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Title:
METHOD FOR DIAGNOSIS OR PROGNOSIS OF HTLV-1 AND/OR HTLV-2 INFECTIONS AND KIT FOR DIAGNOSING HTLV-1 AND/OR HTLV-2 INFECTIONS USING FLOW CYTOMETRY
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2021/232121
Kind Code:
A1
Abstract:
The present invention relates to a method for the diagnosis or prognosis of HTLV-1 and/or HTLV-2 infections, involving: (1) collecting samples of serum from patients; (2) preparing MT-2 and MoT cells for cell fixation and permeabilization and subsequently marking MT-2 and MoT cells; (3) mixing serums from human individuals with the preparation of MT-2 and MoT cells, with subsequent incubation of the mixture and washing; (4) adding SAPE and biotinylated anti-IgG1 antibody, with subsequent incubation of the mixture and washing; (5) subjecting the samples to flow cytometry; (6) analyzing the reactivity profile of anti-HTLV-1/2 IgG1 antibodies; and (7) using a synchronous or asynchronous algorithm to determine whether or not there is an HTLV-1 and/or HTLV-2 infection. The present invention also relates to a kit for diagnosing HTLV-1 and/or HTLV-2 infections using flow cytometry, said kit comprising fixed and marked lymphocytic cells in suspension, which are infected by HTLV-1 (MT-2) and HTLV-2 (MoT); a reagent containing biotinylated human anti-IgG1 antibodies; a serum sample from uninfected human individuals as a negative control; a serum sample from human individuals infected with HTLV-1 and/or HTLV-2 as a positive control; and a developing reagent.

Inventors:
MARTINS-FILHO OLINDO (BR)
CARVALHO ANDREA (BR)
PASCOAL VANESSA (BR)
CARVALHO KELLY (BR)
TRINDADE BRUNO (BR)
PAIVA LUCIENE (BR)
REIS JORDANA (BR)
ALCÂNTARA LUIZ (BR)
MARTINS JÚLIA (BR)
PROIETTI ANNA BÁRBARA (BR)
SABINO ESTER (BR)
Application Number:
PCT/BR2021/050101
Publication Date:
November 25, 2021
Filing Date:
March 10, 2021
Export Citation:
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Assignee:
FUNDACAO OSWALDO CRUZ (BR)
International Classes:
G01N33/569; C12Q1/04; C12R1/91; C12R1/93
Domestic Patent References:
WO2013134839A12013-09-19
Other References:
GASTALDELLO RENÉ, GALLEGO SANDRA, ISA MARÍA BEATRIZ, NATES SILVIA, MEDEOT SILVIA: "Efficiency of indirect immunofluorescence assay as a confirmatory test for the diagnosis of human retrovirus infection (HIV-1 and HTLV-I/II) in different at risk populations", REVISTA DO INSTITUTO DE MEDICINA TROPICAL DE SÃO PAULO, vol. 41, no. 3, 1 May 1999 (1999-05-01), pages 159 - 164, XP055873367, ISSN: 0036-4665, DOI: 10.1590/S0036-46651999000300005
COELHO-DOS-REIS JORDANA GRAZZIELA; PERUHYPE-MAGALHÃES VANESSA; PASCOAL-XAVIER MARCELO ANTÔNIO; DE SOUZA GOMES MATHEUS; DO AMARAL L: "Flow cytometric-based protocols for assessing anti-MT-2 IgG1 reactivity: High-dimensional data handling to define predictors for clinical follow-up of Human T- cell Leukemia virus type-1 infection", JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS, vol. 444, 16 February 2017 (2017-02-16), pages 36 - 46, XP029952171, ISSN: 0022-1759, DOI: 10.1016/j.jim.2017.02.006
COELHO-DOS-REIS J G A; MARTINS-FILHO O A; DE BRITO-MELO G E A; GALLEGO S; CARNEIRO-PROIETTI A B; SOUZA J G; BARBOSA-STANCIOLI E F: "Performance of IgG and IgGl anti- HTLV-1 reactivity by an indirect immunofluorescence flow cytometric assay for the identification of persons infected with HTLV-1, asymptomatic carriers and patients with myelopathy", JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS, vol. 160, no. 1-2, 1 September 2009 (2009-09-01), pages 138 - 48, XP026221316, ISSN: 0166-0934, DOI: 10.1016/j.jviromet.2009.05.007
DATABASE Nucleotide 25 July 2016 (2016-07-25), ANONYMOUS: "Human T- lymphotropic virus 2, complete proviral genome", XP055825987, retrieved from Genbank Database accession no. M10060
Attorney, Agent or Firm:
KASZNAR LEONARDOS PROPRIEDADE INTELECTUAL (BR)
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Claims:
REIVINDICAÇÕES

1) Método para diagnóstico ou prognóstico de infecção por HTLV 1 e/ou HTLV2 caracterizado pelo fato de que consiste nas seguintes etapas:

(1) Coletar amostras de soro de pacientes;

(2) Preparar células MT-2 e MoT para fixação e permeabilização celular e posteriormente marcar células MT-2 e MoT;

(3) Misturar soros de indivíduos humanos à preparação de células MT-2 e MoT, com posterior incubação da mistura e lavagem;

(4) Adicionar anticorpo anti-IgGl biotinilado e revelar com estreptavidina conjugada ao fluorocromo ficoeritrina - PE (SAPE), com posterior incubação da mistura e lavagem;

(5) Aplicar as amostras em citômetro de fluxo;

(6) Analisar perfil de reatividade de anticorpos IgGl anti-

HTLV-1/2; e

(7) Avaliar por meio de um algoritmo sincrônico ou assincrônico se há ou não infecção por HTLV 1 e/ou HTLV2.

2) Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na etapa (2) as células MT-2 e MoT são marcadas diferencialmente por fluorescência.

3) Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato da substância fluorescente ser selecionada dentre Alexa-fluor, FITC, Chicago Sky Blue, Rodamina, Ficoeritrina, Alloficocianina.

4) Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato da substância fluorescente ser Alexa-fluor 647 (AF647).

5) Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de ser realizada análise da reatividade de anticorpos anti-HTLV-1 e 2 empregando-se histogramas de intensidade de fluorescência em função do número de células, seguindo análise da intensidade de fluorescência relativa (FL2) apresentada pela população selecionada.

6) Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de ser realizada análise da expressão dos resultados sob a forma de percentual de células fluorescentes positivas (PCFP) em diluições do soro pré-estabelecidas.

7) Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato da avaliação da reatividade de IgGl anti- HTLV-1/2 ser realizada com o soro diluído a 1:32 tanto para MT-2 e MoT (analise sincrônica) ou assincronicamente, no qual é obtida a subtração entre duas diluições no esquema 1:32 (MT-2) - 1:1024 (MoT).

8) Kit para diagnóstico de infecção por HTLV 1 e/ou HTLV2 por citometria de fluxo caracterizado pelo fato de compreender:

- células linfocíticas em suspensão fixadas e marcadas, infectadas por HTLV-1 (MT-2) e por HTLV-2 (MoT);

- reagente contendo anticorpos anti-IgGl humano biotinilado;

- amostra de soro de indivíduos humanos não infectados, como controle negativo;

- amostra de soro de indivíduos humanos infectados por HTLV-1 e/ou HTLV-2, como controle positivo; e

- reagente de revelação ou SAPE.

9) Kit de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente placas de 96 poços e adesivos de vedação.

10) Kit de acordo com a reivindicação 8 ou 9 caracterizado pelo fato de que as células células MT-2 e MoT são marcadas diferencialmente por fluorescência. 11) Kit de acordo com a reivindicação 10 caracterizado pelo fato da substância fluorescente ser selecionada dentre Alexa-fluor, FITC, Chicago Sky Blue, Rodamina, Ficoeritrina, Alloficocianina.

12) Kit de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato da substância fluorescente ser Alexa-fluor 647 (AF647).

Description:
MÉTODO PARA DIAGNÓSTICO OU PROGNÓSTICO DE INFECÇÃO POR HTLV-1 E/OU HTLV-2, E, KIT PARA DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO POR HTLV-1 E/OU HTLV-2 POR CITOMETRIA DE

FLUXO

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção encontra-se no campo da imunologia.

A presente invenção se refere a um método para diagnóstico ou prognóstico de infecção por HTLV 1 e/ou HTLV2. A presente invenção se refere ainda a um kit para diagnóstico de infecção por HTLV 1 e/ou HTLV2 por citometria de fluxo.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Aspectos gerais da infecção pelo HTLV

[002] O HTLV ( Human T-lymphotropic virus) é classificado como um complexo retrovírus, pertencente ao gênero Deltaretrovirus da família Retroviridae e da subfamília Orthoretrovirinae (SAITO, 2010). Foi o primeiro retrovírus associado a doença em humanos, tendo sido isolado da linhagem de células T de um paciente portador de linfoma (GALLO,

2005). Existem quatro tipos de HTLV descritos, sendo os dois principais o

HTLV-1 e HTLV-2. E importante ressaltar que aproximadamente 95 a 98% dos indivíduos infectados permanecem as sintomáticos (SANTOS & LIMA, 2005). No entanto, o HTLV-1 apresenta importância clínica significativa por participar na etiologia da mielopatia associada ao HTLV-l/paraparesia espástica tropical (HAM/TSP), uveíte associada ao HTLV-1 (HAU), eczema grave da infância - também denominado dermatite infecciosa (Dl) - e, ainda, possível associação com artropatias, polimiosites e síndrome de Sjogren, entre outras. Já o HTLV-2 pode estar eventualmente associado a manifestações clínicas, como HAM/TSP, inflamação pulmonar e aumento da mortalidade por câncer (ROUCOUX et al, 2004; MURPHY et al, 2004; BISWAS et al, 2010; GONÇALVES et al, 2010). [003] A transmissão do HTLV se dá por via vertical

(transplacentária, durante o parto e pela amamentação), horizontal (relação sexual) e parenteral (transfusão de sangue e hemoderivados contaminados e uso de drogas injetáveis) (SANTOS; LIMA, 2005; NOMURA et al, 2006).

[004] Estima-se que 15 a 20 milhões de pessoas no mundo estejam infectadas pelo HTLV-1 (YOSHIDA; JEANG, 2005, p. 5925).

Estudos preconizam que a África é o reservatório primário do HTLV-1, sendo o mesmo endémico em diversas partes do mundo, em especial no

Japão, Caribe, América Central e do Sul, África Equatorial, Oriente Médio e Melanésia (GALLO et al., 1987, apud SANTOS; LIMA, 2005). Já o

HTLV-2 é endémico na América do Norte, Central e Sul, África e Europa (PROIETTI et al, 2005).

[005] No Brasil, estudos de prevalência confirmam a presença do

HTLV-1 e 2 em todo o país. CARNEIRO-PROIETTI et al (2012), descreveram prevalência de HTLV-1 e 2 igual a 83, 100 e 222 por 100.000 doadores de sangue nos hemocentros de Minas Gerais, São Paulo e Pernambuco, respectivamente. Recentemente, BRAÇO et al (2019) demonstraram presença do HTLV-2 na população indígena da Amazônia, com prevalência de 38% entre as mulheres e 18% entre os homens.

[006] Durante a infecção pelo HTLV, o sistema imune dos indivíduos infectados fica exposto a uma mistura complexa de antígenos derivados do vírus, respondendo a esses estímulos com mecanismos múltiplos da resposta imune.

[007] Uma vez que muitas proteínas virais são imunogênicas e anticorpos reagindo contra elas são detectados no soro de pessoas infectadas, a pesquisa de anticorpos anti-HTLV é considerada ferramenta importante para o diagnóstico e prognóstico da doença.

[008] Devido ao risco de transmissão parenteral, testes sorológicos e moleculares para o diagnóstico da infecção pelo HTLV-1 e 2 em bancos de sangue foram introduzidos em diversos países, sendo no Brasil obrigatório desde 1993 (portaria no 1376 do Ministério da Saúde, ratificada pela Resolução da Diretória Colegiada-RDC n° 153 de 14 de julho de 2004 da ANVISA).

[009] O diagnóstico da infecção pelo HTLV-1 e 2 apresenta duas etapas principais. A primeira é a etapa de triagem sorológica, no qual são utilizados testes com elevada sensibilidade, ou com elevado valor preditivo negativo, como os ensaios imunoenzimáticos, incluindo ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) e ensaios de aglutinação em látex, usando, em sua maioria, lisado virai, proteínas recombinantes e peptídeos sintéticos como fonte de antígenos. Atualmente, os ensaios sorológicos não utilizam apenas lisado virai, mas também proteínas recombinantes e peptídeos sintéticos, no intuito de aumentar a sensibilidade da técnica e de diminuir a reatividade cruzada com antígenos de outros vírus como HIV e HCV (BRASIL, 2004).

[0010] Na segunda etapa, é feita a confirmação do diagnóstico de infecção utilizando, para tal, testes com elevada especificidade, ou com elevado valor preditivo positivo, como o ensaio de Western Blot (WB), o ensaio de imunofluorescência indireta em lâmina (IFI), ou ainda, testes moleculares como a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).

[0011] Em 1995, Fujiyama e colaboradores realizaram um estudo publicado no Boletim da Organização Mundial de Saúde (Bulletin of World Health Organization) onde os ensaios de triagem sorológica foram comparados. Foram incluídos dois kits de ensaios de aglutinação e nove kits de ensaios imunoenzimáticos (EIA). Neste estudo, os kits de ensaio de aglutinação apresentam sensibilidade inferior (entre 94 e 95%) em relação aos ensaios de EIA (entre 99,5 a 100%). Assim, em unidades hemoterápicas existe utilização preferencial deste último na etapa de triagem sorológica. Segundo Fujiyama, a menor sensibilidade apresentada pelo método de aglutinação pode estar relacionada à baixa exposição de epítopos quando comparado a ensaios imunoenzimáticos que utilizam vírion de HTLV-1 purificado, proteínas recombinantes e peptídeos sintéticos (FUJIYAMA et al., 1995).

[0012] Em um estudo comparativo, Berini e colaboradores obtiveram resultados controversos em relação ao observado por Fujiyama e colaboradores. Neste estudo, os testes mais sensíveis foram EIA Biokit (BIOKIT, ESPANHA) e INNO-LIA® HTLV I/II (FUJIREBIO, USA), com sensibilidade de 98,6%, seguidos dos ensaios imunoenzimáticos Murex Abbott (ABOTT, USA) (97,2%) e Vironostika (AVIOQ, USA) (96,5%). O maior índice de concordância foi obtido pelo teste Murex Abbott, enquanto o menor foi obtido pelo Vironostika (BERINI et al, 2008). Dos quatro testes avaliados, apenas o Vironostika é aprovado pelo órgão americano de vigilância sanitária, Food and Drug Administration (FDA). No Brasil, Jacob et al (2007) demonstraram que o teste ELISA Vironostika apresentou elevada sensibilidade e especificidade quando usado em populações de alto risco. Recentemente, novos ensaios empregando micropartículas quimioluminescentes para detecção de HTLV- 1 e 2 foram descritos (rHTLVl/2 - Architect, Abbott). Alguns autores têm mostrado a eficiência desse imunoensaio como teste de triagem em larga escala e têm verificado sensibilidade de 100% e especificidade de 99,4% a 99,95% (MALM et al, 2010; KAPPRELL et al, 2010).

[0013] Uma vez que os sub tipos HTLV-1 e 2 são muito semelhantes em sua composição gênica e proteica, há necessidade de realização de testes capazes de diferenciá-los. Roberts et al (1993), avaliaram o desempenho de um ensaio de western blot (WB) modificado, Imunoblot, na confirmação e diferenciação de infecção por HTLV-1 e HTLV-2. Neste ensaio foram utilizadas proteínas recombinantes, como p21e, MTA-1 (específica para HTLV-1), K55 (específica para o HTLV-2) e lisado virai de HTLV-1. Os autores demonstraram que a metodologia apresentou 98,8% de sensibilidade e 100% de especificidade na confirmação e tipagem da infecção pelo HTLV-1 e 2. No entanto, o alto custo envolvido para desenvolver e manter o teste de Imunoblot estimulam o desenvolvimento de novas técnicas com potencial para utilização em países em desenvolvimento.

[0014] Gastaldello et al (1999), realizaram a avaliação do desempenho da técnica de imunofluorescência indireta (IFI) como método confirmatório do diagnóstico de infecção pelo HTLV em relação ao WB. Para isto, analisaram por WB amostras com sorologia positiva ou negativa para HTLV-1 e 2 pertencentes a populações em diferentes graus de risco de adquirir a infecção e determinaram os valores de sensibilidade, especificidade, e valores preditivos positivo e negativo da metodologia em teste. Como fontes de antígenos, foram empregadas as linhagens celulares MT-2 e MT-4 (permanentemente infectadas com HTLV-1) e MoT (permanentemente infectada com HTLV-2). Os valores estimados para sensibilidade e especificidade da IFI foram de 97% e 100%, respectivamente, sendo os valores preditivos positivo e negativo de 100% e 97%, respectivamente, para o sistema utilizando MT-2/HTLV-1. Adicionalmente, demonstrou-se que a IFI implementada pelos autores (MT-2) foi mais sensível quando as amostras foram testadas simultaneamente contra os dois antígenos virais (HTLV-1 e HTLV-2). A concordância global entre a IFI versus WB foi estimada como elevada (GASTALDELLO et al., 1999). Estes resultados indicam que a IFI é uma técnica altamente sensível e específica, sendo adequada para o diagnóstico confirmatório da infecção pelo HTLV-1 e 2 em populações com diferentes graus de risco de infecção, podendo substituir o WB no fluxograma proposto pelo Ministério da Saúde para o diagnóstico sorológico da infecção pelo HTLV-1 e 2 (portaria no 1376 do Ministério da Saúde, ratificada pela Resolução da Diretória Colegiada-RDC n° 153 de 14 de julho de 2004 da ANVISA).

[0015] No que diz respeito às técnicas moleculares, a PCR é um dos métodos de escolha para confirmação do diagnóstico de infecção pelo HTLV-1 e 2. A reação de PCR faz uso de iniciadores específicos para uma determinada região genômica virai do HTLV, permitindo a amplificação exponencial da sequência de escolha. Essa técnica apresenta elevada sensibilidade e especificidade para o diagnóstico de HTLV (CATALAN SOARES et al., 2001, BRASIL, 2004), não depende da presença de anticorpos e possibilita a identificação precoce do vírus (CATALAN SOARES et al., 2001). No entanto, a PCR é uma técnica de custo relativamente elevado, no que tange a sua padronização e desenvolvimento, podendo também apresentar falso-positivos devido a problemas de contaminação, tão frequentes no laboratório de biologia molecular.

[0016] A técnica de PCR em tempo real também vem sendo avaliada para o diagnóstico da infecção pelo HTLV-1. Arruda et al (2007) não observaram diferença significativa na sensibilidade e na especificidade entre a PCR convencional e a PCR em tempo real na identificação do vírus. No entanto, verificou-se a ocorrência de resultados falso-negativos em 8% dos testes com PCR qualitativa. Mais recentemente, ensaios de PCR em tempo real multiplex vêm sendo utilizados para detecção e quantificação do HTLV-1 e 2. Waters e colaboradores, por exemplo, desenvolveram um ensaio com eficiência variando entre 98,8-101,2% e sensibilidade para detecção de 1 cópia de HTLV-1 e HTLV-2 (2011). Já Martins e colaboradores obtiveram sensibilidade de 99,4% em um ensaio similar (MARTINS et al, 2010). Por ser mais sensível, prático e de custo inferior, os autores sugerem o uso da PCR em tempo real como teste confirmatório do HTLV em bancos de sangue em substituição ao WB.

[0017] Além disso, vários estudos têm revelado que a carga proviral estaria associada com o processo de evolução para doença, podendo portanto ser utilizada para o prognóstico de HAM/TSP ou ATL (NAGAI et al, 1998; MONTANHEIRO et al, 2005; KUBOTA et al, 1993; KUBOTA et al, 2003, IWANAGA et al, 2010). Utilizando PCR em tempo real, Montanheiro et al (2005) encontraram diferença estatisticamente significativa na carga proviral de indivíduos assintomáticos infectados pelo HTLV-1 em relação a pacientes portadores de HAM/TSP.

[0018] O desempenho da reatividade de IgG-1 anti-HTLV-1 obtida por citometria de fluxo utilizando células MT-2 como suporte antigênico foi avaliado por COELHO-DOS-REIS et al. (2009) para verificar sua aplicabilidade para o diagnóstico de pessoas infectadas pelo HTLV-1. Os dados mostraram 97% de sensibilidade e 100% de especificidade para este modelo de teste. O método também se mostrou capaz de diferenciar pacientes portadores de mielopatia de pacientes assintomáticos.

[0019] O pedido de patente BR102012005567-8 refere-se a um método para diagnóstico diferencial de doença de chagas, leishmaniose visceral e leishmaniose tegumentar utilizando citometria de fluxo. O teste é realizado através de marcação fluorescente diferencial dos agentes biológicos com concentrações gradativas de substâncias fluorescentes, incluindo Alexa Flúor, e da verificação do perfil de reatividade de IgGl com os agentes biológicos. A análise dos resultados emprega um algoritmo dessincronizado, baseado na detecção do percentual de parasitas fluorescentes positivos em uma sequência pré-estabelecida de 3 avaliações com variações no suporte antigênico e nas diluições de soro. A cada avaliação sequencial é possível confirmar ou excluir a reação a um dos agentes etiológicos envolvidos no teste, de forma que, finalizada a última análise, pode-se confirmar a infecção por leishmaniose visceral, leishmaniose tegumentar, doença de chagas, ou excluir a infecção por um dos três patógenos. [0020] COELHO-DOS-REIS et al. (2017) revela o aperfeiçoamento do protocolo de teste descrito em COELHO-DOS-REIS et al. (2009), correspondente à preparação do suporte antigênico (células MT- 2) de duas maneiras: células apenas fixadas e células fixadas e permeabilizadas. Soro de indivíduos saudáveis não infectados (NI) e infectados pelo HTLV-1, categorizados como as sintomáticos (AS), progredindo para mielopatia (pHAM) ou com diagnóstico clínico de mielopatia (HT) foram avaliados nos dois modelos de preparação do suporte antigênico. A análise revelou bom desempenho dos dois protocolos no diagnóstico da infecção pelo HTLV-1. Por outro lado, o protocolo utilizando células fixadas e permeabilizadas exibiu maior sensibilidade para detectar a soropositividade em pacientes com mielopatia.

[0021] O pedido de patente US 2003/0008410 descreve imunoensaios que utilizam citometria de fluxo para detectar a presença de vários anticorpos em amostras, mais especificamente propõe o uso de suportes sólidos para reações antígeno-anticorpo para detecção de anticorpos em soros por meio de citometria de fluxo, detectando assim múltiplos analitos em uma amostra, incluindo HTLV. Apesar disso, em nenhum momento o pedido descreve um método para diferenciar HTLV-1 de HTLV-2, como no presente pedido.

[0022] No Brasil, a soroprevalência média encontrada entre doadores aptos à doação é cerca de 20 a 100 vezes mais alta do que a relatada para os Estados Unidos e Europa. Esse fato, aliado à extensão territorial e ao tamanho da população, indica que o Brasil abriga o maior número absoluto de indivíduos soropositivos para o HTLV-1 e 2 entre todos os países endémicos. Sem dúvida, tem-se na infecção pelo HTLV um problema de saúde pública (PROIETTI et al., 2006).

[0023] Entre os grandes desafios encontrados pelos pesquisadores envolvidos em estudos sobre HTLV atualmente, destaca-se a busca pela preparação antigênica que possibilite o desenvolvimento de técnicas de caráter confirmatório (com elevada especificidade), tendo em vista o elevado custo e limitações das técnicas atualmente empregadas para o diagnóstico de infecção pelo HTLV-1 e 2 (Ensaios de WB e PCR). Adicionalmente, a necessidade de se desenvolver metodologias que viabilizem análises semi-quantitativas e quantitativas tem emergido na conjuntura do acompanhamento clínico de pacientes infectados pelo HTLV-1, uma vez que a monitoração e avaliação do grau de morbidade destes indivíduos podem ser cruciais para sua qualidade de vida e sobrevivência. Desta forma, o estabelecimento de novas metodologias para o diagnóstico e prognóstico da infecção pelo HTLV-1 e 2 apresenta-se ainda como um vasto campo para investigações.

[0024] O desenvolvimento de uma metodologia de imunofluorescência indireta, baseada em citometria de fluxo, para a análise sorológica em infecções humanas (MARTINS-LILHO et al., 1995; CORDEIRO et al., 2001, ROCHA et al., 2002; VITELLI- AVELAR et al., 2007), trouxe nova perspectiva para os estudos da resposta imune humoral de doenças infecto-parasitárias. Esse método apresenta pouca variabilidade metodológica e sensibilidade e especificidade elevadas devido à utilização de diferentes sistemas de detecção e revelação, uma vez que moléculas fluorescentes acopladas a anticorpos monoclonais são lidos por um sistema de lasers presente no citometro de fluxo. Esta metodologia também tem o potencial para sua utilização em microplacas de 96 poços utilizando microvolumes de reagentes. Isto possibilita não somente um processo de automação, mas também a redução de custos para a realização do teste em bancos de sangue.

[0025] Em conciliação com a metodologia de imunofluorescência indireta utilizando como suporte sólido a linhagem celular MT-2, desenvolvida por GASTALDELLO et al (1999), os inventores do presente pedido têm empregado esta linhagem celular fixada para a detecção de IgG e IgGl anti-HTLV-1 pela técnica de citometria de fluxo. Os dados mostraram elevada performance do método (especificidade de 100%) em distinguir pacientes as sintomáticos e portadores de HAM/TSP. Além disso, observou-se sensibilidade de 93% para IgG e 98% para IgGl, confirmando a alta reatividade de indivíduos infectados com o HTLV-1 e detectadas pelo método proposto (COELHO-DOS-REIS et al, 2009).

[0026] O presente pedido de patente estabelece um protocolo onde é possível avaliar, em plataforma única, a presença de IgGl anti-HTLV-1 e 2 (FC-Duplex HTLV-1 /2-IgGl), utilizando como suporte antigênico células MT-2 (linhagem permanentemente infectada pelo HTLV-1) e MoT (linhagem infectada pelo HTLV-2).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0027] Até o momento, os ensaios imunoenzimáticos, a imunofluorescência e o WB são os testes sorológicos de escolha para a triagem e confirmação diagnóstica da infecção por HTLV, embora apresentem limitações. A PCR também é utilizada como teste confirmatório. Entretanto, estas técnicas possuem limitações como reatividade cruzada, custos elevados e falta de padronização entre os laboratórios. Além do diagnóstico da infecção, há necessidade de realização de testes capazes de diferenciar os subtipos virais HTLV-1 e 2, uma vez que são muito semelhantes em sua composição gênica e proteica e podem causar diferentes patogenias. Desta forma, o estabelecimento de novas metodologias para o diagnóstico da infecção pelo HTLV-1 e 2 apresenta-se ainda como um vasto campo para investigações.

[0028] Neste sentido, a presente invenção propõe um sistema de detecção de anticorpos IgGl, em plataforma única de imunofluorescência por citometria de fluxo, empregando um ensaio de caráter competitivo em plataforma única [MT2(HTLV-l);MoT(HTLV-2)] com sistema de revelação de alta sensibilidade (biotina/avidina/SAPE), associado a um princípio de pareamento sincrônico e assincrônico da reatividade diferencial de IgGl em diluições seriadas (IgGla-MT2 - IgGla-MoT) como passo único para o diagnóstico universal e diferencial da infecção pelo HTLV-1 e HTLV-2, com perspectiva para avaliação prognóstica (AS vs HAM). A avaliação prognóstica é baseada em não apenas identificar infecção ou exposição ao HTLV, mas também a possibilidade do paciente desenvolver doença, ou seja, evoluir de assintomático para paciente com a mielopatia associada ao HTLV-1 bem outras doenças inflamatórias associadas ou doenças de caráter neoplásico. Assim, a metodologia poderá auxiliar no acompanhamento clínico de pacientes assintomáticos.

[0029] Apesar da técnica revelada no pedido de patente

BR102012005567-8 também utilizar algoritmo para a leitura dos resultados, o modo de operação é completamente distinto daquele descrito no presente pedido. Conforme poderá ser avaliado na descrição detalhada da invenção, a análise da reatividade dos soros na diluição 1:32 à célula MT-2 é capaz de diferenciar com acurácia os pacientes infectados com HTLV-1 dos infectados com HTLV-2. Entretanto, alguns indivíduos HTLV-1 assintomáticos não são identificados como infectados pelo método. Após a realização de vários modelos de cálculo, os inventores do presente pedido desenvolveram o algoritmo assincrônico, que consiste na subtração da reatividade de MT-2 (na diluição de 1:32) da reatividade de MoT (na diluição de 1:1024), proporcionando um teste sem qualquer resultado incorreto associado e com menor chance de que a reação exibida por um determinado soro esteja dentro da margem de erro do teste.

[0030] O presente pedido de patente trata de abordagem relevante e pretende contribuir para o diagnóstico sorológico universal e diferencial da infecção pelo vírus HTLV-1 e 2 por citometria de fluxo. Esta metodologia também utiliza microplacas de 96 poços empregando microvolumes de reagentes, possibilitando não somente um processo de automação, mas também a redução de custos para a realização dos testes. Além disso, essa metodologia é de grande aplicação em bancos de sangue dos grandes centros, uma vez que o equipamento utilizado, o citômetro de fluxo, é disponibilizado em todos eles.

[0031] Em relação à diferenciação dos subtipos virais, o método proposto fornece uma solução simples através do pareamento assincrônico de diluições em plataforma única competitiva utilizando simultaneamente antígenos de HTLV-1 e HTLV-2, onde é possível diagnosticar a infecção e diferenciar os subtipos virais em uma única etapa.

[0032] Outra vantagem do método proposto diz respeito ao suporte antigênico, que são células permanentemente infectadas com os subtipos virais já previamente marcadas, não necessitando de realização de protocolos de marcação, o que simplifica a sua utilização. Além disso, o método permite leitura e interpretação dos resultados de forma simplificada, uma vez que diluições pré-determinadas podem indicar a positividade ou negatividade para a infecção e positividade para cada subtipo virai através da segregação em relação ao percentual de células fluorescentes positivas (PCFP).

[0033] Em um aspecto, a presente invenção se refere a um método para diagnóstico ou prognóstico de infecção por HTLV 1 e/ou HTLV2, que consiste em (1) coletar amostras de soro de pacientes; (2) preparar células MT-2 e MoT para fixação e permeabilização celular e, posteriormente, marcar células MT-2 e MoT; (3) misturar soros de indivíduos humanos à preparação de células MT-2 e MoT, com posterior incubação da mistura e lavagem; (4) adicionar anticorpo anti-IgGl biotinilado e revelar com estreptavidina conjugada ao fluorocromo ficoeritrina - PE (SAPE), com posterior incubação da mistura e lavagem; (5) aplicar as amostras em citômetro de fluxo; (6) analisar perfil de reatividade de anticorpos IgGl anti-HTLV-1/2; e (7) avaliar por meio de um algoritmo sincrônico ou assincrônico se há ou não infecção por HTLV 1 e/ou HTLV2. Em uma concretização, as células MT-2 e MoT, na etapa (2), são marcadas diferencialmente por fluorescência. Em outra concretização, a substância fluorescente é selecionada dentre Alexa-fluor, FITC, Chicago Sky Blue, Rodamina, Ficoeritrina, Alloficocianina. Em outra concretização preferencial, a substância fluorescente é Alexa-fluor 647 (AF647). Em outra concretização, é realizada análise da reatividade de anticorpos anti- HTLV-1 e 2 empregando-se histogramas de intensidade de fluorescência em função do número de células, seguindo análise da intensidade de fluorescência relativa (FL2) apresentada pela população selecionada. Em outra concretização, é realizada análise da expressão dos resultados sob a forma de percentual de células fluorescentes positivas (PCFP) em diluições do soro pré-estabelecidas. Em outra concretização, a avaliação da reatividade de IgGl anti-HTLV-1/2 é realizada com o soro diluído a 1:32 tanto para MT-2 e MoT (análise sincrônica) ou assincronicamente, no qual é obtida a subtração entre duas diluições no esquema 1:32 (MT-2) - 1:1024 (MoT).

[0034] Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um kit para diagnóstico de infecção por HTLV 1 e/ou HTLV2 por citometria de fluxo que compreende células linfocíticas em suspensão fixadas e marcadas, infectadas por HTLV-1 (MT-2) e por HTLV-2 (MoT); reagente contendo anticorpos anti-IgGl humano biotinilado; amostra de soro de indivíduos humanos não infectados, como controle negativo; amostra de soro de indivíduos humanos infectados por HTLV 1 e/ou HTLV-2, como controle positivo; e reagente de revelação ou SAPE. Em uma concretização, o kit compreende adicionalmente placas de 96 poços e adesivos de vedação. Em outra concretização, as células MT-2 e MoT são marcadas diferencialmente por fluorescência. Em outra concretização, a substância fluorescente é selecionada dentre Alexa-fluor, FITC, Chicago Sky Blue, Rodamina, Ficoeritrina, Alloficocianina. Em outra concretização, a substância fluorescente é Alexa-fluor 647 (AF647). BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0035] O objetivo da invenção, juntamente com vantagens adicionais da mesma, poderá ser melhor entendido mediante referência às figuras em anexo e às seguintes descrições:

[0036] A Figura 1 mostra a análise da reatividade de anticorpos anti-HTLV-1 e 2, feita inicialmente pela seleção da população celular de interesse, baseada nas características de tamanho versus granulosidade, o que permite o posicionamento do marcador sobre a região correspondente à população de interesse (Figura IA). As células MT-2 e MoT foram incubadas com concentrações menores (MT-2) e maiores (MoT) dos corantes FITC e ALEXA 647 para diferenciação das duas linhagens celulares (Figura 1B). As células foram misturadas e os dois protocolos (FIX - fixação - e FIX&PERM - fixação seguida de permeabilização) foram executados conforme ilustrado na figura 1C.

[0037] A Figura 2 descreve a estratégia de análise da reatividade de anticorpos anti-HTLV-1/2 utilizando plataforma duplex com MT-2 e MoT. Em A, a seleção da população celular linfocítica (Rl), composta pela mistura de MT-2 e MoT, foi realizada com base nas características de tamanho (FSC) versus granulosidade (SSC). Em B, foi utilizada uma abordagem inicial (approach #1) para a diferenciação das células com concentrações menores (MT-2) e maiores (MoT) dos corantes Alexa Fluor

647. A esquerda (Approach #2), a diferenciação das populações coradas com Alexa Fluor 647 foi confirmada por histograma de fluorescência em FL4. Em C, a reatividade de IgGl anti-MT-2 e anti-MoT foi avaliada por meio de histogramas de fluorescência em FL2. A quantificação do percentual de células fluorescentes positivas (PCFP) das amostras foi realizada posicionando o marcador no controle do conjugado (internai control) que apresentou reatividade até 2%. Este mesmo marcador foi posicionado nos histogramas das demais amostras de NI, HTLV-1 e HTLV-2 para avaliar a reatividade de cada amostra.

[0038] A Figura 3 mostra a estabilidade da marcação fluorescente e da avaliação da reatividade de anticorpos anti-HTLV-1/2 utilizando plataforma duplex com MT-2 e MoT. Em A, histogramas de fluorescência FL4 apresentam a estabilidade da marcação de MT-2 e MoT com Alexa Fluor 647 antes, dois, seis e 12 meses após armazenamento. Amostras estocadas até dois meses após preparação foram mantidas à 4°C e -20°C. Em B, a reatividade de IgGl anti-MT-2 e anti-MoT foi avaliada por meio de histogramas de fluorescência em FL2 nas preparações armazenadas por 12 meses à -20°C. Os percentuais de células fluorescentes positivas (PCFP) das amostras NI, HTLV-1 e HTLV-2 foram quantificados conforme descrito anteriormente e está assinalado em cada histograma.

[0039] A Figura 4 apresenta a aplicabilidade do FC-DUPLEX no diagnóstico universal da infecção pelo HTLV-1/2. Curvas de titulação com reatividade média expressa em PCFP das diluições do soro de 1:32 à 1:4.096 demonstram a reatividade de anticorpos anti-HTLV-1/2 utilizando plataforma duplex com MT-2 e MoT em pool de soros NI e HTLV-1/2. As preparações antigênicas foram realizadas com células fixadas (FIX - cinza) e com as células fixadas e permeabilizadas (FIX-PERM - preto). A reatividade média diferencial entre NI e HTLV-1/2 está ilustrada na figura por meio do delta (D). A diluição do soro com maior delta (retângulo cinza pontilhado) foi selecionada para posterior análise em gráficos de dispersão, análise de TG-ROC e curva ROC. O ponto de corte selecionado pela curva ROC permitiu o cálculo de índices de desempenho e respectivos intervalos de confiança, como área sobre a curva (AUC), sensibilidade (Se) e especificidade (Sp), que estão ilustrados no gráfico. [0040] A Figura 5 mostra a aplicabilidade do FC-DUPLEX no diagnóstico diferencial da infecção pelo HTLV-1/2. Curvas de titulação com reatividade média expressa em PCFP das diluições do soro de 1:32 à 1:4.096 demonstram a reatividade de anticorpos anti-HTLV-1/2, utilizando plataforma duplex com MT-2 e MoT em pool de soros HTLV-1 e HTLV-2. As preparações antigênicas foram realizadas com células fixadas (FIX - cinza) e com as células fixadas e permeabilizadas (FIX-PERM - preto). A reatividade média diferencial entre HTLV-1 e HTLV-2 está ilustrada na figura por meio do delta (D). A diluição do soro com maior delta (retângulo cinza pontilhado) foi selecionada para posterior análise em gráficos de dispersão, análise de TG-ROC e curva ROC. O ponto de corte selecionado pela curva ROC permitiu o cálculo de índices de desempenho e respectivos intervalos de confiança, como área sobre a curva (AUC), Co- Negativity (Co-Neg) e Co-Positivity (Co-Pos) que estão ilustrados no gráfico.

[0041] A Figura 6 apresenta otimização do FC-DUPLEX no diagnóstico diferencial da infecção pelo HTLV-1/2. Curvas de titulação sincrônica e assincrônica com reatividade média expressa em PCFP das diluições do soro de 1:32 à 1:4.096 demonstram a reatividade de anticorpos anti-HTLV-1/2, utilizando plataforma duplex com MT-2 e MoT em pool de soros HTLV-1 e HTLV-2. As preparações antigênicas foram realizadas com células fixadas (FIX - cinza) e com as células fixadas e permeabilizadas (FIX-PERM - preto). A reatividade média diferencial entre HTLV-1 e HTLV-2 está ilustrada na figura por meio do delta (D). A diluição do soro com maior delta (retângulo cinza pontilhado) foi selecionada para posterior análise em gráficos de dispersão, análise de TG- ROC e curva ROC. O ponto de corte selecionado pela curva ROC permitiu o cálculo de índices de desempenho e respectivos intervalos de confiança, como área sobre a curva (AUC), Co-Negativity (Co-Neg) e Co-Positivity (Co-Pos) que estão ilustrados no gráfico. [0042] A Figura 7 mostra desempenho do FC-DUPLEX no diagnóstico diferencial da infecção pelo HTLV-1/2. Gráficos de delta PCFP entre reatividade de MT-2 - reatividade de MoT dos algoritmos sincrônico (MT2 1:32 - MoT 1:32) e assincrônicos (MT-2 1:32 - MoT 1:1024; MT-2 1:32 - MoT 1:2048) obtidos para soros de pacientes HTLV- l(n=29) e HTLV-2 (n=26). Em cinza escuro, está representada a “zona cinza” que corresponde à margem de erro arbitrária que aumenta a estringência da análise. Em plano de fundo cinza claro, está representada o algoritmo que produz a menor taxa de indivíduos dentro na “zona cinza”. [0043] A Figura 8 mostra os resultados obtidos para a análise da aplicabilidade do FC-DUPLEX em diferenciar indivíduos as sintomáticos (HAC), possível HAM/TSP (pHAM) e HAM/TSP (HAM). Esta avaliação será feita de tal forma a aplicar a metodologia ao prognóstico da infecção, ou seja, detectar a presença de doença causada pelo vírus. Para tal, curvas de titulação com reatividade média expressa em PCFP das diluições do soro de 1:32 à 1:4.096 demonstram a reatividade de anticorpos anti-HTLV- 1/2, utilizando plataforma duplex com MT-2 e MoT em soros HTLV-1 no intuito de diferenciar indivíduos as sintomáticos (HAC) de indivíduos possível HAM/TSP (pHAM) bem como indivíduos com diagnóstico definitivo de HAM/TSP (HAM). As preparações antigênicas foram realizadas com células fixadas (FIX - cinza) e com as células fixadas e permeabilizadas (FIX-PERM - preto). A reatividade média diferencial entre HAC e HAM está ilustrada na figura por meio do delta (D), ou seja a subtração entre a reatividade demonstrada pelos dois grupos. A diluição do soro com maior delta (retângulo cinza pontilhado) foi selecionada para posterior análise em gráficos de dispersão (scatter plot), análise de TG- ROC e curva ROC. O ponto de corte (cut-off) selecionado pela curva ROC permitiu o cálculo de índices de desempenho e respectivos intervalos de confiança, como área sobre a curva (AUC), Sensibilidade (Se) e Especificidade (Sp) que estão ilustrados no gráfico.

DEFINIÇÕES

[0044] Ao menos que definido de outra forma, todos os termos científicos e técnicos são entendidos por terem os mesmos significados comumente utilizados na técnica que pertencem. Para o propósito da presente divulgação, os termos a seguir são definidos.

[0045] “Compreender” ou variações são usados por todo o relatório descritivo e reivindicações em um sentido inclusivo, isto é, para especificar a presença dos recursos determinados, mas não para excluir a presença ou adição de recursos adicionais que podem aprimorar materialmente a operação ou a utilidade de qualquer uma das modalidades da invenção, a não ser que o contexto exija de outro modo devido à linguagem de expressão ou implicação necessária.

[0046] “Diagnóstico”, conforme usado na presente invenção, refere-se à determinação de uma condição médica, geralmente por meio da investigação da sua história, etiologia e sintomas e aplicação de testes. Tal método envolve uma série de etapas que conduzem à identificação de uma condição clínica, que incluem etapas de análise e interpretação dos dados obtidos.

[0047] “Prognóstico” refere-se à propriedade do teste a ser utilizado para acompanhar pacientes sem sintomas e à previsão da probabilidade de desenvolvimento de uma doença, inclusive se os sintomas irão melhorar, piorar, ou continuar estáveis com o passar do tempo.

[0048] “HTLV 1” e “HTLV 2” refere-se a retro virus associados a doença em humanos.

[0049] “Células MT-2 e MoT” referem-se a células linfocíticas permanentemente infectadas por HTLV-1 e HTLV-2, respectivamente. [0050] O termo “algoritmo sincrônico ou assincrônico” foi utilizado para indicar que as diluições do soro selecionadas para a subtração no algoritmo seriam as mesmas para MT-2 e MoT (sincrônico) ou diluições distintas, não pareadas (as sincrônico).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0051] Embora a presente invenção possa ser suscetível a diferentes concretizações, é mostrada nos desenhos e na seguinte discussão detalhada uma concretização preferida, com o entendimento de que a presente descrição deve ser considerada uma exemplificação dos princípios da invenção e não pretende limitar a presente invenção ao que foi ilustrado e descrito aqui.

MÉTODO PARA DIAGNÓSTICO OU PROGNÓSTICO DE INFECÇÃO POR HTLV 1 E/OU HTLV2

[0052] Em uma primeira concretização, a presente invenção se refere a um método para diagnóstico ou prognóstico de infecção por HTLV 1 e/ou HTLV2, que consiste em (1) coletar amostras de soro de pacientes; (2) preparar células MT-2 (contendo o HTLV-1 na forma de proviras integrado ao genoma celular) e MoT (permanentemente infectadas com o vírus HTLV-2) para fixação e permeabilização celular e posteriormente marcar células MT-2 e MoT; (3) misturar soros de indivíduos humanos à preparação de células MT-2 e MoT, com posterior incubação da mistura e lavagem; (4) adicionar anticorpo anti-IgGl biotinilado e revelar com estreptavidina conjugada ao fluorocromo ficoeritrina-PE (SAPE), com posterior incubação da mistura e lavagem; (5) aplicar as amostras em citômetro de fluxo; (6) analisar perfil de reatividade de anticorpos IgGl anti-HTLV-1/2; e (7) avaliar por meio de um algoritmo sincrônico ou assincrônico se há ou não infecção por HTLV 1 e/ou HTLV2. Em outra concretização as células MT-2 e MoT são marcadas diferencialmente por fluorescência. Em outra concretização, a substância fluorescente é selecionada dentre Alexa-fluor, FITC, Chicago Sky Blue, Rodamina, Ficoeritrina, Alloficocianina. Em outra concretização, a substância fluorescente ser Alexa-fluor 647 (AF647). Em outra concretização, é realizada análise da reatividade de anticorpos anti-HTLV-1 e 2 empregando-se histogramas de intensidade de fluorescência em função do número de células, seguindo análise da intensidade de fluorescência relativa (FL2) apresentada pela população selecionada. Em outra concretização, é realizada análise da expressão dos resultados sob a forma de percentual de células fluorescentes positivas (PCFP) em diluições seriadas do soro pré-estabelecidas. Em outra concretização, o soro pode ser diluído sincronicamente na proporção 1:32 ou assincronicamente no esquema 1:32 (MT-2) - 1:1024 (MoT).

[0053] Importante esclarecer que além de soro humano, podem ser utilizadas amostras de outros fluidos como urina e saliva.

KIT PARA DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO POR HTLV 1 E/OU HTLV2 POR CITOMETRIA DE FLUXO

[0054] Em uma primeira concretização, a invenção se refere a um kit para diagnóstico de infecção por HTLV 1 e/ou HTLV2 por citometria de fluxo que compreende células linfocíticas em suspensão fixadas e marcadas, infectadas por HTLV-1 (MT-2) e por HTLV-2 (MoT); reagente contendo anticorpos anti-IgGl humano biotinilado; amostra de soro de indivíduos humanos não infectados, como controle negativo; amostra de soro de indivíduos humanos infectados por HTLV 1 e/ou HTLV-2, como controle positivo; e reagente de revelação ou SAPE. Em outra concretização, o kit compreende adicionalmente placas de 96 poços e adesivos de vedação. Em outra concretização, as células MT-2 e MoT são marcadas diferencialmente por fluorescência. Em outra concretização, a substância fluorescente é selecionada dentre Alexa-fluor, FITC, Chicago Sky Blue, Rodamina, Ficoeritrina, Alloficocianina. Em outra concretização, a substância fluorescente é Alexa-fluor 647 (AF647).

[0055] Importante esclarecer que além de soro humano, podem ser utilizadas amostras de outros fluidos como urina e saliva.

EXEMPLOS

[0056] Neste projeto foram incluídos como voluntários do estudo: indivíduos não infectados, doadores de sangue da Fundação Hemominas com sorologia negativa para doenças infecciosas e considerados sadios (n=21 ), indivíduos assintomáticos portadores do viras HTLV-1 (n=27) ou HTLV-2 (n=26), pacientes infectados pelo HTLV-1 e portadores da forma clínica oligos sintomática, também denominados pHAM (n=32), pacientes infectados pelo HTLV-1 portadores da forma clínica HAM/TSP (n=29). No total foram utilizadas no projeto 200 amostras de soro.

Critérios de inclusão

Indivíduos adultos entre 18 e 75 anos não infectados, monoinfectados pelo HTLV-1, monoinfectados pelo HTLV-2, coinfectados pelo vírus HIV-1 e HTLV-1 e monoinfectados pelo HIV-1.

Critérios de exclusão Pacientes com deficiência mental;

Pacientes em uso de corticosteróides ou fármacos imunossupressores.

Pesquisa de anticorpos IgGl por citometria de fluxo

[0057] Para a pesquisa dos anticorpos IgGl anti-HTLV-1 e 2, foi empregada amostra de soro obtida após centrifugação de 5mL de sangue coletado em tubo sem anticoagulante. As amostras foram inativadas a 56°C por 30min e centrifugadas a 14.000rpm, 4°C por 5min para remoção de partículas. Após a centrifugação, o sobrenadante foi aliquotado e estocado a -70°C até sua utilização.

[0058] No momento do uso, as amostras foram descongeladas, diluídas em PBS (0,15M pH 7,2, 8,0g/L de NaCl, 2,0g/L de KC1, 2,0g/L de KH2P04 e l,15g/L de Na2HP04) suplementado com 3% de soro fetal bovino -SBF (Sigma Co., USA), centrifugadas a 4°C, 14.000rpm por 5min e os sobrenadantes foram armazenados em geladeira até o uso.

Suporte antigênico virai para Imunofluorescência por Citomeria de Fluxo - Células MT-2 e MoT

[0059] As células MT-2, derivadas de pacientes com ATL, contêm o HTLV-1 na forma de proviras integrado ao genoma celular. Uma vez em cultura, as células MT-2 produzem proteínas virais, dentre as quais, as proteínas do envelope virai (Env) e proteínas estruturais (Gag). Essas proteínas, devido a sua localização, podem ser translocadas para a superfície celular ou permanecer no citoplasma, apresentando-se como principal alvo para os anticorpos específicos presentes no soro de indivíduos infectados pelo HTLV-1 (COELHO-DOS-REIS et al., 2009). [0060] Por este motivo, neste estudo, a estratégia de permeabilização celular após a fixação foi introduzida para aumentar a exposição antigênica e promover o aumento da sensibilidade da técnica aqui proposta, conforme observado em estudo anterior (COELHO-DOS- REIS et al., 2017). Já a linhagem de células MoT é permanentemente infectada com o vírus HTLV-2.

[0061] Nesse estudo, células MT-2 e MoT fixadas e permeabilizadas foram utilizadas como suporte sólido de antígenos virais para a detecção de anticorpos IgGl anti-HTLV-1 e 2. As células MT-2 foram preparadas e cedidas pelo laboratório de reativos para diagnósticos de Bio-manguinhos - FIOCRUZ/RJ. As células MoT (infectadas pelo viras HTLV-2) foram preparadas e cedidas pelo National Institute of Health (NIH, USA).

[0062] A manutenção das células foi feita por passagens semanais.

Brevemente, as células foram semeadas em garrafas de cultura de tecido de 75cm2 (marca TPP), com meio RPMI-20% de SBF e mantidas em estufa a 37oC, 5% de C02, 95% de umidade por 72h para favorecer o crescimento das células. Após esse tempo, a suspensão celular foi homogeneizada e centrifugada a 200rpm, por 10 min., para a eliminação dos grumos celulares. As células não agregadas foram lavadas por duas vezes com PBS suplementado com 0,5% de SBF por meio de centrifugação a 1.300rpm por 10 min. em tubos cónicos de 50mL. Para os ensaios de imunofluorescência a suspensão celular foi fixada e permeabilizada por ressuspensão em solução fixadora para citometria - MFF (10,0g/L de paraformaldeído, 10,2g/L de cacodilato de sódio e 6,65g/L de cloreto de sódio pH7,2). A suspensão celular foi ajustada para 1,0 x 10 6 /mL em PBS-0,5% SBF. É importante ressaltar que foram utilizadas culturas de células MT-2 e MoT em fase log de crescimento afim de se obter maior expressão de antígenos virais e, consequentemente, maior sensibilidade do método.

Exemplo 1

Diferenciação de MT-2 e MoT por citometria de fluxo

[0063] A figura 1 revela a estratégia metodológica para diferenciação de MT-2 e MoT por citometria de fluxo, bem como os passos metodológicos utilizados para a realização do ensaio.

[0064] MT-2 e MoT apresentam sobreposição em gráficos de tamanho e granulosidade obtidos por citometria de fluxo, desta forma, não é possível diferenciar as duas linhagens por esta estratégia, já que possuem perfis morfométricos similares (Figura IA). Diante disso, pensou-se em realizar uma marcação fluorescente diferencial, utilizando fluorocromos FITC e Alexa Fluor 647 em diferentes concentrações para separar as linhagens MoT e MT-2. Tanto o FITC quanto o Alexa Flúor 647 se mostraram eficientes para essa separação (Figura 1B). Como a revelação foi realizada com o fluorocromo PE, que em citometria tem um espectro de emissão de luz na cor laranja, optou-se pelo Alexa Flúor 647, uma vez que não há interferência deste no fluorocromo de revelação.

Exemplo 2

Pesquisa de anticorpo IgGl por citometria de fluxo [0065] Os ensaios de citometria de fluxo para estudo de anticorpos

IgGl anti-HTLV-1 e 2 presente em soros de pacientes infectados foram realizados segundo protocolo para análise sorológica e usando células fixadas como descrito por Coelho-dos-Reis et al., (2009) e com células fixadas e permeabilizadas conforme descrito por Coelho-dos-Reis et al., (2017).

[0066] Conforme descrito na Figura 1, as células MT-2 e MoT foram fixadas e permeabilizadas utilizando protocolo específico e detalhado (Coelho-dos-Reis et al., 2017). Posteriormente, em placas de 96 poços com fundo em “U” (Nunc, Denmark) foram adicionados 50pL do soro diluído em PBS-3% SBF e 50pL da suspensão de células previamente fixada e permeabilizada (1 x 10 6 células/mL - MT-2 e MoT). A mistura foi incubada a 37°C por 30min, lavada 2 vezes com 150pL de PBS-3% SBF por centrifugação (4°C, 1.300rpm por lOmin) e o sobrenadante desprezado (figura 1C).

[0067] Para a pesquisa de anticorpos IgGl, a cada poço da placa foram adicionados 50pL de anticorpo anti-IgGl biotinilado diluído em PBS-3% SBF e 10pL de SAPE diluída em PBS-2% de soro albumina bovina. A mistura foi incubada a 37°C por 30min. Após incubação, as células foram lavadas 2 vezes como descrito acima e o sobrenadante desprezado.

[0068] As amostras foram mantidas a 4°C, ao abrigo de luz, até o momento da leitura no citômetro de fluxo (FACScalibur-Becton Dickinson, San Jose, CA, EUA). O tempo máximo para a coleta dos dados foi sempre inferior a 24h. Os dados coletados foram armazenados, permitindo a análise posterior dos mesmos.

[0069] Para cada ensaio foi feito um controle da reação, onde as células foram incubadas na ausência de soro humano, porém na presença do anticorpo secundário. Obtenção dos dados de citometria de fluxo

[0070] A citometria de fluxo é uma metodologia que utiliza sistema ótico eletrónico, que avalia a emissão de fluorescência e a dispersão de raios lasers incidentes sobre uma célula, permitindo a análise de 3 parâmetros celulares: tamanho (FSC-Forward Scatter), granulosidade ou complexidade interna (SSC-Side Scatter) e a emissão de fluorescência.

Nesse estudo foram utilizados corantes fluorescentes como FITC e Alexa

Fluor 647 para seleção e diferenciação de MT-2 e MoT, metodologia ainda não descrita ou realizada anteriormente, o que consiste em uma das principais estratégias de inovação da presente técnica. Estes fluorocromos foram empregados em concentrações distintas e, quando excitados, emitirão sinais luminosos distintos, correspondentes às fluorescências do tipo 1 (FL1 - fluorescência verde) e do tipo 3 (FL3 - fluorescência vermelha), respectivamente. Por serem populações celulares de tamanho aproximado de 1 pm e de relativa complexidade interna, os ganhos de FSC e SSC foram empregados na escala linear para permitir a identificação das mesmas em gráficos bidimensionais. Para os ganhos de fluorescência (FL1,

FL2 e FL-3) foram empregados os ajustes obtidos após calibração do citômetro utilizando-se o kit CaliBrite da Becton Dickinson. A fluorescência repórter, ou seja, a fluorescência associada à magnitude da reatividade será a FL2 (SAPE). E importante salientar que os mesmos ajustes de fluorescência foram empregados para todos os experimentos, garantindo a possibilidade de estudo comparativo isento de variabilidade metodológica. O eliminador de “debris” foi posicionado empregando o parâmetro de tamanho, pois esta modalidade oferece maiores chances de interferência durante o processo de leitura. A leitura das amostras foi sempre realizada em “listmode” com ambos fotomultiplicadores de fluorescência em escala LOG. O sistema de compensação das fluorescências, que visa eliminar a sobreposição da emissão de luz por diferentes fluorocromos no mesmo comprimento de onda, também foi acionado para permitir a análise posterior dos dados tanto em histogramas individuais quanto em gráficos de FL1 versus FL2 ou FL3 versus FL2. [0071] A análise da reatividade de anticorpos anti-HTLV-1 e 2 foi feita conforme figura 1 para seleção das populações celulares de interesse. Utilizando histogramas de intensidade de fluorescência em função do número de células, foi possível analisar a intensidade de fluorescência relativa (FL2) apresentada pela população selecionada, conforme apresentado na figura 2.

[0072] Os resultados das análises de fluorescência apresentados pelas células após incubação com soros obtidos de indivíduos não infectados, pacientes infectados pelo HTLV-1 ou HTLV-2, foram expressos sob a forma de percentual de células fluorescentes positivas (PCFP), segundo descrito (COELHO-DOS-REIS et al., 2009; COELHO- DOS-REIS et al., 2017). O PCFP foi determinado para cada amostra pelo estabelecimento do limiar de negatividade em função da curva de fluorescência obtida para o controle da ligação inespecífica do conjugado. O posicionamento do marcador seguirá sempre o critério de se obter no máximo 2% de PCFP para o controle do conjugado (figura 2).

[0073] Em seguida, empregando o mesmo marcador foram obtidos os valores de PCFP para amostras individuais (figura 2C). Para cada conjunto de ensaios, um novo marcador foi posicionado empregando o controle do conjugado daquele experimento. Esse tipo de parâmetro oferece algumas vantagens, como facilidade, reprodutibilidade e rapidez para obtenção dos resultados e sua precisão, no que se refere a dados obtidos em análises interlaboratoriais ou em análises realizadas repetidas vezes.

Exemplo 3

Análise da estabilidade e antigenicidade [0074] A análise da estabilidade da marcação e da reatividade antigênica das células foi realizada em duas diferentes condições de acondicionamento (4°C e -20°C) e em 4 momentos (no momento da marcação, dois meses, seis meses e 12 meses após a marcação). O padrão de marcação se manteve estável em todos os momentos a 4°C e a -20°C (Figura 3A). A preparação antigênica armazenada a -20°C se manteve estável em todos os tempos analisados (Figura 3B). O mesmo não foi observado para as preparações mantidas a 4°C, que só permaneceram estáveis até o segundo mês de estocagem. Os resultados indicaram que a marcação com Alexa Fluor 647 foi estável até um ano após a preparação da suspensão celular. A estabilidade da reatividade ao suporte antigênico celular foi igualmente mantida até um ano após a preparação das suspensões celulares (figura 3B).

Exemplo 4

[0075] Para avaliar a aplicabilidade da metodologia da FC-Duplex na detecção da reatividade anti-MT-2/MoT no diagnóstico universal da infecção pelo HTLV-1/2, foram construídas curvas de reatividade para amostras de soros NI e HTLV-1/2 diluídas seriadamente (1:32 a 1:4,096). Dois protocolos de preparação antigênica foram avaliados, sendo um com células apenas fixadas (FIX) e outro com as células fixadas e permeabilizadas (FIX-PERM), conforme mostra a figura 4. Os resultados demonstraram que a diluição de 1:32, utilizando o protocolo FIX, foi a que apresentou maior reatividade média diferencial entre soros NI e HTLV-1/2. Nesta diluição e com ponto de corte de 20%, a técnica apresentou sensibilidade e especificidade elevadas (92% e 94%, respectivamente), com excelente performance (AUC=0.96),

[0076] Para avaliar a aplicabilidade da metodologia da FC-Duplex na detecção da reatividade anti-MT-2/MoT no diagnóstico diferencial da infecção pelo HTLV-1/2, foram construídas curvas de reatividade para amostras de soros HTLV-1 e HTLV-2 diluídas seriadamente (1:32 a 1:4.096). Dois protocolos de preparação antigênica foram avaliados, sendo um com apenas células fixadas (FIX) e outro com as células fixadas e permeabilizadas (FIX-PERM), conforme mostra a figura 5.

[0077] Os resultados demonstraram que a diluição de 1:32, utilizando o protocolo FIX, foi a que apresentou maior reatividade média diferencial entre soros HTLV-1 e HTLV-2. Nesta diluição e com ponto de corte de 40%, a técnica apresentou co-negatividade e co-positividade elevadas (100% e 96%, respectivamente) com excelente desempenho (AUC=0.99).

[0078] Apesar do excelente desempenho da metodologia FC-

DUPLEX no diagnóstico universal e diferencial da infecção pelo HTLV- 1/2, alguns indivíduos HTLV-1, assintomáticos, não foram identificados como infectados pelo método. Desta forma, com o objetivo de melhorar o desempenho do teste, foi proposta a realização de um algoritmo assincrônico baseado na subtração da reatividade de MT-2 - MoT. Após a realização de vários cálculos, esse modelo de subtração foi escolhido como mais adequado, com base no fato de que a reatividade de uma das células poderia ser a reatividade de “background”, ou seja, a reatividade de interferência que deveria ser subtraída da reatividade obtida para a linhagem alvo (MT-2 para HTLV-1 e MoT para HTLV-2).

[0079] O termo sincrônico/assincrônico foi utilizado para indicar que as diluições do soro selecionadas para a subtração seriam as mesmas (sincrônico) para MT-2 e MoT ou diluições distintas, ou seja, não pareadas - (assincrônico), conforme ilustra a figura 6. Os resultados do algoritmo sincrônico indicaram que a diluição de 1:32 demonstrou o maior delta de segregação entre a reatividade obtida para MT-2 e MoT. Em relação ao algoritmo assincrônico, a subtração da reatividade de MT-2 (na diluição de 1:32) da reatividade de MoT (em todas as diluições testadas) apresentou deltas com valores superiores a 60%. A análise da curva ROC, utilizando os pontos de corte indicados por esta análise, apontou que o algoritmo sincrônico apresentou resultados com elevado desempenho com AUC, Co- neg e Co-pos de 1,00, indicando que não houve resultados incorretos, ou seja, falso-positivos e falso-negativos quando se aplicou o algoritmo. O mesmo foi observado para o algoritmo assincrônico, baseado na subtração da reatividade de MT-2 na diluição de 1:32 das reatividades obtidas para as diluições de MoT 1:1024 e 1:2048.

[0080] Considerando que os algoritmos sincrônico (MT2 1:32 -

MoT 1:32) e assincrônicos (MT- 2 1:32 - MoT 1:1024; MT-2 1:32 - MoT

1:2048) obtiveram desempenho semelhante conforme indicado pela curva

ROC, foi aplicada uma análise mais estringente, considerando uma margem de erro de 10%. Desta forma, como mostrado na figura 7, o algoritmo que apresentou o menor número de indivíduos dentro da margem de erro, denominada zona cinza, foi o esquema MT-2 1:32 - MoT 1:1024. E importante ressaltar que os três algoritmos apresentaram resultados verdadeiros de 100%. No entanto, o esquema MT-2 1:32 - MoT 1:1024 apresentou um menor número de resultados na zona cinza quando aplicado a zona de erro arbitrária possível do teste, ou seja esse esquema permitiu a detecção de um maior número de resultados confiáveis.

Exemplo 5

[0081] Para verificar o potencial da metodologia em predizer ou identificar casos de doença e diferencia-los de indivíduos as sintomáticos, ou seja, para avaliar o valor prognóstico do teste, curvas de reatividade expressas em PCFP foram plotadas para os protocolos Fix e Fix&Perm utilizando MT-2 e MoT conforme pode ser observado no painel superior da figura 8. Utilizando ferramentas estatísticas, foi possível observar que a metodologia tem valor prognóstico, sendo capaz de diferenciar a reatividade de soros de indivíduos assintomáticos (HAC) de pacientes (HAM/TSP).

[0082] Quanto a fins prognósticos para a identificação de pacientes

HAM/TSP, o desempenho foi elevado com acurácia de 99% (AUC=0,99 IC 0,95-1,00), demonstrando a segregação entre a maioria dos indivíduos infectados assintomáticos (HAC) e com HAM/TSP (HAM). Para segregar estes dois grupos, a curva ROC selecionou o ponto de corte de 60% que determinou co-positividade (HAM, 89%) e co-negatividade (HAC, 89%) relevantes. Como demonstrado na figura 8, o melhor desempenho foi obtido para suporte antigênico de MT-2 com a diluição do soro de 1:256 (delta=62%), ponto de corte na curva ROC em 60%, com área sobre a curva 0.99, sensibilidade e especificidade de 89%, com 40% dos indivíduos testados com características semelhantes aos indivíduos sintomáticos e com 60% assemelhando-se a indivíduos assintomáticos. Alguns estudos ainda são necessários para se corroborar o desempenho do método para prognóstico. Como perspectiva o grupo pretende avaliar os mesmos indivíduos 10 anos após essa primeira análise.

Exemplo 6 Análise Estatística

[0083] Neste estudo, foi utilizada como ferramenta estatística a

Receiver Operating-Characteristics curve, ou curva ROC, no intuito de avaliar a acurácia global do método aplicado. A curva ROC além de indicar a acurácia do método permite identificar com precisão o ponto de corte associado ao menor número de resultados incorretos.

[0084] O desempenho do método FC-Duplex HTLV-l/2-IgGl foi avaliado segundo os índices expressos em porcentagem e em chance. Os índices expressos em porcentagem incluíram: a Sensibilidade ou Co- positividade = [verdadeiros positivos/ verdadeiros positivos + falsos negativos] x 100; Especificidade ou Co-negatividade = [verdadeiros negativos/ verdadeiros negativos + falsos positivos] x 100; Valor preditivo positivo - VPP = verdadeiros positivos/ total de positivos x 100; Valor preditivo negativo - VPN = verdadeiros negativos/ total de negativos x 100 (COELHO-DOS-REIS et al., 2009); Probabilidade de infecção/doença pós- teste negativo = 1 - (verdadeiros negativos/ total de negativos) x 100; e Eficiência = prevalência da amostra x Sensibilidade + (1 - prevalência da amostra) (GREINER et al., 1995). Outra ferramenta estatística que foi utilizada para a avaliação do desempenho da metodologia foi a Two- Graph-ROC (TG-ROC) (GREINER et al, 1995). A TG-ROC possibilita a visualização de uma ampla faixa de valores de ponto de corte para sensibilidade e especificidade.

[0085] Os softwares utilizados para a construção das curvas e análise dos dados foram os programas estatísticos CMDT (GREINER et al, 1995) e MEDCALC, versão gratuita disponível na internet (http://www.medcalc.be/download.php) e PRISM GraphPad software (San Diego, CA, USA).

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