Beim Dosieren größerer Flüssigkeitsmengen wird üblicherweise der durch Adhäsion an den Oberflächen des Dosiergerätes z. B. einer Meßpipette, anhaftende Flüssig- keitsrest bei der Eichung des Dosiergerätes berücksichtigt, indem das aus dem Dosie- rer auslaufende Volumen bestimmt wird.

Das Dosieren von kleinsten Flüssigkeitsmengen, die ein Volumen in der Größenord- nung von 10-9 bis 10 Liter aufweisen, ist auch heute noch ein Problem, weil bei diesem Dosieren kleiner Flüssigkeitsmengen selbst kleinste Flüssigkeitsverluste be- reits zu erheblichen Abweichungen von der gewünschten Dosiermenge führen.

Solche Flüssigkeitsverluste entstehen z. B. wenn eine Flüssigkeit A mit einer Dosier- vorrichtung, beispielsweise einer Pipettenspitze, von einem Gefäß in einen anderen Behälter übertragen wird und etwas Flüssigkeit an dieser Spitze hängen bleibt, wobei sich die Größe des relativen Dosierfehlers umgekehrt proportional zur Größe der zu dosierenden Flüssigkeitsmenge verhält.

Es hat deshalb nicht an Versuchen gefehlt, verlustfreie Dosierungsverfahren zur Ver- fügung zu stellen. So sind z. B. Dosiervorrichtungen auf dem Markt, die mit Unter- druck arbeiten, um kleine Flüssigkeitsmengen zu dosieren. Aber selbst bei diesen Vorrichtungen entstehen erhebliche Dosierfehler durch Flüssigkeitsverluste. Femer können mit diesen Dosiervorrichtungen keine Flüssigkeitstropfen < I nl dosiert wer- den.

Es stellt sich deshalb die Aufgabe ein genaues Verfahren zum Dosieren kleiner Flüs- sigkeitsmengen einer Flüssigkeit A in eine Flüssigkeit B ohne Flüssigkeitsverlust zur Verfügung zu stellen.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Bereitstellung einer Vorrichtung und eines Verfahrens zum Dosieren kleiner Flüssigkeitsmengen einer Flüssigkeit A und gegebenenfalls darin gelöster Substanzen zu einer zweiten Flüssigkeit B gelöst, bei dem eine Dosierspitze mit einer ultraphoben Oberfläche an vorgegebenen Stellen zunächst mit einer Flüssigkeit A eines definierten Volumens benetzt und danach in einer zweiten Flüssigkeit B reversibel entnetzt wird, so daß die Flüssigkeit A und gegebenenfalls darin gelöste Substanzen vollständig in die Flüssigkeit B übertragen werden.

Gegenstand der Erfindung ist eine Vorrichtung zum Dosieren kleiner Flüssigkeits- mengen einer Flüssigkeit A und gegebenenfalls darin gelöster Substanzen in eine Flüssigkeit B mit wenigstens einer Dosierspitze, dadurch gekennzeichnet, daß die Dosierspitze einen Bereich mit einer Oberfläche mit ultraphober Eigenschaft auf- weist, der durch die Flüssigkeit A benetzbar ist und wobei in dem Bereich eine oder mehrere Vertiefungen mit einem definierten Volumen und/oder eine planare End- fläche, an der ein definiertes Flüssigkeitsvolumen anhaften kann, angebracht sind.

Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Dosieren kleiner Flüssig- keitsmengen einer Flüssigkeit A und gegebenenfalls darin gelöster Substanzen in eine Flüssigkeit B unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung, dadurch gekennzeichnet, daß die Dosierspitze an ihren das Dosiervolumen bestimmenden Stellen mit einer die ultraphobe Oberfläche der Dosierspitze benetzenden Flüssigkeit A benetzt wird und danach die Dosierspitze in einer die ultraphobe Oberfläche nicht benetzenden Flüssigkeit B reversibel entnetzt wird, wobei die Flüssigkeit A vollstän- dig in die Flüssigkeit B übertragen wird.

Eine benetzende Flüssigkeit A im Sinne der Erfindung ist jede beliebige Flüssigkeit, die ultraphobe Oberflächen benetzt. Vorzugsweise ist in der Flüssigkeit A eine zu dosierende Substanz, z. B. ein Wirkstoff gelöst. Besonders bevorzugt ist diese Flüs- sigkeit Dimethylsulfoxid.

Eine Flüssigkeit B im Sinne der Erfindung ist jede beliebige Flüssigkeit, die ultra- phobe Oberflächen nicht benetzt. Vorzugsweise ist diese Flüssigkeit Wasser.

Vorteilhafterweise wird das Be-bzw. Enttnetzen der Dosierspitze (1) durchgeführt, in dem die Dosierspitze in die jeweilige Flüssigkeit eingetaucht und anschließend herausgezogen wird.

Die Dosierspitze im Sinne der Erfindung hat eine beliebige Form, mit einem durch- schnittlichen Durchmesser von vorzugsweise 0,05 bis 10 mm und einer Länge von vorzugsweise 0,05 bis 100 mm.

Vorzugsweise ist die Dosierspitze jedoch ein Draht mit einem bevorzugten Durch- messer von 0,05 bis I mm und einer bevorzugten Länge von 1 bis 50 mm Dosierspitzen können vorteilhafterweise durch spanabhebende Verfahren aus Metall oder durch Mikrostrukturtechnik aus Silizium hergestellt werden.

Diese Silizium-Wafer weisen vorteilhafterweise z. B. eine quaderfömmige Aussparung mit einer Kantenlänge von jeweils 50 pm auf, so daß Flüssigkeitsmengen von 0,125 nl mit dieser Vorrichtung dosiert werden können. Solche quaderfömmigen Ausspa- rungen kann man durch anisotrophes Ätzen von Silizium erzeugen. Nach dem Ätzen wird die Dosierspitze dann mit einem ultraphoben Überzug versehen, der weiter unten näher spezifiziert ist.

Vorzugsweise weist die Vorrichtung größer oder gleich 100, besonders bevorzugt gober oder gleich 1000 Dosierspitzen auf. Vorzugsweise sind diese Dosierspitzen äquidistant, beispielsweise auf einer Platte angeordnet. Der Abstand zwischen den einzelnen Dosierspitzen entspricht dabei z. B. dem Abstand einer Vielzahl von nebeneinander angeordneten Reagenzgläsem. Durch diese Anordnung können z. B. mehr als 1000 Dosierspitzen der erfindungsgemäßen Vorrichtung gleichzeitig in eine oder in verschiedene Flüssigkeit (en) A mit dem/den darin gelösten Wirkstoff (en) ge- taucht werden und die Dosierspitzen dann gleichzeitig in mehr als 1000 Reagenz- gläsern, die mit der/den Flüssigkeit (en) B gefüllt sind, entnetzt werden, so daß die

Flüssigkeit (en) A und damit der oder die Wirkstoff (e) gleichzeitig in mehr als 1000 Versuchslösungen B dosiert werden kann (können). Durch diese Vorgehensweise kann z. B. bei Versuchsreihen im Rahmen der kombinatorischen Chemie sehr viel Zeit gespart werden, weil nicht jedem Reagenzglas einzeln der Wirkstoff dosiert werden muß. Femer können kleinste Volumina < 1 nl der Flüssigkeit A in die Flüs- sigkeit B übertragen werden.

Vorzugsweise wird daher die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Befiillung von Mikrotiterplatten eingesetzt.

Mikrotiterplatten weisen eine Vielzahl von nebeneinander angeordneten Ver- tiefungen auf, die mit Reagentien oder Edukten gefüllt werden.

Die erfindungsgemäße Dosiervorrichtung kann zum Befüllen der Vielzahl von Ver- tiefungen verwendet werden, wenn eine entsprechend ausgewählte Zahl von Dosier- spitzen der Vorrichtung in einen Behälter mit Vorratslösung getaucht und dann in die mit Flüssigkeit gefüllten Vertiefungen der Mikrotiterplatte überführt wird.

In einer bevorzugten Ausfiihrungsform sind die Dosierspitzen Drähte, die einen Durchmesser von 0,05 bis I mm aufweisen und eine Länge von 1 bis 50 mm haben.

Solche Drähte weisen eine vergleichsweise simplere Konstruktion und Handhabung auf als z. B. Mikroliterpipetten. Drähte können zur schnellen Übertragung von kleinsten Probenmengen benutzt werden.

Vorteilhafterweise hat dieser Draht mindestens eine Einbuchtung, die dem Volumen der zu dosierenden Flüssigkeitsmenge entspricht.

Ultraphobe Oberflächen im Sinne der Erfindung zeichnen sich dadurch aus, daß der Kontaktwinkel eines Wassertropfens, der auf der Oberfläche liegt, mehr als 150° beträgt und der Abrollwinkel 10° nicht überschreitet.

Als Abrollwinkel wird hier der Neigungswinkel einer grundsätzlich planaren aber strukturierten Oberfläche gegen die Horizontale verstanden, bei dem ein stehender Wassertropfen des Volumens lOgI aufgrund der Schwerkraft bewegt wird, wenn die Oberfläche geneigt wird.

Solche ultraphoben Oberflächen sind z. B. in den Offenlegungsschriften WO 98/23549, WO 96/04123, WO 96/21523 und WO 96/34697 offenbart, die hiermit als Referenz eingefiihrt werden und somit als Teil der Offenbarung gelten.

In einer bevorzugten Ausfiihrungsform weist die ultraphobe Oberfläche eine Ober- flächentopographie auf, bei der der Wert des Integrales der Funktion S (log f) = a (f) die einen Zusammenhang zwischen den Ortsfrequenzen der einzelnen Fourierkomponenten und deren Amplituden a (f) gibt, zwischen den Integrations- grenzen log (fi/pm-l) =-3 und log (f2/rri 1) = 3, mindestens 0,5, insbesondere mindestens 0,6 beträgt und aus einem ultraphoben Material oder aus einem haltbar ultraphobierten Material besteht. Eine solche ultraphobe Oberfläche ist in der unver- öffentlichten internationalen Patentanmeldung mit dem Aktenzeichen PCT/99/10322 beschrieben.

Bevorzugt ist die ultraphobe Oberfläche eine Aluminium-Oberfläche, die mit Mikro- strukturen versehen, eloxiert, gegebenenfalls gesealt, kalziniert, gegebenenfalls mit einer Haftvermitlerschicht beschichtet und anschließend mit einem hydrophoben und/oder oleophoben Überzug versehen wird, so wie es in der unveröffentlichten deutschen Patentanmeldung mit dem Aktenzeichen 19 860 137.9 beschrieben ist.

Die Dosierspitze kann insgesamt aus Aluminium gefertigt sein oder weist vorzugs- weise einen Aluminium-Überzug auf, wobei das Aluminium, wie oben angegeben behandelt wird.

Ebenfalls bevorzugt ist die ultraphobe Oberfläche eine Aluminium-Oberfläche, die gegebenenfalls anodisch oxidiert, mit heißem Wasser oder Wasserdampf gesealt, ge- gebenenfalls mit einer Haftvermittlerschicht beschichtet und anschließend mit einem

hydrophoben und/oder oleophoben Überzug versehen wird, so wie es in der unver- öffentlichten deutschen Patentanmeldung mit dem Aktenzeichen 19 860 138.7 be- schrieben ist. Die Dosierspitze kann insgesamt aus Aluminium gefertigt sein oder weist vorzugsweise einen Aluminium-Überzug auf, wobei das Aluminium, wie oben angegeben behandelt wird.

Weiterhin bevorzugt ist die ultraphobe Oberfläche eine Oberfläche, die mit Ni (OH) 2 -Partikeln beschichtet, gegebenenfalls mit einem Haftvermittler überzogen und an- schließend mit einem hydrophoben und/oder oleophoben Überzug versehen wird, so wie es in der unveröffentlichten deutschen Patentanmeldung mit dem Aktenzeichen 19 860 139.5 beschrieben ist. Vorzugsweise haben die Ni (OH) 2-Partikel einen Durchmesser d50 von 0,5 bis 20 pm.

In einer weiteren vorteilhaften Anwendungsform ist die ultraphobe Oberfläche aus Wolframcarbid, das mit einem Laser strukturiert, gegebenenfalls mit einem Haftver- mittler beschichtet und anschließend mit einem hydrophoben und/oder oleophoben Überzug versehen wird, so wie es in der unveröffentlichten deutschen Patentanmel- dung mit dem Aktenzeichen 19 860 135.2 beschrieben ist. Vorzugsweise wird die Dosierspitze nur mit Wolframcarbid beschichtet, das dann wie oben angegeben be- handelt wird. Vorzugsweise hat das Wolframcarbid eine Schichtdicke von 10 bis 500 pm.

Außerdem bevorzugt wird die Oberfläche mit einem Strahlmittel gesandstrahlt, gegebenenfalls mit einer Haftvermittlerschicht beschichtet und anschließend mit einem hydrophoben und/oder oleophoben Überzug versehen, wie es in der unver- öffentlichten deutschen Patentanmeldung mit dem Aktenzeichen 19 860 140.9 be- schrieben ist.

Als hydrophober und/oder oleophober Überzug der genannten Oberflächen eignen sich alle grenzflächenaktiven Phobierungshilfsmittel mit beliebigen Molmassen. Bei diesen Verbindungen handelt es sich um kationische, anionische, amophotere und/oder nicht-ionische grenzflächenaktive Verbindungen, wie sie z. B. im Verzeich-

nis"Surfactants Europa, A Dictionary of Surface Active Agents available in Europe, Edited by Gordon L. Hollis, Royal Socity of Chemistry, Cambridge, 1995 aufgeführt werden.

Als anionische Phobierungshilfsmittel sind beispielsweise zu nennen : Alkylsulfate, Ethersulfate, Ethercarboxylate, Phosphatester, Sulfosucinate, Sulfosuccinatamide, Paraffinsulfonate, Olefinsulfonate, Sarcosinate, Isothionate, Taurate und Lingni- nische Verbindungen.

Als kationische Phobierungshilfsmittel sind beispielsweise quartemäre Alkylammo- niumverbindungen und Imidazole zu nennen.

Amphotere Phobierungshilfsmittel sind zum Beispiel Betaine, Glycinate, Propionate und Imidazole.

Nichtionische Phobierungshilfsmittel sind beispielsweise : Alkoxylate, Alkylamide, Ester, Aminoxide und Alkylpolyglykoside. Weiterhin kommen in Frage : Umset- zungsprodukte von Alkylenoxiden mit alkylierbaren Verbindungen, wie z. B. Fett- alkoholen, Fettaminen, Fettsäuren, Phenolen, Alkylphenolen, Arylalkylphenolen, wie Styrol-Phenol-Kondensate, Carbonsäureamiden und Harzsäuren.

Besonders bevorzugt sind Phobierungshilfsmittel bei denen I bis 100 %, besonders bevorzugt 60 bis 95 % der Wasserstoffatome durch Fluoratome substituiert sind. Bei- spielhaft seien perfluoriertes Alkylsulfat, perfluorierte Alkylsulfonate, perfluorierte Alkylphosphonate, perfluorierte Alkylphosphinate und perfluorierte Carbonsäuren genannt.

Bevorzugt werden als polymere Phobierungshilfsmittel zur hydrophoben Beschich- tung oder als polymeres hydrophobes Material für die Oberfläche Verbindungen mit einer Molmasse MW>500 bis 1.000.000, bevorzugt 1.000 bis 500.000 und besonders bevorzugt 1500 bis 20.000 eingesetzt. Diese polymeren Phobierungshilfsmittel können nichtionische, anionische, kationische oder amphotere Verbindungen sein.

Femer können diese polymeren Phobierungshilfsmittel Homo-und Copolymerisate, Pfropf-und Pfropfcopolymerisate sowie statistische Blockpolymere sein.

Besonders bevorzugte polymere Phobierungshilfsmittel sind solche vom Typ AB-, BAB-und ABC-Blockpolymere. In den AB-oder BAB-Blockpolymeren ist das A- Segment ein hydrophiles Homopolymer oder Copolymer, und der B-Block ein hy- drophobes Homopolymer oder Copolymer oder ein Salz davon.

Besonders bevorzugt sind auch anionische, polymere Phobierungshilfsmittel, insbe- sondere Kondensationsprodukte von aromatischen Sulfonsäuren mit Formaldehyd und Alkylnaphthalinsulfonsäuren oder aus Formaldehyd, Naphthalinsulfonsäuren und/oder Benzolsulfonsäuren, Kondensationsprodukte aus gegebenenfalls substitu- iertem Phenol mit Formaldehyd und Natriumbisulfit.

Weiterhin bevorzugt sind Kondensationsprodukte, die durch Umsetzung von Naphtholen mit Alkanolen, Anlagerungen von Alkylenoxid und mindestens teilwei- ser Überführung der terminalen Hydroxygruppen in Sulfogruppen oder Halbester der Maleinsäure und Phthalsäure oder Bernsteinsäure erhältlich sind.

In einer anderen bevorzugten Ausführung ist das Phobierungshilfsmittel aus der Gruppe der Sulfobernsteinsäureester sowie Alkylbenzolsulfonate. Weiterhin bevor- zugt sind sulfatierte, alkoxylierte Fettsäuren oder deren Salze. Als alkoxylierte Fett- säurealkohole werden insbesondere solche mit 5 bis 120, mit 6 bis 60, ganz beson- ders bevorzugt mit 7 bis 30 Ethylenoxideinheiten versehene C6-C22-Fettsäurealko- hole, die gesättigt oder ungesättigt sind, insbesondere Stearylalkohol, verstanden. Die sulfatierten alkoxylierten Fettsäurealkohole liegen vorzugsweise als Salz, insbeson- dere als Alkali-oder Aminsalze, vorzugsweise als Diethylaminsalz vor.

Bevorzugte Anwendungsgebiete für das erfindungsgemäße Verfahren und die erfin- dungsgemäßen Vorrichtung sind biochemische oder chemische Verfahren, bei denen mikroskopische Flüssigkeitsmengen bewegt, vermischt oder dosiert werden müssen.

Als Beispiele seien hier envähnt :

Die Polymerasekettenreaktion PCR (polymerase chain reaction), ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) oder die Bestimmung von Enzymaktivitäten.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist einfacher durchzuführen als die konventionelle Mikrodosierung mit Hilfe von z. B. Mikroliterpipetten mittels Ansaugen und Aus- drücken der Flüssigkeit aus der Pipette. Durch die reversible Entnetzung der Dosier- spitze ist die Dosierung von kleinsten Flüssigkeitsmengen ohne Verluste möglich.

Dadurch können Dosierfehler vermieden werden. Die erfindungsgemäße Vor- richtung ist einfach und preiswert herzustellen. Mit der erfindungsgemäßen Vor- richtung können gleichzeitig mehr als 1000 Tropfen einer Flüssigkeit A in dieselbe Anzahl an Gefäßen, die mit einer Flüssigkeit B gefüllt sind, übertragen werden. Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung können Flüssigkeitstropfen mit einem Volumen < 1 nl dosiert werden. Die erfindungsgemäße Vorrichtung weist keine Pumpe oder sonstige Ansaugmechanismen auf, so daß keinerlei Verschleiß entsteht.

Im folgenden wird die erfindungsgemäße Vorrichtung anhand der Figuren 1 und 2 beispielhaft erläutert.

Es zeigen : Figur 1 einen Längsschnitt durch eine Dosierspitze 1 mit einer Vertiefung 2 Figur 2 einen Längsschnitt durch eine Dosierspitze 1 mit einer benetzten End- fläche 3

Beispiele Beispiel 1 Figur 1 zeigt die Dosierspitze ausgeftihrt als Draht 1, der einen Durchmesser von 1 mm und eine Länge von 10 mm aufweist. Der Draht 1 weist eine umlaufende Ein- schnürung 2 auf, die als Meßvolumen dient. Der Draht wurde aus V4A Stahl gefer- tigt, der durch Sandstrahlen und Beschichten mit einem hydrophoben Überzug im Bereich 6 behandelt worden ist.

Dafür wurde diese Dosierspitze I mit einem 3-Kammer-Strahlgerät (Typenbezeich- nung : Kermo 3) der Firma Renfert GmbH, D-78245 Hilzingen gesandstrahlt. Als Strahlmittel wurde Korund der Firma Renfert eingesetzt. Es handelte sich um ein ungebrauchtes Strahlmittel mit einem A1203-Anteil < 99,5 Gew-% und einer mitt- leren Komgröße von 125 um. Als Strahldüse wurde eine Runddüse mit einem Durchmesser von 1,2 mm der Firma Renfert verwendet. Die Dosierspitze 1 wurde mit 5 bar gesandstrahlt, wobei der Abstand der Runddüse von der Dosierspitze 1 1,5 cm betrug und die Strahldüse rasterförmig um die Dosierspitze 1 herum geführt wurde. Die Behandlung wurde 1 Minute lang durchgeführt Die so behandelte Dosierspitze I wurde mit einer etwa 50 nm dicken Goldschicht durch Zerstäubung beschichtet. Dieses Beschichtungsverfahren entspricht dem Ver- fahren, das auch für die Präparation in der Elektronenmikroskopie üblich und bei Klaus Wetzig, Dietrich Schulze,"In situ Scanning Electron Microscopy in Material Research", Seite 36-40, Akademie Verlag, Berlin 1995 beschrieben ist. Diese Lite- raturstelle wird hiermit als Referenz eingeführt und ist somit als Teil der Offenba- rung zu betrachten.

Schließlich wurde die Goldschicht der Probe 24 Stunden mit einigen Tropfen einer Lösung von n-Perfluoroktanthiol in a, a, a-Trifluortoluol (I g/l) bei Raumtemperatur in einem geschlossenem Gefäß beschichtet, anschließend mit a, a, a-Trifluortoluol gespült und getrocknet.

Auf einer solchen Oberfläche hat ein Wassertropfen (entnetzende Fliissigkeit B) einen Randwinkel von 165°. Gleichzeitig hat ein Tropfen Dimethylsulfoxid (Flüs- sigkeit A) auf dieser Oberfläche einen Randwinkel von 94° und benetzt diese somit.

Ferner weist der Draht die Einbuchtung 2 auf, deren Volumen (gestrichelt darge- stellt) dem zu dosierenden Volumen der Flüssigkeit 5 entspricht. Durch die Form der Einbuchtung füllt die Flüssigkeit 5 diese Einbuchtung vollständig aus, so daß mit dem Draht eine sehr exakte Flüssigkeitsmenge 5 in ein Gefäß, das mit Flüssigkeit B gefüllt ist, dosiert werden kann.

Beispiel 2 Figur 2 zeigt einen Draht ähnlich dem aus Beispiel 1 jedoch ohne Einbuchtungen.

Die Oberfläche des Drahtes wurde wie bei Figur 1 beschrieben behandelt. In diesem Fall haftet der Flüssigkeitstropfen an der Endfläche 3 des Drahtes. Dadurch, daß der Tropfen 4 (gestrichelt dargestellt), der an der Spitze des Drahtes hängt, die Form einer Halbkugel aufweist, kann dessen Volumen unter einem Mikroskop einfach be- stimmt werden. In diesem Fall wird die Größe des zu dosierenden Tropfens durch die Wahl des Durchmessers variiert.

Ein Draht gemäß Figur 2 mit einer Länge von 0,5 mm und einem Durchmesser von 0,1 mm wurde in eine Lösung des Farbstoffs 4- (6-Diethylamino-3-diethylimino-3H- xanthe-9-yl)-1,3-benzodisulfonsäure (Kiton Rot) in Dimethylsulfoxid bis zu einer Tiefe von 0.2 mm eingetaucht. Die Konzentration des Farbstoffs wurde zuvor pho- tometrisch bestimmt und beträgt bei einer Wellenlänge von 560 nm 3.2 x 102 mol/1.

Anschließend wurde die Dosierspitze 1 in eine Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit einem Probenvolumen von 64 gl Wasser (dosiert mit einer Mikroliterpipette der Fa.

Brand, Meßbereich 1-100 p1) bis zu einer Tiefe von 0.4 mm eingetaucht. Die Farb- stoffkonzentration im Wasser wurde anschließend photometrisch zu 1.25 x 10-7 mol/1 bestimmt. Dies entspricht einem durch die Dosierspitze I übertragenen Volumen von

V = 0.254 nl. Die Dosierung wurde 30 mal in gleicher Weise durchgeführt, wobei sich ein übertragenes Volumen von V = (0.260 0.007) nl (Standardabweichung), entsprechend einem Dosierfehler von AV/V = 2.7 %, ergibt.