SÜSS PHILIPP (DE)
BRUNDIEK HENRIKE (DE)
FEKETE MELINDA (DE)
| Patentansprüche Verfahren zur Herstellung von Gallensäurederivaten mit geschützter Hydroxylgruppe 3-Position umfassend: i) Bereitstellen einer ersten Zusammensetzung enthaltend mindestens ein Gallensäurederivat der allgemeinen Formel I: wobei der Rest R1 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cl - bis C30- Alkylgruppe, Cl-bis C30-Alkenylgruppe, Cl-bis C30-Alkinylgruppe, C5- bis C12-Cycloalkylgruppe und C5- bis C12-Arylgruppe , wobei der Ring B des Gallensäurederivats der allgemeinen Formel I eine oder zwei weitere Hydroxylgruppe(n) an Position 6 bzw. an den Positionen 6 und 7 aufweist; und wobei keiner der Ringe A, C und D weitere Hydroxylgruppen aufweist; Kontaktieren der ersten Zusammensetzung enthaltend mindestens ein Gallensäurederivat der allgemeinen Formel I aus i) mit einer Verbindung R2-X, wobei R2 eine -C(=0)-C1- bis C30-Alkylgruppe ist, und X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hydroxylgruppe, -O-Cl- bis C20-Alkylgruppe, -O- Cl - bis C20-Alkenylgruppe, -O-Cl - bis C20-Alkinylgruppe, Thiolgruppe, -S- Cl - bis C20-Alkylgruppe, Amingruppe, -NHR3-Gruppe, -NR3R4-Gruppe, wobei R3 und R4 jeweils unabhängig eine Cl- bis C20-Alkylgruppe sind, Halogenatom und -0-(C=0)-R5-Gruppe, wobei R5 eine Cl- bis C30- Alkylgruppe ist; und einer Lipase ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lipase B aus Candida antarctica gemäß SEQ ID Nr. 1, Lipase 1 aus Diutina rugosa gemäß SEQ ID Nr. 2, Lipase 2 aus Diutina rugosa gemäß SEQ ID Nr. 3, Lipase 3 aus Diutina rugosa gemäß SEQ ID Nr. 4, Lipase 4 aus Diutina rugosa gemäß SEQ ID Nr. 5, Lipase 5 aus Diutina rugosa gemäß SEQ ID Nr. 6, Lipase aus Rhizopus niveus gemäß SEQ ID Nr. 7, Lipase aus Aspergillus niger gemäß SEQ ID Nr. 8 und Lipase aus Penicillium camemberti FM 013 gemäß SEQ ID Nr. 9, oder einem homologen Enzym aufweisend eine Sequenzidentität von mindestens 65 % mit einer der Sequenzen gemäß SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 9, welches die gleiche Funktion wie die Lipase gemäß SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 9 aufweist, unter Erhalt einer zweiten Zusammensetzung enthaltend mindestens ein Gallensäurederivat gemäß der allgemeinen Formel II: wobei der Rest R1 die unter i) zur Formel I genannte Bedeutung und der Rest R2 die unter ii) genannte Bedeutung hat, wobei der Ring B des Gallensäurederivats der allgemeinen Formel II eine oder zwei weitere Hydroxylgruppe(n) an Position 6 bzw. an den Positionen 6 und 7 aufweist; und wobei keiner der Ringe A, C und D weitere Hydroxylgruppen aufweist. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei der Rest R1 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cl - bis C18-Alkylgruppe, C5- bis C7-Cycloalkylgruppe und Phenylgruppe, weiter bevorzugt aus Cl - bis C5-Alkylgruppe, weiter bevorzugt ein unverzweigter Cl - bis C3- Alkylrest, weiter bevorzugt ein Methylrest, ist. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hydroxylgruppe, -O-Cl- bis C20-Alkylgruppe, -O-Cl- bis C20-Alkenylgruppe, -O- Cl - bis C20-Alkinylgruppe, Thiolgruppe, -S-Cl- bis C20-Alkylgruppe, Amingruppe, - NHR3-Gruppe und -NR3R4-Gruppe, wobei R3 und R4 jeweils unabhängig eine Cl - bis C20-Alkylgruppe sind, bevorzugt aus der Gruppe bestehend aus Hydroxylgruppe, -O- Cl - bis C20-Alkylgruppe und -O-Cl - bis C20-Alkenylgruppe Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Rest R2 eine unverzweigte - C(=0)-Cl-bis C18-Alkylgruppe, bevorzugt eine unverzweigte -C(=0)-Cl-bis C5- Alkylgruppe, weiter bevorzugt -C(=0)-CH3, ist. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die gemäß ii) eingesetzte Lipase Lipase B aus Candida antarctica gemäß SEQ ID Nr. 1 oder ein homologes Enzym aufweisend eine Sequenzidentität von mindestens 65 % mit der Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 , welches die gleiche Funktion wie die Lipase B aus Candida antarctica gemäß SEQ ID Nr. 1 aufweist, ist. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das homologe Enzym eine Sequenzidentität von mindestens 80%, bevorzugt von mindestens 90%, weiter bevorzugt von mindestens 95%, weiter bevorzugt von mindestens 98%, mit der Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID No. 9 aufweist und die gleiche Funktion wie die Lipase aufweist. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Ring B des Gallensäurederivats der allgemeinen Formel I und des Gallensäurederivats der allgemeinen Formel II eine oder zwei weitere Hydroxylgruppe(n) in alpha- Stellung an Position 6 bzw. an den Positionen 6 und 7 aufweist. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Gallensäurederivat der allgemeinen Formel I ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus R1 -Estern von Hyodesoxycholsäure (HDCA), Hyocholsäure (HCA) und Mischungen von R1 -Estern von Hyodesoxycholsäure (HDCA) und Hyocholsäure (HCA), wobei R1 die in Anspruch 1 oder 2 genannte Bedeutung hat. Gallensäurederivat der allgemeinen Formel II, erhalten oder erhältlich gemäß einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8. Gallensäurederivat der allgemeinen Formel II, wobei der Rest R1 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cl- bis C30- Alkylgruppe, Cl- bis C30-Alkenylgruppe, Cl- bis C30-Alkinylgruppe, C5- bis C12- Cycloalkylgruppe und C5- bis C12-Arylgruppe; und der Rest R2 eine-C(=0)-Cl-bis C30- Alkylgruppe ist; wobei der Ring B des Gallensäurederivats der allgemeinen Formel II eine oder zwei weitere Hydroxylgruppe(n) an Position 6 bzw. an den Positionen 6 und 7 aufweist; und wobei keiner der Ringe A, C und D weitere Hydroxylgruppen aufweist. 11. Gallensäurederivat nach Anspruch 10 aufweisend die Formel IIb oder IIc: wobei der Rest R1 jeweils ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cl-bis C30- Alkylgruppe, Cl-bis C30-Alkenylgruppe, Cl-bis C30-Alkinylgruppe, C5 bis C12- Cycloalkylgruppe und C5 bis C12-Arylgruppe, bevorzugt aus der Gruppe bestehend aus Cl - bis C18-Alkylgruppe, C5- bis C7-Cycloalkylgruppe und Phenylgruppe, weiter bevorzugt aus Cl - bis C5-Alkylgruppe, weiter bevorzugt ein unverzweigter Cl - bis C3- Alkylrest, weiter bevorzugt ein Methylrest, ist; und der Rest R2 eine -C(=0)-Cl-bis C30-Alkylgruppe, bevorzugt eine unverzweigte -C(=0)-Cl-bis C18-Alkylgruppe, weiter bevorzugt eine unverzweigte -C(=0)-Cl-bis C5-Alkylgruppe, weiter bevorzugt -C(=0)-CH3, ist. Verwendung eines Gallensäurederivats der allgemeinen Formel II, bevorzugt eines Gallensäurederivats der allgemeinen Formel II erhalten oder erhältlich nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 , wobei der Rest R1 und der Rest R2 die in einem der Ansprüche 1 bis 12 genannten Bedeutungen haben; wobei der Ring B des Gallensäurederivats der allgemeinen Formel II eine oder zwei weitere Hydroxylgruppe(n) an Position 6 bzw. an den Positionen 6 und 7 aufweist; und wobei keiner der Ringe A, C und D weitere Hydroxylgruppen aufweist, zur Herstellung von Lithocholsäure. 13. Verfahren zur Herstellung von Lithocholsäure, umfassend i) Bereitstellen einer ersten Zusammensetzung enthaltend mindestens ein Gallensäurederivat der allgemeinen Formel I: wobei der Rest R1 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cl-bis C30- Alkylgruppe, Cl-bis C30-Alkinylgruppe, Cl-bis C30-Alkenylgruppe, C5 bis C12-Cycloalkylgruppe und C5 bis C12-Arylgruppe; wobei der Ring B des Gallensäurederivats der allgemeinen Formel I eine oder zwei weitere Hydroxylgruppe(n) an Position 6 bzw. an den Positionen 6 und 7 aufweist; und wobei keiner der Ringe A, C und D weitere Hydroxylgruppen aufweist; Kontaktieren der ersten Zusammensetzung enthaltend mindestens ein Gallensäurederivat der allgemeinen Formel I aus i) mit einer Verbindung R2-X, wobei R2 eine-C(=0)-Cl-bis C30- Alkylgruppe ist, und X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hydroxylgruppe, -O-Cl- bis C20- Alkylgruppe, -O- Cl - bis C20-Alkenylgruppe, -O-Cl - bis C20-Alkinylgruppe,Thiolgruppe, -S- Cl - bis C20-Alkylgruppe, Amingruppe, -NHR3-Gruppe, -NR3R4-Gruppe, wobei R3 und R4 jeweils unabhängig eine Cl- bis C20-Alkylgruppe sind, Halogenatom und -0-(C=0)-R5-Gruppe, wobei R5 eine Cl- bis C20- Alkylgruppe ist; und einer Lipase ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 9 oder einem homologen Enzym aufweisend eine Sequenzidentität von mindestens 65 % mit der Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 9, welches die gleiche Funktion wie die Lipase gemäß SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 9 aufweist, unter Erhalt einer zweiten Zusammensetzung enthaltend mindestens ein Gallensäurederivat gemäß der allgemeinen Formel II: wobei der Rest R1 die unter i) zur Formel I genannte Bedeutung und der Rest R2 die unter ii) genannte Bedeutung hat; wobei der Ring B des Gallensäurederivats der allgemeinen Formel II eine oder zwei weitere Hydroxylgruppe(n) an Position 6 bzw. an den Positionen 6 und 7 aufweist; und wobei keiner der Ringe A, C und D weitere Hydroxylgruppen aufweist; iii) Umsetzung des aus ii) erhaltenen Gallensäurederivats gemäß der allgemeinen Formel II zur Lithocholsäure. Verfahren zur Herstellung von Lithocholsäure, umfassend a) Bereitstellen einer Zusammensetzung enthaltend ein Gallensäurederivat der allgemeinen Formel IIb, bevorzugt erhalten oder erhältlich nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 , wobei der Rest R1 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cl-bis C30- Alkylgruppe, Cl-bis C30-Alkenylgruppe, Cl-bis C30-Alkinylgruppe, C5 bis C12-Cycloalkylgruppe und C5 bis C12-Arylgruppe; der Rest R2 eine C(=0)- Cl-bis C30-Alkylgruppe ist; wobei der Ring B des Gallensäurederivats der allgemeinen Formel II eine weitere Hydroxylgruppe an Position 6 aufweist; und wobei keiner der Ringe A, C und D weitere Hydroxylgruppen aufweist; Kontaktieren der Zusammensetzung enthaltend ein Gallensäurederivat der allgemeinen Formel IIb nach a) mit einem Oxidationsmittel oder einem Cl- bis C10-Alkylthiol, bevorzugt Propanthiol, unter Umwandlung der mindestens einen Hydroxylgruppe in B und/oder D in eine =0-Gruppe oder eine -S-Cl- bis ClO-Alkylgruppe, bevorzugt eine =0-Gruppe oder eine -S-Propylgruppe, unter Erhalt eines Gallensäurederivats der allgemeinen Formel Illb, wobei der Rest R1 und der Rest R2 die gleiche Bedeutung wie bei der allgemeinen Formel II aufweisen, und der Ring B mindestens eine =0-Gruppe oder eine -S-Cl- bis C10-Alkylgruppe, bevorzugt eine =0-Gruppe oder eine - S-Propylgruppe, an Position 6 aufweist; c) Kontaktieren des Gallensäurederivats der allgemeinen Formel Illb nach b) mit einem Reduktionsmittel, optional mit zusätzlicher Verseifung, unter Erhalt von Lithocholsäure. 15. Lithocholsäure, erhalten oder erhältlich nach dem Verfahren gemäß Anspruch 13 oder dem Verfahren gemäß 14. 16. Verwendung von Lithocholsäure erhalten oder erhältlich nach dem Verfahren gemäß Anspruch 13 oder dem Verfahren gemäß Anspruch 14 zur Herstellung von hydroxylierten Gallensäuren, bevorzugt von Ursodesoxycholsäure oder Ursodesoxycho lsäurederivaten. |
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Gallensäurederivaten mit geschützter Hydroxylgruppe in 3 -Position umfassend das Kontaktieren eines
Gallensäurederivats mit ungeschützter 3-alpha-Hydroxylgruppe mit einer spezifischen Lipase.
Verschiedenste pharmazeutische Produkte werden heutzutage aus Gallensäuren hergestellt, wobei die Grundsubstanzen aus Säugetieren gewonnen werden. Das eingesetzte tierische Ausgangsmaterial ist artenspezifisch aus verschiedenen Gallensäuren zusammengesetzt, wobei sich die Gallensäuren in ihrem Hydroxylierungsmuster voneinander unterscheiden. Die Gemeinsamkeit besteht in der beta-Konfiguration des A-Rings und der 3-alpha- Hydroxygruppe am A-Ring. Die aus Schweinen erhaltenen Gallensäuremischungen umfassen beispielsweise Chenodesoxycholsäure (CDCA), Hyodesoxycholsäure (HDCA) und
Hyocholsäure (HCA). Nur aus wenigen Tierarten sind nahezu reine Gallensäuren verfügbar. So ist beispielsweise aus Rindern Cholsäure (CA) ohne Vergesellschaftung mit anderen
Gallensäuren erhältlich. Aufgrund des hohen Bedarfs für pharmazeutische Zwecke ist dies als einzige Quelle für reine Gallensäuren allerdings nicht ausreichend. Für die Verwendung von Gallensäuren aus anderen Tieren war es daher bisher immer erforderlich, die verschiedenen Gemische sauber voneinander zu trennen, wobei der Trennaufwand meist erheblich ist.
Aufgabe der Erfindung war daher die Bereitstellung eines Verfahrens, mit welchem Gemische verschiedener Gallensäuren in eine (einheitliche) Basis Verbindung überführt werden können.
Überraschend wurde gefunden, dass ein solches Verfahren dadurch bereitgestellt werden kann, dass die 3-alpha-Hydroxylgruppe am A-Ring spezieller Gallensäurederivate selektiv enzymatisch verestert wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Herstellung von
Gallensäurederivaten mit geschützter Hydroxylgruppe in 3-Position umfassend:
i) Bereitstellen einer ersten Zusammensetzung enthaltend mindestens ein
Gallensäurederivat der allgemeinen Formel I:
wobei der Rest R 1 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cl - bis C30- Alkylgruppe, Cl- bis C30-Alkenylgruppe, Cl- bis C30-Alkinylgruppe, C5- bis C12- Cycloalkylgruppe und C5- bis C12-Arylgruppe und mindestens einer der Ringe B und D mindestens eine weitere, bevorzugt alpha-ständige, Hydroxylgruppe, aufweist (Positionen 6, 7, 15, 16);
Kontaktieren der ersten Zusammensetzung enthaltend mindestens ein
Gallensäurederivat der allgemeinen Formel I aus i) mit
- einer Verbindung R 2 -X, wobei R 2 eine -C(=0)-C1- bis C30-Alkylgruppe ist, und X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hydroxylgruppe, -O-Cl- bis C20- Alkylgruppe, -O-Cl - bis C20-Alkenylgruppe, -O-Cl - bis C20-Alkinylgruppe;
Thiolgruppe, -S-Cl- bis C20-Alkylgruppe, Amingruppe, -NHR 3 -Gruppe, -NR 3 R 4 - Gruppe, wobei R 3 und R 4 jeweils unabhängig eine Cl - bis C20-Alkylgruppe sind, Halogenatom und -0-(C=0)-R 5 -Gruppe, wobei R 5 eine Cl - bis C30-Alkylgruppe ist; und
- einer Lipase ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lipase B aus Candida antarctica gemäß SEQ ID Nr. 1, Lipase 1 aus Diutina rugosa gemäß SEQ ID Nr. 2, Lipase 2 aus Diutina rugosa gemäß SEQ ID Nr. 3, Lipase 3 aus Diutina rugosa gemäß SEQ ID Nr. 4, Lipase 4 aus Diutina rugosa gemäß SEQ ID Nr. 5, Lipase 5 aus Diutina rugosa gemäß SEQ ID Nr. 6, Lipase aus Rhizopus niveus gemäß SEQ ID Nr. 7, Lipase aus Aspergillus niger (ATCC 1015) gemäß SEQ ID Nr. 8 und Lipase aus Penicillium camemberti FM 013 gemäß SEQ ID Nr. 9, oder ein homologes Enzym aufweisend eine Sequenzidentität von mindestens 65 % mit einer der Sequenzen gemäß SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 9, welches die gleiche Funktion wie die Lipase gemäß SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 9 aufweist,
unter Erhalt einer zweiten Zusammensetzung enthaltend mindestens ein
Gallensäurederivat gemäß der allgemeinen Formel II:
wobei der Rest R 1 die unter i) zur Formel I genannte Bedeutung und der Rest R 2 die unter ii) genannte Bedeutung hat, und mindestens einer der Ringe B und D mindestens eine weitere, bevorzugt alpha-ständige, Hydroxylgruppe, aufweist.
Mit der Methode der selektiven 3ΌΗ Veresterung können alle Gallensäurederivate, insbesondere alle Gallensäurederivate der allgemeinen Formel I, über chemische Prozesse zu einer Basisverbindung vereinheitlicht werden, aus der alle gewünschten Gallensäurespezies durch stereo- und enantioselektive Hydroxylierungsprozesse zur Verfügung stehen. Durch diese Vereinheitlichungsstrategie kann der weltweite Rohstoffbedarf an tierischen
Gallensäuren befriedigt werden und die Nebenprodukt/ Abfall Produktion reduziert werden.
C5 bis C12-Cycloalkylgruppen bzw. C5- bis C7-Cycloalkylgruppen umfassen ein Ringsystem oder zwei oder mehr Ringsysteme, wobei zwei oder mehrere Ringsysteme separat oder aneliert sind. C5 bis C12-Arylgruppen umfassen ein Ringsystem oder zwei oder mehr
Ringsysteme, wobei zwei oder mehrere Ringsysteme separat oder aneliert sind. Der Begriff „Alkyl", sofern nicht anders explizit angegeben, umfasst verzweigte und unverzweigte Alkylgruppen, gleiches gilt für„Alkenyl" und„Alkinyl". Bevorzugt ist der Rest R 1 des Gallensäurederivats gemäß der allgemeinen Formel I bzw. des Gallensäurederivats gemäß der allgemeinen Formel II ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus r Cl - bis C18-Alkylgruppe, C5- bis C7-Cycloalkylgruppe und Phenylgruppe, weiter bevorzugt aus Cl - bis C5-Alkylgruppe, weiter bevorzugt ist R 1 ein unverzweigter Cl - bis C3- Alkylrest, weiter bevorzugt ein Methylrest.
Der Rest X der Verbindung R 2 -X gemäß ii) ist bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hydroxylgruppe, -O-Cl- bis C20-Alkylgruppe, -O-Cl- bis C20- Alkenylgruppe, -O-Cl- bis C20-Alkinylgruppe, Thiolgruppe, -S-Cl- bis C20-Alkylgruppe, Amingruppe, -NHR 3 -Gruppe und -NR 3 R 4 -Gruppe, wobei R 3 und R 4 jeweils unabhängig eine Cl - bis C20-Alkylgruppe sind; bevorzugt ist X ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hydroxylgruppe, -O-Cl - bis C20-Alkylgruppe und -O-Cl - bis C20-Alkenylgruppe.
In der Verbindung R 2 -X gemäß ii) bzw. im Gallensäurederivat gemäß der allgemeinen Formel II ist R 2 bevorzugt eine unverzweigte -C(=0)-Cl-bis C18-Alkylgruppe, weiter bevorzugt eine unverzweigte -C(=0)-Cl-bis C5-Alkylgruppe, weiter bevorzugt -C(=0)-CH 3 . Als Verbindung R 2 -X gemäß ii) wird besonders bevorzugt eine Verbindung aus der Gruppe bestehend aus Cl - bis C18-Alkyl-C(=0)-0-Cl- bis C20-Alkyl- Verbindung
(Carbonsäurealkylester), Cl - bis C18-Alkyl-C(=0)-0-Cl- bis C20-Alkenyl- Verbindung, Cl- bis Cl 8- Alkyl-C(=0)-OH- Verbindung (Carbonsäure) und Mischung von zwei oder mehr dieser Verbindungen eingesetzt. Höchst bevorzugt werden als Verbindung R 2 -X gemäß ii) Ethylacetat (Essigsäureethylester), Vinylacetat, Essigsäure oder Mischungen von zwei oder mehr dieser Verbindungen eingesetzt, weiter bevorzugt Ethylacetat, Vinylacetat oder eine Mischung aus Ethylacetat und Vinylacetat.
Gemäß ii) wird eine Lipase eingesetzt, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Lipase B aus Candida antarctica gemäß SEQ ID Nr. 1 , Lipase 1 aus Diutina rugosa gemäß SEQ ID Nr. 2, Lipase 2 aus Diutina rugosa gemäß SEQ ID Nr. 3, Lipase 3 aus Diutina rugosa gemäß SEQ ID Nr. 4, Lipase 4 aus Diutina rugosa gemäß SEQ ID Nr. 5, Lipase 5 aus Diutina rugosa gemäß SEQ ID Nr. 6, Lipase aus Rhizopus niveus gemäß SEQ ID Nr. 7, Lipase aus Aspergillus niger (ATCC 1015) gemäß SEQ ID Nr. 8 und Lipase aus Penicillium camemberti FM 013 gemäß SEQ ID Nr. 9, oder ein homologes Enzym aufweisend eine
Sequenzidentität von mindestens 65 % mit einer der Sequenzen gemäß SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 9, welches die gleiche Funktion wie die Lipase gemäß SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 9 aufweist. Die Lipasen gemäß den SEQ ID Nr. 1 bis 9 sind nachfolgend in Tabelle 1 aufgelistet. Alle Lipasen sind bekannt, stehen in öffentlichen Sammlungen zur Verfügung und können einschränkungsfrei erworben werden. Die Sequenzen aller Lipasen sind in diversen Datenbanken gelistet, wobei die Angaben gemäß der nachfolgenden Tabelle 1 und dem Sequenzprotokoll denen in der Datenbank UniProt entsprechen (Stand: 10. Januar 2017). Tabelle 1 : Lipasen gemäß den SEQ ID Nr. 1 bis 9
Name Organismus Sequenz SEQ
ID Nr.
Lipase B Pseudozyma >sp|P41365|LIPB_PSEA2 Lipase B OS=Pseudozyma 1 antarctica antarctica PE=1 SV=1
(Moesziomyces MKLLSLTGVAGVLATCVAATPLVKRLPSGSDPAFSQ antarcticus, PKSVLDAGLTCQGASPSSVSKPILLVPGTGTTGPQSFD
Candida SNWIPLSTQLGYTPCWISPPPFMLNDTQVNTEYMVN antarctica) AITALYAGSGNNKLPVLTWSQGGLVAQWGLTFFPSI
RSKVDRLMAFAPDYKGTVLAGPLDALAVSAPSVWQ
QTTGSALTTALRNAGGLTQIVPTTNLYSATDEIVQPQ
VSNSPLDSSYLFNGKNVQAQAVCGPLFVIDHAGSLTS
QFSYWGRSALRSTTGQARSADYGITDCNPLPANDL
TPEQKVAAAALLAPAAAAIVAGPKQNCEPDLMPYA
RPFAVGKRTCSGIVTP
Lipase 1 Diutina rugosa >sp|P20261 |LIPl DIURU Lipase 1 OS=Diutina rugosa 2
(Candida GN=LIP1 PE=1 SV=3
rugosa) MELALALSLIASVAAAPTATLANGDTITGLNAIINEAF
LGIPFAEPPVGNLRFKDPVPYSGSLDGQKFTSYGPSC
MQQNPEGTYEENLPKAALDLVMQSKVFEAVSPSSED
CLTINWRPPGTKAGANLPVMLWIFGGGFEVGGTST
FPPAQMITKSIAMGKPIIHVSVNYRVSSWGFLAGDEI
KAEGSANAGLKDQRLGMQWVADNIAAFGGDPTKV
TIFGESAGSMSVMCHILWNDGDNTYKGKPLFRAGIM
QSGAMVPSDAVDGIYGNEIFDLLASNAGCGSASDKL
ACLRGVS SDTLEDATNNTPGFLAYS SLRLSYLPRPDG
VNITDDMYALVREGKYANIPVIIGDQNDEGTFFGTSS
LNVTTDAQAREYFKQSFVHASDAEIDTLMTAYPGDI
TQGSPFDTGILNALTPQFKRISAVLGDLGFTLARRYFL
NHYTGGTKYSFLSKQLSGLPVLGTFHSNDIVFQDYLL
GS GSLI YNNAFIAF ATDLDPNTAGLLVKWPEYTS S S Q
SGNNLMMINALGLYTGKDNFRTAGYDALFSNPPSFF
V
Lipase 2 Diutina rugosa >sp|P32946|LIP2 DIURU Lipase 2 OS=Diutina rugosa 3
(Candida GN=LIP2 PE=1 SV=1
rugosa) MKLCLLALGAAVAAAPTATLANGDTITGLNAIVNEK
FLGIPFAEPPVGTLRFKPPVPYSASLNGQQFTSYGPSC
MQMNPMGSFEDTLPKNARHLVLQSKIFQWLPNDED
CLTINVIRPPGTRASAGLPVMLWIFGGGFELGGSSLFP
GDQMVAKSVLMGKPVIHVSMNYRVASWGFLAGPDI
QNEGSGNAGLHDQRLAMQWVADNIAGFGGDPSKVT
IYGESAGSMSTFVHLVWNDGDNTYNGKPLFRAAIM
QSGCMVPSDPVDGTYGTEIYNQWASAGCGSASDKL
ACLRGLSQDTLYQATSDTPGVLAYPSLRLSYLPRPDG
TFITDDMYALVRDGKYAHVPVIIGDQNDEGTLFGLSS
LNVTTDAQARAYFKQSFIHASDAEIDTLMAAYTSDIT
QGSPFDTGIFNAITPQFKRISALLGDLAFTLARRYFLN
YYQGGTKYSFLSKQLSGLPVLGTFHGNDIIWQDYLV
GSGSVIYNNAFIAFANDLDPNKAGLWTNWPTYTSSS
Q S GNNLMQINGLGLYTGKDNFRPD AYS ALFSNPP SFF
V
Lipase 3 Diutina rugosa >sp|P32947|LIP3 DIURU Lipase 3 OS=Diutina rugosa 4
(Candida GN=LIP3 PE=1 SV=1
rugosa) MKLALALSLIASVAAAPTAKLANGDTITGLNAIINEA
FLGIPFAEPPVGNLRFKDPVPYSGSLNGQKFTSYGPSC Name Organismus Sequenz SEQ
ID Nr.
MQQNPEGTFEENLGKTALDLVMQ SKVFQAVLPQ SE
DCLTINWRPPGTKAGANLPVMLWIFGGGFEIGSPTIF
PPAQMVTKSVLMGKPIIHVAVNYRVASWGFLAGDDI
KAEGSGNAGLKDQRLGMQWVADNIAGFGGDPSKVT
IFGESAGSMSVLCHLIWNDGDNTYKGKPLFRAGIMQ
SGAMVPSDPVDGTYGNEIYDLFVSSAGCGSASDKLA
CLRSASSDTLLDATNNTPGFLAYSSLRLSYLPRPDGK
NITDDMYKLVRDGKYASVPVIIGDQNDEGTIFGLSSL
NVTTNAQARAYFKQSFIHASDAEIDTLMAAYPQDIT
QGSPFDTGIFNAITPQFKRISAVLGDLAFIHARRYFLN
HFQGGTKYSFLSKQLSGLPIMGTFHANDIVWQDYLL
GS GS VI YNNAFIAF ATDLDPNTAGLLVNWPKYTS S S Q
SGNNLMMINALGLYTGKDNFRTAGYDALMTNPSSFF
V
Lipase 4 Diutina rugosa >sp|P32948|LIP4 DIURU Lipase 4 OS=Diutina rugosa 5
(Candida GN=LIP4 PE=3 SV=1
rugosa) MKLALVLSLIVSVAAAPTATLANGDTITGLNAIINEA
FLGIPFAQPPVGNLRFKPPVPYSASLNGQKFTSYGPSC
MQMNPLGNWD S SLPKAAINSLMQ SKLFQ AVLPNGE
DCLTINWRPSGTKPGANLPVMVWIFGGGFEVGGSS
LFPPAQMITASVLMGKPIIHVSMNYRVASWGFLAGP
DIKAEGSGNAGLHDQRLGLQWVADNIAGFGGDPSK
VTIFGESAGSMSVMCQLLWNDGDNTYNGKPLFRAAI
MQSGAMVPSDPVDGPYGTQIYDQWASAGCGSASD
KLACLRSISNDKLFQATSDTPGALAYPSLRLSFLPRPD
GTFITDDMFKLVRDGKCANVPVIIGDQNDEGTVFALS
SLNVTTDAQARQYFKESFIHASDAEIDTLMAAYPSDI
TQGSPFDTGIFNAITPQFKRIAAVLGDLAFTLPRRYFL
NHFQGGTKYSFLSKQLSGLPVIGTHHANDIVWQDFL
VSHSSAVYNNAFIAFANDLDPNKAGLLVNWPKYTSS
SQSGNNLLQINALGLYTGKDNFRTAGYDALFTNPSSF
FV
Lipase 5 Diutina rugosa >sp|P32949|LIP5 DIURU Lipase 5 OS=Diutina rugosa 6
(Candida GN=LIP5 PE=3 SV=1
rugosa) MKLALALSLIASVAAAPTATLANGDTITGLNAIINEA
FLGIPFAEPPVGNLRFKDPVPYRGSLNGQSFTAYGPS
CMQ QNPEGTYEENLPKVALDLVMQ SKVFQ AVLPNS
EDCLTINWRPPGTKAGANLPVMLWIFGGGFEIGSPTI
FPPAQMVSKSVLMGKPIIHVAVNYRLASFGFLAGPDI
KAEGSSNAGLKDQRLGMQWVADNIAGFGGDPSKVT
IFGESAGSMSVLCHLLWNGGDNTYKGKPLFRAGIMQ
SGAMVPSDPVDGTYGTQIYDTLVASTGCSSASNKLA
CLRGLSTQALLDATNDTPGFLSYTSLRLSYLPRPDGA
NITDDMYKLVRDGKYASVPVIIGDQNDEGFLFGLSSL
NTTTEADAEAYLRKSFIHATDADITALKAAYPSDVTQ
GSPFDTGILNALTPQLKRINAVLGDLTFTLSRRYFLNH
YTGGPKYSFLSKQLSGLPILGTFHANDIVWQHFLLGS
GSVIYNNAFIAFATDLDPNTAGLSVQWPKSTSSSQAG
DNLMQISALGLYTGKDNFRTAGYNALFADPSHFFV
Lipase Rhizopus >sp|P61871 |LIP RHINI Lipase OS=Rhizopus niveus PE=1 7 niveus SV=1
MVSFISISQGVSLCLLVSSMMLGSSAVPVSGKSGSSN TAVSASDNAALPPLISSRCAPPSNKGSKSDLQAEPYN Name Organismus Sequenz SEQ
ID Nr.
MQKNTEWYESHGGNLTSIGKRDDNLVGGMTLDLPS
DAPPISLSSSTNSASDGGKWAATTAQIQEFTKYAGIA
ATAYCRSWPGNKWDCVQCQKWVPDGKIITTFTSLL
SDTNGYVLRSDKQKTIYLVFRGTNSFRSAITDIVFNFS
DYKPVKGAKVHAGFLS SYEQWNDYFP WQEQLTA
HPTYKVIVTGHSLGGAQALLAGMDLYQREPRLSPKN
LSIFTVGGPRVGNPTFAYYVESTGIPFQRTVHKRDIVP
HVPPQSFGFLHPGVESWIKSGTSNVQICTSEIETKDCS
NSIVPFTSILDHLSYFDINEGSCL
Lipase Aspergillus >tr|G3XZX5|G3XZX5 ASPNA Lipase OS=Aspergillus 8 niger (strain niger (strain ATCC 1015 / CBS 113.46 / FGSC AI 144 / ATCC 1015 / LSHB Ac4 / NCTC 3858a / NRRL 328 / USDA 3528.7) CBS 113.46/ GN=ASPNIDRAFT 53361 PE=4 SV=1
FGSC AI 144 / MYIPSVLLLAASLFHGATALPTPGSTPIPPSQDPWYSA
LSHB Ac4 / PEGFEEADPGAILRVRPAPGNLTVWGNASAAYNILY
NCTC 3858a / RTTD SQ YKP S WAVTTLLVPP VAAS AAVNQ S VLLS YQ
NRRL 328 / IAYDSFDVNASPSYAMYTSPPSDIILALQRGWFVNVP USDA 3528.7) D YEGPNASFTAGVQ S GHATLD S VRS VLASGFGLNED
AQYALWGYSGGALASEWAAELQMQYAPELNIAGLA
VGGLTPNVTSVMDTVTSTISAGLIPAAALGLSSQHPE
TYEFILSQLKTTGPYNRTGFLAAKDLTLSEAEVFYAF
QNIFDYFVNGSATFQAEWQKALNQDGYMGYHGFP
QMPVLAYKAIHDEISPIQDTDRVIKRYCGLGLNILYE
RNTIGGHSAEQVNGNARAWNWLTSIFDGTYAQQYK
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Lipase Penicillium >tr|A0A0G4PG74|A0A0G4PG74_PENCA Lipase, GDSL 9 camemberti OS=Penicillium camemberti FM 013
FM 013 GN=PCAMFM013 S014g000212 PE=4 SV=1
MATIETQGNEDAFKPYDQFLLFGDSITQMACNQELG
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Bevorzugt wird Lipase B aus Candida antarctica gemäß SEQ ID Nr. 1 oder ein homologes Enzym aufweisend eine Sequenzidentität von mindestens 65 % mit der Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 , welches die gleiche Funktion wie die Lipase B aus Candida antarctica gemäß SEQ ID Nr. 1 aufweist, eingesetzt.
Gemäß ii) wird eine Lipase gemäß einer der SEQ ID Nr. 1 bis 9 oder ein homologes Enzym aufweisend eine Sequenzidentität von mindestens 65 % mit einer der Sequenzen gemäß SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 9, welches die gleiche Funktion wie die Lipase gemäß SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 9 aufweist, eingesetzt. Bevorzugt weist das homologe Enzym eine
Sequenzidentität von mindestens 80%, bevorzugt von mindestens 90%>, weiter bevorzugt von mindestens 95%, weiter bevorzugt von mindestens 98%, mit der Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID No. 9 und die gleiche Funktion wie die Lipase auf.
Im Gallensäurederivat der allgemeinen Formel I bzw. II weist erfindungsgemäß mindestens einer der Ringe B und D mindestens eine weitere, bevorzugt alpha-ständige, Hydroxylgruppe, auf. Bevorzugt weist der Ring B eine oder zwei weitere Hydroxylgruppe(n), bevorzugt in alpha-Stellung, auf (Positionen 6 und/oder 7). Weiter bevorzugt weist der C-Ring des
Gallensäurederivats der allgemeinen Formel I bzw. II keine weitere Hydroxylgruppe auf (Position 12 und/oder 13), weiter bevorzugt weist keiner der Ringe A, C und D weitere Hydroxylgruppen auf (Positionen 1, 2, 12, 13, 15, 16). In einer bevorzugten Ausführungsform weist daher der Ring B eine oder zwei weitere Hydroxylgruppe(n), bevorzugt in alpha- Stellung, auf (Positionen 6 und/oder 7) und keiner der Ringe A, C und D weist weitere Hydroxylgruppen auf (Positionen 1, 2, 12, 13, 15, 16), abgesehen von der 3-alpha-OH- Gruppe am Ring A des Gallensäurederivats der allgemeinen Formel I bzw. der alpha-R 2 -0- Gruppe am A-Ring des Gallensäurederivats der allgemeinen Formel II.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform weist der Ring B eine oder zwei weitere Hydroxylgruppe(n), bevorzugt in alpha-Stellung, an Position 6 bzw. an den Positionen 6 und 7 und keiner der Ringe A, C und D weist weitere Hydroxylgruppen auf (Positionen 1, 2, 12, 13, 15, 16), abgesehen von der 3-alpha-OH-Gruppe am Ring A des Gallensäurederivats der allgemeinen Formel I bzw. der alpha-R 2 -0-Gruppe am A-Ring des Gallensäurederivats der allgemeinen Formel II.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Gallensäurederivat der allgemeinen Formel I ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus R'-Estern von Chenodesoxycholsäure (CDCA), Hyodesoxycholsäure (HDCA), Hyocholsäure (HCA) und Mischungen von zwei oder mehr davon, wobei R 1 die vorstehend zur allgemeinen Formel I bzw. II genannte Bedeutung hat. Überraschend wurde gefunden, dass bei Verwendung einer Lipase, ausgewählt aus der oben genannten Gruppe, bevorzugt von Lipase B aus Candida antarctica gemäß SEQ ID Nr. 1 oder eines homologen Enzyms aufweisend eine Sequenzidentität von mindestens 65 % mit der Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1, welches die gleiche Funktion wie die Lipase B aus Candida antarctica gemäß SEQ ID Nr. 1 aufweist, weiter bevorzugt bei Verwendung von Lipase B aus Candida antarctica gemäß SEQ ID Nr. 1 , sowohl Hyodesoxycholsäure (HDCA) als auch Hyocholsäure (HCA) so umgesetzt werden, dass nur die 3-alpha-Hydroxylgruppe am A-Ring reagierte, obwohl eine alpha-ständige Hydroxylgruppe in Position 6 am B-Ring bzw.
Hydroxylgruppen in den Positionen 6 und 7 am B-Ring vorhanden ist/sind, welche unter anderen Acylierungsbedingungen zumindest mitreagieren würde In einer weiter bevorzugten Ausführungsform ist das Gallensäurederivat der allgemeinen
Formel I daher ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Rl -Estern von Hyodesoxycholsäure (HDCA, 3a,6a-Dihydroxycholansäure), Hyocholsäure (HCA, 3a,6a,7a-Trihydroxy-5ß- cholan-24-säure) und Mischungen von R 1 -Estern von HDCA und HCA, wobei R 1 die vorstehend zur allgemeinen Formel I bzw. II genannte Bedeutung hat.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Gallensäurederivat der allgemeinen Formel II, erhalten oder erhältlich gemäß einem Verfahren wie vorstehend beschrieben.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Gallensäurederivat der allgemeinen Formel II,
wobei der Rest R 1 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cl- bis C30-Alkylgruppe, Cl - bis C30-Alkenylgruppe, Cl - bis C30-Alkinylgruppe, C5- bis C12-Cycloalkylgruppe und C5- bis C12-Arylgruppe; und der Rest R 2 eine-C(=0)-Cl-bis C30-Alkylgruppe ist; und mindestens einer der Ringe B und D mindestens eine weitere, bevorzugt alpha-ständige, Hydroxylgruppe, aufweist (Positionen 6, 7, 15, 16). Das Gallensäurederivat der allgemeinen Formel II weist bevorzugt die Formel IIa, IIb oder IIc, weiter bevorzugt die Formel IIb oder IIc, auf:
wobei der Rest R 1 jeweils ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cl-bis C30- Alkylgruppe, Cl- bis C30-Alkenylgruppe, Cl- bis C30-Alkinylgruppe,C5 bis C12- Cycloalkylgruppe und C5 bis C12-Arylgruppe, bevorzugt aus der Gruppe bestehend aus Cl- bis C18-Alkylgruppe, C5- bis C7-Cycloalkylgruppe und Phenylgruppe, weiter bevorzugt aus Cl- bis C5-Alkylgruppe, weiter bevorzugt ein unverzweigter Cl- bis C3-Alkylrest, weiter bevorzugt ein Methylrest, ist; und der Rest R 2 eine -C(=0)-Cl-bis C30-Alkylgruppe, bevorzugt eine unverzweigte -C(=0)-Cl-bis C18-Alkylgruppe, weiter bevorzugt eine unverzweigte -C(=0)-Cl-bis C5-Alkylgruppe, weiter bevorzugt -C(=0)-CH 3 , ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung daher ein Gallensäurederivat der Formel IIa, wobei der Rest R 1 ein Methylrest und der Rest R 2 eine -C(=0)-CH 3 ist (alpha-3 '- Acetyl-chenodesoxycholsäuremethylester). In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Gallensäurederivat der Formel IIb, wobei der Rest R 1 ein Methylrest und der Rest R 2 eine -C(=0)-CH 3 ist (alpha-3 '-Acetyl-hyodesoxycholsäuremethylester). In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Gallensäurederivat der Formel IIc, wobei der Rest R 1 ein Methylrest und der Rest R 2 eine -C(=0)-CH 3 ist (alpha- 3'-Acetyl-hyocholsäuremethylester). Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Gallensäurederivat der Formel IIb, wobei der Rest R 1 ein Methylrest und der Rest R 2 eine -C(=0)-CH 3 ist (alpha-3 '-Acetyl-hyodesoxycholsäuremethylester) und/oder ein Gallensäurederivat der Formel IIc, wobei der Rest R 1 ein Methylrest und der Rest R 2 eine -C(=0)-CH 3 ist (alpha-3 '-Acetyl-hyocholsäuremethylester).
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung eines Gallensäurederivats der allgemeinen Formel II
bevorzugt eines Gallensäurederivats der allgemeinen Formel II erhalten oder erhältlich nach dem Verfahren wie vorstehend beschrieben, wobei der Rest R 1 jeweils ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cl-bis C30-Alkylgruppe, Cl - bis C30-Alkenylgruppe, Cl - bis C30- Alkinylgruppe, C5 bis C12-Cycloalkylgruppe und C5 bis C12-Arylgruppe, bevorzugt aus der Gruppe bestehend aus Cl- bis C18-Alkylgruppe, C5- bis C7-Cycloalkylgruppe und
Phenylgruppe, weiter bevorzugt aus Cl- bis C5-Alkylgruppe, weiter bevorzugt ein unverzweigter Cl- bis C3-Alkylrest, weiter bevorzugt ein Methylrest, ist; und der Rest R 2 eine -C(=0)-Cl-bis C30-Alkylgruppe, bevorzugt eine unverzweigte -C(=0)-Cl-bis C18- Alkylgruppe, weiter bevorzugt eine unverzweigte -C(=0)-Cl-bis C5-Alkylgruppe, weiter bevorzugt -C(=0)-CH 3 , ist; und mindestens einer der Ringe B und D mindestens eine weitere, bevorzugt alpha-ständige, Hydroxylgruppe, aufweist, zur Herstellung von
Lithocholsäure. Bevorzugt wird zur Herstellung von Lithocholsäure ein Gallensäurederivat der allgemeinen Formel II verwendet, wobei mindestens einer der Ringe B und D mindestens eine weitere, bevorzugt alpha-ständige, Hydroxylgruppe, aufweist. Bevorzugt weist der Ring B eine oder zwei weitere Hydroxylgruppe(n), bevorzugt in alpha-Stellung, auf (Positionen 6 und/oder 7). Weiter bevorzugt weist der C-Ring des Gallensäurederivats der allgemeinen Formel II keine weitere Hydroxylgruppe auf (Position 12 und/oder 13), weiter bevorzugt weist keiner der Ringe A, C und D weitere Hydroxylgruppen auf (Positionen 1, 2, 12, 13, 15, 16). In einer bevorzugten Ausführungsform weist daher der Ring B eine oder zwei weitere
Hydroxylgruppe(n), bevorzugt in alpha-Stellung, auf (Positionen 6 und/oder 7) und keiner der Ringe A, C und D weist weitere Hydroxylgruppen auf (Positionen 1, 2, 12, 13, 15, 16), abgesehen von der 3-alpha-R 2 0-Gruppe am Ring A des Gallensäurederivats der allgemeinen Formel II.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Gallensäurederivat der allgemeinen Formel II, welches zur Herstellung von Lithocholsäure verwendet wird, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus R 1 -, R 2 -Derivaten von Chenodesoxycholsäure (CDCA), Hyodesoxycholsäure (HDCA), Hyocholsäure (HCA) und Mischungen von zwei oder mehr davon, wobei R 1 und R 2 die vorstehend genannte Bedeutung haben. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Gallensäurederivat der allgemeinen Formel II, welches zur Herstellung von
Lithocholsäure verwendet wird, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus R 1 -, R 2 -Derivaten von Hyodesoxycholsäure (HDCA), Hyocholsäure (HCA) und Mischungen von R 1 -, R 2 - Derivaten von Hyodesoxycholsäure (HDCA) und R 1 -, R 2 -Derivaten von Hyocholsäure (HCA), wobei R 1 und R 2 die vorstehend genannte Bedeutung haben.
Das Gallensäurederivat der allgemeinen Formel II, welches zur Herstellung von
Lithocholsäure verwendet wird, weist daher bevorzugt die Formel IIa, IIb oder IIc, weiter bevorzugt die Formel IIb oder IIc, auf:
wobei der Rest R 1 jeweils ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cl-bis C30- Alkylgruppe, Cl- bis C30-Alkenylgruppe, Cl- bis C30-Alkinylgruppe, C5 bis C12-
Cycloalkylgruppe und C5 bis C12-Arylgruppe, bevorzugt aus der Gruppe bestehend aus Cl- bis C 18- Alkylgruppe, C5- bis C7-Cycloalkylgruppe und Phenylgruppe, weiter bevorzugt aus Cl- bis C5 -Alkylgruppe, weiter bevorzugt ein unverzweigter Cl- bis C3-Alkylrest, weiter bevorzugt ein Methylrest, ist; und der Rest R 2 eine -C(=0)-Cl-bis C30-Alkylgruppe, bevorzugt eine unverzweigte -C(=0)-C 1 -bis C 18-Alkylgruppe, weiter bevorzugt eine unverzweigte -C(=0)-Cl-bis C5 -Alkylgruppe, weiter bevorzugt -C(=0)-CH 3 , ist. In einer bevorzugten Ausfuhrungsform betrifft die Erfindung daher die Verwendung eines Gallensäurederivats der Formel IIa, wobei der Rest R 1 ein Methylrest und der Rest R 2 eine -C(=0)-CH 3 ist, zur Herstellung von Lithocholsäure. In einer weiteren bevorzugten
Ausführungsform betrifft die Erfindung daher die Verwendung eines Gallensäurederivats der Formel IIb, wobei der Rest R 1 ein Methylrest und der Rest R 2 eine -C(=0)-CH 3 ist, zur
Herstellung von Lithocholsäure. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung daher die Verwendung eines Gallensäurederivats der Formel IIc, wobei der Rest R 1 ein Methylrest und der Rest R 2 eine -C(=0)-CH 3 ist, zur Herstellung von Lithocholsäure. Gemäß einer weiter bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung daher die
Verwendung eines Gallensäurederivats der Formel IIb, wobei der Rest R 1 ein Methylrest und der Rest R 2 eine -C(=0)-CH 3 ist, zur Herstellung von Lithocholsäure, und/oder die
Verwendung eines Gallensäurederivats der Formel IIc, wobei der Rest R 1 ein Methylrest und der Rest R 2 eine -C(=0)-CH 3 ist, zur Herstellung von Lithocholsäure. Verwendet werden zur Herstellung von Lithocholsäure kann ein einzelnes Gallensäurederivat der allgemeinen Formel II oder eine Mischung aus zwei oder mehr Gallensäurederivaten der allgemeinen Formel II. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Mischung aus den Gallensäurederivaten gemäß Formel IIa, IIb und IIc, weiter bevorzugt eine Mischung aus den Gallensäurederivaten gemäß Formel IIb und IIc, verwendet.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von Lithocholsäure,
umfassend
i) Bereitstellen einer ersten Zusammensetzung enthaltend mindestens ein
Gallensäurederivat der allgemeinen Formel I:
wobei der Rest R 1 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cl-bis C30- Alkylgruppe, Cl- bis C30-Alkenylgruppe, Cl- bis C30-Alkinylgruppe, C5 bis C12- Cycloalkylgruppe und C5 bis C12-Arylgruppe; und mindestens einer der Ringe B und D mindestens eine weitere, bevorzugt alpha-ständige, Hydroxylgruppe, aufweist (Positionen 6, 7, 15, 16);
Kontaktieren der ersten Zusammensetzung enthaltend mindestens ein
Gallensäurederivat der allgemeinen Formel I aus i) mit einer Verbindung R 2 -X, wobei R 2 eine-C(=0)-Cl-bis C30-Alkylgruppe ist, und X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hydroxylgruppe, -O-Cl- bis C20-Alkylgruppe, -O-Cl- bis C20- Alkenylgruppe, -O-Cl - bis C20-Alkinylgruppe, Thiolgruppe, -S-Cl- bis C20- Alkylgruppe, Amingruppe, -NHR 3 -Gruppe, -NR 3 R 4 -Gruppe, wobei R 3 und R 4 jeweils unabhängig eine Cl - bis C20-Alkylgruppe sind, Halogenatom und -0-(C=0)-R 5 - Gruppe, wobei R 5 eine Cl - bis C20-Alkylgruppe ist; und einer Lipase ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 9 oder einem homologen Enzym aufweisend eine Sequenzidentität von mindestens 65 % mit der Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 9, welches die gleiche Funktion wie die Lipase gemäß SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 9 aufweist, unter Erhalt einer zweiten Zusammensetzung enthaltend mindestens ein Gallensäurederivat gemäß der allgemeinen Formel II:
wobei der Rest R 1 die unter i) zur Formel I genannte Bedeutung und der Rest R 2 die unter ii) genannte Bedeutung hat und mindestens einer der Ringe B und D mindestens eine weitere, bevorzugt alpha-ständige, Hydroxylgruppe, aufweist;
iii) Umsetzung des aus ii) erhaltenen mindestens einen Gallensäurederivats gemäß der allgemeinen Formel II zur Lithocholsäure.
Das aus ii) erhaltene und gemäß iii) umgesetzte Gallensäurederivat weist die allgemeine Formel II auf
wobei der Rest R 1 jeweils ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cl-bis C30- Alkylgruppe, Cl-bis C30-Alkenylgruppe, Cl-bis C30-Alkinylgruppe C5 bis C12- Cycloalkylgruppe und C5 bis C12-Arylgruppe, bevorzugt aus der Gruppe bestehend aus Cl- bis C18-Alkylgruppe, C5- bis C7-Cycloalkylgruppe und Phenylgruppe, weiter bevorzugt aus Cl- bis C5-Alkylgruppe, weiter bevorzugt ein unverzweigter Cl- bis C3-Alkylrest, weiter bevorzugt ein Methylrest, ist; und der Rest R 2 eine verzweigte oder unverzweigte -C(=0)-C1- bis C30-Alkylgruppe, bevorzugt eine unverzweigte -C(=0)-Cl-bis C18-Alkylgruppe, weiter bevorzugt eine unverzweigte -C(=0)-Cl-bis C5-Alkylgruppe, weiter bevorzugt -C(=0)-CH 3 , ist; und mindestens einer der Ringe B und D mindestens eine weitere, bevorzugt alphaständige, Hydroxylgruppe, aufweist. Bevorzugt weist im gemäß ii) erhaltenen und gemäß iii) umgesetzten Gallensäurederivat der allgemeinen Formel II mindestens einer der Ringe B und D mindestens eine weitere, bevorzugt alpha-ständige, Hydroxylgruppe, auf. Bevorzugt weist der Ring B eine oder zwei weitere Hydroxylgruppe(n), bevorzugt in alpha-Stellung, auf (Positionen 6 und/oder 7). Weiter bevorzugt weist der C-Ring des Gallensäurederivats der allgemeinen Formel II keine weitere Hydroxylgruppe auf (Position 12 und/oder 13), weiter bevorzugt weist keiner der Ringe A, C und D weitere Hydroxylgruppen aufweist (Positionen 1, 2, 12, 13, 15, 16). In einer bevorzugten Ausführungsform weist daher der Ring B eine oder zwei weitere Hydroxylgruppe(n), bevorzugt in alpha-Stellung, auf (Positionen 6 und/oder 7) und keiner der Ringe A, C und D weist weitere Hydroxylgruppen auf (Positionen 1, 2, 12, 13, 15, 16), abgesehen von der 3-alpha-OH-Gruppe am Ring A des Gallensäurederivats der allgemeinen Formel II. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform weist der Ring B eine oder zwei weitere Hydroxylgruppe(n), bevorzugt in alpha-Stellung, auf (Position 6 bzw. Positionen 6 und 7) und keiner der Ringe A, C und D weist weitere Hydroxylgruppen auf (Positionen 1, 2, 12, 13, 15, 16), abgesehen von der 3-alpha-OH-Gruppe am Ring A des Gallensäurederivats der allgemeinen Formel II. In einer bevorzugten Ausfuhrungsform ist das gemäß ii) erhaltene und gemäß iii) umgesetzte Gallensäurederivat der allgemeinen Formel II ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus R 1 -, R 2 -Derivaten von Chenodesoxycholsäure (CDCA), Hyodesoxycholsäure (HDCA),
Hyocholsäure (HCA) und Mischungen von zwei oder mehr davon, wobei R 1 und R 2 die vorstehend genannte Bedeutung haben. Gemäß einer weiter bevorzugten Ausfuhrungsform ist das gemäß ii) erhaltene und gemäß iii) umgesetzte Gallensäurederivat der allgemeinen Formel II ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus R 1 -, R 2 -Derivaten von Hyodesoxycholsäure (HDCA), Hyocholsäure (HCA) und Mischungen von R 1 -, R 2 -Derivaten von Hyodesoxycholsäure (HDCA) und R 1 -, R 2 -Derivaten von Hyocholsäure (HCA), wobei R 1 und R 2 die vorstehend genannte Bedeutung haben.
Das Gallensäurederivat der allgemeinen Formel II, welches gemäß ii) erhalten und gemäß iii) umgesetzt wird, weist daher bevorzugt die Formel IIa, IIb oder IIc, weiter bevorzugt die Formel IIb oder IIc, auf:
wobei der Rest R 1 jeweils ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cl-bis C30- Alkylgruppe, Cl-bis C30-Alkenylgruppe, Cl-bis C30-Alkinylgruppe, C5 bis C12- Cycloalkylgruppe und C5 bis C12-Arylgruppe, bevorzugt aus der Gruppe bestehend aus v Cl - bis C18-Alkylgruppe, C5- bis C7-Cycloalkylgruppe und Phenylgruppe, weiter bevorzugt aus Cl- bis C5-Alkylgruppe, weiter bevorzugt ein unverzweigter Cl- bis C3-Alkylrest, weiter bevorzugt ein Methylrest, ist; und der Rest R 2 eine verzweigte oder unverzweigte -C(=0)-C1- bis C30-Alkylgruppe, bevorzugt eine unverzweigte -C(=0)-Cl-bis C18-Alkylgruppe, weiter bevorzugt eine unverzweigte -C(=0)-Cl-bis C5-Alkylgruppe, weiter bevorzugt -C(=0)-CH 3 , ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist im Gallensäurederivat der Formel IIa der Rest R 1 ein Methylrest und der Rest R 2 eine -C(=0)-CH 3 . In einer weiteren bevorzugten
Ausführungsform ist im Gallensäurederivat der Formel IIb der Rest R 1 ein Methylrest und der Rest R 2 eine -C(=0)-CH 3 . In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist im
Gallensäurederivat der Formel IIc der Rest R 1 ein Methylrest und der Rest R 2 eine -C(=0)- CH 3 ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird im Verfahren zur Herstellung von Lithocholsäure ein einzelnes Gallensäurederivat der allgemeinen Formel II oder eine Mischung aus zwei oder mehr Gallensäurederivaten der allgemeinen Formel II eingesetzt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird eine Mischung aus den Gallensäurederivaten der Formeln IIa, IIb und IIc, weiter bevorzugt eine Mischung aus den Gallensäurederivaten der Formeln IIb und IIc, eingesetzt.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von Lithocholsäure, umfassend
a) Bereitstellen einer Zusammensetzung enthaltend ein Gallensäurederivat der allgemeinen Formel II, bevorzugt erhalten oder erhältlich nach dem Verfahren wie vorstehend beschrieben,
wobei der Rest R 1 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cl-bis C30- Alkylgruppe, Cl-bis C30-Alkenylgruppe, Cl-bis C30-Alkinylgruppe C5 bis C12- Cycloalkylgruppe und C5 bis C12-Arylgruppe; der Rest R 2 eine C(=0)-Cl-bis C30- Alkylgruppe ist; und mindestens einer der Ringe B und D mindestens eine weitere, bevorzugt alpha-ständige, Hydroxylgruppe, aufweist;
Kontaktieren der Zusammensetzung enthaltend ein Gallensäurederivat der allgemeinen Formel II nach a) mit einem Oxidationsmittel oder einem Cl - bis C10-Alkylthiol, bevorzugt Propanthiol, unter Umwandlung der mindestens einen Hydroxylgruppe in B und/oder D in eine =0-Gruppe oder eine -S-Cl- bis C10-Alkylgruppe, bevorzugt eine =0-Gruppe oder eine -S-Propylgruppe, unter Erhalt eines Gallensäurederivats der allgemeinen Formel III,
wobei der Rest R 1 und der Rest R 2 die gleiche Bedeutung wie bei der allgemeinen Formel II aufweisen, und mindestens einer der Ringe B und D mindestens eine =0- Gruppe oder eine -S-Cl - bis C10-Alkylgruppe, bevorzugt eine =0-Gruppe oder eine S-Propylgruppe, aufweist;
Kontaktieren des Gallensäurederivats der allgemeinen Formel III nach b) mit einem Reduktionsmittel, optional mit zusätzlicher Verseifung, unter Erhalt von
Lithocholsäure.
Das gemäß b) eingesetzte Oxidationsmittel umfasst bevorzugt eine oder mehrere
Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pyridinium chlorochromat (PCC), Hypochlorit, Hypobromit, Dichromat, Chromsäure, Dess-Martin-Periodan ( 1,1,1 -Triacetoxy- l,l-dihydro-l,2-benziodoxol-3(lH)-one), Oxalychlorid/DMSO, Wasserstoffperoxid, Sauerstoff, Iod, Kaliumpermanganat, Cl - bis C30-Persäuren, Percarbonat,
Kaliumperoxomonosulfat, und Dimethylchlorosulphonium ion, bevorzugt aus der Gruppe bestehend aus Pyridinium chlorochromat (PCC), Hypochlorit, Hypobromit, Dichromat, Chromsäure, Wasserstoffperoxid, Kaliumpermanganat, Cl - bis C30-Persäuren und
Percarbonat, weiter bevorzugt Hypochlorit oder Hypobromit, weiterbevorzugt Hypochlorit. Das gemäß c) eingesetzte Reduktionsmittel umfasst bevorzugt eine oder mehrere
Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hydrazin, Hydrazinderivat, bevorzugt Tosylhydrazin, Semicarbazid; Hydrazinhydrat, Wasserstoff,
Natriumcyanoborhydrid, Diisobutylaluminiumhyrid, Lithiumaluminiumhydrid, Silan, Butylzinnhydrid, Zink/Salzsäure, Lithium, Natrium und Natriumborhydrid, weiter bevorzugt aus der Gruppe bestehend aus Hydrazin, Hydrazinderivat, bevorzugt Tosylhydrazin,
Semicarbazid; Hydrazinhydrat, Wasserstoff und Natriumborhydrid, weiter bevorzugt
Hydrazin oder Natriumborhydrid. Das Reduktionsmittel reduziert mindestens eine =0- Gruppe oder -S-Cl- bis C10-Alkylgruppe zu einer Methylengruppe und setzt bevorzugt die 3-alpha-Hydroxylgruppe am Ring A wieder frei (Abspaltung der R 2 -Gruppe). Die optionale Verseifung bzw. die dafür geeigneten Mittel und Bedingungen sind dem Fachmann bekannt.
Das in der gemäß a) bereitgestellten Zusammensetzung enthaltene Gallensäurederivat weist die allgemeine Formel II auf
wobei der Rest R 1 jeweils ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cl-bis C30- Alkylgruppe, Cl-bis C30-Alkenylgruppe, Cl-bis C30-Alkinylgruppe, C5 bis C12-
Cycloalkylgruppe und C5 bis C12-Arylgruppe, bevorzugt aus der Gruppe bestehend aus Cl- bis C 18- Alkylgruppe, C5- bis C7-Cycloalkylgruppe und Phenylgruppe, weiter bevorzugt aus Cl- bis C5 -Alkylgruppe, weiter bevorzugt ein unverzweigter Cl- bis C3-Alkylrest, weiter bevorzugt ein Methylrest, ist; und der Rest R 2 eine verzweigte oder unverzweigte -C(=0)-C1- bis C30- Alkylgruppe, bevorzugt eine unverzweigte -C(=0)-C 1 -bis C 18-Alkylgruppe, weiter bevorzugt eine unverzweigte -C(=0)-Cl-bis C5 -Alkylgruppe, weiter bevorzugt -C(=0)-CH 3 , ist; und mindestens einer der Ringe B und D mindestens eine weitere, bevorzugt alphaständige, Hydroxylgruppe, aufweist. Bevorzugt weist in dem in der gemäß a) bereitgestellten Zusammensetzung enthaltene Gallensäurederivat der allgemeinen Formel II mindestens einer der Ringe B und D mindestens eine weitere, bevorzugt alpha-ständige, Hydroxylgruppe, auf. Bevorzugt weist der Ring B eine oder zwei weitere Hydroxylgruppe(n), bevorzugt in alpha- Stellung, auf (Positionen 6 und/oder 7). Weiter bevorzugt weist der C-Ring des
Gallensäurederivats der allgemeinen Formel II keine weitere Hydroxylgruppe auf (Position 12 und/oder 13), weiter bevorzugt weist keiner der Ringe A, C und D weitere Hydroxylgruppen aufweist (Positionen 1, 2, 12, 13, 15, 16). In einer bevorzugten Ausführungsform weist daher der Ring B eine oder zwei weitere Hydroxylgruppe(n), bevorzugt in alpha-Stellung, auf (Positionen 6 und/oder 7) und keiner der Ringe A, C und D weist weitere Hydroxylgruppen auf (Positionen 1, 2, 12, 13, 15, 16), abgesehen von der 3-alpha-R 2 0-Gruppe am Ring A des Gallensäurederivats der allgemeinen Formel II. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform weist der Ring B eine oder zwei weitere Hydroxylgruppe(n), bevorzugt in alpha-Stellung, an Position 6 bzw. an den Positionen 6 und 7 und keiner der Ringe A, C und D weist weitere Hydroxylgruppen auf (Positionen 1, 2, 12, 13, 15, 16), abgesehen von der 3-alpha-R 2 0- Gruppe am Ring A des Gallensäurederivats der allgemeinen Formel II.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das in der gemäß a) bereitgestellten
Zusammensetzung enthaltene Gallensäurederivat der allgemeinen Formel II ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus R 1 -, R 2 -Derivaten von Chenodesoxycholsäure (CDCA),
Hyodesoxycholsäure (HDCA), Hyocholsäure (HCA) und Mischungen von zwei oder mehr davon, wobei R 1 und R 2 die vorstehend genannte Bedeutung haben. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform ist das in der gemäß a) bereitgestellten Zusammensetzung enthaltene Gallensäurederivat der allgemeinen Formel II ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus R 1 -, R 2 -Derivaten von Hyodesoxycholsäure (HDCA), Hyocholsäure (HCA) und Mischungen von R 1 -, R 2 -Derivaten von Hyodesoxycholsäure (HDCA) und R 1 -, R 2 - Derivaten von Hyocholsäure (HCA), wobei R 1 und R 2 die vorstehend genannte Bedeutung haben.
Das Gallensäurederivat der allgemeinen Formel II, welches in der gemäß a) bereitgestellten Zusammensetzung enthalten ist, weist daher bevorzugt die Formel IIa, IIb oder IIc, weiter bevorzugt die Formel IIb oder IIc, weiter bevorzugt die Formel IIb, auf:
wobei der Rest R 1 jeweils ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cl-bis C30- Alkylgruppe, Cl-bis C30-Alkenylgruppe, Cl-bis C30-Alkinylgruppe, C5 bis C12- Cycloalkylgruppe und C5 bis C12-Arylgruppe, bevorzugt aus der Gruppe bestehend aus Cl- bis C18-Alkylgruppe, C5- bis C7-Cycloalkylgruppe und Phenylgruppe, weiter bevorzugt aus Cl- bis C5-Alkylgruppe, weiter bevorzugt ein unverzweigter Cl- bis C3-Alkylrest, weiter bevorzugt ein Methylrest, ist; und der Rest R 2 eine verzweigte oder unverzweigte -C(=0)-C1- bis C30-Alkylgruppe, bevorzugt eine unverzweigte -C(=0)-Cl-bis C18-Alkylgruppe, weiter bevorzugt eine unverzweigte -C(=0)-Cl-bis C5-Alkylgruppe, weiter bevorzugt -C(=0)-CH 3 , ist.
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform ist in der gemäß a) bereitgestellten Zusammensetzung enthaltenen Gallensäurederivat der Formel IIa der Rest R 1 ein Methylrest und der Rest R 2 eine -C(=0)-CH 3 . In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform ist in der gemäß a)
bereitgestellten Zusammensetzung enthaltenen Gallensäurederivat der Formel IIb der Rest R 1 ein Methylrest und der Rest R 2 -C(=0)-CH 3 . In einer weiteren bevorzugten
Ausführungsform ist in der gemäß a) bereitgestellten Zusammensetzung enthaltenen
Gallensäurederivat der Formel IIc der Rest R ein Methylrest und der Rest R 2 -C(=0)-CH 3 . In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zur Herstellung von Lithocholsäure sind umfasst:
a) Bereitstellen einer Zusammensetzung enthaltend ein Gallensäurederivat der allgemeinen Formel IIb, bevorzugt erhalten oder erhältlich nach dem Verfahren wie vorstehend beschrieben,
wobei der Rest R 1 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cl-bis C30- Alkylgruppe, Cl-bis C30-Alkenylgruppe, Cl-bis C30-Alkinylgruppe C5 bis C12- Cycloalkylgruppe und C5 bis C12-Arylgruppe; der Rest R 2 eine C(=0)-Cl-bis C30- Alkylgruppe ist;
Kontaktieren der Zusammensetzung enthaltend ein Gallensäurederivat der allgemeinen Formel IIb nach a) mit einem Oxidationsmittel oder einem Cl- bis C10-Alkylthiol, bevorzugt Propanthiol, unter Umwandlung der mindestens einen Hydroxylgruppe in B und/oder D in eine =0-Gruppe oder eine -S-Cl- bis ClO-Alkylgruppe, bevorzugt eine =0-Gruppe oder eine -S-Propylgruppe, unter Erhalt eines Gallensäurederivats der allgemeinen Formel Illb,
O
OR
D
A B
(Illb)
o wobei der Rest R 1 und der Rest R 2 die gleiche Bedeutung wie bei der allgemeinen Formel II aufweisen, und der Ringe B in 6 Position eine =0-Gruppe oder eine -S-Cl- bis ClO-Alkylgruppe, bevorzugt eine =0-Gruppe oder eine -S-Propylgruppe, aufweist; Kontaktieren des Gallensäurederivats der allgemeinen Formel Illb nach b) mit einem Reduktionsmittel, optional mit zusätzlicher Verseifung, unter Erhalt von
Lithocholsäure. Die Erfindung betrifft weiterhin Lithocholsäure, erhalten oder erhältlich nach einem der oben vorstehend beschriebenen Verfahren.
Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung von Lithocholsäure erhalten oder erhältlich nach einem der oben vorstehend beschriebenen Verfahren zur Herstellung von hydroxylierten Gallensäuren. Im Speziellen aber nicht ausschließlich betrifft die Erfindung die Verwendung von Lithocholsäure erhalten oder erhältlich nach einem der oben vorstehend beschriebenen Verfahren zur Herstellung von Ursodesoxycholsäure oder Ursodesoxycholsäurederivaten. Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher illustriert.
Beispiele
Beis iel 1 - Herstellung von Chenodesoxycholsäuremethylester
0,5 kg Chenodesoxycholsäure (CDCA) wurden in 1,5 Liter Methanol (technisch) unter Rühren in einem Doppelwand-Glasreaktor gelöst. Langsam wurden 0,0031 Liter
konzentrierte Schwefelsäure (98 %) zugegeben. Danach wurde die Temperatur auf 85 °C eingestellt und die Reaktion unter Rückfluss gerührt. Nach Vollumsatz zum
Chenodesoxycholsäuremethylester (CDCA-Me) wurde die Reaktionslösung auf 40 °C eingestellt und 0,75 Liter Methanol unter Vakuum abdestilliert. Danach wurden 2 Liter Ethylacetat (technisch) zur Lösung gegeben. Die organische Phase wurde zweimal mit 1 ,5 Liter gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung und dreimal mit 1 ,5 Liter gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde anschließend unter Vakuum bis zur Trockene eingeengt.
Ausbeute: 0,475 kg CDCA-Me; 95 % bezogen auf eingesetzte CDCA. Beispiel 2 - Herstellung von 3'-Acetyl-Chenodesoxycholsäuremethylester
0,475 kg CDCA-Me aus Beispiel 1 wurden in 1,16 Liter Ethylacetat (technisch) unter Rühren in einem Doppelwand-Glasreaktor gelöst. Dazu wurden 0,25 Liter Vinylacetat (> 95 %) und 0,0035 kg immobilisierte Lipase B aus Candida antarctica gemäß SEQ ID Nr. 1 gegeben. Die Reaktionstemperatur wurde auf 45 °C eingestellt. Nach beendeter Reaktion wurde die Lipase ab filtriert und das Lösungsmittel unter Vakuum bis zur Trockene eingeengt, wobei 3'-Acetyl- Chenodesoxycholsäuremethylester (3'-Ac-CDCA-Me) als Feststoff erhalten wurde.
Ausbeute: 0,451 kg 3'Ac-CDCA-Me; 95 % bezogen auf eingesetzte CDCA-Me.
Beispiel 3 - Herstellung von 3'-Acetyl-7-oxo-Chenodesoxycholsäuremethylester
0,451 kg 3'Ac-CDCA-Me aus Beispiel 2 wurden in 2,65 Liter Ethylacetat (technisch) und 0,66 Liter Eisessig gelöst. Unter Kühlung wurden 2,65 Liter Natriumhypochlorit-Lösung (5- 10% technisch) zur Reaktion gegeben so dass die Reaktionstemperatur 20 °C nicht überstieg. Bei Vollumsatz zur Oxo -Verbindung wurde die wässrige Phase abgelassen und die organische Phase mit 0,8 Liter einer 10 %igen Natriumdithionit-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde mit 3,5 Liter Wasser gewaschen und anschließend über
Magnesiumsulfat getrocknet. Die getrocknete organische Phase wurde unter Vakuum bis zur Trockene eingeengt, wobei 3'-Acetyl-7-oxo-Chenodesoxycholsäuremethylester (3'Ac-7-oxo- CDCA-Me) als Feststoff erhalten wurde.
Ausbeute: 0,383 kg 3'Ac-7-oxo-CDCA-Me; 90 % bezogen auf eingesetzten 3'Ac-CDCA-Me. Beispiel 4 - Herstellung von Lithocholsäure
Hydrazinhydrat
0,383 kg 3'-Acetyl-7-oxo-Chenodesoxycholsäuremethylester (3'Ac-7-oxo-CDCA-Me) aus Beispiel 3 wurden in 1,5 Liter Ethylenglykol suspendiert und 0,425 Liter Wasser wurden unter Rühren hinzugegeben. Es wurden 0,489 kg festes Kaliumhydroxid zur Reaktionslösung gegeben und 4,1 Liter Hydrazin-Hydrat (50 % in Wasser). Die Reaktionslösung wurde auf 130 °C erhitzt wobei Wasser und Hydrazin-Hydrat abdestilliert wurden. Nach beendeter Abdestillation wurde die Temperatur auf 195 °C eingestellt und für 2,5 h gehalten. Es trat eine starke Gasentwicklung auf, welche den Reaktionsfortschritt aufzeigte. Danach wurde die Reaktionslösung auf unter 100 °C abgekühlt und 8,5 Liter einer Wasser/Eis Mischung zur Reaktion gegeben und stark gerührt. Anschließend wurde mit 0,638 Liter konzentrierter Schwefelsäure auf pH 1 angesäuert. Das Rohprodukt fiel als feiner weißer Feststoff aus und wurde abfiltriert. Das Rohprodukt wurde mit 0,5 Liter Wasser und 0,5 Liter Acetonitril gewaschen und anschließend getrocknet. Die Roh-Lithocholsäure wurde in 1,0 Liter Eisessig aufgenommen und durch Zugabe von 1,0 Liter Wasser langsam kristallisiert. Die hergestellte Lithocholsäure wurde filtriert und getrocknet. Ausbeute: 0,278 kg Lithocholsäure; 90 % bezogen auf eingesetzten 3'Ac-7-oxo-CDCA-Me.
Beispiel 5 - Herstellung von 3'-Acetyl-7-Propylthio-Chenodesoxycholsäuremethylester
0,451 kg 3'Ac-CDCA-Me aus Beispiel 2 wurden in 4,5 Liter Ethylenglykoldimethylether (DME) gelöst und 0,337 Liter Propanthiol und 0,135 Liter BF 3 x Et 2 0 hinzugegeben. Die Reaktionslösung wurde 2 Tage unter Rückfluss erhitzt. Danach wurde die abgekühlte Reaktionslösung mit Natriumcarbonatlösung neutral gewaschen und die organische Phase unter Vakuum bis zur Trockene eingeengt, wobei 3'-Acetyl-7-Propylthio-Chenodesoxy- cholsäuremethylester als Feststoff erhalten wurde.
Ausbeute: 0,405 kg 3'-Acetyl-7-Propylthio-Chenodesoxycholsäuremethylester; 91 % bezogen auf eingesetzten 3'Ac-CDCA-Me.
Beispiel 6 - Herstellung von Lithocholsäure
0,405 kg 3'-Acetyl-7-Propylthio-Chenodesoxycholsäuremethylester aus Beispiel 5 und 1,3 kg Nickelchlorid-Hexahydrat wurden in 10 Liter Methanol-THF (1 : 1) bei 0 °C gelöst. 0,318 kg Natriumborhydrid wurden in kleinen Portionen ä 20 g zur Reaktionslösung gegeben. Nach beendeter Zugabe wurde die Lösung für weitere 30 min gerührt. Das Präzipitat wurde über Celit filtriert und mit Methanol-THF nachgewaschen. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum bis zur Trockene entfernt, unter Erhalt von Roh-Lithocholsäure als Feststoff.
Die Roh-Lithocholsäure wurde in 1,0 Liter Eisessig aufgenommen und durch Zugabe von 1,0 Liter Wasser langsam kristallisiert. Die hergestellte Lithocholsäure wurde filtriert und getrocknet.
Ausbeute: 0,281 kg Lithocholsäure; 70 % bezogen auf eingesetztes 3'-Acetyl-7-Propylthio- Chenodesoxycholsäuremethylester. Beispiel 7 - Herstellung von Hyodesoxycholsäuremethylester
H
OH OH 0,5 kg Hyodesoxycholsäure (HDCA) wurden in 1,5 Liter Methanol (technisch) unter Rühren in einem Doppelwand-Glasreaktor gelöst. Langsam wurden 0,0031 Liter konzentrierte Schwefelsäure (98 %) zugegeben. Danach wurde die Temperatur auf 85 °C eingestellt und die Reaktion unter Rückfluss gerührt. Nach Vollumsatz zum Hyodesoxycholsäuremethylester (HDCA-Me) wurde die Reaktionslösung auf 40 °C eingestellt und 0,75 Liter Methanol unter Vakuum abdestilliert. Danach wurden 2 Liter Ethylacetat (technisch) zur Lösung gegeben. Die organische Phase wurde zweimal mit 1,5 Liter gesättigter Natriumhydrogencarbonat- Lösung und dreimal mit 1 ,5 Liter gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde anschließend unter Vakuum bis zur Trockene eingeengt. Ausbeute: 0,485 kg HDCA-Me; 98 % bezogen auf eingesetzte HDCA.
B ispiel 8 - Herstellung von 3 '-Acetyl- Hyodesoxycholsäuremethylester
OH OH 0,485 kg HDCA-Me aus Beispiel 7 wurden in 1,16 Liter Ethylacetat (technisch) unter Rühren in einem Doppelwand-Glasreaktor gelöst. Dazu wurden 0,25 Liter Vinylacetat (> 95 %) und 0,0035 kg immobilisierte Lipase B aus Candida antarctica gemäß SEQ ID Nr. 1 gegeben. Die Reaktionstemperatur wurde auf 45 °C eingestellt. Nach beendeter Reaktion wurde die Lipase ab filtriert und das Lösungsmittel unter Vakuum bis zur Trockene eingeengt, wobei 3'-Acetyl- Hyodesoxycholsäuremethylester (3'-Ac-HDCA-Me) als Feststoff erhalten wurde.
Ausbeute: 0,470 kg 3'Ac-HDCA-Me; 96 % bezogen auf eingesetzte HDCA-Me. Überraschend wurde gefunden, dass bei der Hyodesoxycholsäure (HDCA) nur die 3-alpha- Hydroxylgruppe am A-Ring acetyliert wurde, obwohl eine alpha- ständige Hydroxylgruppe in Position 6 am B-Ring vorhanden war, welche unter anderen Acylierungsbedingungen zumindest mitreagieren würde, bei Einsatz von Lipase B aus Candida antarctica gemäß SEQ ID Nr. 1 aber trotz nahezu vollständiger Acetylierung der 3-alpha-Hydroxylgruppe am A- Ring die 6-alpha-Hydroxylgruppe am B-Ring als Hydroxylgruppe verblieb.
Analog wurde HCA-Me (0,47 kg), welcher wiederum analog zu Beispiel 7 aus HCA (0,5 kg) erhalten worden war, mit Vinylacetat und immobilisierte Lipase B aus Candida antarctica gemäß SEQ ID Nr. 1 acetyliert (3'Ac-HCA-Me, 0,44 kg, 94 %). Hier wurde ebenfalls gefunden, dass nur die 3-alpha-Hydroxylgruppe am A-Ring acetyliert wurde, obwohl alphaständige Hydroxylgruppen in Positionen 6 und 7 am B-Ring vorhanden waren, welche unter anderen Acylierungsbedingungen zumindest mitreagieren würden, bei Einsatz von Lipase B aus Candida antarctica gemäß SEQ ID Nr. 1 aber trotz nahezu vollständiger Acetylierung der 3-alpha-Hydroxylgruppe am A-Ring die 6- und die 7-alpha-Hydroxylgruppe am B-Ring als Hydroxylgruppe verblieben; diese Ergebnisse sind deutlich aus den NMR-Spektren zu erkennen.
Die 1H- und 13 C-NMR-Daten sind nachfolgend tabellarisch aufgeführt.
δ 13C (ppm)
Nr. 3-Ac-HDCA-Me 3-Ac-HCA-Me
1 35.40 35.4
2 26.69 26.84
3 74.31 74.54
4 25.46 28.54
5 48.46 47.80
6 67.93 69.42
7 34.90 72.07 δ 13C (ppm)
Nr. 3-Ac-HDCA-Me 3-Ac-HCA-Me
8 34.88 38.64
9 39.93 32.73
10 36.07 36.16
11 20.09 20.74
12 40.05 39.58
13 42.97 42.89
14 56.29 50.30
15 24.31 23.79
16 28.26 28.31
17 56.08 55.88
18 12.17 11.91
19 23.61 23.15
20 35.48 35.56
21 18.40 18.43
22 31.18 31.20
23 31.18 31.20
24 174.92 175.19
25 51.67 51.72
26 170.76 171.23
27 21.58 21.65
δ 1H (ppm)
Nr. 3-Ac-HDCA-Me 3-Ac-HCA-Me
1
2
3 4.67, tt 4.50, tt
4
5
6 4.02, dt 3.80, brs
7 3.83, brt
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18 0.59, s 0.61
19 0.87, s 0.88
20
21 0.89, d 0.89
22
23 2.17, 2.30
24
25 3.60 -
26
27 1.98 - tt: Triplett von Tripletts; dt: Dublett von Tripletts; s d: Dublett; brs: breites Singlett; brt: breites Triplett Beispiel 9 - Herstellung von 3'-Acetyl-7-oxo-Hyodesoxycholsäuremethylester
0,470 kg 3'Ac-HDCA-Me aus Beispiel 8 wurden in 2,65 Liter Ethylacetat (technisch) und 0,66 Liter Eisessig gelöst. Unter Kühlung wurden 2,65 Liter Natriumhypochlorit-Lösung (5-
10% technisch) zur Reaktion gegeben so dass die Reaktionstemperatur 20 °C nicht überstieg.
Bei Vollumsatz zur Oxo -Verbindung wurde die wässrige Phase abgelassen und die organische Phase mit 0,8 Liter einer 10 %igen Natriumdithionit-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde mit 3,5 Liter Wasser gewaschen und anschließend über
Magnesiumsulfat getrocknet. Die getrocknete organische Phase wurde unter Vakuum bis zur
Trockene eingeengt, wobei 3'-Acetyl-7-oxo-Hyodesoxycholsäuremethylester (3'Ac-7-oxo-
HDCA-Me) als Feststoff erhalten wurde.
Ausbeute: 0,391 kg 3'Ac-7-oxo-HDCA-Me; 83 % bezogen auf eingesetzten 3'Ac-HDCA- Me.
Beispiel 10 - Herstellung von Lithocholsäure
0,391 kg 3'-Acetyl-7-oxo-Hyodesoxycholsäuremethylester (3'Ac-7-oxo-HDCA-Me) aus Beispiel 9 wurden in 1,5 Liter Ethylenglykol suspendiert und 0,425 Liter Wasser wurden unter Rühren hinzugegeben. Es wurden 0,489 kg festes Kaliumhydroxid zur Reaktionslösung gegeben und 4,1 Liter Hydrazin-Hydrat (50 % in Wasser). Die Reaktionslösung wurde auf 130 °C erhitzt wobei Wasser und Hydrazin-Hydrat abdestilliert wurden. Nach beendeter Abdestillation wurde die Temperatur auf 195 °C eingestellt und für 2,5 h gehalten. Es trat eine starke Gasentwicklung auf, welche den Reaktionsfortschritt aufzeigte. Danach wurde die Reaktionslösung auf unter 100 °C abgekühlt und 8,5 Liter einer Wasser/Eis Mischung zur Reaktion gegeben und stark gerührt. Anschließend wurde mit 0,638 Liter konzentrierter Schwefelsäure auf pH 1 angesäuert. Das Rohprodukt fiel als feiner weißer Feststoff aus und wurde abfiltriert. Das Rohprodukt wurde mit 0,5 Liter Wasser und 0,5 Liter Acetonitril gewaschen und anschließend getrocknet. Die Roh-Lithocholsäure wurde in 1,0 Liter Eisessig aufgenommen und durch Zugabe von 1 ,0 Liter Wasser langsam kristallisiert. Die hergestellte Lithocholsäure wurde filtriert und getrocknet.
Ausbeute: 0,234 kg Lithocholsäure; 60 % bezogen auf eingesetzten 3'Ac-7-oxo-HDCA-Me. Beispiel 11 - Herstellung von 3'-Acetyl-7-Propylthio-Hyodesoxycholsäuremethylester
0,470 kg 3'Ac-HDCA-Me aus Beispiel 8 wurden in 4,5 Liter Ethylenglykoldimethylether (DME) gelöst und 0,337 Liter Propanthiol und 0,135 Liter BF 3 x Et 2 0 hinzugegeben. Die Reaktionslösung wurde 2 Tage unter Rückfluss erhitzt. Danach wurde die abgekühlte
Reaktionslösung mit Natriumcarbonatlösung neutral gewaschen und die organische Phase unter Vakuum bis zur Trockene eingeengt, wobei 3'-Acetyl-7-Propylthio-Hyodesoxy- cholsäuremethylester als Feststoff erhalten wurde. Ausbeute: 0,428 kg 3'-Acetyl-7-Propylthio-Hyodesoxycholsäuremethylester; 91 % bezogen auf eingesetzten 3'Ac-HDCA-Me.
B ispiel 12- Herstellung von Lithocholsäure
0,428 kg 3'-Acetyl-7-Propylthio-Hyodesoxycholsäuremethylester aus Beispiel 11 und 1,3 kg Nickelchlorid-Hexahydrat wurden in 10 Liter Methanol-THF (1 : 1) bei 0 °C gelöst. 0,318 kg Natriumborhydrid wurden in kleinen Portionen ä 20 g zur Reaktionslösung gegeben. Nach beendeter Zugabe wurde die Lösung für weitere 30 min gerührt. Das Präzipitat wurde über Celit filtriert und mit Methanol-THF nachgewaschen. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum bis zur Trockene entfernt, unter Erhalt von Roh-Lithocholsäure als Feststoff.
Die Roh-Lithocholsäure wurde in 1,0 Liter Eisessig aufgenommen und durch Zugabe von 1,0 Liter Wasser langsam kristallisiert. Die hergestellte Lithocholsäure wurde filtriert und getrocknet.
Ausbeute: 0,291 kg Lithocholsäure; 68 % bezogen auf eingesetztes 3'-Acetyl-7-Propylthio- Hyodesoxycholsäuremethylester .
Next Patent: SEAT FOR A MOTOR VEHICLE