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Patent Searching and Data


Title:
METHOD FOR DIAGNOSING NEOPLASMS
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2003/093825
Kind Code:
A1
Abstract:
Disclosed is a method for the early detection of neoplasms in a patient and for assessing the danger represented by developing and/or spreading malignant neoplasms. The inventive method is characterized by the fact that the presence and quantity of antibodies (i) which bond to ganglioside structures and antigen structures simulating ganglioside structures, and (ii) the presence of which and/or the quantities of highly sensitive antibodies being significantly greater than in normal individuals correlating with the existence of a neoplasm and/or the patient's health being jeopardized by malignant neoplasms, is determined in a biological sample of the patient by using an assay that is highly sensitive to the antibodies that are to be determined.

Inventors:
BERGMANN ANDREAS (DE)
Application Number:
PCT/EP2003/003552
Publication Date:
November 13, 2003
Filing Date:
April 04, 2003
Export Citation:
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Assignee:
BRAHMS AG (DE)
BERGMANN ANDREAS (DE)
International Classes:
C07K16/30; G01N21/78; G01N33/53; G01N33/533; G01N33/564; G01N33/574; (IPC1-7): G01N33/574; G01N33/564
Other References:
KONSTANDOULAKIS M M ET AL: "AUTOANTIBODIES IN THE SERUM OF PATIENTS WITH GASTRIC CANCER: THEIR PROGNOSTIC IMPORTANCE", HYBRIDOMA, LIEBERT, NEW YORK, NY, US, vol. 17, no. 5, October 1998 (1998-10-01), pages 431 - 435, XP008008268, ISSN: 0272-457X
LEWARTOWSKA ALEKSANDRA ET AL: "Ganglioside reactive antibodies of IgG and IgM class in sera of patients with differentiated thyroid cancer.", IMMUNOLOGY LETTERS, vol. 80, no. 2, 1 February 2002 (2002-02-01), pages 129 - 132, XP001113115, ISSN: 0165-2478
ESCANDE-BEILLARD NATHALIE ET AL: "A sensitive flow cytometry method for anti-GM1 antibodies detection.", JOURNAL OF NEUROIMMUNOLOGY. NETHERLANDS APR 2002, vol. 125, no. 1-2, April 2002 (2002-04-01), pages 163 - 169, XP001113027, ISSN: 0165-5728
BECH E ET AL: "ELISA-type titertray assay of IgM anti-GM1 autoantibodies.", CLINICAL CHEMISTRY. UNITED STATES JUL 1994, vol. 40, no. 7 Pt 1, July 1994 (1994-07-01), pages 1331 - 1334, XP001108903, ISSN: 0009-9147
Attorney, Agent or Firm:
Andrae, Steffen (Balanstrasse 55, München, DE)
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Claims:
Patentansprüche
1. Verfahren zur Früherkennung von Neoplasmen bei einem Patienten und zur Abschätzung seiner Gefährdung durch eine Ausbildung und/oder Ausbreitung maligner Neoplasmen, dadurch gekennzeichnet, dass man in einer biologischen Probe des Patienten unter Verwendung eines Assays hoher Sensitivität für die zu bestimmenden Antikörper, die Anwesenheit und Menge von Antikörpern bestimmt, die (i) an Gangliosidstruk turen und an Gangliosidstrukturen simulierende Antigenstruk turen binden und (ii) deren Anwesenheit und/oder deren gegenüber Normalpersonen signifikant erhöhte Mengen mit hoher Sensitivität mit dem Vorliegen eines Neoplasmas und/ oder einer Gefährdung des Patienten durch maligne Neoplasmen korrelieren.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man in einer Körperflüssigkeit des Patienten an AsialoGM1 (AGM1) und/oder MonosialoGM1 (GM1) bindende Antikörper (anti AGM1Antikörper und/oder antiGM1Antikörper) vom IgGund/ oder IgATyp bestimmt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich net, dass man an AGM1 bindende Antikörper bestimmt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man die Antikörperbestimmung mit Hilfe eines LigandenBindungsassays (Immunoassays) vom Sandwichtyp oder vom kompetitiven Typ durchführt.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man man die Antikörperbestimmung mit Hilfe eines Liganden bindungsAssays unter Verwendung eines mit einem Chemilumi neszenzMarkierungsmolekül markierten Reagens durchführt.
6. Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, da durch gekennzeichnet, dass man den Nachweis der Antikörper mit einem Nachweis von Neoplasmen, die einer Krebserkrankung eines inneren Organs oder einer metastasierenden Krebser krankung zuzuordnen sind, korreliert.
7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Krebserkrankung ein ColonKarzinom, ein MammaKarzinom, ein OvarialKarzinom, ein MagenKarzinom, ein Pankreas Karzinom, ein ÖsophagusKarzinom, ein GallenKarzinom, ein LeberKarzinom, ein CZellKarzinom, ein SchilddrüsenKarzi nom, ein ProstataKarzinom, ein LungenKarzinom, ein Appen dixKarzinom, ein BlasenKarzinom, ein CardiaKarzinom, ein Karzinom des distalen Verophagus, ein MundbodenKarzinom, ein NierenKarzinom oder ein Oberbauchkarzinom ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Patient ein Patient mit einer ent zündlichen Darmerkrankung ist und der Nachweis von signifi kant erhöhten Mengen von an AGM1 und/oder GM1 bindenden Anti körpern mit einem erhöhten DarmkrebsRisiko bei diesem Patienten korreliert wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass man vor der Messung und/oder bei der Auswertung der erhaltenen Meßergebnisse bei dem Patienten Neuropathien, die von erhöhten Titern von an AGM1 oder GM bindenden Antikörpern begleitet sind, ausschließt.
10. Verwendung von an AGM1 bindenden Autoantikörpern vom IgGund/oder IgATyp als universelle Marker für die Früh erkennung und Prognose von malignen neoplastischen Erkran kungen und für die Abschätzung des Risikos eines Patienten, dass sich bei ihm eine maligne neoplastische Erkrankung entwickelt.
Description:
Verfahren zur Diagnose von Neoplasmen Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnose von Neo- plasmen bei einem menschlichen Patienten, insbesondere zu deren Früherkennung, sowie zur Abschätzung der Gefährdung eines menschlichen Patienten durch eine Ausbildung und/oder Ausbreitung maligner Neoplasmen, indem man in einer biologi- schen Probe eine"universelle Krebs-Markersubstanz"be- stimmt.

Die erfindungsgemäß bestimmte Markersubstanz ist eine humo- rale Markersubstanz, die mit sehr hoher Sensitivität (rich- tiger Erkennung von Proben von Kranken) das Vorhandensein von Neoplasmen bei Patienten anzeigt und darüber hinaus zusätzlich auch eine besondere Gefährdungslage/Prognose für Patienten, bei denen sich derartige Neoplasmen noch nicht klinisch manifestieren, die jedoch aufgrund z. B. ihrer Lebensumstände (z. B. einer beruflichen Exposition ; Rauchen) und/oder einer Vorerkrankung und/oder medizinischen Behand- lung einem besonderen statistischen Risiko ausgesetzt sind, eine maligne neoplastische Erkrankung zu entwickeln.

Der Begriff"Neoplasma"wird im Rahmen der vorliegenden Anmeldung als Oberbegriff bzw. Synonym für Tumoren, ins- besondere bösartige Tumoren, verwendet, wie sie für Krebs- erkrankungen (Karzinome) typisch sind. An bösartigen Neubil- dungen (malignen Neoplasmen), d. h. Krebs, sind in einem Land wie Deutschland pro Jahr mehr als 300.000 Männer und Frauen erkrankt, wobei die Zahl der jährlich diagnostizierten neuen Krebsfälle sowie die Sterblichkeit erheblich sind (vgl. (1) ; in der nachfolgenden Beschreibung werden generell Querver- weise auf Quellen als in Klammern gesetzte Zahlen angegeben ; die Zahlen beziehen sich auf die Literaturliste am Ende der Beschreibung). Maligne Neoplasmen können in nahezu jedem Gewebe bzw. Organ entstehen, und je nach betroffenem Organ unterscheidet man zahlreiche Krebserkrankungen, die sich im Hinblick auf ihre statistische Häufigkeit, Prognose und Therapierbarkeit erheblich voneinander unterscheiden können.

In den letzten Jahren wurde eine Vielzahl von Therapien ent- wickelt, die im Hinblick auf die Heilbarkeit zahlreicher Formen von Krebserkrankungen erhebliche Fortschritte mit sich gebracht haben. In allen Fällen gilt jedoch, dass die Heilungschancen von Krebserkrankungen stets besser werden, je früher die Krebserkrankung erkannt wird. Ganz besonders wichtig ist dabei eine Früherkennung von Krebs, d. h. eine Erkennung von Neoplasmen, zu einem Zeitpunkt, zu dem noch keine oder noch keine signifikanten klinischen Symptome auftreten.

Zur möglichst frühen Erkennung von Neoplasmen in der klini- schen Diagnose werden in biologischen Proben, insbesondere Blutproben und Körpersekreten, von untersuchten Patienten sog. "Tumormarker"bestimmt. Tumormarker sind Substanzen, die entweder von malignen Tumorzellen direkt gebildet werden oder die dadurch entstehen, dass Tumorzellen die Synthese des jeweiligen Markers in Nicht-Tumorzellen induzieren.

Werden Tumormarker in erhöhter Konzentration in flüssigen biologischen Proben (humorale Tumormarker) bzw. im Gewebe lokalisiert (zelluläre Tumormarker), ermöglichen sie Schlüs- se auf das Vorliegen, den Verlauf und die Prognose einer Tumorerkrankung. Die derzeit in der klinischen diagnosti- schen Praxis eingeführten Tumormarker können onkofetale Antigene, mit monoklonalen Antikörpern erkennbare Kohlenhy- dratepitope, Enzyme, Isoenzyme, onkogene Produkte und Rezep- toren sein. Ein Überblick über die derzeit in der klinischen Diagnostik genutzten Tumormarker findet sich in (2).

Allen derzeit bestimmten Tumormarkern ist gemeinsam, dass sie einerseits eine relativ hohe Organspezifität aufweisen, dass die Sensitivität ihrer Bestimmung jedoch gleichzeitig relativ beschränkt ist. Die relativ hohe Organspezifität der gegenwärtig bestimmten Tumormarker hat einerseits den Vor- teil, dass man bei ihrem Nachweis gleichzeitig eine Informa- tion über das Organ erhält, bei dem die ursächliche Krebs- erkrankung mit hoher Wahrscheinlichkeit aufgetreten ist. Die hohe Spezifität ist jedoch insofern ein Nachteil, als Krebs- erkrankungen anderer Organe bei der Bestimmung organspezifi- scher Tumormarker nicht erkennbar werden bzw. für eine umfassende Krebsfrüherkennung die gleichzeitige Bestimmung zahlreicher verschiedener Tumormarker erforderlich ist. Die relativ geringe Sensivität der Bestimmung der bekannten Tumormarker (bei einer hohen Sensitivität einer Bestimmung werden die meisten oder alle Erkrankten richtig erkannt), die je nach Krebserkrankung und Tumormarker zwischen 20 und 80% liegt, hat zur Folge, dass die Gefahr einer Nichterken- nung von Krebserkrankungen trotz der Bestimmung der an sich dafür geeigneten Tumormarker immer noch recht hoch ist.

Angesichts der skizzierten Situation wäre es außerordentlich wünschenswert, ein Verfahren zur Hand zu haben, das mit einer sehr hohen Sensitivität zuverlässige Hinweise auf das Vorliegen irgendeiner Tumorerkrankung (d. h. maligner Neo- plasmen) liefert, so dass dann, ggf. unter zusätzlicher Berücksichtigung des klinischen Bilds des untersuchten Patienten zur Vermeidung von Fehlinterpretationen der Mess- ergebnisse, ggf. weitere diagnostische Maßnahmen zur genaue- ren Lokalisierung und differenzialdiagnostischen Bestimmung der nachgewiesenen neoplastischen Erkrankung gerechtfertigt sind. Gleichzeitig sollten bei einem solchen Verfahren Gesunde im Normalfall als solche erkennbar sein, so dass ein diagnostischer Fehlalarm möglichst vermieden werden kann.

Derzeit existiert noch kein Verfahren, das die geschilderten Anforderung erfüllt, und angesichts der hohen Spezifitäts- und Sensivitätsunterschiede der bisher bekannten Tumormarker bestand auch wenig Anlaß zu der Hoffnung, dass ein univer- seller, hochsensitiver Tumormarker mit einer geringen Organ- spezifität überhaupt existiert und für die klinische Diagno- stik nutzbar gemacht werden kann.

Die vorliegende Erfindung beruht auf der außerordentlich überraschenden Feststellung, dass ein bestimmter, an sich aus anderen Zusammenhängen bekannter Antikörper bzw. Auto- antikörper, soweit derzeit experimentell überprüfbar war, bei allen getesteten malignen Neoplasmen (Krebsarten) in biologischen Proben, insbesondere Patientenseren, diagno- stisch signifikant erhöht gefunden wird, während der gleiche Antikörper bei gesunden Normalpersonen nicht oder nur in deutlich geringeren Mengen nachweisbar ist. Durch die Be- stimmung dieses Antikörpers wird es gemäß der vorliegenden Erfindung möglich, bei Patienten oder Personen, die sich einer Routineuntersuchung unterziehen oder an einer Reihen- untersuchung teilnehmen, mit hoher Zuverlässigkeit das Vorliegen maligner Neoplasmen zu erkennen, ohne dass eine signifikante Anzahl von gesunden Normalpersonen falsch positiv ermittelt wird. Soweit der bestimmte Antikörper auch bei einigen speziellen anderen Erkrankungen in erhöhten Konzentrationen auftritt, ist in der Regel eine korrekte Interpretation der Meßergebnisse aufgrund zusätzlicher klinischer Befunde ohne größere Schwierigkeiten möglich.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird somit ein Verfahren geschaffen, das als Verfahren zur Diagnose, insbesondere zur Frühdiagnose, von Neoplasmen bei einem Patienten und zur Abschätzung seiner Gefährdung durch eine Ausbildung und/oder Ausbreitung maligner Neoplasmen bezeichnet werden kann, bei dem man in einer biologischen Probe des Patienten die Anwe- senheit und Menge von Antikörpern bestimmt, die an Ganglio- sidstrukturen und an Gangliosidstrukturen simulierende Antigenstrukturen binden, und zwar spezieller von an Mono- sialo-GM1 bindenden Antikörpern (anti-GM1-Antikörpern) und/- oder an Asialo-GM1 bindenden Antikörpern (anti-AGM1-Antikör- pern) vom IgG-und/oder IgA-Typ, und die Anwesenheit der- artiger Antikörper und/oder ihre gegenüber Normalpersonen signifikant erhöhe Menge mit dem Vorliegen eines Neoplasmas und/oder einer erhöhten Gefährdung des Patienten durch maligne Neoplasmen korreliert.

Vorzugsweise ist das erfindungsgemäße Verfahren gemäß den Ansprüchen 2 und 3 ein Verfahren, bei dem bei der Messung an GMl-und/oder AGM1 bindende Antikörper vom IgG-und/oder IgA- Typ zuverlässig und mit hoher Sensitivität erfaßt werden.

Vorteilhafte Varianten und Ausgestaltungen des erfindungs- gemäßen Verfahrens werden durch die nachfolgenden Ansprüche 4 bis 9 hervorgehoben.

Ein besonders wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung kann als Verwendung von an AGm, bindenden Autoantikörpern vom IgG-und/oder IgA-Typ als universelle Marker für die Früh- erkennung und Prognose von malignen neoplastischen Erkran- kungen und für die Abschätzung des Risikos eines Patienten, dass sich bei ihm eine maligne neoplastische Erkrankung entwickelt, zusammengefaßt werden.

Nachfolgend werden die Auffindung des erfindungsgemäßen Dia- gnoseverfahrens unter Präsentation der diesem Verfahren zu- grundeliegenden Meßwerte sowie eine derzeit bevorzugte Art seiner praktischen Durchführung noch in näheren Einzelheiten erläutert. Anschließend werden eine Deutung und ex-post- Plausibilisierung des erfindungsgemäßen Verfahrens im Lichte wissenschaftlicher Veröffentlichungen, die mit dem Gegen- stand der vorliegenden Erfindung in einen Zusammenhang gebracht werden können, gegeben, die zeigen, dass die erfin- dungsgemäße Bestimmung von anti-Gangliosid-Antikörpern bzw.

Autoantikörpern, insbesondere von solchen der genannten Art, auch für eine neue Deutung der Krebsentstehung bzw.-ent- wicklung hoch bedeutsam ist, wobei die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegenden Befunde klare Hinweise auf neue therapeutische Ansätze zur Krebsprävention, Krebshemmung sowie ggf. Krebstherapie liefern.

Die vorliegende Erfindung ist ein Ergebnis der intensiven Forschungen der Anmelderin auf dem Gebiet der klinischen Diagnose von Autoimmunerkrankungen. Sie geht aus von der bekannten Erkenntnis, dass zu den Antikörpern, die in der Literatur im Zusammenhang mit Autoimmunerkrankungen, ins- besondere nervenschädigenden, neuropathischen Autoimmuner- krankungen, diskutiert werden, auch bestimmte Anti-Ganglio- sid-Antikörper gehören.

Ganglioside sind Glykolipide, die Bestandteile der extrazel- lulären Seite der Plasmamembran tierischer Zellen sind und als solche auch im Nervengewebe auftreten. Sie enthalten pro Mol mehrere Monosaccharid-Einheiten, jedoch keinen Phosphor- Gehalt und werden den Sphingolipiden zugeordnet. Verglichen mit Proteinen sind sie eher niedermolekulare Biomoleküle.

Die Ganglioside, an die die im Rahmen der vorliegenden Erfindung diskutierten Antikörper binden, sind das allgemein als GM1 bezeichnete Monosialo-Gangliosid bzw. die zugehörige "Asialo"-verbindung AGM1. GM1 weist eine Polysaccharidkette aus 4 Zucker-Monomereinheiten auf, die zwei D-Galactoseein- heiten, eine N-Acetylgalactosamin-und eine D-Glucoseeinheit umfassen, wobei letztere an einen Ceramidteil gebunden ist.

An die innerhalb der Polysaccharidkette angeordnete D-Galac- toseeinheit ist bei dem Gangliosid GEL ein N-Acetylneuramin- säurerest (NANA ; Sialsäure-oder o-Sialinsäurerest ;"Mono- sialo"-Rest) gebunden, der bei dem sialinsäurefreien Asialo- GM1 (AGM1) fehlt.

Die genannten Ganglioside und verwandte Verbindungen werden mit zahlreichen wichtigen biologischen Funktionen des menschlichen Körpers in Zusammenhang gebracht, zu denen z. B. das exonale Wachstum und die neuronale Diffenzierung, Rezep- torenfunktionen und Beteiligungen an verschiedenen Immun- reaktionen des Körpers sowie an der Signaltransduktion und Zell-Zell-Erkennung gehören. Es wird in diesem Zusammenhang beispielsweise verwiesen auf (14 bis 26).

Es ist seit langem bekannt, dass im menschlichen Körper Antikörper bzw. Autoantikörper auftreten können, die an die genannten und verwandte Ganglioside binden. Deren physio- logische Rolle sowie ihre eventuelle Bedeutung für die klinische Diagnostik ist Gegenstand zahlreicher wissen- schaftlicher Untersuchungen.

Der weitaus überwiegende Teil aller veröffentlichten Arbei- ten befaßt sich mit der Rolle und der diagnostischen Signi- fikanz von Anti-Gangliosid-Antikörpern bei Neuropathien, z. B. bei immunvermittelten motorischen Neuropathien wie dem Guillain-Barre-Syndrom (Radikuloneuritis, Polyradikulitis) und dem verwandten (Miller-) Fisher-Syndrom (vgl. z. B. 27 bis 43 ; 63). Auch im Zusammenhang mit der Alzheimer-Erkrankung wurde bereits von einem vermehrten Auftreten von Anti-GM1- Autoantikörpern bei einigen Patienten berichtet (42). Ferner wurden sie bei einzelnen HIV-Patienten gefunden (55 bis 57).

Von einzelnen Versuchen ihrer Bestimmung im Zusammenhang mit bestimmten Krebsarten wurden ebenfalls berichtet (58 bis 60), wobei jedoch nur wenig aussagekräftige Ergebnisse bzw.

Ergebnisse mit einer niedrigen Sensitivität erhalten wurden, worauf nachfolgend noch genauer einzugehen sein wird.

Studiert man die einschlägigen Veröffentlichungen genauer, fällt bei aller Ähnlichkeit der Beobachtungen auf, dass die Befunde und Aussagen bezüglich der zu beobachtenden Mengen- die in der Regel eher gering sind-und Typen der verschie- denen (Auto) -Antikörper bei den verschiedenen Patienten im einzelnen relativ stark voneinander abweichen. Das führte bereits zu dem Schluss, dass die Bestimmung derartiger Anti- körper für die klinische Diagnostik nur von einem begrenzten bis zweifelhaften Wert sei (39,62).

Bei der Anmelderin entstand aufgrund der z. T. erheblich divergierenden Literaturdaten der Eindruck, dass ein Grund dafür im Methodologischen liegen könnte und aufgrund syste- matischer Fehler der angewandten Meßmethoden bisher noch keine wirklich zuverlässigen, aussagekräftigen Ergebnisse vorliegen. Die meisten der Bestimmungen, deren Ergebnisse veröffentlicht wurden, wurden mit Immunoassays vom ELISA-Typ durchgeführt, die so gestaltet waren, dass man mit einer Festphase arbeitete, an die-teilweise von den Autoren selbst aus biologischem Material gewonnene-Ganglioside gebunden waren. Diese Festphase wurde mit der flüssigen biologischen Probe umgesetzt, in der die zu bestimmenden Antikörper vermutet wurden. Nach der jeweils gewählten Inkubationszeit, einer Fest-Flüssig-Trennung und einem Waschen der Festphase wurden dann an diese gebundene humane Antikörper unspezifisch mit enzymmarkierten tierischen anti- human-Ig-Antikörpern markiert und bestimmt.

Ein solches Assayschema ist bei seiner Anwendung auf die Anti-Gangliosid-Antikörper-Bestimmung außerordentlich anfäl- lig für Störungen und Messfehler und kann nur bei sorgfälti- ger Standardiseriung und Normierung zuverlässige, reprodu- zierbare Ergebnisse liefern. Eine der Ursachen ist, dass die Qualität der Festphase, die durch Immobilisierung der rela- tiv niedermolekulargewichtigen Ganglioside erhalten wird, anfällig für starke Schwankungen ist. Das ist teilweise da- durch begründet, dass vor der Umsetzung mit der flüssigen Probe restliche freie Bindungskapazitäten der Festphase abgesättigt werden müssen. Hierzu wird in der Regel Rinder- serumalbumin, d. h. ein Protein verwendet. Dieser Schritt führt jedoch dazu, dass die unspezifische Bindung anderer Proteine, z. B. solcher vom IgG-Typ, aus der Probe sehr hoch wird, was zu einem starken Hintergrundsignal führt, vor dem die zu bestimmenden Antikörper bestimmt werden müssen. Ist jedoch die Empfindlichkeit eines Assays nicht sehr hoch- was bei Assays von ELISA-Typ in der Regel der Fall ist- können sich Hintergrundsignal und Messsignal so stark über- lagern, dass unrichtige (falsch negative bzw. falsch positi- ve) bzw. nicht zuverlässig reproduzierbare Messergebnisse erhalten werden. Zu den verschiedenen angewandten Assayme- thoden und den systematischen und praktischen Problemen bei der Anwendung derartiger Methoden auf die Bestimmung von anti-Gangliosid-Antikörpern kann z. B. verwiesen werden auf (64 bis 68), wobei sich insbesondere (66) intensiver mit der Problematik der praktischen Anti-Gangliosid-Antikörperbe- stimmung befaßt.

Angesichts dieser Ausgangslage hatte sich die Anmelderin entschieden, das Problem der reproduzierbaren Bestimmung von anti-GM1-bzw. anti-AGM1-Antikörpern und der diagnostischen Signifikanz einer solchen Bestimmung z. B. bei Alzheimer-Pa- tienten aufzugreifen und dabei die bei ihr als Produzentin von Assays für die klinische Diagnostik von Autoantikörpern vorhandenen besonderen Erfahrungen und Mittel zu nutzen. Für die interne Forschung entwickelte sie unter Einhaltung aller üblichen Qualitätsstandards Varianten einer verbesserten Modifikation der vorbekannten Antigangliosidassays. Die mit diesen verbesserten Assays durchgeführten Messungen von an GM1 bzw. AGMZ bindenden Antikörpern in Seren eines Ver- gleichskollektivs von Normalpersonen (Blutspendern) ohne relevante klinische Krankheitsbefunde sowie in Seren ver- schiedener Erkrankter lieferte, wie weiter unten ausgeführt wird, das überraschende Ergebnis, dass in allen der Anmelde- rin zur Verfügung stehenden Seren von krebskranken Patienten gegenüber Normalpersonen hoch signifikant erhöhte Titer für anti-G1-bzw. anti-AGM1-Antikörper vom IgA sowie vom IgG- Typ, dagegen nicht vom IgM-Typ, gefunden wurden, und zwar mit einer Sensitivität, die nahezu 100% erreichte, und dass diese signifikant erhöhten Titer in allen Krebsseren gefun- den wurden, ohne dass eine Selektivität bezüglich irgend- einer bestimmten Krebserkrankung erkennbar wurde. Dieser Befund war außerordentlich überraschend und steht im Gegen- satz zu allen bisherigen Erfahrungen mit als Tumormarker untersuchten bzw. eingesetzten Biomolekülen.

Obwohl die nachfolgend genauer beschriebenen Ergebnisse mit einem bestimmten verbesserten Ligandenbindungsassay ("Immu- noassay") aus dem Labor der Anmelderin gewonnen wurden, ist die Nutzung der dabei gewonnenen Erkenntnisse nicht nur mit einem Assay des beschriebenen speziellen Formats möglich. Es wird vielmehr davon ausgegegangen, dass der nachfolgend beschriebene konkrete Assay für die in Frage stehende Anti- körperbestimmung noch deutlich suboptimal ist, und dass kommerzielle Assays für die klinische Bestimmung von Anti- Gangliosid-Antikörpern, insbesondere von anti-GMl-und anti- AGM1-(Auto) antikörpern sich von dem beschriebenen Assay nach einer Optimierung in mehrfacher Hinsicht noch deutlich unterscheiden werden.

Die Verfahren zur Bestimmung der genannten Antikörper in einer biologischen Probe können beliebige bekannte Verfahren der Immundiagnostik sein, die zum Nachweis und zur Messung von Antikörpern (Autoantikörpern) angewandt werden. Vorzugs- weise werden die Antikörper mit Hilfe eines Ligandenbin- dungsassays bestimmt, bei dem man als Antigen zur Bindung der gesuchten Antikörper das jeweilige Gangliosid in immobi- lisierter Form verwendet. Zur Markierung der aus einer biologischen Probe spezifisch gebundenen Antikörper kann man dann auf irgendeine geeignete, an sich bekannte Weise mar- kierte Anti-Human-Antikörper, markierte Ganglioside oder deren Kohlenhydratstruktur simulierende Binder mit einer für das jeweilige Assayformat geeigneten Affinität verwenden.

Auch kompetitive Assayformate können besondere Vorteile bie- ten. Vorzugsweise wird dabei nicht mit einer Enyzmmarkierung gearbeite, sondern es wird eine andere Markierung gewählt, z. B. eine Markierung für eine Chemilumineszenz-Nachweisreak- tion, z. B. ein Akridiniumester. Selbstverständlich ist vor- zugsweise ein solcher Assay zur Antikörperbestimmung zu ver- wenden, der die benötigte hohe Sensitivität im Bereich der vorkommenden Antikörper-Konzentrationen gewährleistet und eine Separierung der Messignale vom Assay-Hintergrund er- möglicht.

Das Bestimmungsverfahren kann an die Chip-Technologie ange- paßt sein oder als Schnelltest (Point-of-Care-Test) ausge- staltet werden.

Zur Vermeidung von ungerechtfertigt engen und einschränken- den Auslegungen der in der vorliegenden Anmeldung und den zugehörigen Ansprüchen verwendeten Begriffe sollen nachfol- gend einige der wichtigsten Begriffe für die Zwecke der vorliegenden Anmeldung besonders definiert werden : "Antikörper" : Dieser Begriff umfaßt, ohne zwischen ver- schiedenen Entstehungs-und Bildungsarten zu unterscheiden, Antikörper sowohl gegen exter- ne Antigene als auch gegen körpereigene Strukturen, d. h. Autoantikörper, wobei letz- tere ggf. auch durch Antigen-Kreuzreaktionen aus Antikörpern gegen externe Antigene zu Autoantikörpern geworden sein können und ihre Bindungsfähigkeit gegen externe Antigene be- wahrt haben können.

Wenn z. B. davon gesprochen wird, dass ein Antikörper"an Gangliosidstrukturen und an Gangliosidstrukturen simulierende Antigen- strukturen"bindet oder gegenüber"Gangliosi- den bzw. bestimmten Gangliosiden reaktiv" ist, wobei reaktiv"im Sinne einer spezifi- schen Bindung reaktiv"bedeutet, soll er durch diese Definition hinreichend definiert sein, ohne dass z. B. seine spezifische Bin- dung auch an zusätzliche andere antigene Strukturen, oder seine praktische Bestimmung unter Verwendung von Reagenzien (zur Immobi- lisierung bzw. Markierung bzw. als Kompetito- ren) mit molekularen Strukturen, die AGM1, insbesondere dessen Kohlenhydratstuktur, nur simulieren, für die Definition als erfin- dungsgemäßer Antikörper eine Rolle spielen sollen.

"Gangliosid"Im Rahmen der vorliegenden Erfindung steht der Begriff"Gangliosid"bei der Kennzeich- nung des Bindungsverhaltens der zu bestimmen- den Antikörper in erster Linie für das Gan- glioside AGM1. Der Begriff soll jedoch auch bisher noch nicht untersuchte verwandte Gan- glioside erfassen, z. B. fukosylierte Ganglio- side, wenn sich noch zeigt, dass auch an die- se Ganglioside bindende Antikörper mit einer vergleichbaren diagnostischen Signifikanz für Neoplasmen in Krebsseren gefunden werden.

"Assay"Dieser Begriff umfaßt beliebige für eine Be- stimmung der fraglichen (Auto-) Antikörper geeignete hoch sensitive Ligandenbindungsas- says, ohne dass eine Beschränkung auf ein bestimmtes Assayformat (Sandwichassay, kom- petitiver Assay, Agglutinationsassay) oder eine bestimmte Art der Markierung gewünscht wird. Es versteht sich, dass bestimmte Assay- formate und/oder Markierungen anderen über- legen und daher bevorzugt sind (z. B. eine Chemilumineszenz-gegenüber einer Enzymmar- kierung). Die Verwendung eines gegenüber dem nachfolgend konkret beschriebenen Assay ver- schlechterten oder verbesserten Assays soll jedoch nicht aus dem Bereich der Ansprüche herausführen, wenn er den in der vorliegenden Anmeldung definierten diagnostischen Zwecken dient.

"Sensitivität"Eine hohe Sensitivität bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die Antikörper bei mindestens 50%, besser 70%, vorzugsweise mindestens 85% und nach stärker bevorzugt mindestens 95% aller an Krebs Erkrankten ge- funden werden.

"universell"Dieser Begriff bedeutet, wie der Begriff"un- spezifisch", in Verbindung mit Begriffen wie "Biomarker"oder"Krebs-oder Tumormarker", dass keine Spezifität für eine bestimmte Krebserkrankung besteht und der Marker bei im wesentlichen allen Krebserkrankungen, wenig- stens bei allen üblichen Krebserkrankungen der inneren Organe und metastasierenden Krebserkrankungen, und ganz besonders bei den in der nachfolgend in Tabelle 5 unter den Ziffern 1 bis 13 genannten Krebserkrankungen in diagnostisch signifikanten Mengen gefunden wird.

Weitere Begriffsbedeutungen ergeben sich für den Fachmann aus der einleitenden und nachfolgenden Beschreibung der Erfindung und ihrer Ausführungsbeispiele.

In der nachfolgenden Beschreibung wird, zusätzlich zu dem Inhalt einiger Tabellen, auch auf Figuren Bezug genommen, die zeigen : Fig. 1 eine graphische Darstellung der Ergebnisse der Messung von Antikörpern der IgG-Klasse, die an Monosialo-GM1 binden, in Seren von 137 Kontroll- personen, gegenübergestellt den Ergebnissen der Vermessung von Seren von 147 Tumorpatienten ; Fig. 2 die Ergebnisse einer Vermessung der gleichen Seren wie in Fig. 1 auf Antikörper der IgA-Klasse, die an Monosialo-GM1 binden ; Fig. 3 die Ergebnisse der Bestimmung von Antikörpern der IgG-Klasse, die an Asialo-GM1 binden, in Seren von 30 Normalpersonen (Kontrollen), gegenübergestellt den Ergebnissen der Vermessung von 30 Tumorseren (alle Seren sind Teilkollektive der in den Figuren 1 und 2 vermessenen Seren) ; Fig. 4 die Ergebnisse der Bestimmung von Antikörpern der IgA-Klasse, die an Asialo-GM1 binden, in den glei- chen Seren wie in Fig. 3 ; Fig. 5 ein Diagramm, in dem eine Aufschlüsselung der Antikörperbestimmung in den Tumorseren gemäß Fig.

1 bezüglich der klinisch diagnostizierten Tumorar- ten/Erkrankungen erfolgt, die durch Zahlen von 1 bis 14 gekennzeichnet sind, wobei die Bedeutung der Zahlen 1 bis 14 in der nachfolgenden Beschrei- bung erläutert wird ; Fig. 6 eine der Aufschlüsselung von Fig. 5 entsprechende Aufschlüsselung der Messung von Antikörpern der IgA-Klasse gemäß Fig. 2 ; Fig. 7 eine der Aufschlüsselung von Fig. 5 entsprechende Aufschlüsselung der Messung von Antikörpern der IgA-Klasse gemäß Fig. 3 ; Fig. 8 eine der Aufschlüsselung von Fig. 5 entsprechende Aufschlüsselung der Messung von Antikörpern der IgA-Klasse gemäß Fig. 4 ; Fig. 9 ein Diagramm, in dem eine Korrelation der Ergeb- nisse der Bestimmungen, im gleichen Seren-Teilkol- lektiv, von Antikörpern vom IgG-Typ, die an Mono- silo-gel binden, und der Bestimmung von Antikör- pern vom IgG-Typ, die an Asialo-GM1 binden, herge- stellt wird (vgl. Fig. 1 und Fig. 3) ; und Fig. 10 eine Korrelation entsprechend der Fig. 9 der Be- stimmung von Antikörpern der IgA-Klasse gemäß Fig.

2 und Fig. 4.

Antikörper-Bestimmungen : 1. Herstellung der Assaykomponenten : A. Herstellung von Teströhrchen (Coated Tubes ; CT) Es wurden drei Arten von Teströhrchen hergestellt : (a) Teströhrchen, an die die Ganglioside GM1 bzw. AGM1 gebunden waren, sowie (b) Teströhrchen mit einer BSA-Beschichtung zur Bestimmung des probenindividuellen Hintergrundsignals. a) Zur Herstellung der gangliosidbeschichteten Teströhr- chen (GA-CTs) wurden die Ganglioside (GM1 und AGM1, jeweils bezogen von der Fa. Sigma, Deutschland) in Methanol gelöst und anschließend in PBS (phosphatgepufferte Salzlösung), pH 7,2, 25% Methanol, auf eine Konzentration von 5yg/ml ver- dünnt. Von dieser Lösung wurden jeweils 300 Al in Polysty- rolröhrchen (Polystyrolröhrchen"Star"der Fa. Greiner, Deutschland) gegeben und bei Raumtemperatur für 16h inku- biert. Anschließend wurde der Inhalt der Röhrchen durch Absaugen entfernt, und die Röhrchen wurden zur Absättigung freier Bindungsstellen mit 4,5 ml 0, 5% BSA (bovines Serumal- bumin, proteasefrei, Fa. Sigma, Deutschland) in Wasser befüllt und 2h bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde der Röhrcheninhalt dekantiert, und die Röhrchen wurden mit 0, 2% Tween, 10 mM Tris/HCl, 10 mM NaCl, pH 7,5 befüllt und wieder dekantiert. Anschließend wurden die Röhrchen zur Antikörper- bestimmung eingesetzt.

(b) Da Serumbestandteile an das zur Absättigung freier Bin- dungsstellen der Teströhrchenwand verwendete BSA binden, und der Grad einer solchen Bindung bei unterschiedlichen Seren sehr unterschiedlich sein kann, ist es erforderlich, für jedes Serum getrennt ein probenindividuelles Hintergrundsi- gnal zu bestimmen.

Zu diesem Zweck wurden die gleichen Teströhrchen mit 4,5 ml 0, 5% BSA in Wasser befüllt und 2h bei Raumtemperatur inku- biert. Dann wurde der Röhrcheninhalt dekantiert, und die Röhrchen wurden mit 0, 2% Tween, 10 mM Tris/HCl, 10 mM NaCl, pH 7,5 befüllt und wieder dekantiert. Anschließend wurden die Röhrchen (HR-CTs) zur Bestimmung des probenindividuellen Hintergrundsignals eingesetzt.

B. Herstellung von Akridiniumester-markierten anti human- IgG bzw. anti human-IgA Antikörpern (Tracer) Ziegen anti human-IgG Antikörper (affinitätsgereinigt ; grade II, Fa. Scantibodies, USA) bzw. Ziegen anti human-IgA Anti- körper (affinitätsgereinigt ; Fa. Sigma, Deutschland), je- weils 2 mg/ml in PBS, pH 7,4, 100 Al wurden mit je 10 yl Akridinium-NHS-ester (Fa. Hoechst, Deutschland ; 1 mg/ml in Acetonitril ; vgl. DE 36 28 573 A1) gemischt und für 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Zusatz von 300 yl 20 mM Glycin, 50 mM NaCl, wurden die markierten Antikörper mittels Adsorptionschromatographie über Hydroxylapatit-HPLC gerei- nigt. Als Trennsäule wurde eine HPHT-Säule (120 mm x 8 mm) verwendet, äquilibriert in Lösemittel A (1 mM NaP04, pH 7,0, 10% Methanol, 0, 1% Lubrol ;"LM A" ; Lubrol 17A17 wurde von der Fa. Serva, Deutschland bezogen). Die Durchflussgeschwin- digkeit betrug 0,8 ml/min. Gebundene Antikörper wurden mittels eines linearen 40 min-Gradienten aus LM A/LM B (500 mM NaP04, pH 7,0, 10% Methanol, 0, 1% Lubrol ;"LM B") bei einer Flussgeschwindigkeit von 0,8 ml/min eluiert. Der Säulenausfluss wurde kontinuierlich auf UV-Absorption bei 280 nm (Protein) und 368 nm (Akridiniumester) vermessen.

Nicht proteingebundener Akridiniumester wurden ungebunden aus der Säule eluiert und damit vollständig von den markier- ten Antikörpern abgetrennt. Die Antikörper wurden bei ca. 25 min eluiert. Nach der Bestimmung der Proteinkonzentration (BCA Methode) der HPLC-gereinigten markierten Antikörper erfolgte eine Verdünnung der Tracer auf eine Endkonzentra- tion von 0,1 yg/ml in PBS, pH 7,2, 1 mg/ml Ziegen-IgG (Fa.

Sigma, Deutschland) und 1% BSA.

2. Durchführung der Bestimmung von anti-Gangliosid Anti- körpern Zu untersuchende Proben (Humanseren) wurden 1 : 20 mit PBS, pH 7,2, 1 mg/ml Ziegen IgG, 1% BSA verdünnt. Hiervon wurden jeweils 10 Al in GA-CTs bzw. HR-CTs pipettiert. Anschließend erfolgte eine 16h Inkubation unter Schütteln (IKA-Schüttler KS250 basic, 400 U/min) bei 4°C.

Ungebundene Antikörper wurden durch 5maliges Befüllen/Dekan- tieren der Röhrchen mit 1 ml 0,2% Tween, 10mM Tris/HCl, 10 mM NaCl, pH 7,5 entfernt. Auf den Röhrchenoberflächen ver- blieben Antikörper wurden durch Bindung markierter Ziegen anti human-IgG bzw. markierter Ziegen anti human-IgA nach- gewiesen, indem man die Röhrchen mit jeweils 200 yl des jeweiligen Tracers (vgl. oben, 1. B. ) und anschließend für 3h bei 4°C unter Schütteln inkubiert. Ungebundener Tracer wurde durch 5maliges Waschen (wie oben) entfernt.

Die Menge des auf der Röhrchenoberfläche verbliebenen mar- kierten Antikörpers wurde mittels Lumineszenzmessung in einem Berthold LB. 952T/16 Luminometer gemessen.

Das für GA-CTs erhaltene Lumineszenzsignal einer jeden Probe wurde dabei um das mit den HR-CTs gemessene jeweilige Hin- tergrundsignal für die gleiche Probe korrigiert. Das resul- tierende Signal (Differenzsignal) ist das Signal für an die Ganglioside GM1 bzw. AGM1 bindenden Antikörper aus der jewei- ligen Probe. Als relative Kalibratoren für die Quantifizie- rung wurden Verdünnungsreihen von Proben mit einem hohen Gehalt an anti-Gangliosid-Antikörpern verwendet.

3. Vermessung von Seren von gesunden Normalpersonen (Kon- trollen) und Krebspatienten Unter Verwendung der wie beschrieben hergestellten Teströhr- chen und unter Anwendung des oben beschriebenen Verfahrens wurden die folgenden Reihenmessungen vorgenommen : Kontrollseren : Als Kontrollseren für die Antikörper-Bestim- mungen unter Verwendung von GA-CTs, die mit Gmi beschichtet waren, dienten 137 Kontrollseren (Blutspenderseren und zur Vermeidung von Lebensalter-bedingten Einflüssen auf die Antikörperkonzentrationen Seren von Normalpersonen aus Pflegeheimen verschiedenen Alters und von Mitarbeitern der Anmelderin). Für die Antikörper-Bestimmungen unter Verwen- dung von GA-CTs, die mit AGM1 beschichtet waren, wurde ein Teilkollektiv dieser Seren vermessen, das nur 30 Seren umfaßte.

Testseren : Als Testseren für die Antikörper-Bestimmungen unter Verwendung von GA-CTs, die mit GEL beschichtet waren, dienten 147 Seren von Patienten mit klinisch diagnostizier- ten Tumoren verschiedener Organe/Gewebe sowie, zusätzlich, 20 Seren von Patienten mit chronisch entzündlichen Darm- erkrankungen. Zu jedem Testserum existierte eine genaue klinische Dokumentation, die eine Aufschlüsselung der in die Messung eingesetzten Seren von Krebspatienten nach der bei ihnen festgestellten Tumorart ermöglichte. Für die Antikör- per-Bestimmungen unter Verwendung von GA-CTs, die mit AGM1 beschichtet waren, wurde ein Teilkollektiv dieser Seren ver- messen, das nur 30 Seren von Krebspatienten umfaßte.

Die Ergebnisse der Bestimmungen von Antikörpern der Klassen IgG und IgA unter Verwendung von GA-CTs, die mit GM1 be- schichtet waren, sind in den Figuren 1 und 2 gezeigt.

Die Ergebnisse der Bestimmungen von Antikörpern der Klassen IgG und IgA unter Verwendung von GA-CTs, die mit AGM1 be- schichtet waren, sind in den Figuren 3 und 4 gezeigt.

Figur 5 zeigt eine Aufschlüsselung der Messergebnisse gemäß Fig. 1 (IgG) nach Krankheitsbildern. Dabei stehen die in waagerechter Richtung aufgetragenen Kennziffern für die der folgenden Aufstellung entnehmbaren klinischen Diagnosen : Kennziffer Diagnose Zahl der Seren 1 Colon-Karzinom n = 37 2 Mamma-Karzinom n = 19 3 Ovarial-Karzinom n = 13 4 Magen-Karzinom n = 11 5 Pankreas-Karzinom n = 11 6 Ösophagus-Karzinom n = 12 7 Gallen-Karzinom n = 8 8 Leber-Karzinom n = 7 9 C-Zell-Karzinom n = 3 10 Schilddrüsen-Karz. n = 5 11 Prostata-Karzinom n = 5 12 Lungen-Karzinom n = 8 13 Sonstige Karzinome n = 8 14 M. Crohn/C. Ulcerosa n = 20 Die"Sonstigen Karzinome"teilten sich dabei wie folgt auf : Appendix-Karzinom (n=1), Blasen-Karzinom (n=1), Cardia- Karzinom (n=1), Distales Verophagus-Karzinom (n=2), Mundbo- den (n=1), Nieren-Karzinom (n=1), Oberbauchtumor (n=1).

Figur 6 ist eine entsprechende Aufschlüsselung der Ergeb- nisse von Fig. 2 (IgA).

Die nachfolgende Tabelle 1 faßt die Ergebnisse der Figuren 5 und 6 zahlenmäßig zusammen.

Tabelle 1 Betroffenes anti GM1 IgG anti GM1 IgA n Organ Colon/Rektum 38 = 100% 35 = 92% 38 Mamma 19 = 100% 16 = 84% 19 Ovarien 13 = 100% 11 = 85% 13 Magen 11 = 100% 9 = 82k 11 Pankreas 11 = 100% 10 = 91h 11 Ösophagus 12 = 100% 10 = 83% 12 Galle 8 = 100% 6 = 75% 8 Leber 6 = 86% 7 100% 7 C-Zell 3 = 100% 3 = 100% 3 Lunge/7 = 88% 7 = 88% 8 Bronchien Schilddrüse 5 = 100% 4 = 80t 5 Prostata 3 = 60% 4 = 80% 5 sonstige 7 = 88% 7 = 88W 8 Die Figuren 7 und 8 sind den Figuren 5 und 6 entsprechende Aufschlüsselungen der mit AGM1-beschichteten GA-CTs erhalte- nen Ergebnisse für die vermessenen Teilkollektive gemäß den Figuren 3 und 4. Dabei stehen in den Figuren 7 und 8 die Kennziffern für die folgenden Diagnosen : Kennziffer Diagnose Zahl der Seren 1 Colon-Karzinom n = 13 2 Mamma-Karzinom n = 6 3 Pankreas-Karzinom n = 4 4 Ösophagus-Karzinom n = 2 5 Gallen-Karzinom n = 2 6 Lungen-Karzinom n = 1 7 Sonstige : n = 2 Oberbauchtumor n = 1 Appendix-Karzinom n = 1 8 M. Crohn/C. Ulcerosa n = 10 Die nachfolgende Tabelle 2 faßt die Ergebnisse der Figuren 7 und 8 zahlenmäßig zusammen.

Tabelle 2 Betroffenes anti AGM1 IgG anti AGM1 IgA n Organ Colon/Rektum 12 = 92% 13 = 100% 13 Mamma 6 = 100W 5 = 83% 6 Pankreas 4 = 100% 4 = 100% 4 Ösophagus 2 = 100% 2 = 100% 2 Galle2 = 100% 2 = 100% 2 Leber1 = 100% 1 = 100% 1 Lunge/1 100% 1 100% 1 Bronchien sonstige2 = 100% 2 = 100% 2 Führt man eine quantitative Korrelation der einerseits mit GM1-beschichteten Teströhrchen und andererseits, für das gleiche Seren-Teilkollektiv, mit AGM1-beschichteten Teströhr- chen erhaltenen Messergebnisse für die IgG-Bestimmung durch, so ergibt sich, wie in Figur 9 gezeigt ist, eine weitgehende Übereinstimmung, die den Schluss erlaubt, dass bei beiden Bestimmungen wenigstens weitestgehend identische Antikörper gemessen wurden.

Ähnliches gilt für die IgA-Bestimmungen, wobei die Figur 9 entsprechende Korrelation in Figur 10 gezeigt ist.

4. Diskussion der Befunde der Bestimmung von anti-Gan- gliosid-Antikörpern in Kontrollseren und in Seren von Krebs- patienten Wie die in den Figuren 1 bis 10 und den obigen Tabellen 1 und 2 zusammengefassten Messergebnisse eindrücklich zeigen, ermöglicht die Bestimmung von Antikörpern, die an Gangliosi- de (AGM1 und/oder Gum1) binden, ein klare Unterscheidung der beiden Grupen von vermessenen Seren. Die Sensitivität der durchgeführten Bestimmungen lag für alle Tumorarten über 75%, in den meisten Fällen sogar bei 100%. Dabei scheint es, dass die Bestimmungen von IgA unter Verwendung von AGM1- beschichteten Teströhrchen Meßergebnisse mit der höchsten Sensitivität liefern (wobei allerdings einschränkend zu berücksichtigen ist, dass die Zahl der Bestimmungen geringer war als im Falle der Verwendung von GM1-beschichteten Röhr- chen).

Es ist ferner darauf hinzuweisen, dass bei einem Versuch, entsprechend den Bestimmungen von Antikörpern vom IgG-und IgA-Typ auch solche vom IgM-Typ zu bestimmen, keine diagno- stisch relevanten Ergebnisse erhalten wurden (Ergebnisse nicht gezeigt).

Die gemessenen hohen Sensitivitäten in Verbindung mit einer hohen Unspezifität bezüglich der verschiedenen Krebsarten machen die Bestimmung von anti-Gangliosid-Antikörpern, insbesondere von solchen der IgG-und/oder IgA-Klassen, zu einem vielversprechenden Bestimmungsverfahren für die Dia- gnose, insbesondere für die Früherkennung, von Neoplasmen.

Der wissenschaftlichen Literatur lassen sich Erkenntnisse, die ein solches Verfahren nahelegen könnten, nicht entneh- men. Es wurden nur einige wenige Arbeiten bekannt, in denen der Versuch unternommen wurde, im Zusammenhang mit Krebs- erkrankungen auch anti-Gangliosid-Antikörper zu bestimmen.

Ausgehend von dem Befund, dass beim sogenannten"small cell lung cancer" (SCLC) im Lungengewebe von Erkrankten eine erhöhte/abnormale Expression von Gangliosiden gefunden wurde, wurde in zwei Arbeiten (58,59) untersucht, ob diese abnormale Gangliosidexpression dazu führt, dass bei Krebs- patienten anti-Gangliosid-Antikörper gebildet und nachgewie- sen werden können. In (58) wurden die gesuchten anti-Fuko- syl-GM1-Gangliosid-Antikörper nicht gefunden, während in (59) für den Fall von differenziertem Schilddrüsenkrebs (DTC) zwar in einer gewissen Anzahl von Patienten geringe Mengen an verschiedenen anti-Gangliosid-Antikörpern nach- gewiesen werden konnten, jedoch z. B. im Falle der anti-GM1- Antikörper-Bestimmung die gefundenen Werte für die Krebs- patienten unter denen der Kontrollen lagen (Fig. l). Nur im Hinblick auf eine Bindung an das fukosylierte Gangliosid FucGM1 wurden etwas stärker erhöhte Antikörpertiter gefun- den. Im Lichte der in der vorliegenden Anmeldung beschriebe- nen Befunde, die denen gemäß (5-8, 59) klar widersprechen, ist anzunehmen, dass es den Autoren von (58,59) angesichts der erheblichen praktischen Schwierigkeiten bei der Bestim- mung von anti-Gangliosid-Antikörpern vor einem intensiven, serumabhängigen Hintergrundsignal mit dem von ihnen ver- wendeten ELISA-Assay nicht gelang, tatsächlich aussagekräf- tige Messergebnisse zu produzieren. (58,59) stellen somit einen von dem erfidungsgemäßen Verfahren klar wegführenden Stand der Technik dar.

In (60) wird ferner von einer Bestimmung von verschiedenen Typen von Antikörpern in Seren von Magenkrebspatienten berichtet, und es wird eine eventuelle prognostische Rolle einer solchen Bestimmung diskutiert, wobei"prognostisch"im Sinne einer Prognose für den weiteren klinischen Verlauf einer bereits bestehenden und erkannten Krebserkrankung verwendet wird. Zur Antikörper-Bestimmung wird ein ELISA- Assay verwendet. Zu den Antikörpern, die gegenüber Kontrol- len erhöht gefunden wurden, gehören auch sog. anti-GM1-Anti- körper, die allerdings nur mit einer Sensitivität von etwa 35% bei den Erkrankten gefunden wurden (gegenübergestellt einem Wert von 5% für Normalpersonen). Im Lichte von (60) und anderen Arbeiten der Autoren von (60) sind diese anti- Gangliosid-Antikörper nur eine von zahlreichen Arten von im Zusammenhang mit Krebs untersuchten Autoantikörpern, und aus den in (60) berichteten Daten läßt sich keinerlei besondere Eignung der Bestimmung derartiger Antikörper für die Diagno- se, insbesondere die Früherkennung, und zur Bestimmung des Risikos eines Patienten, eine maligne Krebserkrankung zu entwickeln, ableiten. Eine solche Perspektive ergab sich erstmals aus den von der Anmelderin unter Einsatz ihrer großen Erfahrung auf dem Assaygebiet erhaltenen, vor dem Hintergrund des Standes der Technik außerordentlich über- raschenden Messdaten.

Die Anmelderin ist aufgrund ihrer Messergebnisse sowie einer zusätzlichen intensiven Literaturstudie der Überzeugung, dass den bei Krebspatienten gefundenen erhöhten anti-Gan- gliosid- (Auto-) Antikörper-Titern eine ganz andere Bedeutung zukommt als z. B. Ausgangspunkt der Überlegungen der Autoren von (58, 59,60) war : Es ist nämlich bekannt, dass die sogenannten"natürlichen Killerzellen" (NK-Zellen ; cytoto- xisch aktive Lymphozyten) an ihrer Oberfläche Asialo-GM1- Strukturen aufweisen, an die anti-AGM1-Antikörper spezifisch binden können, die dadurch die NK-Zellen desaktivieren und zerstören. Aktive NK-Zellen spielen eine außerordentlich wichtige Rolle im Rahmen der Immunabwehr des Menschen, indem sie z. B. alle entarteten körpereigenen Zellen, z. B. Krebs- zellen, abtöten, die aufgrund ihrer Entartung die Fähigkeit verloren haben, die NK-Zellen zu hemmen, die mit Ihnen in Kontakt kommen. Eine Beeinträchtigung (Hemmung, Abtötung) der normalen NK-Zellen, die deren selektiv-cytotoxische Eigenschaften aufhebt, führt daher dazu, dass im Verlaufe der natürlichen Lebensvorgänge entartete Zellen, insbesonde- re vom Tumorzell-Typ, nicht mehr ordnungsgemäß eliminiert werden. Aufgrund der verbesserten Überlebenschancen der- artiger entarteter potentieller Tumorzellen können sich diese bei einer gestörten Funktion der NK-Zellen im Körper festsetzen, ungestört teilen und zu einem eigentlichen Tumor entwickeln. Es ist darauf hinzuweisen, dass es auf dem Gebiet von Tierexperimenten, bei den mit Versuchstieren gearbeitet wird, bei denen ein künstlicher Krebs erzeugt wird, bereits üblich ist, durch Gabe von anti-AGM1-Antikör- pern in Verbindugn mit einem krebsauslösenden Karzinogen oder einem Tumorkeim die Immunabwehr des Versuchstiers auszuschalten, so dass sich der-im Tiermodell gewünschte- experimentelle Krebs entwickeln kann (3 bis 13).

Ist bei einem menschlichen Individuum, z. B. aufgrund einer bakteriellen Exposition (z. B. Infektionen mit Campylobacter jejuni oder auch Helicobacter pylori ; vgl. 44 bis 54), die Produktion von anti-Asialo-GM1-Antikörpern einmal initiiert bzw. stark erhöht, entsteht eine Voraussetzung für eine potentielle Schädigung der NK-Zellen und damit der Immunab- wehr mit der Folge eines erhöhten Risikos, dass sich ent- artete Tumorzellen zu einem Tumor entwickeln können. Es ist also davon auszugehen, dass die in allen Krebsseren, die im Rahmen der o. g. Bestimmungen vermessen wurden, signifikant erhöht gefundenen anti-AGM1-Antikörpertiter weniger im Sinne der bekannten Tumormarker eine Folge des Vorliegens eines Neoplasmas (Tumors) sind, sondern eher eine Voraussetzung seines Entstehens. Im Laufe der Tumorentwicklung kann es dann, in Verbindung mit einer stimulierten NK-Zell-Aktivi- tät, u. U. zu einem"Aufschaukeln"der Antikörpertiter kom- men.

Da die mit Gangliosiden kreuzreagierenden Antikörper und die für deren Produktion erforderliche Prägung des Immunsystems bereits vor der Entwicklung eines Tumors vorhanden sein können, kann die Bestimmung von anti-AGM1-Antikörpern somit erfindungsgemäß auch im Sinne der Ermittlung einer Disposi- tion, d. h. als Bestimmung eines Krebs-Risiko-Markers, erfol- gen. Es kann in diesem Zusammenhang vorteilhaft sein, eine solche Bestimmung nach einer in vivo Stimulierung der Anti- körperbildung unter Verwendung unbedenklicher Stimulantien zu vorzunehmen. Angesichts der deutlich erhöht gefundenen IgA-Antikörper kann die Bestimmung ausdrücklich auch mit geeigneten Assays in Körpersekreten (z. B. Speichel, Schleim) erfolgen.

Es ist in diesem Zusammenhang von hohem Interesse, dass, wie insbesondere den Figuren 5 bis 8 zu entnehmen ist, erhöhte Titer an anti-AGM1-Antikörpern auch bei einem Teil von Pa- tienten gefunden werden, die an einer chronisch entzündli- chen Darmerkrankung (Morbus Crohn, Colitis Ulcerosa) leiden.

Es ist bekannt, dass z. B. bei Colitis Ulcerosa eine erhöhtes Risiko besteht, dass sich bei den Patienten im späteren Verlauf Darmkrebs entwickelt. Das Risiko beträgt etwa 40'-..

Der Befund, dass dieser prozentuale Wert in der Größenord- nung der Werte liegt, die in Seren von Patienten mit chro- nisch entzündlichen Darmerkrankungen (Kennziffer 14 in den Figuren 5 und 6 ; Kennziffer 8 in den Figuren 7 und 8) für erhöhte anti-AG1-Titer gefunden werden, d. h. eine Parallität von statistische Krebsrisiko und einem Auftreten von anti- AGM1-Antikörpern in den Seren einschlägig Erkrankter erkenn- bar wird, ist ein weiterer die o. g. Annahmen stützender Befund.

Die sich aufgrund er in dieser Anmeldung geschilderten Befunde ergebenden Konsequenzen für neuartige Verfahren zur Prävention, Hemmung und Therapie von Krebs sind Gegenstand einer gleichzeitig mit der vorliegenden Anmeldung einge- reichten eigenen parallelen Patentanmeldung.

Literaturliste : 1. http : //www. medicine-worldwide. de/krankheiten/krebs/- xxx. html, wobei/xxx zu ersetzen ist z. B. durch/all- gemeines ; /lungenkrebs ; /brustkrebs ; /prostatakrebs ; /darmkrebs ; /leukaemie ; /corpuskarzinom ; 2. Lothar Thomas (Herausgeber), Labor und Diagnose, 5. erw. Auflage, Kapitel 34 : Tumormarker, S. 956-1019 ; 3. Hugh F. Pross et al., Role of Natural Killer Cells in Cancer, Nat Immun 1993 ; 12 : 279-292 ; 4. Lewis L. Lanier et al., Arousal and inhibition of human NK Cells, Immunological Reviews 1997, Vol. 155 : 145-154 ; 5. Yoichi Fuji et al., IgG Antibodies to AsialoGMl Are More Sensitive than IgM Antibodies to Kill in vivo Natural Killer Cells and Prematured Cytotoxic T Lympho- cytes of Mouse Spleen, Microbiol. Immunol. Vol. 34 (6), 533-542,1990 ; 6. Carmine M. Volpe et al., AsGMl + NK Cells Prevent Meta- stasis of Invading LD-MCA-38 Tumor Cells in the Nude Mouse, J Surg Res 84,157-161 (1999) ; 7. Susan D. Wilson et al., Correlation of Suppressed Natu- ral Killer Cell Activity with Altered Host Resistance Models in B6C3F1 Mice, Toxicology and Applied Pharmaco- logy 177,208-218 (2001) ; 8. H. Yoshino et al., Natural killer cell depletion by anti-asialo GM1 antiserum treatment enhances human hematopoietic stem cell engraftment in NOD/Shi-scid mice ; Bone Marrow Transplantation (2000) 26,1211-1216 ; 9. N. Saijo et al., Analysis of Metastatic Spread and Growth of Tumor Cells in Mice with Depressed Natural Killer Activity by Anti-asialo GM1 Antibody or Antican- cer Agents, J Cancer Res Clin Oncol (1984) 107 : 157- 163 ; 10. Sonoku HABU et al., Role of Natural Kiler Cells against Tumor growth in Nude Mice-A Brief Review, Tokai J Exp Clin Med., Vol. 8, No. 5,6 : 465-468,1983 ; 11. Lewis L. Lanier, NK Cell Receptors, Annu. Rev. Immunol.

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