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Title:
METHOD FOR THE ENZYMATIC CONTROL OF PITCH DEPOSITS FORMED DURING PAPER PULP PRODUCTION USING AN ESTERASE THAT HYDROLYSES TRIGLYCERIDES AND STEROL ESTERS
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2002/075045
Kind Code:
A1
Abstract:
The invention relates to the selection of a mushroom, Ophiostoma piceae, which secretes a commercial esterase. The invention also relates to the production and characterisation of the enzyme and the application tests carried out on synthetic process liquids and pulps representative of paper pulp production processes using hardwood and softwood. The results obtained demonstrate that the novel enzyme possesses great affinity and activity in relation to cholesterol linoleate, oleate, tributyrin and triolein, said enzyme being able to reduce the concentrations of sterol esters and triglycerides during the treatment of process liquids from the production of eucalyptus and pine pulps respectively.

Inventors:
CALERO RUEDA OLGA (ES)
GUTIERREZ SUAREZ ANA (ES)
DEL RIO ANDRADE JOSE CARLOS (ES)
MUNOZ MARTIN MARIA DEL CARMEN (ES)
PLOU GASCA FRANCISCO JOSE (ES)
MARTINEZ FERRER ANGEL TOMAS (ES)
MARTINEZ HERNANDEZ MARIA JESUS (ES)
Application Number:
PCT/ES2002/000120
Publication Date:
September 26, 2002
Filing Date:
March 14, 2002
Export Citation:
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Assignee:
CONSEJO SUPERIOR INVESTIGACION (ES)
CALERO RUEDA OLGA (ES)
GUTIERREZ SUAREZ ANA (ES)
DEL RIO ANDRADE JOSE CARLOS (ES)
MUNOZ MARTIN MARIA DEL CARMEN (ES)
PLOU GASCA FRANCISCO JOSE (ES)
MARTINEZ FERRER ANGEL TOMAS (ES)
MARTINEZ HERNANDEZ MARIA JESUS (ES)
International Classes:
C12N9/18; C12N9/20; D21C9/08; (IPC1-7): D21C9/08; C12N9/18; C12N9/20; D21C11/00
Domestic Patent References:
WO2000053843A12000-09-14
WO1994023052A11994-10-13
WO1993010224A11993-05-27
Other References:
CALERO-RUEDA O. ET AL.: "Control biologico del pitch: caracterizacion de una lipasa de ophiostoma piceae", 1999, XVII CONGRESO NACIONAL DE MICROBIOLOGIA SOCIEDAD ESPANOLA DE MICRABIOLOGIA GRANADA
GOA Y., BREUIL C.: "Propierties and substrate specifities of an extracellular lipase purified from ophiostoma piceae", WORLD JOURNAL OF MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, vol. 14, 1998, pages 421 - 429
MARTINEZ M.J. ET AL.: "Fungal screening for biological removal of extractives from eucalyptus globulus wood", CAN. J. BOT., vol. 77, 1999, pages 1513 - 1522
Attorney, Agent or Firm:
Represa, Sánchez Domingo (113 - 2 Planta Madrid, ES)
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Claims:
REIVINDICACIONES MODIFICADAS [recibidas por la oficina Internacional el 20 de septiembre de 2002 (20.09. 2002); reivindicaciónes 1-25 reemplazadas por les reivindicaciónes 1-27 modificadas (4 paginas)]
1. Esterasa ftngica que combina propiedades catalíticas de lipasas (EC 3.1. 1. 3) y esterol esterasas (EC 3. 1. 1.13) caracterizada porque los esteres de esteroles que hidrohliza son esteres de sitosterol, colesterol, stigmastanol, iucosterolj, cicloartenol, 24 metilencicloartenol y citrostadienol con dcidos grasos, eu particular oleico y linoleico, y los gliceridos que ludfolixa son triglicéridos, diglicéridos y monog ! icendos dc acidos grasps, en particular oleico y linoleico, 2.
2. E sterasa se gún la reivindicación 1, c aracterizada p orque es p roducida p or h ongos ascomicetos productores del llamado "azulado" de la madera.
3. Esterasa segun la reivindicationes 1 y 2, caracterizada porque es producida por hongos del genero Ophiostoma.
4. Esterasa según la reivindicaciones 13, caraetcfizada porque la eslerasa aplicada es producida por la especie Ophiostoma piceae.
5. Esterasa según la reivindicationes 14, caracterizada porque la secuencia Nterminal es la SEQ.ID.NO 1.
6. Esterasa segun las reivindicacions 15, caracterizada porque es una gHcoproteina con un 8% de carbohidratos unidos por enlaces Nglicosidicos y una masa molecular estimada por electroforesis en condiciones desnaturalizantes de 56,5 kDa.
7. sterasa según la reivindicación 16, caracterizada proque es producida por la cepa CECT 20416 de Ophiostoma piceae 8Psterasa según las reivindicaciones 17 caracterizada por ser una esterasa recombinante codificada por el gen de la esterasa de Oplziostoma picea CECT 20416.
8. Procedimiento para la obtención de la esterasa de Ophiostoma piceae CECT 20416 según las reivindicaciones 17, caracterizado por la producción de la enzima en oultivo liquido del hongo, que puede incluir un compuesto lipídico como inductor ; y su posterior purificación mediante cromatografía de interacción hidrofóbica.
9. Procedimiento para la obtencion de la a esterasa recombinante sgún la reivindicación 8 que incluye@i) La amplificación por PCR (reaccidn de polimerasa en cadena) de una sonda utile ado como iniciadores oligonucleótidos que codifican la sccuencia Nterminal de la esterasa purificada de Ophiostomv piceae (SEQ.ID.NO 1) y secuencias intemas de dicha proteína y DNA o cDNA del mismo hongo como molde; ii) la uiilizaciou de dicha sonda para realizar el"screening"de una liberia de cDNA de Ophiostoma picae; iii) la clonación del gen que codifica la enzima en un vector adccuado ; y i v) su expresion h eterologa en alguno delos organismosusadosparala produccion industrial de enzimas.
10. Utilización de una esterasa sa segín las reivindicatciones 18, para el control de los dep6si. tos de brea (pitch) ofrmados durante la fabricación de pasta de papel caracterizada porque la madera utilizada como materia prima para la fabricacion de pasta de papel es madera de frondosas (angiosperm as leñosas).
11. Utilización de la esterasa serin la Teivindicaci6n 11, caracterizada porque la madera utilizada como materia prima para la fabricación de pasta de papel es madera de species de eucalipto, chopo, álamo, o abedul.
12. Utilización de la esterasa según las reivindicación 12, caracterizada poruqe la madera utilizada como materia prima para la iaMcacion de pasta de papel pertenece a las species Eucalptus globulus, Eucalyptus camaldulensis, Eucalyptus grandis, Populus tremula, Populus tremuloides, Betula pendula o Betula tremula.
13. Utilización de la esterasa seg) ln las reivindicacion 11, caracterizada porque la madera utilizada como materia prima paa la fabricación de pasta de papel es madera de conifers (gimnospermas leflosas). 15.
14. Utilización de la esterasa según la reivindicación 14, caracterizada porque ta madera utilizada como materia pmna para la fabricaci6n de pasta de papel es madera de species de Pinus o Picea.
15. Utilización de la esterasa según las reivindicación 15, caracterizada porque la madera utilizada como materia prima para la fabricación de pasta de papel pertenece a las species Pinus sylvestris, Pinus taeda, Pinus contorta, Pinus virginiana, o Picea abies.
16. Utilización de la esterasa segun las reivindicaciones 1116, caracterizada porque la pasta de papel se fabrica mediante los procedimientos de pulpeo de la madera denominados mecánicos. 18Utilización de la esterasa sogen las reivindicaciones lllG, catacterizada porque la pasta de papel se fabrica mediate los procedimientos de pulpeo de la madera denominados químicos, 19.Utilización de la esterasa según las reivindicación 18, cxaracterizada porque la pasta de papel se. f. abrica mediante lo. s procedimientos de pulpeo quimicos dcnominados coccion kraft o cocci6n al sulfito.
17. 20Utilizaci6n de la esterasa serin las reivindicaciones 1116, caracterizada porque la pasta de papel se fabrica mediante una combinción de los procedimientos de pulpeo de la madera denominados naccamcos y quimicos.
18. 21Utilización de la esterasa begun las reivindicationes 1820 caracten7. ada porque la pasta de papel se blanquea por los procedimentos denominados ECF (libres de cloro elemental).
19. 22Utilización de la esterasa segfin las reivindicaciones 1 S20, caracterizada porque la pasta de papel sc blanquea por los procedimientos denominados TCF (totalmentc libres de cloro).
20. 23Utilización de la esterasa según las reivindicationes 13, 19, 21 y 22 caracterizada porque el control cnzim. ático de los depositos de"pitch"se apIica durante la fabricacidjl de pasta kraft de madera de Eucalyptus globulus blanqueada mediante procedimientos EC : I ; o TCF.
21. 24Utilizacion de la esterasa segel las reivindicaciones 1123, caracterizada porque la esterasa utilizada para el control ematico del"pitch"se aplica a la pasta tras la coccion, durant el blanqueo o al término de este a una temperatura comprendida entre 4°C y 60°C y un pH entre 3j5 y 8, preferentemente entre 3,5 y 6,5 por un tiempo entre 10 minutos y 24 horas, preferentemente entre 1 y 6 horas.
22. 25Utilización de la estcrasa segun las reivindicaciones 1123, caracterizada porque la esterasa utilizada para el control enzimatico del"pitch"se aplica a los lfquidos de proceso procedentes de la cocción, el lavado de la pasta, o el blanqueo de la misma a una temperatura comprendida entre 4°C y 60°C y un pH entre 3,5 y 8, prcferentementc entre 3, 56, 5 por un tiempo entre 10 minutos y 24 horas, preferentemente entre 1 y 6 horas.
23. 26Utilizacion de la esterasa segun la reivindicaci6n 24, caracterizada porque la concentacion de la esterasa utilizada está comprendida entre 0, 05 50 U/g de pasta, preferentemente entre 0,1 5 U/g de pasta, mas preferentemente entre 0, 1 1 U/g de pasta.
24. 27 Utilización de la esterasa según la reivindicación 25, caractedzada porque la concentración de la esterasa utilizada esta comprendida entre 0, 050 50 U/l de liquid de proceso, preferentemente entre 0, 15 U/l de liquido de proceso, mas preferentemente entre 0,11 U/I de liquido de proceso.
Description:
TÍTULO Procedimiento para el control enzimático de los depósitos de brea (pitch) formados durante la fabricación de pasta de papel utilizando una esterasa que hidroliza tanto triglicéridos como ésteres de esteroles.

SECTOR DE LA TÉCNICA La invención va dirigida al sector industrial de producción de pasta de papel, para empresas que utilizan madera tanto de frondosas como de coníferas como materia prima. Utilizando la invención descrita es posible i) hidrolizar los ésteres de esteroles y triglicéridos procedentes de la fracción extraíble de la madera, ii) disminuir los problemas de depósitos en las pastas de papel causados por estos compuestos ; y iii) reducir los costos en los procesos industriales de fabricación de pasta y papel. Respecto al segundo punto, con el tratamiento enzimático se disminuye la concentración ésteres de ácidos grasos en las pastas y líquidos de proceso lo que redunda en un aumento en la calidad del producto final al reducirse et nivel de depósitos. Respecto al tercero, este tratamiento puede reducir el número de interrupciones por depósitos de"pitch" (en castellano brea o betún) en los procesos industriales de fabricación de pasta y papel, con el consiguiente ahorro de tiempo y energía.

ESTADO DE LA TECNICA La fabricación de pastas de papel mediante tecnologías no contaminantes ha traído consigo nuevos problemas en la producción y blanqueo de la pasta. Entre estos problemas ocupa un lugar importante la formación de depósitos que reducen la calidad del producto final, e incluso obligan a la realización de paradas técnicas en las máquinas, produciendo graves pérdidas en este sector industrial (Hillis y Sumimoto, 1989). A los depósitos oscuros que se producen durante el proceso de fabricación de la pasta y el papel causados por componentes de la fracción extraíble de la madera se les denomina depósitos de"pitch" (en castellano brea o betún). A menudo otros productos, p. ej. restos de gomas procedentes de la maquinaria y/o diferentes aditivos presentes en las aguas de proceso, se incorporan también a dichos depósitos donde las breas actúan como aglomerantes.

Los componentes de la fracción extraíble de la madera (obtenida utilizando tolueno- etanol, diclorometano o acetona) implicados en la formación de depósitos de"pitch" son generalmente de naturaleza lipofilica (solubles en cloroformo o hexano) e incluyen grasas, ceras, alcohols grasos, ácidos grasos, terpenos, esteroles y ésteres de esteroles (Hillis, 1962). La problemática de la formación de depósitos de"pitch"en la fabricación de pasta de coníferas se ha estudiado mucho en los últimos años debido al uso mayoritario de este tipo de madera en los principales países productores de pasta (USA, Canadá y los países nórdicos de la UE). Entre los procedimientos tradicionales ensayados para el control del"pitch"se encuentran : el descortezado de la madera, el almacenamiento a la intemperie de troncos o astillas y la adición a las pastas y/o líquidos de proceso de agentes que limiten la deposición del"pitch" (Allen, 1980; Allen, 1988). Sin embargo, tales métodos no han sido suficientes para eliminar los problemas de deposición de"pitch"en la pasta de papel.

Como alternativa a los métodos químicos, en los últimos años, se han desarrollado para el control de"pitch"métodos biológicos que se basan en el uso de microorganismos o sus enzimas. En la actualidad existen preparados comerciales para inocular la madera con microorganismos (Chen et al., 1994; Farrell et al., 1993) y complejos enzimáticos comerciales con actividad lipasa para tratar las pastas. Entre las lipasas estudiadas cabe destacar los estudios realizados con la lipasa recombinante (expresada en Aspergillus oryzae) producida por Novozymes (anteriormente Novo Nordisk) y comercializada con el nombre de Resinasa A, y las lipasas de Candida rugosa y Candida cylindraceae. Los resultados obtenidos tratando pasta mecánica de madera de pino con estas lipasas ponen de manifiesto que se hidrolizan los triglicéridos, que se han identificado como los principales responsables de los depósitos de"pitch"en estas maderas (Fischer y Messner, 1992; Fujita et al., 1992). En la actualidad existen tres patentes internacionales que describen la posibilidad de utilizar lipasas para reducir los problemas de pitch en la industria de pasta y papel. En la primera, W09207138, se describe la reducción de algunos componentes resínicos de las maderas, principalmente los triglicéridos, al añadir diferentes dosis de lipasas en la etapa reductora de fabricación de pastas termomecánicas. En la segunda, W09213130, se describe la utilización de una lipasa en el proceso de fabricación de pasta que resiste temperaturas alrededor de 70°C.

En la tercera, US 5,256,252, se describe un método para el control de pitch con lipasa y polímeros catiónicos que captan los ácidos grasos liberados por las enzimas.

Sin embargo, a pesar de que los problemas de"pitch"se pueden disminuir en las pastas de conifers, que contienen en sus extractos cantidades importantes de triglicéridos (Fengel y Wegener, 1984 ; Rowe, 1989), el tratamiento con estas enzimas no es efectivo para evitar los problemas de"pitch"en las pastas de diferentes frondosas y, en particular, en las pastas kraft de Eucalyptus globulus (una especie muy utilizada por la industria papelera en España y Portugal) y otras especies del mismo género.

En los últimos años, las investigaciones llevadas a cabo para caracterizar los extraíbles de la madera de eucalipto han puesto de manifiesto que los triglicéridos constituyen una fracción pequeña en los extraíbles de la madera de Eucalyptus globulus, en los que se han detectado principalmente compuestos de tipo esterol y ésteres de esteroles responsables de los depósitos de"pitch"de la pasta kraft (del Río et al., 1998; Gutiérrez et al., 1999a). Estos compuestos permanecen en la pasta TCF (totalmente libre de cloro) después de la cocción y el blanqueo (del Río et al., 2000). Otras especies de frondosas, como el Populus tremuloides muy utilizado para la fabricación de pasta de papel en América del Norte, también contienen cantidades significativas de esteroles libres y esterificados que dan lugar a problemas de"pitch" (Serreqi et al, 2000). Por otra parte, estos compuestos también forman parte de los extraíbles de la madera de coníferas con contenidos importantes en algunas de ellas, como es el caso de la madera de Picea abies (Claassen et al., 2000 ; Serreqi et al., 2000) Los ésteres de esteroles son problemáticos por su resistencia a la hidrólisis química durante la cocción kraft (comparados con los triglicéridos que son eliminados en forma de sales de ácidos grasos), pero también dan lugar a problemas de"pitch"durante la fabricación de pastas mecánicas a partir de maderas con alto contenido en estos compuestos. Recientemente se ha descrito que existen hongos capaces de degradar selectivamente (para evitar pérdidas en el rendimiento de la fabricación de pasta), los compuestos problemáticos en la fracción extraíble de la madera de Eucalyptus globulus (Gutiérrez et al., 1999b ; Martínez et al., 1999) y de Pinus sylvestris (Martínez-Íñigo et al., 1999). Este hecho ha desencadenado la búsqueda de nuevas enzimas que puedan utilizarse para reducir los problemas que causan estos compuestos.

En la actualidad existen dos patentes que mencionan la posibilidad de utilizar enzimas de tipo esterol esterasa para eliminar ésteres de esteroles durante la fabricación de pasta de papel. En la primera, W09423052, se purifica una enzima de Pseudomonas fragi y se sugiere la posibilidad de utilizarla en la hidrólisis de compuestos lipofilicos presentes en pasta de papel, aunque no se describen las condiciones en que las pastas deberían tratarse, ni los resultados tras tratar la pasta con estas enzimas. En la segunda, W00053843, se comprueba la efectividad de algunos crudos enzimáticos de hongos y bacterias en la degradación de ésteres de esteroles en el tratamiento de un líquido de proceso de pasta termomecánica de madera de Picea abies y se indica la posibilidad de utilizar estos crudos en combinación con la lipasa comercial Resinasa A (que como se mencionó anteriormente, se limita a hidrolizar glicéridos) en los procesos de fabricación de pasta de papel. En esta patente se menciona la posibilidad de que los crudos enzimáticos de hongos y bacterias puedan tener además de actividad esterol esterasa, actividad lipasa, hemicelulasa, pectinasa y ligninasa, aunque no se realiza ningún ensayo para comprobar si existen estas actividades.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Et objeto de la presente invención es un procedimiento para el control enzimático de los depósitos de brea (pitch) formados durante la fabricación de pasta de papel mediante la aplicación de esterasas que hidrolizan ésteres de esteroles. Las esterasas aplicadas hidrolizan asimismo glicéridos. Preferentemente, la esterasa aplicada es producida por hongos ascomicetos productores del llamado"azulado"de la madera, específicamente por hongos del género Ophiostoma y más en particular por la especie Ophiostoma piceae.

El procedimiento objeto de la presente invención se aplica a procesos de fabricación de pasta de papel en los que la madera utilizada como materia prima es madera de frondosas (angiospermas leñosas), en particular de especies de eucalipto, chopo, álamo o abedul y más en particular de Eucalyptus globulus, Eucalyptus camaldulensis, Eucalyptus grandis, Populus tremula, Populus tremuloides, Betula pendula o Betula trémula.

Asimismo puede aplicarse el procedimiento de la invención cuando la madera utilizada es madera de conifers (gimnospermas leñosas), en particular de especies de pino o

picea y más en particular de Pipits sylvestri. r, PII11Is taeda, Pirus coWorta, Pirrus virgitziana, o Picea abies.

El procedimiento es aplicable cuando la pasta de papel se fabrica mediante los diversos procedimientos de pulpeo de la madera : mecánicos, químicos (específicamente los denominados cocción kraft o cocción al sulfito), o combinaciones de los mismos. Es asimismo válido para los diversos métodos de blanqueado : ECF (libres de cloro elemental), TCF (totalmente libres de cloro).

En el procedimiento de la invención las esterasas se aplican a la pasta tras la cocción, durante el blanqueo o al término de éste a una temperatura comprendida entre 4°C y 60°C y un pH entre 3,5 y 8, preferentemente entre 3,5 y 6,5 por un tiempo entre 10 minutos y 24 horas, preferentemente entre 1 y 6 horas. La concentración de las esterasas utilizadas está comprendida entre 0,05-50 U/g de pasta, preferentemente entre 0,1- 5 U/g de pasta, más preferentemente entre 0,1- 1 U/g de pasta consiguiéndose una hidrólisis de hasta el 95% de los ésteres de esteroles presentes y de hasta un 70% de los triglicéridos presentes.

Cuando el procedimiento se aplica a los líquidos de proceso procedentes de la cocción, el lavado de la pasta o el blanqueo de la misma se hace igualmente a una temperatura comprendida entre 4°C y 60°C y un pH entre 3,5 y 8, preferentemente entre 3,5 y 6,5 por un tiempo entre 10 minutos y 24 horas, preferentemente entre 1 y 6 horas. La concentración de las esterasas utilizadas está comprendida entre 0,050-50 U/l de líquido de proceso, preferentemente entre 0,1-5 U/l de líquido de proceso, más preferentemente entre 0,1-1 U/l de líquido de proceso consiguiéndose una hidrólisis de hasta el 95% de los ésteres de esteroles presentes y de hasta un 70% de los triglicéridos presentes.

En todos los casos el procedimiento permite hidrolizar preferentemente los siguientes ésteres de esteroles : sitosterol, estigmastanol, fucosterol, cicloartenol, 24- metiléncicloartenol y citrostadienol.

Constituye otro objeto de la presente invención un preparado enzimático para el control de los depósitos de brea (pitch) formados durante la fabricación de pasta de papel producido en un medio de cultivo para Ophiosloma piceae que incluye un compuesto lipídico como inductor. La esterasa producida por Ophiostoma piceae es purificada

mediante cromatogarafia de interacción hidrofóbica, preferentemente Hip-Trap Octyl Sepharose (Pharmacia).

La esterasa utilizada puede ser una esteras recombinante codificada por el gen de la esterasa de Ophiostoma piceae, obtenida por un procedimiento que incluye : i) La amplificación por PCR (reacción de polimerasa en cadena) de una sonda utilizando como iniciadores oligonucleótidos que codifican la secuencia N-terminal de la esterasa purificada de Ophiostoma piceae (TTVNVKYPEGEWG) y secuencias internas de dicha proteina y DNA o cDNA de mismo hongo como molde ; ii) la utilización de dicha sonda para realizar el"screening"de una librería de cDNA de Ophiostoma piceae ; iii) la clonación de gen que codifica la enzima en un vector adecuado; y iv) su expresión heteróloga en alguno de los organismos usados para la producción industrial de enzimas.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Fig. 1. Producción de esterasa de Ophiostoma piceae. Evolución de proteínas, sustancia reductoras (S. R.) y actividad enzimática utilizando como sustratos p-nitrofenil butirato (pNPB), p-nitrofenil palmitat (pNPP) y colesteril oleato (COL).

Fig. 2. Purificación de la actividad esterasa de Ophiostoma piceae Perfil cromatográfico del cnudo enzimático de Ophiostoma piceae, obtenido por ultrafiltración, en la columna de interacción hidrofóbica"Hip-Trap Octyl Sepharose" (Pharmacia).

Fig. 3. Hidrólisis enzimática de extraíbles pon icos de madera de eucalipto. A) Cromatografia de gases de la fracción soluble en cloroformo de los extraíbles de Eucalyptus globulus tratada durante 3 h con esterasa de Ophiostoma piceae hervida (control). B) Análisis de esta fracción tras 3 h de incubación con la enzima nativa.

Fig. 4. Hidrólisis enzimática de extraíbles lipofilicos de madera de pino. A) Cromatografia de gases de la fracción soluble en cloroformo de los extraíbles de Pinus sylvestris tratada durante 3 h con esterasa de Ophiostoma piceae hervida (control). B) Análisis de esta fracción tras 3 h de incubación con la enzima nativa.

Fig. 5. Hidrólisis enzimática de los compuestos lipofílicos presentes en pasta termomecánica de madera de Picea abies A) Cromatografia de gases de la fracción soluble en cloroformo de los extraíbles de la pasta de Picea abies tratada durante 3 h con esterasa de Ophiostoma piceae hervida (control). B) Análisis de esta fracción tras 3 h de incubación con la enzima nativa.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los estudios para el desarrollo de la presente invención se iniciaron con la búsqueda de hongos que produjeran enzimas lipolíticas involucradas en la degradación de compuestos responsable de la formación de depósitos de"pitch" (brea) en pastas de papel, especialmente de frondosas donde hasta el momento no se había descrito ninguna enzima efectiva.

Los trabajos comenzaron con un"screening"de hongos productores de lipasas/esterasas. Los hongos estudiados (Tabla I), un total de 28 especies pertenecientes a las divisiones Ascomycota y Basidiomycota y al grupo de los denominados hongos imperfectos o deuteromicetos, procedían de las colecciones de cultivos del Centro de Investigaciones Biológicas de CSIC (IJFM) en Madrid y del Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) en Baarn (Países bajos). A estos hongos se añadieron 2 cepas del ascomiceto Ophiostoma piliferum comercializadas por Cariant como Cartapip@ 58 y 57. La capacidad de estos hongos para producir enzimas lipolíticas fue investigada tal como se describe en el apartado siguiente.

Tabla I.-Relación de cepas fúngicas empleadas. CBS = Centraalbureau vor Schimmelcultures ; IJFM=Instituto Jaime Ferrán de Microbiología (Colección de CIB); MSD=Merck Sharp & Dhome.

Familia Colección Origen IJFM Basidiomicetos Bjerkandera adusta Coriolaceae A581 CBS 595. 78 Coniophora puteana Coniophoraceae A676 carpóforo (ENCE-Pontevedra) Crepidotusvariabilis Crepidotaceae A675 carpóforo (Viascón-Pontevedra) Dichomitus squalens Polyporaceae A631 MSD3-92 Funolia trogii Coriolaceae A615 Dra. Alconada Ganoderma australe Ganodermataceae A130 carpóforo (Chiloe-Chile) Melanotus hepatochrous Strophariaceae A673 carpóforo (ENCE-Pontevedra) Phanerochaete chrysosporium Meruliaceae A547 CBS 481. 73 Phlebia chrysocrea Meruliaceae A469 carpóforo (Futrono-Chile) Phlebia radiata Meruliaceae A588 CBS 184.83 Pleurotuseryngii Lentinaceae A169 CBS 613. 91 Pleurotus ostreatus Lentinaceae A579. CBS 411. 71 Pleurotuspulmonarius Lentinaceae A578 CBS 507. 85 Phellinus torulosus Hymenochaetaceae A630 MSD3-152 Schizophyllumcommune Schizophyllaceae A360 carpóforo (Quemchi-Chile) Trametes versicolor Coriolaceae A136 carpóforo (Exeter-Inglaterra) Ascomicetos Nectria coccinea Hypocreaceae A669 carpóforo (ENCE-Pontevedra) Ophiostoma microsporum Ophiostomataceae A645 CBS 412.77 Ophiostoma megalobrunneum Ophiostomataceae A644 CBS 560.83 Ophiostoma piceae Ophiostomataceae A237 Dr. Butin (Alemania) Ophiostoma piliferum Ophiostomataceae A638 Cartapip 58/S Ophiostoma piliferum Ophiostomataceae A639 Cartapip 97 Ophiostoma valdivianum Ophiostomataceae A641 CBS 454.83 Dcuteromicetos Alternaria sp. Pleosporaceae* A672 pastillas eucalipto (ENCE-Pontevedra) Fusarium oxysporum Hypocreaceae''A685 Dr. Tello Geotrichum candidum Dipodascaceae A640 CBS 820.71 Kirramyces eucalypti A671 Carpóforo (ENCE-Pontevedra) Periconia igniaria-A668 astillas eucalipto (ENCE-Pontevedra) * teleomorfo en la familia citada.

Búsqueda de hongos con actividad esterasa En una primera etapa se seleccionaron hongos productores de esterasa en un ensayo en placas de Petri con agar-Tween 80 y calcio, basándonos en un método descrito por Nuero et al. (1994). Los hongos que hidrolizan el Tween 80 (oleato de polioxietilen sorbitano), crecen y, en presencia de Ca2+, forman oleato cálcico que precipita formando

un halo alrededor de la colonia. Los hongos productores de halos en placas de agar- Tween 80 (Tabla II), se cultivaron en medio líquido con glucosa y tartrato amónico (Guillén et al., 1992), suplementado con 0,5% de peptona y añadiendo al cuarto día de incubación 0,5% de aceite de oliva, con el fin de inducir las actividades enzimáticas objeto de este estudio. En este caso la actividad esterasa se determinó utilizando p- nitrofenil butirato (pNPB) (Plou et al., 1998) y p-nitrofenil palmitato (pNPP) (Hoshino et al., 1992). Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima capaz de liberar 1 llmol dep-nitrofenol en un minuto.

Tabla II.-Detección de actividad lipasa en placas de agar-Tween 80 : formación de un halo alrededor de la colonia Halo Basidiomicetos Bjerkandera adusta + <BR> <BR> Coniophora puteana Crepidotus variabilis <BR> <BR> Dichomitus squalens Ganoderma australe + Melanotus hepatochrous <BR> <BR> Phanerochaete chrysosporium- Phlebia chrysocrea- Phlebia radiata- Pleurotus eryngii + Pleurotus ostreatus + <BR> <BR> Pleurotus pulmonarius Phellinus torulosus Schivophyllum commune <BR> <BR> Trametes versicolor + Ascomicetos Nectria coccinea + <BR> <BR> Ophiostoma microsporum Ophiostoma melanobrunneum Ophiostoma piceae + Ophiostoma piliferum + Ophiostoma piliferum + Ophiostoma valdivianum + Deuteromicetos Alternaria sp. + Fusarium oxysporum + Geotrichum candidum + Kirramyces eucalypti <BR> <BR> Periconia igniaria +

Entre todos los hongos estudiados solo los del género Ophiostoma (Ophiostoma piceae, Ophiostoma piliferum y Ophiostoma valdiviamem) y Fusarilxm (Fusarium oxysponum) produjeron una enzima capaz de hidrolizar pNPB y pNPP en medio líquido.

Para detectar si estos hongos tenían enzimas capaces de hidrolizar los ésteres de esteroles implicados en la formación de depósitos de"pitch", se buscó actividad esterol- esterasa en los cultivos utilizando colesteril oleato. Esta actividad enzimática se determinó utilizando 1 mM colesteril oleato en Tris-HCI 25 mM, pH 7, estabilizado con 0,2% de deoxicolato sódico y 1% de goma arábiga (en las mismas condiciones que el pNPP). La reacción se llevó a cabo a 37°C y se paró hirviendo 5 min. El colesterol libre formado en la reacción se determinó a 405 nm por el método enzimático comercializado por Boehringer. Este ensayo puso de manifiesto que de los 4 hongos citados anteriormente sólo Ophiostoma piceae presentaba actividad apreciable sobre ésteres de esteroles. La Fig. 1 muestra la evolución de las actividades enzimáticas, así como de las proteínas y sustancias reductoras, en los cultivos de Ophiostoma piceae.

Producción y purificación de la esterasa de Ophiostoma piceae Entre todos los hongos estudiados, Ophiostoma piceae fue seleccionado para llevar a cabo este estudio por : i) los altos niveles de actividad esterasa producida en medio líquido detectada utilizando como sustratos pNPP y pNPB ; y ii) su actividad sobre colesteril oleato, un sustrato utilizado para detectar la actividad esterol-esterasa, que podría estar implicada en la degradación de los ésteres de esteroles presentes en los extraíbles de eucalipto y otras maderas y en los depósitos que se encuentran en las pastas. Este hongo se encuentra en la colección del Centro de Investigaciones Biológicas, en la colección"Instituto Jaime Ferrán de Microbiología" (IJFM) identificado con el n° A237 y en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) identificado con el n° 20416 (fecha de depósito 1-03-2001).

La producción de la enzima se estudio en presencia de 0, 0,25,0,5,1 y 2% de aceite de oliva (añadido a los 4 días de incubación). Los niveles de actividad fueron mayores en presencia de 0,5% de aceite de oliva, no incrementándose a concentraciones mayores. El crudo enzimático para purificar la esterasa se obtuvo en el medio con 0,5% de aceite de oliva a los 12 días de incubación. El micelio se separó por centrifugación y el líquido de cultivo se concentró por ultrafiltración, utilizando una membrana de 5000

Da (Filtrón). La actividad durante el proceso de purificación se analizó utilizando pNPB como sustrato.

El líquido ultrafiltrado se equilibró con (NN4) 2SO4 2 M y se aplicó a un cartucho de interacción hidrofóbica (Hip-Trap Octyl Sepharose, de Pharmacia), equilibrada con la misma concentración de (NH4) 2S04 en Tris-HCl 25 mM, pH 7. Las proteínas retenidas se eluyeron con un gradiente lineal decreciente de (NH4) 2S04 (2-0 M) en 30 min, a un flujo de 1 ml/min. Las proteínas mas hidrófobas, que todavía quedaban retenidas, se eluyeron con 0,1% de Tritón X-100 en el mismo tampón. En estas condiciones se obtuvo un único pico con actividad esterasa, que eluía con el Tritón (Fig. 2).

La Tabla III resume el proceso utilizado para purificar la esterasa de Ophiostoma piceae. Se obtuvo la enzima pura, con un rendimiento del 69%, después de la ultrafiltración y un solo paso cromatográfico.

Tabla III.-Proceso de purificación de la esterasa de Ophiostoma piceae. La actividad enzimática durante el proceso de purificación se determinó utilizando como sustrato pNPB.

Actividad Proteínas Rendimiento Actividad Grado de específica purificación U mg % U/mg Líquido 5000 97,5 100 51,3 1,0 Ultrafiltrado 4150 52,8 83 78,6 1,5 Octyl-Sepharose 3450 28,5 69 121,1 2,4 Características físico-químicas de la esterasa de Ophiostoma piceae El peso molecular de esta proteína fue estimado por SDS/PAGE en 56,5 kDa y el pl en 3,3. La enzima es una glicoproteína, con un 8% de carbohidratos unidos por el enlaces N-glicosídicos. La secuencia N-terminal de la esterasa de Ophiostoma piceae es : TTVNVKYPEGEWG. La Tabla IV muestra la comparación de las propiedades de esta enzima con otras lipasas purificadas de Ophiostoma piceae y Ophiostoma piliferum.

Como podemos ver, la enzima purificada en este trabajo presenta el peso molecular y la secuencia N-terminal semejante a dos isoenzimas descritas como lipasas de Ophiostoma

piliferum (Brush et al., 1999) y es muy diferente de una lipasa caracterizada de Ophiostoma piceae (Gao y Breuil, 1998).

Tabla IV.-Propiedades de distintas esterasas/lipasas caracterizadas en hongos del género Ophiostoma.

Pm pl Carbohidrato Secuencia N-terminal Da (%) Esterasa O. piceae 56. 5 3. 3 8 TTVNVKYPEGEWG LipasaO. piceae 35 4. 1 10 TTTDIDALAFFTAW (GaoyBreuil 1998) Lipasa O. piliferum I 60 3.8 8 TTVDVDYPEGKVTG (Brushetal., 1999) Lipasa 0. piliferum n 52 3.6 0 TTVDVDYPEG (Brush et al., 1999) El efecto del pH en la velocidad inicial de la hidrólisis de pNPB, en tampón acetato y fosfato 50 mM, reveló que la esterasa de Ophiostoma piceae caracterizada en este trabajo, presentaba su mayor actividad entre pH 6 y pH 8 a temperatura ambiente, mantenía un 80% de actividad a los tres días de incubación entre pH 4 y pH 6,5 y era estable a pH 6 durante 12 horas entre 4 y 30 °C.

Especificidad de sustrato Generalmente, para la determinación de la actividad esterasa o lipasa es necesario emulsionar los distintos ésteres mediante el empleo de agentes tensioactivos. Por esta razón las constantes cinéticas aparentes, constante de Michaelis-Menten (K",) y la velocidad máxima (V,,,.), se han estudiado en el presente trabajo utilizando distintos sustratos y las mismas condiciones de reacción. Estas incluyen 1% polioxoetilen-10- tridecil eter en el caso de las reacciones con ésteres de p-nitrofenol, y 10% de polioxoetilen-10-tridecil eter y NaCI 0,15 M en el caso de la trioleina, tributirina y ésteres de colesterol. De esta forma el tamaño de las micelas es siempre el mismo y se puede comparar la afinidad de la enzima frente a los diferentes sustratos. Las constantes cinéticas de esta esterasa frente a pNPB y pNPP se estimaron valorando el p-nitrofenol liberado (método descrito anteriormente) y frente a los diferentes ésteres de colesterol y la tributirina y trioleina se estimaron en un pH-estato, valorando los ácidos grasos liberados con NaOH 50 mM a 25°C. En este caso una unidad de actividad enzimática se

define como la cantidad de enzima que libera 1 pmol de ácido graso por minuto a 25°C.

La representación de la velocidad de reacción frente a la concentración de sustrato dio en todos los casos curvas de saturación del tipo Michaelis-Menten Las constantes cinéticas de la esterasa de Ophiostoma piceae se muestran en la Tabla V. En esta tabla podemos ver que la esterasa tiene una afinidad comparable por el pNPB y el pNPP, aunque la velocidad máxima aparente fue mayor con el sustrato de cadena mas larga.

Otras lipasas/esterasas presentan mayor afinidad por sustratos de cadena mas corta (Druet et al., 1992; Plou et al., 1997). En este sentido, recientemente se ha descrito mayor hidrólisis de ésteres de p-nitrofenol con ácidos grasos de cadena corta por una lipasa de Ophiostoma piliferum, aunque este estudio se realizó utilizando en todos los casos la misma concentración de sustrato (2,5 mM éster de p-nitrofenol, 2% tritón in 50 mM PIPES, pH 6,9) (Brush et al., 1999). Sin embargo, la influencia positiva de ácidos grasos de cadena más larga también se ha descrito en una lipasa de Ophiostoma piceae (Gao y Breuil, 1998), aunque en este estudio no se determinó la afinidad de la enzima, sino sólo la velocidad de hidrólisis de distintos ésteres de esteroles a la misma concentración de sustrato (0.75 mM de éster de esterol, 5% dimetilsulfóxido, 0,4% tritón X-100,0,2% goma arábiga y tampón acetato 50 mM, pH 5,4). Como se ha comentado antes, esta lipasa de Ophiostoma piceae tiene distinto peso molecular, pI y N-terminal que la enzima caracterizada en este trabajo.

Tabla V.-Constantes cinéticas de la esterasa de Ophiostoma piceae : Constantes cinéticas aparentes de esta enzima frente a p-nitofenol ésteres, triglicéridos y colesterol <BR> <BR> ésteres.<BR> <P>K/Km<BR> mM s. R-l sr pNPB C4 : 0 0,33 45 137 pNPP C16 : 1 0,33 69 210 Tributirina C4 : 0 5,87 42 7 Trioleina C18 : 1 0,01 174 23818 Colesteril butirato C4 : 0 1,54 12 7 Colesteril palmitato C 16 : 0 0,13 14 101 Colesteril estearato C 18 : 0 0,05 7 156 Colesteril oleato C18 : 1 0,09 53 616 Colesteril linoleato C18 : 2 0,08 91 1092

En el caso de los triglicéridos y los ésteres de colesterol, la presencia de ácido grasos de cadena larga también incrementa la afinidad por el sustrato y la velocidad de la reacción. Cabe destacar que la especificidad de esta esterasa de Ophiostoma piceae por la trioleina es 3370 veces mayor que por la tributirina, indicando la preferencia de la enzima por sustratos muy hidrofóbicos. Aunque la posibilidad de hidrolizar ésteres de esteroles ya se había detectado en las lipasas de Ophiostomapiceae (Gao y Breuil, 1998) y Ophiostoma piliferum (Brush et al., 1999), es la primera vez que se hace un estudio de especificidad sobre estos sustratos. Además la nueva esterasa de Ophiostoma piceae hidroliza mas rápidamente los ésteres de colesterol que las otras lipasas.

Según los resultados obtenidos en et estudio de especificidad, y a pesar de que esta esterasa de Ophiostoma piceae tiene una afinidad por la trioleina y tributirina similar a otras lipasas comerciales (EC 3.1.1.3), esta enzima también muestra afinidad sobre los ésteres de esteroles, no detectada en las lipasas, por lo pensamos que debe incluirse en el grupo de las esterol esterasas (EC 3.1.1.13). Por último comentar que la mayor eficacia de esta esterasa sobre los ésteres de esteroles es sobre los formados con el ácido oleico y linoleico, que representan la fracción mayoritaria de los ésteres de esteroles en la fracción extraíble de madera de eucalipto (20 y 62% respectivamente) (Gutiérrez et al., 1999a). Esta propiedad resulta de gran interés, tal como se puede observar en los ejemplos 1 y 2 por su posible aplicación en sector papelero, en el que los depósitos de estos compuestos producen grandes pérdidas económicas.

MODO DE REALIZACION DE LA INVENCION Ejemplo 1 Tratamiento enzimático de líquidos de proceso : Fabricación de pasta de eucalipto Para comprobar la efectividad de la esterasa de Ophiostoma piceae en el tratamiento de los líquidos de proceso durante la fabricación de pasta de eucalipto se estudió la transformación de una suspensión acuosa de la fracción lipofilica de los extraíbles de la madera de Eucalyptus globulus (líquido de proceso sintético). Esta fracción rica en ésteres de esteroles involucrados en la formación de depósitos de"pitch" (del Río et al., 1998, Gutiérrez et al., 1998) se obtuvo tras extraer la madera de Eucalyptus globulus en Soxhlet con acetona durante 6 h, y secar el extracto en estufa de aireación a 60°C. La fracción soluble en cloroformo de estos extraíbles de eucalipto (500 ug), donde se

encuentran los compuestos lipofilicos responsables de los depósitos de"pitch", se suspendió en tampón Tris-CIH 25 mM, pH 7, conteniendo 0.186 % desoxicolato sódico y 0.09 % goma arábiga, y se incubó durante 3 horas a temperatura ambiente con 185 mU de la esterasa de Ophiostoma piceae. Simultáneamente se realizaron controls con enzima hervida. Tras el tratamiento enzimático los compuestos lipofilicos se extrajeron con cloroformo y analizaron en un cromatógrafo Hewlett Packard HP 5890 equipado con un detector de llama y una columna capilar de sílice de 5m x 0,25 mm y 0,1 Um de espesor de película (DH5-HT de J & W Scientific), utilizando helio como gas portador.

La temperatura del inyector y del detector fue 300 °C y 350 °C respectivamente. El horno se programó de 100 °C (1 min) a 350 °C (3 min) a 15 °C/min. Los esteroles libres y esterificados se cuantificaron utilizando una curva de calibración realizada con mezclas de sitosterol y colesteril oleato (los coeficientes de correlación fueron mayores del 99%).

Los análisis de las muestras por cromatografia de gases ponen de manifiesto que la esterasa de Ophiostoma piceae hidroliza los ésteres de esteroles presentes en los líquidos de proceso de la producción de pasta de eucalipto procedentes de la fracción lipofilica de los extraíbles de la madera (Fig 3). Estos compuestos están involucrados en los depósitos de"pitch"durante el pulpeo de estas maderas. La cuantificación de la eficacia de estos tratamientos mostró una disminución del contenido en ésteres de esterol del 71%.

Ejemplo 2 Tratamiento enzimático de líquidos de proceso : Fabricación de pasta de pino Con el fin de comprobar la eficacia de la esterasa de Ophiostoma piceae en el tratamiento de los líquidos de proceso durante la fabricación de pasta de pino se trató una suspensión acuosa de la fracción lipofítica de los extraíbles de Pinus sylvestris (líquido de proceso sintético) con la esterasa de Ophiostoma piceae. Los extraíbles de Pinus sylvestris (Claassen et al., 2000) fueron obtenidos según se indica en el ejemplo 1. También en este caso se trataron 500 ptg de la fracción soluble en cloroformo con 185 mU de actividad esterasa durante 3 h en las condiciones descritas en el ejemplo 1.

Los análisis por cromatografia de gases de los tratamientos de la fracción extraíble de pino con la esterasa de Ophiostoma piceae (Fig 4) ponen de manifiesto que la enzima

hidroliza los triglicéridos presentes en los líquidos de proceso durante la fabricación de pasta mecánica de madera de pino. Estos compuestos son mayoritarios en los extraíbles de pino y causan depósitos de pitch. La cuantificación de estos tratamientos mostró una disminución de un 43% en los triglicéridos y un 20% en los ésteres de esteroles (a pesar de que estos últimos son una fracción minoritaria en los extractos).

Ejemplo 3 Tratamiento enzimático de pastas : Fabricación de pasta termomecánica de Pfcca abies La eficacia de la esterasa de Ophiostoma piceae en la degradación de triglicéridos y ésteres de esteroles presentes en pastas, se llevó a cabo utilizando pasta termomecánicas de Picea abies, cuyo contenido en triglicéridos y ésteres de esteroles representa el 30% y 20% respectivamente de la fracción extraíble (Sjóstróm, 1992). 10 g de pasta seca se trataron durante 3h con 10 U de la esterasa en un volumen de 200 mi de tampón fosfato pH 6,10 mM y 0.05% desoxicolato sódico. Simultáneamente se realizaron controls con enzima hervida. La pasta tratada enzimáticamente se liofilizó y se extrajo en Soxhlet con acetona durante 6 h. La fracción extraíble se secó y los compuestos solubles en cloroformo se analizaron por cromatografia de gases y se cuantificaron tal como se indica en los ejemplos 1 y 2.

Los análisis de las muestras por cromatografia de gases (Fig 5) ponen de manifiesto que la esterasa de Ophiostoma piceae hidroliza tanto los triglicéridos como los ésteres de esteroles presentes en la pasta de picea. La cuantificación de estos tratamientos mostró una disminución del 87% de triglicéridos y del 46% de los ésteres de esteroles.

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