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Title:
METHOD AND DEVICE FOR CONTROLLING THE EXCHANGE OF SUBSTANCES BETWEEN A SAMPLE AND THE SURROUNDING ATMOSPHERE THEREOF
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2001/090721
Kind Code:
A1
Abstract:
The inventive method can be used with all open samples or reaction chambers. It is particularly useful in the synthesis of DNA arrays for the conditioning of micro or nano titerplates with a number of small wells. The atmosphere surrounding the micro or nano titerplates contains water vapour and the wells contain aqueous solutions. Water is continuously transferred between the atmosphere and the solutions in the form of condensation and evaporation. In order to avoid either of these processes from impinging upon the other, the temperature of the sample is controlled in such a way that the weight of the sample, for example, remains constant. A micro or nano titerplate with solutions in the wells can thus be kept for several days in an open atmosphere, without any change occurring in the concentrations of the substances in the wells.

Inventors:
MUELLER RALPH (DE)
Application Number:
PCT/EP2001/005903
Publication Date:
November 29, 2001
Filing Date:
May 22, 2001
Export Citation:
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Assignee:
BASF LYNX BIOSCIENCE AG (DE)
MUELLER RALPH (DE)
International Classes:
B01L3/00; G01N1/28; G01N35/00; G01N35/02; (IPC1-7): G01N1/40; B01L3/00; G01N1/28
Domestic Patent References:
WO1999039829A11999-08-12
Foreign References:
US5908776A1999-06-01
DE19739120A11999-03-11
US5587321A1996-12-24
US5851492A1998-12-22
Attorney, Agent or Firm:
Köllner, Malte (Köllner & Kewitz Robert-Bosch-Strasse 7 Darmstadt, DE)
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Claims:
Patentansprüche
1. Verfahren zum Steuern des Stoffaustauschs zwischen einer Probe und der die Probe umgebenden Atmosphäre, wobei als Probe ein Lösungsmittel mit einer im Lösungsmit tel gelöste Substanz gewählt wird ; wobei das Volumen der Probe und/oder die Konzentration der gelösten Substanz und/oder die in der Probe gelöste Menge der Substanz bestimmt wird ; und wobei die physikalischen Eigenschaften der Probe und/oder der umgebenden Atmosphäre derart eingestellt werden, dass sich eine gewünschte Kondensation des Lösungsmitteldampfs in oder auf die Probe bzw. eine gewünschte Verdunstung oder Sublimati on des Lösungsmittels aus der Probe ergibt.
2. Verfahren zum Steuern des Stoffaustauschs zwischen einer Probe und der die Probe umgebenden Atmosphäre, wobei als Probe ein Lösungsmittel mit einer im Lösungsmit tel gelöste Substanz gewählt wird ; wobei das Volumen der Probe und/oder die Konzentration der gelösten Substanz und/oder die in der Probe gelöste Menge der Substanz bestimmt wird ; und wobei die Probe mit einem Nebel einer Flüssigkeit benebelt wird, um die Flüssigkeit in die Probe einzutragen.
3. Verfahren nach dem mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Taupunkt des Lösungsmitteldampfs in der umgebenden Atmosphäre bestimmt wird ; und dass die Temperatur der Probe oberhalb des Taupunkts des Lösungsmittels in der umgebenden Atmosphäre eingestellt wird, um das Volumen der Probe durch Verdunstung oder Sublimation zu verringern.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Nebel durch einen Ultraschalloder Piezovernebler erzeugt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass ein Nebel aus einem Lösungsmittel mit einer darin ge lösten Substanz gebildet wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Volumen der Probe durch Bestimmen des Gewichts der Probe bestimmt wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Volumen der Probe durch eine optische Messung be stimmt wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Volumen der Probe durch eine kapazitive oder in duktive Messung bestimmt wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Volumen der Probe durch eine Schwingungsmessung bestimmt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der gelösten Substanz durch eine op tische Messungbeispielsweise eine Absorptionsoder Fluo reszenzmessungbestimmt wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der gelösten Substanz oder die in der Probe gelöste Menge der Substanz durch eine elektrische Messungbeispielsweise eine Messung der Impedanz oder der Dielektrizitätskonstante der Probebestimmt wird.
12. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche mit einer Probe, die mit einer Atmosphäre in Kontakt ist, wobei die Atmosphäre einen Dampf eines Stoffs enthält und die Probe diesen Stoff enthält oder ihn aufnehmen kann ; mit Mitteln (20,22) zum Bestimmen des Taupunkts des Dampfs des Stoffs in der Atmosphäre ; und mit Mitteln (32,24) zum Einstellen der physikalischen Eigenschaften der Probe und/oder der Atmosphäre bezogen auf den Taupunkt des Dampfs des Stoffs in der Atmosphäre derart, dass sich eine gewünschte Kondensation des Dampfs in oder auf die Probe bzw. Verdunstung bzw. Sublimation des Stoffs aus der Probe ergibt ; wobei die Probe eine Mikrooder Nanotiterplatte (10) mit einer Vielzahl von Wells (12) ist ; dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zum Einstellen der physikalischen Eigen schaften der Probe eine TemperaturRegeleinrichtung (22,24) für die Probe mit einer Negativform (14) der Mikrooder Nano titerplatte (10) mit Vertiefungen (15) für die Wells (12) ent halten.
Description:
Verfahren und Vorrichtung zum Steuern des Stoffaustauschs zwi- schen einer Probe und der die Probe umgebenden Atmosphäre Beschreibung Zur Aufklärung der molekularen Wirkung von potentiellen Me- dikamenten werden sogenannte Genomexpressionsprofilanalysen durchgeführt. Dabei wird versucht, die tatsächlich in einer Zelle exprimierten Gene zu bestimmen, da die zugehörigen Pro- teine Einfluss auf die Entwicklung der Zelle nehmen. Eine Mög- lichkeit, die tatsächlich vorhandenen Proteine zu bestimmen, besteht darin, die in der Zelle synthetisierten mRNA zu bestimmen, da aus ihnen die Proteine gebildet werden.

Dazu werden isolierte Zellen aufgeschlossen. Durch geeigne- te Aufreinigungsschritte wird die mRNA aus den Zellen iso- liert. Danach wird sie i. d. R. mittels der Reversen Transkriptase in cDNA übersetzt. Diese wird mit i. d. R. line- arer PCR amplifiziert. Dabei wird die cDNA i. d. R. radioaktiv oder mit Farbstoffen markiert. Die so gewonnene cDNA wird an- schließend z. B. mit Hilfe von geeigneten DNA-Arrays qualita- tiv bzw. quantitativ analysiert. Bei der Analyse wird die Bin- dung bzw. Hybridisierung der gewonnenen DNA-Moleküle an geeig- nete, auf dem Array immobilisierte DNA-Fragmente detektiert.

Hierzu bedarf es der Herstellung geeigneter DNA-Arrays.

Diese werden i. d. R. ausgehend von Mikro-oder Nanotiterplat- ten hergestellt, die Lösungen mit geeigneten DNA-Fragmenten in den Wells enthalten. Die Wells sind kleine Vertiefungen mit

einem Volumen pro Well von beispielsweise 20 ul. Jedes Well enthält ein bekanntes, speziell synthetisiertes DNA-Fragment.

Zum Aufbau eines DNA-Arrays werden jeweils z. B. 220 pl Lösung aus einem Well auf eine genau definierte Position auf z. B. einem Objektträger (Slide) pipettiert. Dies wird von Robotern durchgeführt, sog. Spotting-Robotern. Der Aufbau eines kom- pletten DNA-Arrays dauert einige Stunden bis einige Tage und wird i. d. R. in einer abgeschlossenen Kammer durchgeführt.

Die pipettierten DNA-Fragmente werden anschließend auf dem Slide immobilisiert, sei es durch eine kovalente Crosslinking- Reaktion oder durch einfache Adsorption.

Anschließend wird die zu untersuchende Probe auf das Slide bzw. das DNA-Array gegeben. Die Probe enthält-wie oben aus- geführt-radioaktiv oder mit Farbstoffen markierte DNA-oder RNA-Moleküle. In einer speziellen Hybridisierungskammer wird bei geeigneter Temperatur die Hybridisierung abgewartet. Nicht hybridisierte DNA oder RNA aus der zu untersuchenden Probe wird durch Spülen entfernt. Hybridisierte DNA-oder RNA- Moleküle werden in einem Reader detektiert.

Schwierigkeiten bereitet dabei die schnelle Verdunstung der Lösungsmittel aus den kleinen Volumina der Wells, wodurch es zu einer Konzentrationsverschiebung und damit zur Änderung von Reaktionsbedingungen kommt. Es kann während der Dauer des Pi- pettierens teilweise zu einer vollständigen Verdunstung des Lösungsmittels kommen. DNA-Arrays mit wohldefinierten Eigen- schaften können so nicht aufgebaut werden.

Der Verdunstung kann prinzipiell durch Kühlen der Mikro- oder Nanotiterplatte entgegengewirkt werden. Bei hoher Luft- feuchtigkeit führt eine niedrige Temperatur der Mikro-oder Nanotiterplatte jedoch zu Kondensation auf der Mikro-oder Na- notiterplatte. Dadurch kommt es zu einem Flüssigkeitseintrag in die Wells, und die Konzentration der Lösungen in den Wells ändert sich. Die Reaktionsbedingungen für den Aufbau der DNA- Arrays ändern sich dadurch in unkontrollierter Weise. Bei stärkerer Kondensation kann es sogar zu einem Überlaufen der

Wells kommen, wodurch sich die Lösungen in den einzelnen Wells teilweise mischen. Ein DNA-Array kann unter diesen Bedingungen nicht mehr zuverlässig aufgebaut werden.

WO 99/39829 beschreibt ein Verfahren zur Lösung dieser Probleme, indem die Probe auf den Taupunkt des Dampfs des Lö- sungsmittels in der umgebenden Atmosphäre gekühlt wird. Dann kommt es effektiv kaum noch zu einer Verdunstung oder Konden- sation.

Ahnliche Probleme stellen sich allgemein im Bereich minia- turisierter Reaktions-, Mischungs-und Lageraufgaben, die sich durch den verstärkten Einsatz von Mikro-und Nanotechnologie, etwa bei Nanotiterplatten etc., in der Bio-und Gentechnologie ergeben.

Aufgabe der Erfindung ist es, den Stoffaustausch zwischen einer Probe und der die Probe umgebenden Atmosphäre zu steu- 'ers'.

Diese Aufgabe wird durch die Erfindungen gemäß den unabhän- gigen Ansprüchen gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen der Er- findungen sind in den Unteransprüchen gekennzeichnet.

Die Probe kann eine Lösung sein, z. B. DNA-Moleküle in ei- ner wässrigen Pufferlösung. Es kann auch jede andere Lösung sein. Ferner kann die Probe ein Festkörper sein, z. B. Eis o- der PVC, der Stoff mit der Umgebung über Sublimation austau- schen kann. Die Probe kann aber auch ein Festkörper mit darin verteilten, d. h. gelösten Substanzen und mit seinem zugehöri- gen Dampfdruck sein.

Der Stoff, der ausgetauscht wird, ist üblicherweise ein Lö- sungsmittel, wie Wasser, wässrige Pufferlösung, Alkohol oder ähnliches, mit dem zugehörigen Dampfdruck.

Zwischen der Probe und dem Stoff bzw. seinem Dampf findet ein kontinuierlicher Austausch mittels Verdampfen und Konden- sation statt. Diese Prozesse sind von thermodynamischer, sta- tistischer Natur. Auch bei höheren Temperaturen treten einzel- ne Moleküle aus dem Dampf in die Probe ein (Kondensation) ; al- lerdings überwiegt bei höheren Temperaturen der Austritt von

Molekülen aus der Probe in die umgebende Atmosphäre (Verduns- tung).

Die Konzentration des Dampfs in der umgebenden Atmosphäre, d. h. der Partialdruck des Dampfs, kann maximal gleich dem Sät- tigungsdampfdruck bei der jeweiligen Temperatur sein. Über- steigt der Partialdruck den Sättigungsdampfdruck, so wird der Überschuss durch Kondensation abgeschieden. Dies kann bei- spielsweise an der Probe eintreten, wenn die Temperatur der Probe so niedrig ist, dass der zur niedrigen Probentemperatur gehörige Sättigungsdampfdruck unter dem momentanen Partial- druck des Dampfs in der die Probe umgebenden wärmeren Atmo- sphäre liegt. In einer solchen Situation kommt es zu Kondensa- tion auf der Probe.

Im umgekehrten Fall, in dem die Probe hinreichend warm ist und der Partialdruck des Dampfs noch nicht den Sättigungsdruck erreicht hat, kommt es zu Verdunstung.

Entscheidend für die Frage, ob es zu Verdunstung oder Kon- densation auf der Probe kommt, sind somit die Temperatur der Probe und der Partialdruck des Dampfs über der Probe. Die Tem- peratur der Probe muss sich dabei am Taupunkt des Dampfs in der die Probe umgebenden Atmosphäre orientieren. Der Taupunkt des Dampfs ist diejenige Temperatur, bei der der Partialdruck des Dampfs gleich dem Sättigungsdampfdruck ist. Liegt die Tem- peratur der Probe über dem Taupunkt, kommt es zu einer effek- tiven Verdunstung ; liegt sie darunter, kommt es zu Kondensati- on.

Der Taupunkt kann z. B. mit einem Taupunkt-Hygrometer be- stimmt werden. Der Taupunkt des Dampfs kann auch durch Messen der Temperatur der umgebenden Atmosphäre und des Dampfdrucks des Stoffs in der umgebenden Atmosphäre bestimmt werden. Aus diesen beiden Größen lässt sich der Taupunkt berechnen. Der Dampfdruck kann dabei auch als relativer Dampfdruck, etwa als relative Luftfeuchtigkeit, gemessen werden, d. h. als prozentu- aler Anteil am Sättigungsdampfdrucks. Die relative Luftfeuch- tigkeit kann beispielsweise mit einem Hygrometer oder sonsti-

gen relativen oder absoluten Feuchtesensoren bestimmt werden.

Aus der Temperatur ergibt sich der (absolute) Sättigungsdampf- druck des Stoffs in der Atmosphäre. Aus dem Sättigungsdampf- druck des Stoffs und dem relativen Dampfdruck ergibt sich der Partialdruck des Stoffdampfs. Aus diesem wiederum erhält man über geeignete Referenzwerte den Taupunkt. Dieser kann unter gewöhnlichen Bedingungen z. B. bei 8°C liegen.

Wenn als Probe ein Lösungsmittel mit einer im Lösungsmittel gelöste Substanz gewählt wird, so ist der Lösungsmitteldampf für die Bestimmung des Dampfdrucks in der umgebenden Atmosphä- re entscheidend.

Zur Einstellung eines gezielten Stoffaustauschs mit der Um- gebung wird erfindungsgemäß das Volumen der Probe und/oder die Konzentration der gelösten Substanz und/oder die in der Probe gelöste Menge der Substanz direkt oder indirekt bestimmt.

-Werden diese Größen etwa über eine Waage beobachtet, so kann beispielsweise ein Gewichtsabnahme festgestellt werden.

Diese kann-bei fehlender Entnahme von Teilen der Probe-in der Regel einzig auf Verdunstung zurückgeführt werden. In ei- nem solchen Fall liegt also die Temperatur der Probe oberhalb des Taupunkts. Wird eine Gewichtszunahme beobachtet, kann in der Regel lediglich Kondensation stattfinden. Die Temperatur der Probe liegt dann unterhalb des Taupunkts. Damit bietet die Bestimmung von Volumen, Gewicht oder Konzentration eine weite- re Möglichkeit, den Taupunkt zu ermitteln, und zwar als dieje- nige Temperatur, bei der sich Volumen, Gewicht oder Konzentra- tion nicht ändern. Auf diese Weise ist eine Regelung um den Taupunkt und eine Stoffaustauschkontrolle einfach möglich.

Die verschiedenen Möglichkeiten der Taupunkt-Bestimmung können kombiniert werden.

Zur Einstellung eines minimalen Stoffaustauschs mit der Um- gebung kann dann z. B. die Temperatur der Probe in der Weise geregelt werden, dass sich z. B. das Volumen oder Gewicht der Probe nicht ändert. Dadurch ergibt sich abwechselnd eine mini-

male Verdunstung und eine minimale Kondensation, die sich in der Summe gegenseitig aufheben.

Selbst eine kleine Probe von z. B. 20 pl in einem Well ei- ner Mikrotiterplatte oder eine Probe von unter einem Mikroli- ter in einer Nanotiterplatte kann mittels des erfindungsgemä- gen Verfahrens mindestens drei bis vier Tage an der offenen Atmosphäre gehalten werden ; während dieser Zeit bleiben die Konzentrationen der Stoffe in der Probe konstant. Man erhält konstante und reproduzierbare Bedingungen der Lösungen in den Wells über einen langen Zeitraum. Daraus ergeben sich ebenso genau definierte Mengen z. B. der DNA-Fragmente auf einem DNA- Array. Es kann somit auch ein großes DNA-Array über mehrere Tage hinweg unter genau definierten Bedingungen aufgebaut wer- den.

Diese Vorteile werden mit einfachsten technischen Mitteln erreicht. Auch können Störungen der Umgebungsbedingungen, z.

B. durch Öffnen der Reaktionskammer oder des gesamten Automa- tionssystems, schnell ausgeglichen werden.

In der Regel wird die Kammer, in der sich die Mikro-oder Nanotiterplatte befindet durch einen Lüfter belüftet. Dieser stört das Gleichgewicht des Austausches zwischen Probe und Um- gebung dahingehend, dass er aus der Probe verdunstetes Lö- sungsmittel wegträgt. Dies muss durch Kondensation wieder aus- geglichen werden. Daher wird die Temperatur der Probe i. d. R. nicht genau auf den Taupunkt eingestellt bzw. um den Taupunkt herum geregelt. Vielmehr wird die Temperatur der Probe leicht unter den Taupunkt eingestellt, so dass es zu einer leichten Kondensation kommt, die die Verdunstungsverluste aufgrund des Lüfters ausgleicht.

In einer anderen Variante kann ein gezieltes leichtes Ver- dunsten zur Aufkonzentrierung der Probe eingestellt werden.

Dazu wird die Temperatur der Probe leicht über dem Taupunkt eingestellt. Zusätzlich sollte der Partialdruck des Dampfs un- ter dem Sättigungsdruck sein, da es sonst zu keiner Verduns-

tung kommt, da die umgebende Atmosphäre keinen weiteren Dampf mehr aufnehmen könnte.

Ebenso gut kann durch Einstellen der Temperatur der Probe unterhalb des Taupunkts ein gezieltes Kondensieren herbeige- führt werden.

Statt die Temperatur der Probe zu regeln, kann auch die Temperatur der Atmosphäre bezogen auf den Taupunkt des Dampfs des Stoffs oder der Dampfdruck des Stoffs in der umgebenden Atmosphäre bezogen auf den Sättigungsdampfdruck eingestellt werden. Der Dampfdruck über der Probe lässt sich auf einfache Weise über einen Verdampfer einstellen. Im einfachsten Fall ist dies eine Heizplatte unter einem offenen Lösungsmittelbe- halter.

Es können auch sowohl die Atmosphäre als auch die Tempera- tur der Probe gleichzeitig in geeigneter Weise eingestellt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch dazu verwendet werden, einen genau definierten Eintrag verschiedener Lösungs- mitteln herbeizuführen, indem über der Probe die zugehörigen Dampfdrücke aufgebaut werden.

Auf diese Weise können minimale Mengen von Stoffen in die Probe eintragen werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ist da- mit auch in der Lage, Pumpen, z. B. Mikropumpen oder piezo- elektrischen Pipettierköpfen auf der technischen Basis von Tintenstrahlköpfen, zu ersetzen. Letztere können etwa 100 pl dosieren. Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Kondensationskon- trolle können über das Einstellen von geringen Partialdrücken, kleinen Oberflächen und kurzen Wechselwirkungszeiten nahezu beliebig kleine Mengen Lösungsmittel eingetragen bzw. auf fes- ten Oberflächen abgeschieden werden. Es können so Wells ge- zielt mit geringen Mengen an Lösungsmitteln gefüllt werden, Konzentrationen geändert werden und Mischungen erstellt wer- den.

Bei Einstellung der Temperatur der Probe leicht oberhalb des Taupunkts können auch gezielt Mischdämpfen mit jeweils de-

finierten Partialdrücken hergestellt werden. Dazu können ver- schiedene Lösungsmittel z. B. in verschiedenen Wells einer Mikro-oder Nanotiterplatte vorgesehen werden, oder es werden zeitlich nacheinander verschiedene Lösungsmittel verdampft.

Auch ein zuverlässiges vorübergehendes Aufbewahren von Pro- ben, insbesondere Flüssigkeitsproben bzw. Lösungen, in offenen Gefäßen, etwa nach Abschluss einer Reaktion oder einer Reakti- onsfolge wie der PCR-Reaktion, kann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erreicht werden.

Schließlich kann das erfindungsgemäße Verfahren auch zum Beschichten von Substraten verwendet werden.

Eine alternative Möglichkeit, Flüssigkeit in die Probe ein- zutragen besteht darin, die Probe mit einem Nebel der Flüssig- keit zu beaufschlagen. Der Nebel besteht aus kleinen Tröpf- chen, die sich auf der Oberfläche der Probe niederschlagen und dadurch die Flüssigkeit aus dem Nebel in die Probe eintragen., Ferner erhöht ein Nebel den Dampfdruck, da der Dampfdruck über den stark gekrümmten Oberflächen kleiner Tröpfchen erhöht ist.

Auf diese Weise lassen sich beispielsweise die Masse, das Volumen oder die Konzentration der Probe regeln, etwa konstant halten. Genauso gut kann die Probe mit Hilfe eines Nebels ver- dünnt werden.

Um den Eintrag der Flüssigkeit durch den Nebel nicht im We- ge der Verdunstung wieder zu verlieren, kann gleichzeitig die Temperatur der Probe auf den Taupunkt des Lösungsmittels in der umgebenden Atmosphäre eingestellt werden.

Ein solcher Nebel kann beispielsweise mit einem Ultra- schall-oder Piezovernebler erzeugt werden.

Der Nebel kann auch aus einem Lösungsmittel mit einer darin gelösten Substanz gebildet werden. Dadurch kann auch eine Sub- stanz in die Probe eingetragen werden. Die Substanz kann bei- spielsweise ein Mononukleotid sein, das zur Synthese von DNA benötigt wird. Ebenso ist mit diesem Verfahren der Eintrag von chemischen Komponenten in das Probenvolumen möglich, wodurch

beispielsweise ein nächster Reaktionsschritt ausgelöst werden kann.

Wie weiter oben erwähnt, dient als Regelgröße das Volumen der Probe und/oder die Konzentration der gelösten Substanz und/oder die in der Probe gelöste Menge der Substanz. Diese Regelgrößen können auf verschiedene Weise direkt oder indirekt bestimmt werden.

Prinzipiell reicht als Regelgröße auch jede indirekte Mess- größe für die genannten Regelgrößen Volumen, Konzentration und Menge. Es reicht also prinzipiell, z. B. lediglich das Gewicht der Probe zu beobachten.

Das Volumen der Probe kann auf unterschiedliche Weise be- stimmt werden, z. B. durch eine optische Messung oder durch eine kapazitive oder induktive Messung sowie durch eine Schwingungsmessung.

Die Konzentration der gelösten Substanz kann ebenfalls durch eine optische Messung-beispielsweise eine Absorptions- oder Fluoreszenzmessung-bestimmt werden. Denkbar ist zur Be- stimmung der Konzentration der gelösten Substanz oder der in der Probe gelöste Menge der Substanz auch eine elektrische Messung, beispielsweise eine Messung der Impedanz oder der Dielektrizitätskonstante der Probe.

Die Vorrichtung zum Ausführen der erfindungsgemäßen Verfah- ren weist zur schnellen und genauen Steuerung der Temperatur einer Mikro-oder Nanotiterplatte eine Negativform mit Vertie- fungen für die Wells der Mikro-oder Nanotiterplatte auf. Die- se Form kann z. B. aus Aluminium oder Kupfer gefertigt werden.

Die Form selbst wird über eine Temperatur-Regeleinrichtung temperiert. Sie kann etwa von temperiertem, zweifach destil- liertem Wasser aus einem Kryostat durchspült werden, oder sie wird von einem Peltierelement oder einer Kombination aus bei- dem gekühlt. Durch den engen Kontakt zwischen den Wells und der Negativform kann die Temperatur der Probe schnell und ge- nau geregelt werden.

Weitere vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen gekennzeichnet.

Im folgenden wird die Erfindung anhand eines Ausführungs- beispiels näher erläutert, das in der Figur schematisch darge- stellt ist. Im einzelnen zeigt : Fig. 1 eine schematische Darstellung einer Vorrichtung zum Steuern des Stoffaustauschs zwischen einer Probe und der die Probe umgebenden Atmosphäre.

Fig. 1 zeigt eine Mikrotiterplatte 10 mit Wells 12, die auf, einer kupfernen Negativform 14 mit Vertiefungen 15 für die Wells 12 angeordnet ist. Über der Mikrotiterplatte 10 befindet sich ein Pipettier-Roboter 16, der Lösungen aus den Wells 12 der Mikrotiterplatte 10 auf einen Objektträger. 18 aufträgt.

Auf dem Objektträger 18 wird auf diese Weise ein DNA-Array aufgebaut.

In der Atmosphäre über der Mikrotiterplatte 10 befindet sich ein Feuchte-und Temperatursensor 20, der mit einem Mik- rocontroller 22 verbunden ist. Der Mikrocontroller 22 berech- net aus den Feuchte-und Temperaturdaten den Taupunkt.

Der Mikrocontroller 22 regelt auch die Temperatur der Mikrotiterplatte 10 über einen Kryostaten 24, mit dem er über eine Leitung 26 kommuniziert. Der Kryostat 24 temperiert die Negativform 14 mit gekühltem Wasser. Das Wasser wird über ei- nen Zulauf 28 und einen Rückfluss 30 zwischen Kryostat 24 und Negativform 14 transportiert.

Außer den Temperatur-und Feuchtewerten der Atmosphäre wird noch von einem Sensor 32 die Temperatur der Mikrotiterplatte 10 gemessen. Das Messsignal wird dem Mikrocontroller 22 über eine Leitung 34 zugeführt.

Ferner wird mit einer Waage 36 das Gewicht der Mikroti- terplatte-zusammen mit der Negativform 14-überwacht. Die

Signale der Waage werden ebenfalls über eine (nicht gezeigte) Leitung zum Mikrocontroller 22 geführt.

Im bevorzugten Ausführungsbeispiel beobachtet der Mikro- controller 22 mit Hilfe der Waage 36, ob Änderungen des Ge- wichts der Mikrotiterplatte 10 auftreten. Verringert sich das Gewicht ohne erkennbaren Grund (etwa Entnahme von Lösung aus den Wells 12 der Mikrotiterplatte 10), so liegt Verdunstung vor. Die Mikrotiterplatte ist also zu warm. Entsprechend sen- det der Mikrocontroller 22 ein Signal an den Kryostaten 24 zum Senken der Temperatur der Mikrotiterplatte.

In einem weiterentwickelten Ausführungsbeispiel prüft der Mikrocontroller 22 ob die Temperatur der Mikrotiterplatte 10 über dem Taupunkt liegt. Ist dies der Fall, sendet der Mikro- controller 22 ein geeignetes Regelsignal über die Leitung 26 an den Kryostaten 24, der daraufhin die Temperatur des Wassers entsprechend senkt, um die Mikrotiterplatte 10 an den Taupunkt heran zu führen.

Das Volumen der Probe, als Regelgröße, kann prinzipiell durch eine Relativmessung ermittelt werden. Die Wells 12 wer- den in einem Spotting-oder Pipettierschritt gefüllt, der ein hinreichend genau bekanntes Volumen vorgibt. Ziel ist es dann, dieses vorgegebene Volumen zu erhalten, evtl. abzüglich eines gewollten Austrags.

Das Volumen der Flüssigkeit in einem Well 12 wird vorzugs- weise durch eine optische Reflexionsmessung bestimmt. Dabei wird die von der Füllhöhen des jeweiligen Wells 12 abhängige Ablenkung vorzugsweise eines Laserstrahls über eine positions- sensitive 4-Quadrantendiode gemessen. Es kann so eine Höhen- auflösung von ca. 10 nm erreicht'werden. Bei einer Quer- schnittsfläche der Wells 12 von 100 um ergibt sich eine Volu- menauflösung von 1 Femtoliter.

Das Volumen kann aber auch optisch über die Abbildungsei- genschaften eines linsenförmigen, transparenten Flüssigkeits- tropfens bestimmt werden, wenn dieser zur Abbildung einer Mehrzahl von Linien verwendet wird. Bei einer Änderung des Vo-

lumens des Tropfens kommt es zu einem Versatz der Linien, aus dem sich bei bekanntem Brechungsindex das Volumen bestimmen lässt.

Das Volumen kann außerdem durch verschiedene elektrische Messungen bestimmt werden. Bei einer kapazitiven Messung des Volumens-bei bekannter Dielektrizitätskonstante-wird das Probenvolumen in das elektrische Feld eines Kondensators ge- bracht. Anschließend wird die Kapazität des Kondensators be- stimmt. Aus der Kapazität kann auf das Volumen der Probe ge- schlossen werden. Dazu kann beispielsweise als Probenvolumen ein Spot auf eine elektrisch leitende Oberfläche gebracht wer- den. Anschließend wird eine Gegenelektrode parallel zu der leitenden Oberfläche ausgerichtet und an diese herangeführt.

Das Gewicht der Probe bzw. der Mikrotiterplatte 10 kann mit einer Präzisionswaage mit einer Genauigkeit von weniger als 10X, ug, ; entsprechend weniger. als 100 nl Wasser, bestimmt wer ;,, den. Eine Gewichtsmessung kann auch dazu verwendet werden, die Menge eines Austrags zu kontrollieren, in dem die Differenz zwischen dem Gewicht vor und nach dem Austrag bestimmt wird.

Möglich ist auch eine Massenbestimmung durch eine Schwin- gungsmessung. Dazu wird die Probe auf der Oberfläche eines Körpers positioniert. Die Masse der Probe kann dann über die Verschiebung der Oberflächen-Schwingungsfrequenz ermittelt werden.

Die Konzentration geladener Spezies in der Lösung lässt sich z. B. durch eine Impedanzmessung bestimmen. Dabei kann die Impedanz durch Variation der Frequenz einer angelegten Wechselspannung Ionen-selektiv bestimmt werden. Aus der Ionen- selektiven Impedanz ergibt sich die Konzentration der einzel- nen Ionen.

Bei Anwesenheit von Chromophoren lässt sich deren Konzent- ration durch eine Absorptionsmessung bestimmen. Bei zusätzli- cher Anwesenheit von Fluorophoren lässt sich die Konzentration über eine Fluoreszenzmessung, vorzugsweise über eine Laser- induzierte-Fluoreszenz (LIF)-Messung, ermitteln.

Fluorophore können auch zur Bestimmung des Volumens einge- setzt werden. Dazu wird dem Volumen ein Fluorophor künstlich zugegeben. Die Probe wird als Ganzes zur Fluoreszenz angeregt.

Ihre Helligkeit wird bestimmt. Über eine Kalibrierkurve kann aus der Helligkeit auf das Volumen geschlossen werden.

In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird zum Wiederauf- füllen der Wells 12 bei erkanntem Gewichtsverlust ein Ver- nebler eingesetzt. Im Vernebler-alternativ auch in einem Inkjet-oder Piezodispenser-werden Tröpfchen mit Volumina von wenigen Picolitern bis mehreren Nanolitern erzeugt.

Der Nebel kann durch Anregung eines Piezoaktuators mit niedrigen oder hohen Frequenzen erzeugt werden. Dabei werden Flüssigkeitsstrahlen hochreproduzierbar in quantifizierbare Tröpfchen zerlegt. Die Anzahl der Tröpfchen kann beim sog.

Single-Shot-Betrieb, bei dem einzelne Tröpfchen wohldefiniert abgegeben werden, genau ermittelt werden. Analog lassen. sich..

Tröpfchen im sog. Bubble-Jet Verfahren auf thermischem Wege erzeugen.

Der Vernebler wird vorzugsweise in unmittelbarer Nähe zu der zu kontrollierenden Substanz aufgestellt, insbesondere dann, wenn andere Bereiche von dem Nebel abzugrenzen sind, was durch geeignete Barrieren erreicht werden kann. Der Vernebler kann aber auch weiter von der Mikrotiterplatte 10 entfernt aufgestellt sein, wenn der Nebel homogen auf verschiedene Pro- ben verteilt werden soll.

Die Nebel-Tröpfchen können unterschiedliche Aufgaben erfül- len : 1. Auffüllen der Wells 12 oder Spots mit reinem Lösungsmit- tel und somit ein Konstanthalten von Volumen und Gewicht. Zu diesem Zweck wird der Nebel aus dem reinen Lösungsmittel er- zeugt.

2. Ein-oder Aufbringen von Reaktionspartnern mit Hilfe des Nebels.

2.1 Eingebracht werden können die Tröpfchen aus dem Nebel in Wells 12 oder auf bereits vorhandene Flüssigkeitströpfchen

bzw. Partikel. Diese können in verschiedenen Medien vorliegen, etwa in festen bzw. Gel-artigen Matrizes oder an Oberflächen gebunden sein oder sich in der Gasphase befinden. In jedem Fall kommt es zu einer Mischung der vorhandenen Tröpfchen mit den Tröpfchen aus dem Nebel.

2.2 Die vorhandenen Tröpfchen können dabei Lösungen enthal- ten, etwa DNA in einer wässrigen Pufferlösung.

2.3 Der Nebel kann zu der vorhandenen Lösung neue Reakti- onspartner einbringen. Diese können beispielsweise Nukleotide oder DNA-, RNA-oder PNA-Fragmente unterschiedlicher Länge sein. Ebenso können es Aminosäuren, Peptide und die ganze Vielfalt der Proteine, wie Enzyme etc., sein. Dementsprechend müssen auch die Lösungsmittel variiert werden, aus denen die Nebeltröpfchen überwiegend bestehen : von Wasser über wässrige Lösungen zu polaren oder amphiphilen Lösungsmitteln.

Im Rahmen der Erfindung sind zahlreiche Abwandlungen und Weiterbildungen der beschriebenen Ausführungsbeispiele ver- wirklichbar.

So ist es beispielsweise möglich, ganze Stapel von Mikro- oder Nanotiterplatten gleichzeitig zu temperieren und damit diese im Stoffaustausch zu kontrollieren. Dazu kann jede ein- zelne Probe, hier also jede Mikro-oder Nanotiterplatte, auf einer Kälteplatte ruhen. Denkbar ist aber auch, dass der Raum, in dem die Proben lagern, insgesamt temperiert wird. Durch ein Kühlen des Raums werden auch die Proben gekühlt. Wird an- schließend Dampf in den Raum eingeleitet, so kondensiert er u. a. auf der Probe.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist nicht auf die Anwendung auf Mikro-oder Nanotiterplatten beschränkt. Es kann für be- liebig geformte Proben eingesetzt werden.

Bezugszeichen 10 Mikrotiterplatte 12 Well 14 kupferne Negativform 15 Vertiefungen 16 Pipettier-Roboter 18 Objektträger 20 Feuchte-und Temperatursensor 22 Mikrocontroller 24 Kryostat 26 Kommunikationsleitung <BR> 28 Zulauf<BR> 30 Rückfluss 32 Temperatursensor 34 Kommunikationsleitung 36 Waage