même temps de culture (240h). En prolongeant, la culture ayant poussé en glycérol peut avoir accumulé jusqu'à 70 mg de PC/g de MS, alors que celle ayant poussé en glucose aura une quantité de PC/g de MS qui restera plus ou moins constante dans le temps. Dans tous les autres cas (mélange glucose-glycérol) la biomasse produite ainsi que la quantité de PC présente dans la biomasse reste constante et même supérieure à celle du glycérol pour le même temps de culture. Ces valeurs sont comprises entre 50 et 60 mg de PC/g de MS, plus de trois fois supérieur à ce qui est trouvé dans la biomasse de cellules ayant poussé sur glucose uniquement.

En conclusion, l’addition de petites quantités de glycérol dans le milieu permet de lever l’inhibition de la synthèse de PC liée à la présence de glucose dans le milieu, qu’il soit présent sous forme de sucre simple (glucose), ou complexe (lactose, saccharose, ou autre ...).

Ce procédé permet de faire croître les cellules en utilisant le glucose (ou une source de carbone contenant du glucose) comme source de carbone principal, et d’utiliser le glycérol uniquement comme inducteur de synthèse de PC et non pas comme substrat principal. Le glucose ou les sources de carbones contenant du glucose sont en général moins chers que le glycérol, et permettent en général d’obtenir des taux de croissance plus élevés que sur glycérol, donc une économie sur les coûts de fermentation.

REFERENCES

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- Gross & al., Plant cell Physiol. 36 (1995) 633-638 ;

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- Moon & al., Korean J. Chem. Eng. 31 (2014) 490-495 ;

- Oesterhelt & al., Plant J. 51 (2007) 500-51 1

- Sloth & al., Enzyme and Microbial Technology 38 (2006) 168-175

- Stadnichuk & al., Plant Science 136 (1998) 1 1-23

- FR 2 789 399

- FR 3 064 635

- WO 2017/050917,

- WO 2017/050918,

- WO 2017/093345

- WO 2018/178334