Verfahren zur Gewinnung olfaktorischer Epithelzellen aus nicht-menschlichen embryonalen Stammzellen

Beschreibung:

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung olfaktorischer Epithelzellen aus nicht-menschlichen embryonalen Stammzellen, olfaktorische Epithelzellen, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens gewonnen wurden sowie Testsysteme für kosmetische und/oder pharmazeutische Zubereitungen auf der Basis olfaktorischer Epithelzellen, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens gewonnen wurden.

Der Geruchssinn eines Menschen beeinflusst seine Wahrnehmung der Umwelt und die Lebensqualität in hohem Maße. Bestimmte Gerüche können Erinnerungen an Situationen auslösen, die zeitlich sehr lange zurückliegen. Der Verlust des Geruchssinns beeinträchtigt die Lebensqualität deutlich: Die geruchlichen Informationen der Umgebung können nicht mehr wahrgenommen werden, und auch bestimmte Warnsignale sind ausgeschaltet.

Der erste Schritt der Wahrnehmung von Gerüchen in Säugetieren findet auf der Ebene des Riechepithels oder olfaktorischen Epithels statt. Das olfaktorische Epithel enthält hoch spezialisierte Neuroepithelzellen, sog. olfaktorische Rezeptor-Neuronen (ORN), die in der Membran ihrer Zilien Rezeptorproteine ausbilden, an die Geruchstoffe spezifisch binden und eine biochemische Signalkaskade auslösen. Dieses Signal wird elektrochemisch in den Olfaktorischen Bulbus (Riechkolben) und anschließend in höhere Hirnregionen weitergeleitet und zu einem Geruchseindruck verarbeitet. Der erste Schritt der Bindung eines Geruchsmoleküls ist gerade deshalb so bedeutsam, da hier die molekulare Identität des Duftmoleküls in ein Muster aktivierter Rezeptorzellen übersetzt wird. Dieser Vorgang, der als Kodierung der Geruchsinformation („odorant coding" oder auch „odorant fingerprinting") bezeichnet wird, ermöglicht einem Organismus, eine ganze Fülle von Duftstoffen zu unterscheiden.

Die wohl beeindruckendste Eigenschaft des Geruchssinnes ist die extrem hohe Trennschärfe, mit der das Riechorgan unterschiedliche olfaktorische Sinnesreize unterscheiden kann. Das menschliche Riechsystem beispielsweise ist in der Lage, ungefähr 10.000 Gerüche zu differenzieren, andere Spezies überbieten diese enorme Zahl noch.

Forschungen an Mäusen führten zur Entdeckung einer ganzen Genfamilie, die die biochemischen Baupläne für -1.000 Geruchsrezeptoren enthält. Beim Menschen ist die Zahl funktioneller olfaktorischer Rezeptorproteine geringer, da es sich bei mehr als 60% dieser Geruchsrezeptorgene um Pseudogene handelt.

Der Anteil der Gene, die für Geruchsrezeptorproteine codieren, stellt die bislang größte Genfamilie im Säugergenom überhaupt dar und reflektiert auf diese Weise die Bedeutung olfaktorischer Informationen für den Organismus.

Jeweils ein Geruchsrezeptorprotein wird exklusiv in einem individuellen olfaktorischen Neuron exprimiert. Das bedeutet, dass das olfaktorische System über ~1.000 getrennte Eingangskanäle in Form von primären Geruchsstimuli verfügt, die 1.000 Subpopulationen der Millionen von olfaktorischen Neuronen der Riechschleimhaut entsprechen.

Die primären Geruchsstimuli, die von den olfaktorischen Rezeptorproteinen erkannt werden, stellt man sich als spezifische Oberflächenmerkmale von Geruchsstoffen vor. Diese durch die Rezeptorproteine der Riechsinneszellen detektierbaren Oberflächenmerkmale werden als Odotope bezeichnet. Die Struktur eines Geruchsstoffs kann mehr als ein Odotop enthalten und deshalb theoretisch von mehr als einem Geruchsrezeptor erkannt werden. Die parallele Erkennung mehrerer Odotope eines Geruchsstoffes führt zur Aktivierung eines individuellen Ensembles olfaktorischer Neurone. Dieses spezifische Muster neuronaler Aktivität repräsentiert den Geruchsstoff auf der Eingangsebene des olfaktorischen Systems.

Geruchsstoffe sind Moleküle flüchtiger Substanzen, die sich im Schleim über dem Riechepithel lösen. Auf diesem Weg gelangen sie an die olfaktorischen Rezeptorproteine, die in der Membran von Riechzilien eingelassen sind. Riechzilien sind Zellfortsätze der olfaktorischen Neurone. 20-30 Riechzilien ragen, ausgehend von einer knopfartigen Auftreibung an der Spitze des apikalen Dendriten eines olfaktorischen Neurons, in den Riechschleim. Die Bindung eines Odotops an ein Rezeptorprotein erzeugt ein Aktionspotenzial, das über das Axon des olfaktorischen Neurons in den Bulbus olfactorius, die erste zentrale Verarbeitungsstation der Geruchsinformationen, weitergeleitet wird.

Die enorme Menge von Kombinationsmöglichkeiten der etwa 1.000 primären Geruchsstimuli setzt einen komplexen Verarbeitungsmechanismus der olfaktorischen Informationen voraus.

Obwohl die zugrunde liegenden Mechanismen der Duftwahrnehmung bekannt sind, existiert bisher kein experimentelles System, mit dem in vitro eine umfassende Beschreibung der molekularen Signalmuster erfolgen und die Situation in vivo an einem adäquaten Zelltyp, das heißt, an einem Zelltyp, der olfaktorischen Rezeptor-Neu ronen in vivo entspricht, studiert werden kann.

Primäre neuronale Riechepithel-Zellen, die zum Aufbau eines Testsystems für die molekulare Analyse von Duftmolekülen geeignet sind, sind durch „klassische" Isolierungs- und Kultivierungsmethoden (aus Nasenbiopsien) kaum zugänglich. Es steht nur wenig geeignetes Material

zur Verfügung, die Präparation ist kompliziert, erfordert große übung und ist zeitaufwändig. Zudem ist die Zellausbeute sehr gering.

Zum Aufbau eines Screeningsystems sind solche Kulturen daher wenig geeignet: Sie resultieren in einer Mischkultur verschiedener Zelltypen, die eine sehr begrenzte Lebensdauer aufweisen. Die Zellen müssen immer frisch aus Biopsiematerial eines Spenderorganismus präpariert werden. Der Zugang zu diesem Material ist schwierig und mit einem hohen bürokratischen Aufwand verbunden, zudem müssen spenderabhängige Unterschiede der Zellpopulationen in Kauf genommen werden. Ganz ähnliche Nachteile gelten für die Ex-vivo-Kultivierung von olfaktorischem Gewebe.

Zum Aufbau einer Screeningtechnologie, mit der sich gezielt molekulare Mechanismen der Duftkodierung sowie Möglichkeiten zur molekularen Steuerung derselben finden lassen, benötigt man jedoch regelmäßig eine ausreichende Menge an olfaktorischen Epithelzellen.

Aus diesem Grund wurde in der Vergangenheit versucht, mittels alternativer Ansätze, insbesondere Rezeptor-Transfektionsstudien an Zeil-Linien sowie Studien an immortalisierten Zeil- Linien neuroepithelialen Ursprungs die Erforschung molekularer Duftwirkung zu ermöglichen.

Auch diese experimentellen Techniken weisen Limitationen auf:

Um die gesamte biologische Signalleistung des Riechepithels durch Rezeptor- Transfektionsstudien abzubilden, müssen alle Rezeptoren eines Säugers einzeln kloniert und gleichzeitig erfolgreich in Empfängerzellen exprimiert werden. Diese Vorgehensweise ist aufwändig, und sehr oft scheitert das Vorgehen an einer unzureichenden Einlagerung des Rezeptorproteins in die Plasmamembran der Empfängerzelle, was auf einer ineffizienten Protein- Translokation der membranständigen Rezeptoren beruht.

Immortalisierte Zeil-Linien neuroepithelialen Ursprungs haben eine längere Lebensdauer, allerdings konnte in allen charakterisierten Linien bisher keine bzw. nur eine limitierte endogene Expression von Rezeptorproteinen nachgewiesen werden, so dass sich diese Zellen eher als Empfängersystem für heterolog transfizierte Rezeptorproteine denn als Ausgangsmaterial zum Aufbau eines Screeningsystems mit endogener Rezeptorexpression eignen.

Untersuchungen der Bindung von Duftmolekülen an die entsprechenden Rezeptorproteine und der ausgelösten Signalkaskade können Aufschluss darüber geben, welche ligandenspezifi- schen Rezeptoren aktiviert werden. Diese individuellen Aktivierungsmuster („odor codes") können zur Charakterisierung des Duftstoffs, zur Optimierung von Duftkompositionen auf biochemischer Ebene oder zur Suche nach spezifischen Rezeptorantagonisten für die Blockierung unerwünschter Gerüche verwendet werden.

Voraussetzung hierfür ist ein biologisches Testsystem, das die biochemischen Komponenten des Säuger-Riechepithels widerspiegelt. Insbesondere sind hierbei das (endogene) Vorhandensein einer repräsentativen Anzahl verschiedener Duftrezeptoren sowie die Elemente der G- Protein-gekoppelten Signalkaskade zu nennen. Daneben sollte das verwendete Testsystem standardisierbare und reproduzierbare Ergebnisse liefern, die nicht abhängig sind von der Verfügbarkeit von Spenderorganismen und individuellen Expressionsschwankungen.

Es besteht daher ein Bedarf an Testsystemen, die dem Riechepithel von Säugern möglichst weitgehend entsprechen und die genannten Nachteile des Standes der Technik vermeiden.

überraschenderweise wurde gefunden, daß sich embryonale Stammzellen in vitro zu Zellen des Riechepithels differenzieren lassen, die geeignet sind, in einem gewünschten Testsystem eingesetzt zu werden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Gewinnung olfaktorischer Epithelzellen aus nicht-menschlichen embryonalen Stammzellen, daß dadurch gekennzeichnet ist, daß man a) embryonale Stammzellen kultiviert, b) die embryonalen Stammzellen mit einem geeigneten Marker oder einer geeigneten Kombination von Markern transfiziert, c) die embryonalen Stammzellen durch weitere Kultivierung in Gegenwart inaktivierter stromaler Zellen sowie nachfolgende Aussaat auf beschichtete Kulturträger und weitere Kultivierung in Gegenwart eines geeigneten Wachstumsfaktors oder einer geeigneten Kombination von Wachstumsfaktoren und/oder in Gegenwart von Retinsäure zu Zellen des Riechepithels differenziert und d) die erfolgreiche Differenzierung in olfaktorischen Epithelzellen anhand der in Schritt b) eingesetzten Marker oder Kombination von Markern überprüft.

Embryonale Stammzellen (ES-Zellen) sind sich regenerierende, pluripotente Zellen, die in der Lage sind, jeden Zelltyp eines Organismus zu bilden. Vielfältige Differenzierungen in einen bestimmten Zelltyp wurden in vitro beschrieben. Die jeweiligen ES-Zellen werden dabei einem bestimmten Differenzierungsprotokoll unterworfen. Erstmals beschrieben wurde die Differenzierung von ES-Zellen in neuronale Vorläuferzellen und reife Neuronen im Jahr 2001 (Reubinoff et al., Nature Biotechnology, 2001 , 19, 1134-1140; Zhang et al., Nature Biotechnology, 2001 , 19, 1129-1133).

Ein erstes spezielles Differenzierungsprotokoll, das auf einer Verbesserung der existierenden Protokolle für neuronale Vorläuferzellen beruht, ist die Bildung verschiedener neuronaler Subtypen aus embryonalen Stammzellen der Maus (Barberi et al., Nat. Biotechnol., 2003, 21 , 1200-

1207). Eine gezielte Differenzierung in Zellen des Riechepithels wurde bisher allerdings nicht beschrieben.

Die erfindungsgemäße Herstellung von olfaktorischen Epithelzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus bietet eine kostengünstige und ressourcenschonende Alternative zu klassischen Kultivierungs- und überexpressionsverfahren.

Die In-vitro-Differenzierung ermöglicht vorteilhafterweise die Bereitstellung von Ausgangsmaterial für ein echtes Riechepithel in vitro, das die Situation in vivo besser wiedergibt als andere Zellkulturmodelle, bzw. artifizielle Systeme, die auf der heterologen Expression von olfaktorischen Rezeptorproteinen (OR) beruhen. Aufgrund ihrer Herkunft besitzen die differenzierten Zellen ein endogenes, für olfaktorische Epithelzellen zelltypisches Proteinexpressionsmuster, d.h. alle wichtigen Komponenten des Signalapparates sind endogen in den Zellen vorhanden und das natürliche Rezeptorpotenzial wird ausgenutzt. Die Zellen eignen sich zum Aufbau eines Screeningsystems, aber auch der Aufbau von Gewebemodellen (evtl. auch zur Transplantation) ist möglich.

Bei der Verwendung von embryonalen Stammzellen aus Nagetieren ist man nicht auf Primärmaterial angewiesen, da das Ausgangsmaterial kommerziell erhältlich ist und im Labor differenziert werden kann. Die Anreicherung eines bestimmten Zelltyps durch eine geeignete Selektionsstrategie sorgt für die Minimierung individueller Unterschiede.

Die in Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens kultivierten embryonalen Stammzellen können grundsätzlich beliebigen Ursprungs sein; bevorzugtermaßen setzt man Zellen aus bereits verfügbaren embryonalen Stammzelllinien ein. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind menschliche embryonale Stammzellen jedoch explizit ausgeschlossen. Vorzugsweise werden in Schritt a) embryonale Stammzellen aus Säugetieren kultiviert, insbesondere solche aus Mäusen, Hamstern, Ratten, Affen oder Hunden, besonders bevorzugt aus Mäusen. Ganz besonders bevorzugt sind erfindungsgemäß murine embryonale Stammzellen aus der Zelllinie ATCC ES-D3 (CRL-11632).

Die Kultivierungsdauer in Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens beträgt 1 bis 40 Tage, vorzugsweise 8 bis 12 Tage.

Die Transfektion der embryonalen Stammzellen in Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt vorzugsweise mit einem Reporterkonstrukt und einer Antibiotikaresistenz unter einem OE-spezifischen Promotor, wodurch die Herstellung einer Reinkultur ermöglicht wird, die durch den Nachweis spezifischer Zellmarker auch als solche identifiziert werden kann. Besonders bevorzugte Marker für die Transfektion in Schritt b) sind erfindungsgemäß ausgewählt unter folgenden Promotoren: „Olfactory Marker Protein" (OMP), olfaktorisches G-Protein (G alpha olf oder GNAL), „Adenylat Cyclase 3" (ADCY3) sowie olfaktorische Rezeptorproteine.

Ganz besonders bevorzugt ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung das „Olfactory Marker Protein" (OMP).

Die Kultivierungsdauer in Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens beträgt 1 bis 40 Tage, vorzugsweise 1 1 bis 20 Tage.

Die in Schritt c) zum Einsatz kommenden stromalen Zellen sind vorzugsweise Zellen des Typs

PA-6 oder MS-5, insbesondere „MS-5 Bone marrow stromal cells".

Die erfindungsgemäße Aussaat auf beschichtete Kulturträger in Schritt c) erfolgt vorzugsweise auf Biopolymer-beschichtete Kulturschalen, insbesondere auf Kulturschalen, deren Beschich- tung ausgewählt ist unter Beschichtungen mit Laminin/Poly-Ornithin, Fibronectin, Laminin,

Collagen Type IV, Collagen Type I, Poly-L-Lysin, Matrigel®, „reconstituted basal membrane"

(RBM) und Mischungen davon. Besonders bevorzugt ist die Beschichtung mit Laminin/Poly-L-

Ornithin.

Erfindungsgemäß in Schritt c) einsetzbare Wachstumsfaktoren sind vorzugsweise ausgewählt unter

• GDF7 (bmp-12, bone morphogenic protein 12) in einer Konzentration von 1 bis 50 ng/mL, insbesondere 5 bis 15 ng/mL, besonders bevorzugt 10 ng/mL;

• bmp-4 (bone morphogenic protein 4) in einer Konzentration von 0,01 bis 0,5 ng/mL, insbesondere 0,05 bis 0,15 ng/mL, besonders bevorzugt 0,1 ng/mL;

• bFGF (Recombinant Human FGF-basic) in einer Konzentration von 1 bis 50 ng/mL, insbesondere 5 bis 15 ng/mL, besonders bevorzugt 10 ng/mL;

• EGF (Recombinant murine Epidermal Growth Factor) in einer Konzentration von 1 bis 50 ng/mL, insbesondere 15 bis 25 ng/mL, besonders bevorzugt 20 ng/mL sowie

• FGF8 (Recombinant Mouse Fiboblast Growth Factor 8b in einer Konzentration von 1 bis 500 ng/mL, insbesondere 1 bis 200 ng/mL, besonders bevorzugt 100 ng/mL.

Ganz besonders bevorzugt wird in Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens eine Kombination der Wachstumsfaktoren bFGF (Recombinant Human FGF-basic) in einer Konzentration von 5 bis 15 ng/mL, besonders bevorzugt 10 ng/mL und EGF (Recombinant murine Epidermal Growth Factor) in einer Konzentration von 15 bis 25 ng/mL, besonders bevorzugt 20 ng/mL eingesetzt.

Vorzugsweise wird in Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens Retinsäure in einer Konzentration von 0,01 bis 50 μM, insbesondere 5 μM eingesetzt.

Weitere Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind

• olfaktorische Epithelzellen, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens gewonnen wurden;

• Testsysteme für kosmetische und/oder pharmazeutische Zubereitungen auf der Basis olfaktorischer Epithelzellen, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens gewonnen wurden;

• Die Verwendung olfaktorischer Epithelzellen, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens gewonnen wurden in Testsystemen für kosmetische und/oder pharmazeutische Zubereitungen.

• Systeme zur Identifizierung der Rezeptorcodes für bestimmte Liganden auf der Basis olfaktorischer Epithelzellen, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens gewonnen wurden;

• Modelle für die Identifzierung von Geruchsinhibitoren oder die Aufklärung der komplexen Muster aktivierter Rezeptoren, mit denen sich Riechstoffe hinreichend beschreiben lassen, auf der Basis olfaktorischer Epithelzellen, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens gewonnen wurden;

• Systeme zur Identifizierung von „Geruchsverstärkern", also Substanzen, die die Amplitude des biologischen Geruchssignals erhöhen, auf der Basis olfaktorischer Epithelzellen, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens gewonnen wurden;

• Bio-elektrische Nasen bzw. Riechchips, erhältlich durch die Kopplung olfaktorischer Epithelzellen, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens gewonnen wurden an Bio- Chips.

• Systeme zur Identifizierung von Rezeptoren bestimmter, vorgegebener Liganden durch Aufbringung differenzierter Neuronen olfaktorischer Epithelzellen, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens gewonnen wurden, auf eine Oberfläche, die die genaue Lokalisation angeregter Neurone und anschließende Analyse (z. B. durch Einzelzell-PCR) ermöglicht.

• Dreidimensionale Gewebemodelle, erhältlich durch Einbringung der differenzierten Zellen bzw. deren Vorstufen, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens gewonnen wurden, in oder auf eine 3D-Matrix, beispielsweise einen sphärischen oder kugelförmigen Träger (z.B. CultisphereO-Träger), oder durch Einbringung der differenzierten Zellen bzw. deren Vorstufen, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens gewonnen wurden, in einfache Gelmatrices (analog zum Aufbau eines Collagengels), oder durch Einbringung der differenzierten Zellen bzw. deren Vorstufen, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens gewonnen wurden, in komplexe Matrices (z.B. gefriergetrocknete Matrices, wie sie für Hautmodelle verwendet werden, typischerweise aus quervernetz- tem Collagen bzw. anderen Bestandteilen der extrazellulären Matrix).

• Die Verwendung olfaktorischer Epithelzellen, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens gewonnen wurden zu Transplantationszwecken, beispielsweise als Xe- notransplantate.

Die folgenden Beispiele beschreiben die Erfindung, ohne sie jedoch darauf einzuschränken:

Beispiel 1

Kultivierung von murinen embryonalen Stammzellen:

Standardmäßig wird die Zelllinie D3 muriner embryonaler Stammzellen eingesetzt (Stamm 129/Sv+c/+p, ATCC Katalog-Nr.: CRL-11632). Die embyonalen Stammzellen (ES-Zellen) werden in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Invitrogen, 41965039) mit 15% FCS (fötalem Kälberserum), 2mM L-Glutamin (Invitrogen, 25030-024), 1 % nicht essentiellen Aminosäuren (Invitrogen, 11140-035) und 50μM ß- Mercaptoethanol (Invitrogen, 31350-010) , LIF 1x10 ³ U/ml (Chemicon, Cat.No.ESG1 107) bei 37°C und 7% CO2 nach einem Standardprotokoll von Torres und Kühn (Laboratory protocols for Conditional Gene Targeting, 1997 (New York: Oxford University Press) auf inaktivierten embryonalen Feederzellen (z. B. MEF feeder cells, neomycin resistant, Cell Biolabs, CBA-311 ) kultiviert. Während der Kultivierungsdauer werden die Zellen alle 2 Tage nach Trypsinierung gesplittet

Beispiel 2

Amplifizierung des OMP-Promotors aus genomischer DNA:

Olfactory Marker Protein (OMP) wird in hohem Maße in terminal differenzierten Riechepithelzellen gebildet und ist ein Hinweis auf deren Funktionalität. Amplifikation des OMP-Promotors: Anterior region: Nukleotide 22.371 bis 27.731 , Posterior region: Nukleotide 16.652-20.445;

Nummerierungen gemäß GenBank Record NW_047561 , gi: 34857865, Version NW_047561.1. PCR Template: BAC-Klon CH230-432I8 (Ratte)

Annealing-Temperatur: 60 ⁰ C, Long Range-PCR (Qiagen-Protokoll)

Die PCR-Produkte wurden durch Agarosegel-Elektrophorese analysiert, und in den Vektor pPIG kloniert. Die Sequenzidentität des resultierenden Konstrukts wurde durch Restriktionskartierung sowie durch Sequenzierung der regulatorischen Regionen verifiziert (Abb. 1 ).

Beispiel 3

Klonierung des OMP-PIG-Vektors und Etablierung einer OMP-PIG-transgenen ES-Zell-Linie: Die in Beispiel 2 gewonnenen Fragmente werden in Vektor pPIG ligiert. Das 5.4 kb-Fragment der Anterior Region (2nd round) wird mit den Restriktionsenzymen EcoRI /SaI I gespalten. Die definierten Enden werden für die Insertion in den Vektor benötigt. Das 3.8 kb-Fragment der Posterior Region wird mit Not I/Mun I gespalten.

In zwei Schritten werden die PCR-Fragmente in pPIG eingefügt. Zum Einfügen der Posterior Region wird pPIG mit Not I/Mun I gespalten und mit dem 3.8 kb-Fragment ligiert. Analog wird das resultierende Konstrukt zum Einfügen der Anterior region mit Eco Rl/ SaI I gespalten und mit dem 5.8 kb-Fragment ligiert. Die enstehende Vektorgröße beträgt 14,4 kb (Abb. 2), der Vektor enthält die Antibiotikaresistenzen Kanamycin/Neomycin sowie Puromycin. Darüber hinaus enthält der Vektor die Kodierung für GFP (Green Fluorescent Protein) unter Kontrolle des OMP-Promotors. Die führt dazu, dass erfolgreich transfizierte Zellen in der Kultur fluoreszieren, sobald der OMP-Gen-Promotor aktiviert wird.

Die embryonalen Stammzellen werden mit dem linearisierten Vektorkonstrukt (Eco Rl) mittels Elektroporation transfiziert und mit G418-Sulfat-halitgem Medium kultiviert. Die resistenten Klone werden isoliert und zur Weiterdifferenzierung verwendet.

Beispiel 4

Differenzierung in Zellen des Riechepithels (siehe auch Tabelle 1 ):

Zur weiteren Differenzierung der stabil transfizierten ES-Zellen werden die Zellen zusammen mit inaktivierten MS-5 Bone marrrow stromal cells in Serum replacement medium (SRM) kultiviert (MS-5: DSMZ, Cat. No. ACC441 ); SRM: DMEM (Invitrogen, 41965-039), 10μM ß-MeOH (Invitogen, 31350-010), 2mM L-Glutamin (Invitrogen, 25030024), 15% Knockout Serum replacement (Invitrogen, 10828028)). Die MS-5-Zellen begünstigen als Feederzellen die Differenzierung der ES-Zellen in Zellen des Riechepithels. Als Kulturschalen werden Kulturschalen mit einem Durchmesser von 6 cm verwendet.

Am dritten Tag der Kultivierung wird das komplette Zellkulturmedium, am fünften Tag das komplette des Zellkulturmediums gegen frisches SRM ausgetauscht. Am 6. Tag werden die Zellen durch Trypsinisierung dissoziiert (der Reaktionsstopp erfolgt durch einen Trypsin- Inhibitor) und im 24well-Format auf Poly-L-Ornithine/Laminin-beschichteten Zellkulturschalen (Becton Dickinson, Cat. No. 354659) ausgesät. Dabei wird die Zellpopulation einer 6cm- Kulturschale auf insgesamt 8 wells im 24er-Format verteilt.

Ab dem 6. Tag wird entweder Neurobasal/B27-Medium oder DMEM/F12-ITSF-Medium und Kombinationen der Wachstumsfaktoren bFGF 10ng/ml, EGF 20ng/ml, (FGF8) mit/(ohne) 100 nM Retinsäure verwendet. Alle zwei Tage wird die Hälfte des Zellkulturmediums gegen frisches Kulturmedium ausgetauscht. Die Kultivierung erfolgt über einen Zeitraum von insgesamt 11 bis 18 Tagen (Abb. 3 bis 5).

Konzentrationen und Zusammensetzungen:

SRM: DMEM (Invitrogen, 41965), 15% Knockout SR (Invitrogen, 10828-028)

10μM ß-MeOH (Invitrogen, 31350-010) 2mM L-Glutamin (Invitrogen,

25030024)

Neurobasal/B27- Neurobasalmedium (Invitrogen, 21 103-049), mit 2% B27 Supplement w/o

Medium: RA 5Ox (Invitrogen, 12587-010), 0,5mM L-glutamin(Gibco, 25030024)

DMEM/F12-ITSF Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12 1 :1-glu (Invitrogen, 21331020),

1 % Insulin-Transferrin-Selenin 100x (Invitrogen, 51500-056) 1 μg/ml

Fibronectin (Sigma, F1141 ) 0,5mM L-Glutamin (Invitrogen, 25030-024) trypsin Trypsin-EDTA (1x), PAA Cat.No. L11-004

Trypsin inhibitor Trypsin inhibitor defined Solution (1x) Sigma, Cat.No. T7659 bFGF Recombinant Human FGF-basic (Tebu, 100-18B), 10 ng/mL

EGF Recombinant murine Epidermal Growth Factor (Tebu, 315-09), 20 ng/mL

FGF8 Recombinant Mouse Fiboblast Growth Factor 8b (R&D Systems, 423-F8),

100 ng/mL RA Retinole Acid (Sigma, R-2625), 100 nM

Optional ist es auch möglich, die Zellen zur Erhöhung der Zellausbeute mit Puromycin zu behandeln und eine Reinkultur herzustellen.

Beispiel 5

Nachweis der Differenzierung durch Analyse des Expressionsprofils:

Zur Entwicklung eines erfolgreichen Differenzierungsprotokolls wurde die Expression wichtiger olfaktorischer Marker in vitro mit In vivo-Daten und aus der Literatur bekannten Daten abgeglichen.

Im ersten Schritt der Differenzierung (s. Beispiel 4) wurde das Differenzierungsprotokoll S auf murine embryonale Stammzellen der Maus angewendet. Die differenzierten Zellen wurden hinsichtlich ihres Phänotyps auf die Expression verschiedener Marker überprüft (s. a. Abb. 3 bis 5):

Marker für neuronale Vorläuferzellen: Mash-1 Marker für Bildung von „immidiate neuronal precursors": Ngn-1 Marker für Bildung von unreifen olfaktorischen Epithelzellen: Gap43

Marker für Bildung von reifen olfaktorischen Eüpithelzellen: OMP, NCAM, olfaktorisches G- Protein, olfaktorische Rezeptoren. Alle relevanten Marker können in den differenzierten Zellen nachgewiesen werden.

Beispiele für verwendete diagnostische Primerkombinationen

Mashi Mash1-F1 Sequenz 5'-cgtcctctccggaactgat

Mash1-R1 Sequenz 5'-ggttggctgtctggtttgtt

Ngn1 Ngn1-F1 Sequenz 5'-cgatccccttttctcctttc

Ngn1-R1 Sequenz 5'-gggtcagttctgagccagtc

GAP43 GAP43-F1 Sequenz 5'-ggctctgctactaccgatgc

GAP43-R1 Sequenzδ'-gcaggagagacagggttcag

Ncami Ncam1-F1 Sequenz 5'-cagtctgaggccactgtcaa

Ncam1-R1 Sequenz 5'-cacacaccagggtgacagac

Gα _df GoIf-FI Sequenz 5'-tacacacccacagaccagga

GoIf-RI Sequenz 5'-cctgccaagactttttctgc

OMP OMP-F1 Sequenz 5'-cttgtggacttggtggaggt

OMP-R1 Sequenz 5'-ccaccgttttcctgtcagtt

Verzeichnis der Abbildungen (Figuren):

Abb. 1.: Analyse der PCR-Produkte (Ist round). Upstream entspricht dem 5.4 kb-Fragment der Anterior-Region, Downstream entspricht dem 3.8 kb-Fragment der Posterior-Region des genomischen OMP-Promotors.

Abb. 2.: Restriktionsanalyse Vektors OMP-PIG. Die theoretischen Fragmentgrößen stimmen mit den experimentell bestimmten Größen überein.

Abb. 3.: Immunfluoreszenzfärbung von Zellen nach Anwendung der angegebenen Differenzierungsprotokolle (Differenzierungstag 11 ). A: Mikroskopische Aufnahme eines Ausschnitts der differenzierten Zellpopulation (Phasenkontrast). B: Immunfluoreszenzfärbung der Zellpopulation aus A) mit Rabbit-Anti-OMP-Antikörper (Biosensis) und Detektion mit einem Cy3-konjugierten Anti-Rabbit-Zweitantikörper. Die Zelle zeigt die typische Morphologie einer gereiften olfaktorischen Epithelzelle in vitro mit der charakteristischen zytoplasmatischen Verteilung von OMP.

Abb. 4.: RT-PCR-Analyse von differenzierten ES-Zellen nach Durchführung verschiedener Differenzierungsprotokolle (L-S, Differenzierungstag 1 1 ). Alle Zellen zeigen eine mehr oder weniger starke Ausprägung der neuronalen Marker Mash-1 und Ngn-1.

Abb. 5.: RT-PCR-Analyse von differenzierten ES-Zellen nach Durchführung verschiedener Differenzierungsprotokolle (L-S, Differenzierungstag 11 ). Die Bildung von OMP-mRNA sowie von G alpha olf mRNA ist bei Anwendung der Protokolle N, O, R und S besonders prominent, wohingegen Feeder-Zellen und undifferenzierte ES-Zellen praktisch keine Bildung der Marker zeigen. Als Kontrolle diente RNA isoliert aus olfaktorischen Epithelien erwachsener Mäuse.

Tabellen:

Tab. 1