La présente invention concerne une méthode de détection d'une activité catalytique d'un échantillon.

Pour développer de nouveaux procédés de biocatalyse utiles notamment à l'industrie chimique et pharmaceutique et à l'ingénierie des protéines, il est nécessaire de disposer de méthodes de détection d'activités catalytiques fiables, rapides et peu onéreuses.

Il existe dans l'art antérieur deux types de substrats permettant la détection d'une activité catalytique.

On connaît d'une part les substrats du type modifiés par un groupement détectable capables de libérer un signal après leur transformation par une activité catalytique particulière et d'autre part les techniques utilisant les substrats du type naturels comme indiqué ci- après.

Parmi les substrats modifiés, il est possible d'utiliser des substrats de type ester d'alcool aromatique qui libèrent après leur transformation un alcool aromatique coloré ou fluorescent (D. C. Demirjian et al. Top. Curr.

Chem. 1999,200, 1). Ces types de substrat ont un désavantage majeur, car la molécule chromogène ou fluorogène est un groupe fortement activé, ce qui rend ces substrats instables. Les réactions de détection qui en découlent peuvent en conséquence tre non-spécifiques.

Une deuxième classe de substrats modifiés conduit à la révélation d'un produit obtenu après réaction secondaire enzymatique et/ou spontanée (N. Jourdain et al.

Tetrahedron Lett. 1998,39, 9415 ; K. L. Matta et al., Carbohydr. Res. 1981,90, C1-C3 ; G. Klein et J. -L. Reymond, Helv. Chim. Acta 1999,82, 400). Cette deuxième classe de

substrats est plus stable. Cependant, cette deuxième classe de substrats est limitée à des utilisations particulières.

En effet, le dosage de la réaction se fait directement sur le produit libéré en utilisant une enzyme. Le produit libéré doit donc répondre à des caractéristiques structurales bien précises, qui limite de ce fait la diversité des activités catalytiques pouvant tre détectée.

Une troisième classe de substrats modifiés a été mise au point pour détecter des activités catalytiques en évitant les problèmes soulevés préalablement (Badalassi F. et al. Angew Chem Int Ed Engl. 2000,39 (22) : 4067-4070).

Mais ces substrats correspondent toujours à des substrats modifiés.

D'autre part, on connaît les substrats naturels capables de révéler une activité catalytique. Cependant, les différentes techniques utilisant des substrats naturels sont soit complexes et lourdes à mettre en oeuvre pour du criblage à haut débit (instrumentation lourde dans le cas de la thermographie IR, la CE, HPLC, GC, MS), soit limitées à des activités catalytiques particulières susceptibles par exemple d'induire une différence de pH et/ou à des conditions réactionnelles étroitement définies (mesure des variations de pH, enzymes secondaires). La plupart de ces mesures sont également très chères à réaliser à cause du coût soit de l'instrumentation, soit des réactifs mis en jeu, en particulier les enzymes secondaires et anticorps anti-produit (M. T. Reetz et al. Angew. Chem. 1999,111, 1872 ; A. Holzwarth et al. Angew. Chem. 1998,110, 2788 ; M. T. Reetz et al. Angew. Chem. 2000,112, 1294, Angew.

Chem. Int. Ed. Engl. 2000,39, 1236 ; Taran et al.

Tetrahedron Lett. 1999,40, 1887,1891 ; S. M. Firestine et al. Nat. Biotechnol 2000,18, 544 ; F. Moris-Varas et al.

Bioorg. Med. Chem. 1999,7, 2183).

La présente invention vise à offrir une méthode de détection d'une activité catalytique qui s'affranchit des différents problèmes techniques cités ci-dessus et qui permet l'utilisation de tous types de substrats.

Ce but est atteint grâce à une méthode de détection d'une activité catalytique d'un échantillon comprenant : -la mise en contact d'un substrat (S) avec l'échantillon susceptible de posséder l'activité catalytique que l'on souhaite détecter, - l'ajout d'un réactif (X) capable de réagir soit avec un groupement chimique du substrat (S) soit avec un groupement chimique du produit (P) formé, - l'ajout d'un révélateur (R) capable de réagir avec le réactif (X), - la détection de la transformation du révélateur (R).

Le réactif (X) est ajouté après un temps d'incubation entre le substrat (S) et l'échantillon. Le réactif (X) réagit après un temps d'incubation donné avec soit le substrat (S) non consommé par l'activité catalytique de l'échantillon soit le produit (P) formé.

L'activité catalytique peut ainsi tre mesurée au cours du temps.

On peut distinguer deux formes de réalisation de la méthode de l'invention : - une première forme de réalisation où le réactif (X) est modifié par le substrat (S) et pas par le produit (P), - une seconde forme de réalisation où le réactif (X) est modifié par le produit (P) et pas par le substrat (S).

Les schémas des figures 1 et 2 illustrent la méthode de l'invention selon respectivement que (S) ou (P) soit capable de réagir avec le réactif (X).

La méthode de l'invention est basée sur la mise en oeuvre du trio : (S) ou (P)/ (X)/ (R), où le réactif (X) est capable de réagir avec (S) ou (P) et le révélateur (R).

La méthode de l'invention est basée sur une cascade de réactions où la quantité d'équivalents de réactifs (X) est inférieure à la somme de la quantité d'équivalents de (S) non consommé ou de (P) formé et d'équivalents de révélateurs (R).

La quantité d'équivalents du révélateur (R) utilisée est avantageusement supérieure ou égale à la quantité d'équivalents de réactifs (X).

A titre d'exemple, une détection de l'activité catalytique peut tre réalisée en utilisant une quantité de réactif (X) correspondant à 1 fois la quantité maximale de (P) attendu ou de (S) transformé suivant le cas où le réactif (X) réagit avec soit (P) formé ou (S) non consommé.

L'activité catalytique de l'échantillon détectée selon la méthode de l'invention peut tre chimique ou enzymatique. Elle correspond à toute activité capable de transformer un substrat (S) en un produit (P). La transformation de (S) en (P) peut tre réalisée par plusieurs réactions séquentielles.

L'échantillon susceptible de contenir ladite activité catalytique peut provenir de différentes origines. Il peut tre par exemple chimique, biologique, microbiologique, animal, végétal, humain. Il peut provenir de tous types d'environnements et de prélèvements.

L'échantillon peut tre simple ou complexe, préparé à

partir de techniques classiques d'extraction puis éventuellement purifié ou utilisé tel quel.

L'activité catalytique détectée par la méthode de l'invention peut correspondre à une activité nouvelle d'un catalyseur connu. Avantageusement l'activité catalytique correspond à une enzyme. Cette activité peut correspondre à celle d'une enzyme ou d'un mélange d'enzymes.

Cette enzyme est choisie dans le groupe comprenant des hydrolases, des oxydases, des lyases, des ligases, des transférases, des isomérases.

Le substrat (S) peut correspondre à toute molécule pouvant tre utilisée pour détecter une activité catalytique selon la méthode de l'invention. Le substrat est donc spécifique de l'activité catalytique recherchée.

Il peut correspondre à tous types de substrats comme un substrat naturel ou synthétique pouvant tre modifié ou non. Le substrat naturel peut correspondre à titre d'exemple à des huiles végétales pour détecter des activités catalytiques de type lipase.

Le réactif (X) correspond à toute molécule capable de réagir avec un groupement chimique présent soit sur le substrat (S) soit sur le produit (P) mais pas avec les deux.

On entend par groupement chimique tout groupe présent sur le substrat (S) ou le produit (P) et éventuellement sur le révélateur (R) capable de réagir avec le réactif (X). Ils peuvent correspondre à titre d'exemple à des groupes 1,2-diol, 1, 2-aminoalcool, 1,2-diamine, alpha-hydroxycétone, alpha-aminocétone, thiol, thioéther, 1,2-catéchol, hydroquinone (=1, 4-dihydroxybenzene), pouvant réagir avec le réactif (X) qui peut tre un agent oxydant comme le périodate.

Le choix du réactif (X) est fait en fonction de l'activité catalytique que l'on souhaite détecter. Il est choisi de manière à pouvoir réagir, comme on l'a vu précédemment, avec un groupement chimique soit de (P) formé soit de (S) non consommé après un temps d'incubation avec l'éhantillon. Il ne doit pas réagir simultanément avec (S) et (P).

Dans le cas où le réactif (X) réagit avec le produit (P), on peut ajouter le réactif (X) au cours de la transformation catalytique de S en P dans la mesure où le réactif (X) n'affecte pas l'activité catalytique ou la transformation de (S) en (P) et dans la mesure où le réactif (X) résiste aux conditions de transformation de S en P. A titre d'exemple, on évitera d'incuber le réactif correspondant au periodate à très haute température. De plus, si la réaction met en jeu un produit intermédiaire (P') pouvant réagir avec le réactif (X), mais qui peut encore tre transformé en produit final (P), il est aussi préférable de ne pas ajouter le réactif avant la fin de la transformation de (S) en (P).

Le révélateur (R) est capable de réagir avec le réactif (X). De plus, la transformation du révélateur (R) par ledit réactif (X) est détectable directement ou indirectement. Enfin, la détection du révélateur (R) est insensible à (S) et (P).

La détection de la transformation du révélateur (R) par le réactif (X) peut correspondre à l'apparition d'un signal ou au contraire à l'extinction d'un signal.

Suivant la présence ou l'absence de ce signal, on pourra conclure sur la réalisation de la transformation catalytique de (S) en (P).

Dans une forme particulière, le révélateur (R) peut réagir avec le réactif (X) transformé. Cependant, dans

ce cas, le signal mesuré avec le réactif (X) transformé doit tre différent de celui mesuré avec le réactif (X).

Le révélateur (R) est choisi de manière à réagir avec le réactif (X) pour donner un composé détectable. A titre d'exemple, le réactif (X) peut modifier un groupement chimique du révélateur (R) pour donner un composé détectable ou le révélateur (R) peut former avec le réactif (X) un complexe non covalent détectable pouvant tre notamment chromogénique.

Dans le cas où le révélateur (R) possède un groupement chimique capable de réagir avec le réactif (X), le groupement chimique du révélateur (R) est transformé par le réactif (X).

Dans le cas où la révélation met en oeuvre un groupement chimique du révélateur (R), les groupements chimiques de (S) ou (P) et du révélateur (R) capables de réagir avec le réactif (X) peuvent tre différents ou identiques.

Le révélateur (R) peut correspondre à une molécule pouvant tre le substrat d'une réaction catalytique ou d'une série de réactions catalytiques différentes de celle (s) capable (s) de transformer (S) en (P).

Dans une forme de mise en oeuvre spécifique de l'invention, le trio suivant est utilisé : (réactif (X) = oxydant chimique/ (S) ou (P) et révélateur (R) pouvant posséder les groupements chimiques suivants : 1,2-diol ou 1,2-aminoalcool ou 1,2-diamine ou alpha-hydroxycétone ou alpha-aminocétone ou thiol, thioéther, ou catéchol, ou catécholamine, hydroquinone).

Le substrat (S) est choisi de manière à réagir avec l'échantillon susceptible de contenir l'activité catalytique que l'on souhaite détecter. Dans cette forme de mise en oeuvre, le substrat (S) ou le produit (P) correspondent à un composé de formule (I) suivante : dans laquelle la liaison C1-C2 est sensible à une coupure par une réaction d'oxydation chimique.

Ri à R4, identiques ou différents, correspondent à un atome d'hydrogène, un groupe alkyle substitué ou non, un groupe fonctionnel substitué ou non.

- X et Y, identiques ou différents, sont choisis parmi un atome d'oxygène, un atome de soufre, une amine de formule-NR8R9, R8 est choisi parmi : un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, un groupe aryle, substitués ou non, et R9 n'est pas un atome d'hydrogène.

On entend par groupe fonctionnel tout groupe chimique appartenant à une classe de composés organiques caractérisée par des propriétés chimiques. On peut citer à titre d'exemple de groupe fonctionnel : des amides, des acyles, des alcoxy, des nitriles, des aryles, des hétéroaryles, des alkenyles, des carbonyles, des thiocarbonyles, des carboxyles, des thiocarboxyles, des carbamyles, des thiocarbamyles, des thiocarbamides, des alcools, des thiols, des amines substitués ou non.

Dans une forme préférée, le produit (P) répond à la formule (I) ci-dessus.

Le réactif (X) est choisi de manière à pouvoir réagir avec (S) ou (P) de formule (I). Dans une forme de mise en oeuvre particulière, le réactif (X) correspond à un

oxydant chimique capable de cliver la liaison C1-C2 de (S) ou (P) de formule (I).

L'oxydant chimique peut correspondre de manière avantageuse et de façon non limitative à un ou plusieurs des réactifs suivants H5I06, Ru02, Os04, (CH3CH2CH2) 4N (Ru04), NaCl04, NaI04, Na3H2IO6, NaMn04, K20s04, KI04, KMn04, KRu04, K2Ru04, LiOCl, l'acétate de plomb, le tétrapropyle ammonium periodate, l'acide chromique ou des sels de celui-ci, NaBi03, Ph3BiCO3, Ca (OCl) 2, les réactifs Ce (IV), Cr (VI), les sels de Co (II), IOAc, I (OAc) 3, N-iodosuccinimide, VO (acac), Pb (OAc) 4, Mn02, H202 ou le mélange des réactifs [H202, Na2WO4, H3PO4].

Tout préférentiellement l'agent chimique oxydant est un sel de périodate.

A titre d'exemple, on peut citer les trois formes de révélation décrites ci-dessous.

Dans une forme de mise en oeuvre, le révélateur (R) est choisi parmi l'aminoalcool nitrophénol et les catéchols de formules suivantes : "aminoalcool nitrophenol" 4- (p-nitrophenoxy)-l-amino-2-butanol 6-metoxy-2- (1', 2'- dihydroxyethyl) naphtalène Parmi les révélateurs (R) du periodate n'ayant pas réagit avec S ou P, on peut citer notamment l'aminoalcool nitrophénol et les catéchols.

Les catéchols (1,2-dihydroxybenzene) donnent de manière générale des réactions avec le periodate résultant en un changement de densité optique, et parfois des changement de fluorescence. L'adrénaline et la noradrénaline sont des révélateurs préférés de cette forme

de mise en oeuvre. Ils donnent une couleur rouge dans un temps extrmement court en réagissant avec le periodate. Il n'est pas évident pour l'homme du métier que l'adrénaline puisse servir de révélateur quantitatif du periodate. En effet, les quinones produits de l'oxydation se décomposent au cours du temps pour former des polymères. De plus, cette révélation met en oeuvre une double oxydation. Les exemples de la littérature (El-Kommos et al. (1990). J. Assoc. Off.

Anal. Chem., 73,516-520) ne renseignent pas sur le fait que la deuxième oxydation est visiblement plus rapide que la première, ce qui permet une conversion de l'adrénaline en adrénochrome mme avec peu de periodate par rapport à l'adrénaline. De ce fait, il n'est absolument pas évident d'utiliser le trio (Réactif = périodate/S ou P = composé de formule I/Révélateur = catéchol) pour détecter une activité catalytique selon la méthode de l'invention.

Ce principe de révélation d'activité catalytique utilisant le périodate comme réactif (X) et l'adrénaline comme révélateur (R) est illustré à la figure 3.

L'octopamine peut également tre utilisé comme révélateur du périodate, dont l'oxydation de la fonction 1,2-aminoalcool libère le p-hydroxybenzaldéhyde, qui montre une absorbance forte à 330 nm (UV proche, facilement détectable).

La figure 4 donne des exemples de révélateur (R) de NaIO4 de type catéchol.

Dans une autre forme de mise en oeuvre, le révélateur (R) correspond à un composé de formule (I) pouvant tre détecté après avoir réagi avec le réactif (X).

Le révélateur correspondant à un composé de formule (I), décrit précédemment, présente la particularité de pouvoir tre détecté après avoir réagi avec le réactif

(X) non transformé par (S) non consommé ou (P) formé après un temps d'incubation avec l'échantillon.

Selon un premier mode de mise en oeuvre de révélation directe, le révélateur (R) répondant à la formule (I) est oxydé en présence du réactif (X), selon le schéma réactionnel suivant : R1 HX R2 Y X + oxydation R3 R4 R1 R2 HY R3 chimique en présence du réactif (II) (III) (I) Les propriétés des produits de formules (II) et/ou (III) libérés peuvent alors tre directement détectées.

A titre d'exemples non limitatifs on peut citer parmi ces propriétés des composés de formules (II) et/ou (III), une propriété physique, telle que la solubilité, une propriété physico-chimique, telle qu'une propriété spectrale, ou une propriété biologique, telle que l'activation d'une enzyme, une odeur, ou l'action d'une phéromone.

Les composés de formules (II) ou (III) peuvent correspondre à des cétones aromatiques, par exemple une cétone béta-aromatique que l'on détecte par une variation spectrale, un aldéhyde comme le benzaldéhyde ou le citronellal que l'on détecte par l'odeur ou à une phéromone que l'on détecte par l'attraction d'insectes. (Suzuki et al., (1980), Agric. Biol. Chem. 44,2519 ; Millar et al.

(1996), Bioorg. Med. Chem. 3,331-340).

Dans un deuxième mode de révélation indirecte, au moins un des groupes R1 à R4 du composé de formule (I) répond à la formule (IV) suivante :

dans laquelle : - R5, R6 et R7, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, un groupe alkyle substitué ou non ou un groupe fonctionnel substitué ou non, et - Z est un précurseur d'un produit détectable ZH.

Le révélateur (R) de formules (I), en présence du réactif, est oxydé pour libérer à titre d'exemple les composés de formules (V) et (III). Le composé de formule (V) subit une réaction de béta-elimination avantageusement spontanée conduisant au produit détectable ZH, selon le schéma réactionnel suivant : R1 Y " ji HX Rl R2 y R5 x R5 2 Oxydation H Rl R2 HY R3 chimique B z R7 Ho R4 (V) (III) béta élimination (I) y R5 R6 R3 \\ + Z ZH Rj \ R7

Cette réaction de béta-élimination avantageusement spontanée, est réalisée préférentiellement en présence d'une base désignée « B » dans le schéma ci- dessus qui peut correspondre à l'albumine de sérum de boeuf (BSA).

Parmi les propriétés du composé ZH, on peut citer à titre d'exemples non limitatifs une propriété physique telle que la solubilité, une propriété physico- chimique telle qu'une propriété spectrale ou une propriété biologique telle que l'induction de croissance de bactéries.

Le composé ZH est choisi parmi un alcool aromatique, un alcool hétéroaromatique, une amine hétéroaromatique, un atome d'halogène, ou un ester phosphorique. A titre d'exemples non limitatifs peuvent tre cités, la fluorescéine, la phenolphtaléine, le rouge de phénol, le p-nitrophénol lo-nitrophénol, le 2,4- dinitrophénol, l'acide 6-hydroxynaphtoïque, l'acide 8- hydroxy-pyrène 1,3, 6-trisulfonique, la tyrosine, la luciférine, l'indolyle, le 5-bromo-4-chloro-indolyle, le quinolinium, le nitro-anilinium, ou la pyridoxamine.

Dans un troisième mode de révélation, le révélateur (R) répond à la formule (I) dans laquelle : - un des R1 à R2 et un des R3 à R4 ont la mme signification que précédemment, - les autres R1 ou R2 et R3 ou R4 interagissent entre eux.

Dans ce cas, la coupure de la liaison C1-C2 du révélateur de formule (I), mis en présence du réactif, provoque une variation spectrale détectable.

Un exemple non limitatif d'interaction entre les R1 ou R2 et R3 ou R4 est un transfert d'énergie de type FRET (Fluorescent Resonance Energy Transfert).

Enfin, le révélateur peut également correspondre au précurseur d'un inhibiteur d'un catalyseur.

En présence du réactif (X), le précurseur de l'inhibiteur est transformé en un inhibiteur d'un catalyseur d'une réaction détectable. Ce catalyseur est différent de l'activité catalytique que l'on souhaite détecter avec le procédé de l'invention. L'inhibiteur peut correspondre à titre d'exemple au phénol, le précurseur correspondant peut correspondre notamment à un composé de formule (VI) suivante : Ce trio (réactif (X) = oxydant chimique/S ou P et révélateur (R) dont les groupements chimiques correspondent à 1, 2-diol ou 1,2-aminoalcool ou 1,2-diamine ou alpha-hydroxycétone ou alpha-aminocétone ou thiol, thioéther, cathecol ou cathecolamine ou hydroquinone) permet à titre d'exemple de détecter selon le procédé de l'invention des phytases, lipases, epoxide hydrolases, amidases, des acylases ou des estérases.

Dans une autre forme de mise en oeuvre de l'invention, le trio suivant est utilisé : (réactif (X) = Dansyl-hydrazine/ (S) ou (P) et révélateur (R) dont les groupements chimiques correspondent à des cétones ou aldéhydes ou hémiacétals de type alcool).

Le substrat (S) est toujours capable de réagir avec l'activité catalytique que l'on souhaite détecter.

Dans une autre forme de mise en oeuvre, le substrat (S) ou le produit (P) correspond à des aldéhydes ou des cétones O=C (molécule). La détection de la

transformation catalytique se fait donc à titre d'exemple de la façon suivante. On utilise comme réactif (X) une hydrazine fluorescente F-NHNH2 (F correspondant à un fluorophore), qui forme le produit fluorescent F-NH- N=C (molécule). Ensuite, le réactif F-NHNH2, n'ayant pas réagit avec S ou P, est dosé avec un révélateur (R) correspondant à un aldéhyde ou une cétone quencheur Q-C=O (Q correspondant au quencher), qui forme le couple non- fluorescent Q-CH=N-NH-F.

On peut concevoir une méthode de détection d'une activité catalytique équivalente capable de transformer un substrat (S) en un produit (P) où (S) ou (P) possèdent les groupements chimiques suivants : des aldéhydes ou des cétones O=C (molécule) ou des hémiacétals de type sucre et : 1) le réactif (X) est une hydrazine quencheuse (ex : 4-carboxy-phenyl-hydrazine) de type Q-NH-NH2, et le révélateur (R) un aldéhyde ou cétone fluorescent F-CHO (ex : 6-méthoxynaphthaldéhyde). La réaction entre le réactif (X) non consommé par (S) ou (P) et le révélateur (R) correspond à une extinction de fluorescence.

2) le réactif (X) est une hydrazine fluorescente F1-NHNH2 et le révélateur (R) un aldéhyde ou cétone F2-CHO. La réaction entre le réactif (X) non consommé par (S) ou (P) et le révélateur (R) correspond à un phénomène de type FRET entre F1 et F2 pouvant tre observé. A titre d'exemple F = fluoresceine thiosemicarbazide et F2 = rhodamine aldéhyde. fluoresceine thiosemicarbazide rhodamine-aldéhyde (L = linker = CH2, (CH2) 2, etc.) Ce type de trio (réactif (X) = Dansyl-hydrazine / (S) ou (P) et révélateur (R) dont les groupements chimiques correspondent à des cétone ou aldéhyde ou hémiacétal de type sucre) permet à titre d'exemple de détecter selon le procédé de l'invention l'oxydation ou la réduction de cétones et d'aldéhydes, la réaction oxy-cope, la coupure oxidative de double liaisons et de diols, la dimérisation réductive d'aldéhyde ou cétone, l'amination réductive d'aldéhyde ou cétone, les additions de nucléophiles divers sur les cétones et aldéhydes (cyanure, bisulfite, etc. ), les réactions d'aldolisation et de rétroaldolisation.

D'autres trios peuvent tre envisagés pour réaliser la méthode de l'invention. On peut encore citer les trios suivant : - (S ou P dont les groupements chimiques correspondent aux aldéhyde, cétone, ou hémiacétal type sucre/X = NaCN, NaBH4, NaHSO3/R = 6- methoxynaphthaldéhyde) où le révélateur (R) ayant réagi avec le réactif (X) non consommé ou transformé par (S) ou (P) devient non fluorescent.

- (S ou P dont le groupement chimique correspond à RCOOH (acide carboxylique) /X = NaOH/R = 4- nitrophenol) où le révélateur (R) ayant réagi avec le

réactif (X) non consommé ou transformé par (S) ou (P) induit un changement de pH.

La méthode de l'invention présente une grande souplesse. Elle peut tre mise en oeuvre sur n'importe quel type de substrat. En effet, il est possible notamment de mesurer l'activité de lipases sur des huiles à n'importe quel pH entre 2 et 10, avec ou sans cosolvants, de manière colorimétrique.

La méthode de détection d'activités catalytiques de la présente invention permet de s'affranchir complètement de la structure des substrats, on peut utiliser tout type de substrats spécifiques naturels ou modifiés d'une activité catalytique donnée. A titre d'exemple, on peut citer l'utilisation de précurseur de diol ou hydroxycétones, en particulier des substrats naturels, comme démontré ici avec l'utilisation d'huile végétale comme substrat ou encore le criblage de la condensation de type benzoine catalysée par la pyruvate décarboxylase, qui donne une hydroxycétone à partir de benzaldéhyde et de pyruvate.

La méthode de l'invention permet de mesurer une activité catalytique sur une grande diversité de substrats.

On peut citer par exemple l'activité des époxydes hydrolases sur une grande diversité de substrats, ce qui n'est pas possible autrement de manière colorimétrique simple. En effet il faudrait sinon déterminer la formation de chaque produit séparément par HPLC, GC ou autre méthode analytique lourde.

En outre, avec la méthode de l'invention, il est possible de suivre des réactions ou le diol (aminoalcool ou diamine) est utilisé comme substrat et disparaît au cours de la réaction.

Dans le cadre de détection à haut débit, la méthode de l'invention permet d'utiliser des substrats commerciaux, ce qui permet d'avoir rapidement une classe

étendue de substrats. Ceci est bien illustré dans les exemples ci-dessous.

La méthode de l'invention peut également tre utilisée pour détecter la transformation d'un substrat (S) en un produit (P) par une activité catalytique.

L'invention se rapporte donc également à l'utilisation d'une méthode de détection d'une activité catalytique d'un échantillon décrite ci-dessus pour la détection d'une transformation catalytique d'un substrat (S) en un produit (P).

L'invention a enfin pour objet un échantillon présentant une activité catalytique capable de transformer un substrat (S) en un produit (P) mise en évidence par la méthode décrite précédemment.

D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront dans les exemples qui suivent où il sera fait référence aux dessins en annexe dans lesquels : La figure 1 est un schéma de la méthode de l'invention où le réactif (X) réagit avec le substrat (S).

La figure 2 est un schéma de la méthode de l'invention où le réactif (X) réagit avec le produit (P).

La figure 3 illustre le principe de la méthode de l'invention utilisant le périodate comme réactif (X) et l'adrénaline comme révélateur (R).

La figure 4 représente des exemples de révélateur (R) de NaIO4 de type catéchol.

La figure 5 montre les substrats d'enzymes utilisés dans les exemples suivants.

Les figures 6 et 7 représentent la détection d'activités lipase et estérase par la méthode de l'invention respectivement en utilisant comme révélateur le nitrophenolaminoalcool et l'adrénaline.

Les figures 8 et 9 représentent les résultats de détection de phytase respectivement : - à différentes températures selon la méthode de l'invention en utilisant comme révélateur le nitrophenolaminoalcool.

- à différents pH en utilisant comme révélateur l'adrénaline.

Les figures 10 et 11 représentent les résultats de détection d'activités époxyde hydrolase selon la méthode de l'invention respectivement en utilisant comme révélateur le nitrophenolaminoalcool et l'adrénaline.

La figure 12 donne un exemple sur plaque de détection de l'Epoxyde hydrolase d'Aspergillus Niger.

EXEMPLE 1 : DETECTION D'ACTIVITES LIPASE ET ESTERASE.

Les réactions de détection sont effectuées à l'aide de 5 substrats décrits à la figure 5. Trois concentrations d'activités enzymatiques sont testées pour effectuer la détection.

1) Première forme de mise en oeuvre. i) Les enzymes diluées dans un tampon phosphate 20 mM pH 7.2 sont ajoutés à des substrats correspondant à des huiles végétales 2a-c (0,05 mL dans 0,4 mL de tampon dans un eppendorf de 1.5 mL, agitateur à 1200 tour/min. ) ou substrats 3 ou 4 (10 mM) à 26°C pendant 60 min. Ces différents substrats sont présents sur la figure 5. ii) Ajout au niveau de la réaction catalytique précédente durant 30 min d'un réactif correspondant à 1 mM NaIO4 capable de réagir chimiquement avec le produit P. iii) Ajout de 1,5 mM du révélateur NH2CH2CHOHCH2CH2OC6H4NO2 (= nitrophenol aminoalcool) + 2 mg. mL~1 BSA, 60 min.

La figure 6 en annexe rapporte les résultats de détection d'activités lipase et estérase avec des huiles

végétales (2a = huile d'olive, 2b = huile de tournesol, 2c = huile de pépins de raisin), tributyrine (3) et ethylene glycol bis-octanoate (4). Les zones colorés vont du blanc (pas d'activité, aucune réduction de la couleur du nitrophénol) à noir (aucune couleur restante du nitrophenol, activité maximum). Abbréviations des échantillons testés (Fluka) : PFL = Pseudomonas fluorescens lipase (F62321) ; CVL = Chromobacterium viscosum lipoprotein lipase (F62333) ; PSL = Pseudomonas sp. lipoprotein lipase (F62335) ; PSBL = Pseudomonas sp. Type B lipoprotein lipase (F62336) ; PLE = pig liver esterase (F46058) ; TBE = Thermoanaerobium brockii esterase (F46061) ; BSE = Bacillus sp. esterase (F46062) ; SCE = Saccharomyces cerevisiae esterase (F46071).

2) Deuxième forme de mise en oeuvre. i) Les enzymes diluées dans un tampon phosphate 20 mM pH 7,2 sont ajoutés à des substrats correspondant à des huiles végétales 2a-c (0,05 mL dans 0,4 mL de tampon <BR> <BR> dans un eppendorf de 1.5 mL, agitateur à 1200 tour/min. ) ou substrats 3 ou 4 (10 mM) à 26°C pendant 30 min avec 1 mM de NaI04. Ces différents substrats sont présents sur la figure 5. ii) Ajout de 1, 5 mM d'adrénaline, 5 minutes.

La figure 7 en annexe illustre les résultats de détection d'activité lipase et estérase avec des huiles végétales (2a = huile d'olive, 2b = huile de tournesol, 2c = huile de pépins de raisin), tributyrine (3) et ethylene glycol bis-octanoate (4). Les zones colorés vont du blanc (pas d'activité, aucune réduction de la couleur de l'adrénochrome) à noir (aucune couleur restante de l'adrénochrome, activité maximum). Abbréviations des échantillons testés (Fluka) : PFL = Pseudomonas fluorescens lipase (F62321) ; CVL = Chromobacterium viscosum lipoprotein lipase (F62333) ; PSL = Pseudomonas sp. lipoprotein lipase (F62335) ; PSBL = Pseudomonas sp. Type B lipoprotein lipase

(F62336) ; PLE = pig liver esterase (F46058) ; TBE = Thermoanaerobium brockii esterase (F46061) ; BSE = Bacillus sp. esterase (F46062) ; SCE Saccharomyces cerevisiae esterase (F46071).

EXEMPLE 2 : DETECTION D'ACTIVITE PHYTASE.

1) Première forme de mise en oeuvre en fonction de la température. i) aq. 10 mM phytate, pH 5.0, phytase (0.1 mg. mol-1), 60 min. à la température indiquée ; ii) 1 mM NaIO4, 30 min., 26 °C ; iii) ajuster le pH à 9.0 avec 0.1 N NaOH, ensuite ajouter 1,5 mM nitrophenolaminoalcool, 2 mg. mL~ BSA, 60 min. la figure 8 représente les résultats de détection de phytase à différentes température : (N) Natuphos phytase (+ 1 mM CaCl2), (A) Novo phytase (+ 1 mM CaCl2), (o) Aspergillus ficuum phytase (1 mM CaCl2 + 100 nM MnCl2). Aucune activité n'est observée sans enzyme.

2) Deuxième forme de mise en oeuvre en fonction du pH. i) aq. 10 mM phytate, phytase (0.1 mg. mL-1), 55°C, 60 min. au pH indiqué ; ii) 1 mM NaI04, 30 min., 26 °C ; iii) Ajout de 1.5 mM d'adrénaline, 5 minutes.

La figure 9 représente les résultats sont illustrés sur la détection de phytase à différents pH : (-) Natuphos phytase (+ 1 mM CaCl2), (A) Novo phytase (+ 1 mM CaCl2), (o) Aspergillus ficuum phytase (1 mM CaCl2 + 100 nM MnCl2).

EXEMPLE 3 : DETECTION D'ACTIVITES EPOXYDE HYDROLASE (EH).

Les réactions de détection sont effectuées à l'aide de grille de substrats époxyde 6a-z disposés selon la figure 5.

1) Première forme de mise en oeuvre. i) 10 mM epoxide dans aq. 20 mM phosphate pH 7.2 avec l'enzyme ii) ajout de 1 mM NaIO4, 30 min., 26°C ; ajout de 1,5 mM de nitrophenolaminoalcool, 2 mg. mol'1 BSA, 60 min., 26°C. iii) Aucune activité n'est détectée sans enzyme ou en présence de BSA (2 mg/mL).

Les différents résultats de détection d'activités époxyde hydrolase sont illustrés sur la figure 10.

2) Deuxième forme de mise en oeuvre. i) 10 mM epoxide dans aq. 20 mM phosphate pH 7.2 avec l'enzyme et 1 mM NaIO4, 30 min., 26°C avec 0.05 mg/mL aspergillus Niger EH, ou 37°C avec 0.1 mg/mL Rhodotorula glutinis EH. ii) ajout de 1,5 mM d'adrénaline, 5 min, 26°C.

Les figures 10 et 11 représentent les résultats de détection d'activités époxyde hydrolase : - Figure 10 : Grille de substrats époxyde 6a-z disposés selon la figure 5. A gauche : Aspergillus niger EH (50 tg. mL-1), 60 min., 26°C ; A droite : Rhodoturula glutinis EH (0.5 mg. mL-1), 37°C, 120 min.

Figure 11 : Grille de substrats époxyde 6a-z disposés selon la figure 5. A gauche : Aspergillus niger EH (50, ut. mL-1), 30 min., 26°C ; A droite : Rhodoturula glutinis EH (0.1 mg. mL-1), 37°C, 30 min.

La figure 12 donne un exemple sur plaque de détection de l'Epoxyde Hydrolase (EH) d'Aspergillus Niger, réalisé par révélation directe à l'adrénaline. Conditions : pH 7.2, 25 microg/mL enzyme, 10 mM substrats, 1 mM NaI04, 30 min., puis ajout de 1.5 mM adrénaline, réaction

instantanée (<30 sec. ). Les puits colorés sont ceux où le periodate n'a pas été consommé par le diol formé par hydrolyses des époxydes, donc où aucune réaction n'a eu lieu (contrôle en haut à gauche).