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Title:
METHOD FOR THE ENZYMATIC SYNTHESIS OF DIOSMETIN DERIVATIVES
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2014/131995
Kind Code:
A1
Abstract:
A method for the enzymatic synthesis of diosmetin derivatives of formula (III):

Inventors:
PEDRAGOSA MOREAU SANDRINE (FR)
LEFOULON FRANÇOIS (FR)
Application Number:
PCT/FR2014/050422
Publication Date:
September 04, 2014
Filing Date:
February 27, 2014
Export Citation:
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Assignee:
SERVIER LAB (FR)
International Classes:
C12P17/06; C07D311/30; C07D311/32; C07H17/07
Foreign References:
EP2107055A12009-10-07
EP1783193A12007-05-09
US20080274519A12008-11-06
EP2107055A12009-10-07
Other References:
LUCRECIA PIÑUEL ET AL: "Operational stabilization of fungal -rhamnosyl--glucosidase by immobilization on chitosan composites", PROCESS BIOCHEMISTRY, ELSEVIER, NL, vol. 46, no. 12, 19 September 2011 (2011-09-19), pages 2330 - 2335, XP028328610, ISSN: 1359-5113, [retrieved on 20110928], DOI: 10.1016/J.PROCBIO.2011.09.014
ANDREIA F. M. FURTADO ET AL: "Hesperidinase encapsulation towards hesperitin production targeting improved bioavailability", JOURNAL OF MOLECULAR RECOGNITION, vol. 25, no. 11, 24 November 2012 (2012-11-24), pages 595 - 603, XP055084389, ISSN: 0952-3499, DOI: 10.1002/jmr.2224
BER., vol. 76B, 1943, pages 452 - 7
ARCHIV DER PHARMAZIE, vol. 316, no. 3, 1983, pages 219 - 22
LIEBIGS ANNALEN DER CHEMIE, 1991, pages 1285 - 9
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Claims:
REVENDICATIONS dans laquelle Rl 5 R2 et R3, identiques ou différents, représentent chacun un atome d'hydrogène ou le groupement de formule (A) :

par hydrolyse enzymatique de la diosmine en diosmétine, à l'aide d'une enzyme rutinase,

dans un mélange de solvant organique et de tampon à pH de 2 à 6,

à une concentration enzymatique supérieure ou égale à 1 g/L,

à un ratio E/S de 50/1 à 1/50,

à une température de 25°C à 50°Q la diosmétine ainsi obtenue étant isolée puis mise en réaction avec le bromure de méthallyle, pour conduire au composé de formule (VII) :

dont la transposition par chauffage conduit au composé de formule (Illa), cas particulier des composés de formule (III) pour lequel R] ; R2 et R3 représentent chacun un atome d'hydrogène :

que l'on fait réagir, lorsque l'on souhaite accéder aux autres composés de formule (III), avec le composé de formule (VIII) :

dans laquelle Ac représente le groupement acétyle, pour conduire, après déprotection de la fonction acide et des fonctions alcool du groupement (A), aux composés de formule (III) pour lesquels au moins l'un des Rj, R2 et R3 est différent de H.

2. Procédé de synthèse du composé de formule (III) :

dans laquelle Rj, R2 et R3, identiques ou différents, représentent chacun un atome d'hydrogène ou le groupement de formule (A) :

HO O

par hydrolyse enzymatique de l'hespéridine en hespérétine, à l'aide d'une enzyme rutinase,

dans un mélange de solvant organique et de tampon à pH de 2 à 6,

à une concentration enzymatique supérieure ou égale à 1 g/L,

à un ratio E/S de 50/1 à 1/50,

à une température de 25°C à 50°C,

Γ hespérétine ainsi obtenue étant isolée puis déshydrogénée en diosmétine par chauffage avec de l'iode dans la pyridine ou la morpholine, la diosmétine ainsi obtenue mise en réaction avec le bromure de méthallyle, pour conduire au composé de formule (VII) : dont la transposition par chauffage conduit au composé de formule (Illa), cas particulier des composés de formule (III) pour lequel ¾, R2 et R3 représentent chacun un atome d'hydrogène :

que l'on fait réagir, lorsque l'on souhaite accéder aux autres composés de formule (III), le composé de formule (VIII) :

dans laquelle Ac représente le groupement acétyle, pour conduire, après déprotection de la fonction acide et des fonctions alcool du groupement (A), aux composés de formule (III) pour lesquels au moins l'un des Rls R2 et R3 est différent de H.

3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, où l'enzyme rutinase est choisie parmi les naringinases et hespéridinases de Pénicillium decumbens et Aspergillus niger et les aromases de Pénicillium multicolor.

4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, où le ratio solvant organique/tampon dans l'étape d'hydrolyse enzymatique, exprimé en L/L, est compris entre

1 /50 et 1/5.

5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, où le solvant organique dans l'étape d'hydrolyse enzymatique est choisi parmi le DMSO, le DMF, le THF, les alcools et l'acétone.

Description:
PROCEDE DE SYNTHESE ENZYMATIQUE DE DERIVES DE DIOSMETINE

La présente invention a pour objet un procédé de synthèse enzymatique de dérivés de diosmétine de formule (III) :

dans laquelle ¾, R 2 et R 3 , identiques ou différents, représentent chacun d'hydrogène ou le groupement de formule (A) :

Les dérivés de diosmétine de formule (III), ainsi que leur activité dans la prévention et le traitement des maladies veineuses et leur préparation à partir de diosmétme, ont été décrits dans le brevet EP 2 107 055.

La diosmétine, un composé de la famille des flavones, est un intermédiaire-clé dans la préparation des composés de formule (III).

La publication Ber. 1943, 76B, pp 452-7, décrit l'obtention de la diosmétine par bromation du triacétate de l'hespérétine puis réaction avec la soude. La publication Archiv der Pharmazie 1983, 316(3), 219-22 décrit la préparation de la diosmétine par chauffage de l'hespérétine dans la pyridine, en présence d'iode.

La publication Liebigs Annalen der Chemie 1991, (12), 1285-9, décrit l'obtention de la diosmétine par pyrolyse à 300°C de la diosmine, son 7-O-rutinoside. Cependant, la diosmétine est obtenue en mélange avec de la diosmine non réagie et le monoglycoside de formule (IV) :

Le problème de la présente invention était d'accéder à la diosmétine à partir de son rutinoside, la diosmine, avec un procédé performant, notamment avec un bon rendement, en minimisant la quantité de monoglycoside dans le produit final et dans des conditions moins drastiques qu'en chimie traditionnelle.

Plus spécifiquement, la présente invention concerne un procédé de synthèse du dérivé de diosmétine de formule (III) :

dans laquelle Rj, R 2 et R 3 , identiques ou différents, représentent chacun un atome d'hydrogène ou le groupement de formule (A).:

par hydrolyse enzymatique de la diosmine de formule (Va) :

dans laquelle R est un groupement rutinose, à l'aide d'une enzyme rutinase,

dans un mélange de solvant organique et de tampon à pH de 2 à 6, préférentiellement environ 4, à une concentration enzymatique supérieure ou égale à 1 g/L,

à un ratio E/S de 50/1 à 1/50, préférentiellement environ 1/5,

à une température de 25°C à 50°C,

la diosmétine ainsi obtenue étant isolée puis mise en réaction avec le bromure de méthallyle, pour conduire au composé de formule (VII) :

dont la transposition par chauffage conduit au composé de formule (Illa), cas particulier composés de formule (III) pour lequel R 1} R 2 et R 3 représentent chacun un atome d'hydrogène

que l'on fait réagir, lorsque l'on souhaite accéder aux autres composés de formule (III), avec le composé de formule (VIII) :

dans laquelle Ac représente le groupement acétyle, pour conduire, après déprotection de la fonction acide et des fonctions alcool du groupement (A), aux composés de formule (III) pour lesquels au moins l'un des Rj, R 2 et R 3 est différent de H.

La présente invention s'étend également à la préparation du composé de formule (III) par hydrolyse enzymatique de Phespéridine de formule (Vb) :

dans laquelle R est un groupement rutinose, à l'aide d'une enzyme rutinase,

dans un mélange de solvant organique et de tampon à pH de 2 à 6, préférentiellement environ 4, à une concentration enzymatique supérieure ou égale à 1 g/L,

à un ratio E/S de 50/1 à 1/50, préférentiellement environ 1/5,

à une température de 25°C à 50°C,

l'hespérétine ainsi obtenue étant isolée puis déshydrogénée en diosmétine par chauffage avec de l'iode dans la pyridine ou la morpholine, la diosmétine ainsi obtenue étant transformée en composé de formule (III) comme décrit précédemment.

Par enzyme rutinase, on entend enzyme capable d'hydrolyser la diosmine de formule (Va) ou l'hespéridine de formule (Vb) en son aglycone, soit en formant directement la diosmétine ou l'hespérétine et le rutinose, soit par hydrolyse successive des parties rhamnose et glucose, par une double activité enzymatique alpha-L-rhamnosidase et beta-D-glucosidase, les produits formés étant alors la diosmétine ou l'hespérétine, le rhamnose et le glucose.

Les enzymes rutinases sont préférentiellement choisies parmi les naringinases, hespéridinases et aromases, plus particulièrement les naringinases et hespéridinases de Pénicillium decumbens et Aspergilhis niger et les aromases de Pénicillium midticolor.

Le ratio solvant organique/tampon est préférentiellement compris entre 1 /50 et 1/5 (exprimé en L/L).

Le solvant organique est préférentiellement choisi parmi le DMSO, le DMF, le THF, les alcools tels que le méthanol ou l'éthanol et l'acétone.

La concentration en substrat est préférentiellement comprise entre 1 et 25 g/L, plus préférentiellement entre 2 et 7 g de composé de formule (V) par litre de mélange de solvants.

Les exemples suivants illustrent la présente invention. Les structures des composés décrits dans les exemples ont été déterminées selon les techniques spectrophotométriques usuelles (infrarouge, résonance magnétique nucléaire, spectrométrie de masse). ABREVIATIONS

ACN ACétoNitrile

ATFA Acide TriFluoroAcétique

DMF : DiMéthylFormamide

DMSO : DiMéthylSulfOxyde

E/S : ratio Enzyme/Substrat exprimé en g/g

HPLC : Chromatographie en Phase Liquide à Haute Performance

RMN : Résonance Magnétique Nucléaire

THF : TétraHydroFurane

TMS : TétraMéthylSilane

tr/min tours/min

EXEMPLE 1 : Diosmétine par hydrolyse enzymatique de la diosmine avec: Pénicillium multicolov

Dans un fermenteur réacteur double enveloppe de 5L (Sartorius), 15g (c=5g/L) de diosmine sont solubilisés dans 150mL de DMSO et ajoutés à 3L de tampon acétate 20mM pH=4,0.

10g (c=3,3g/L) d'aromase de Pénicillium multicolov (Amano-Japon) sont alors ajoutés au milieu. Le milieu réactionnel est maintenu à 30°C, sous agitation mécanique 220 tr/min pendant 48h. Le milieu réactionnel est centrifugé (centrifugeuse SIGMA 6K15 à 4000 tr/min) pendant 15 min. Après élimination de la phase aqueuse (surnageant), le culot est repris dans l'acétone (500mL). Une analyse HPLC montre la présence très majoritaire de la diosmétine (voir Figure 1).

La suspension est portée au reflux pendant lh, puis abandonnée à température ambiante toute une nuit. Après filtration sous vide des impuretés précipitées, le filtrat est évaporé pour conduire après séchage à 7,3 g de diosmétine (Rendement > 98% - poudre jaune - pureté RMN >90%).

Ή RMN (DMSO-dô, ppm / TMS) : 12,94 (1H, s); 10,7-11,0 (1H, large s); 9,4-9,5 (1H, large s); 7,56 (1H, d); 7,44 (1H, s); 7,10 (1H, d); 6,75 (1H, s); 6,45 (1H, s); 6,15 (1H, s); 3,86 (3H, s). SM (ES+) MH+ Ci 6 H 12 0 6 : 301. EXEMPLE 2 : Diosmétine par hydrolyse enzymatique de la diosmine avec Pénicillium decwnbens

Dans un fermenteur réacteur double enveloppe de 5L (Sartorius), 15g (c=5g/L) de diosmine sont solubilisés dans 150mL de DMSO et ajoutés à 3L de tampon acétate 20mM pH=4,0.

10g (c=3,3g/L) de naringinase de Pénicillium decumbens B92 (Sigma) sont alors ajoutés au milieu. Le milieu réactionnel est maintenu à 30°C, sous agitation mécanique 220 tr/min pendant 24h.

Le milieu réactionnel est centrifugé (centrifugeuse SIGMA 6K15 à 4000 tr/min) pendant 15 min. Après élimination de la phase aqueuse (surnageant), le culot est repris dans l'acétone (IL).

Une analyse HPLC montre la présence de diosmétine et du composé partiellement hydrolysé de formule (IV) (monoglycoside) dans un rapport 85/15.

Après évaporation de l'acétone, le produit brut est séché sous vide à 30°C pendant 12h. On obtient environ 10g d'une poudre beige/jaune.

Le produit brut séché est alors repris dans 500mL d'acétone. La suspension est portée au reflux pendant lh, puis abandonnée à température ambiante toute une nuit. Après filtration sous vide, séchage et évaporation, on obtient 5,5 g de diosmétine (rendement : 79% ; pureté chimique >95%).

EXEMPLE 3 : Hespérétine par hydrolyse enzymatique de l'hespéridine

Dans un erlenmeyer de IL , 0,4g (c=2g/L) d'hespéridine sont solubilisés dans 10 mL de DMSO et ajoutés à 0,2 L de tampon acétate 20 mM à pH 4,1.

10 g (c=50 g/L) d'hespéridinase d'Aspergillus niger (Sigma ref H8137) sont alors ajoutés au milieu. Le milieu réactionnel est maintenu à 40°C, sous agitation orbitalaire 220 tr/min pendant 24H.

Le milieu réactionnel est centrifugé (centrifugeuse SIGMA 6K15 à 4000 tr/min) pendant 15 min. Après élimination de la phase aqueuse (surnageant), le culot est repris dans l'acétone (100 mL).

La suspension est portée au reflux pendant lh, puis abandonnée à température ambiante pendant une nuit. Après filtration sous vide des impuretés précipitées, le filtrat est évaporé pour conduire après séchage à 0,19 g d'hespérétine (Rendement : 96% ). 1H MN (DMSO-d6, ppm / TMS) : 12,12 (1H, s); 10,74 (1H, s); 9,05 (1H, s); 6,94 (3H, m); 5,90 (2H, 2s); 5,44 (1H, dd); 3,77 (3H, s); 3,19 (1H, dd); 2,71 (1H, dd).

SM (ES+) MH+ Ci 6 H 14 0 6 : 303.

EXEMPLE 4 : Diosmétine à partir d'hespérétine La diosmétine est obtenue par chauffage de l'hespérétine avec de l'iode dans la pyridine, selon le procédé décrit sous « Diosmetin (2e) » à la page 221 de la publication Archiv der Pharmazie 1983, Vol 316(3), 219-22.

EXEMPLE 5 : 6,8,2'-Tris-(isobut-2-en-l-yl) diosmétine

Stade A : 2-{4-Méthoxy-3-[( isobut-2-en-l-yl)oxy]phényl}-5, 7-bis-[( isobut-2-en-l -yl)oxy] -4H- chromen-4-one

A 30 g de diosmétine sont ajoutés 69,3 g de carbonate de potassium et 450 ml d'acétone. Le mélange est chauffé au reflux pendant 4h30, puis ramené à température ambiante, puis 54 g de bromure de méthallyle sont ajoutés. Le mélange réactionnel est ensuite chauffé à reflux pendant la nuit, puis ramené à température ambiante et filtré. Le gâteau est rincé à l'acétone puis le filtrat est évaporé pour conduire à un résidu qui est recristallisé dans le toluène pour conduire au produit du titre. Stade B : 6,8,2'-Tris-(isobut-2-en-l-yl) diosmétine

A 10 g du composé obtenu au stade précédent sont ajoutés 120 ml de Ν,Ν-diméthylaniline, puis le mélange est chauffé au reflux pendant lh. Le solvant est ensuite évaporé sous pression réduite et le résidu obtenu est recristallisé dans l'isopropanol pour conduire au produit du titre.

Point de fusion : 141°C.