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Title:
METHOD FOR IMMOBILISING MICROORGANISMS, RELATED MATERIAL, AND USE THEREOF
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2004/090128
Kind Code:
A1
Abstract:
The present invention relates to a method for immobilising microorganisms (particularly yeasts or bacteria), a related material, and the use thereof in fermentation or bioconversion. Specifically, the present invention relates to the immobilisation of microorganisms in optionally dehydrated polymeric spheres consisting of two or more layers. The technical problem is that only part of the total microorganism population, namely the microorganisms adjacent to the edge of the sphere, is actually active in conventional spheres. According to the present invention, this problem is solved by providing a nutrient supply in the centre of the sphere and placing the microorganisms in a layer adjacent thereto, the resulting combination optionally being coated with a sterile layer defining, in this embodiment, a triple-layer sphere.

Inventors:
DE FATIMA TEIXEIRA CARDOSO DA (PT)
STREHAIANO PIERRE MARIE JEAN (FR)
CHEDAS SAMPAIO RUI (PT)
Application Number:
PCT/IB2003/001753
Publication Date:
October 21, 2004
Filing Date:
April 09, 2003
Export Citation:
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Assignee:
PROENOL IND BIOTECNOLOGICA LDA (PT)
DE FATIMA TEIXEIRA CARDOSO DA (PT)
STREHAIANO PIERRE MARIE JEAN (FR)
CHEDAS SAMPAIO RUI (PT)
International Classes:
C12C11/09; C12G1/022; C12G1/073; C12N11/04; (IPC1-7): C12N11/04; C12G1/022; C12G1/073; C12C11/09
Domestic Patent References:
WO1992014544A11992-09-03
Foreign References:
FR2519022A11983-07-01
EP0578617A21994-01-12
EP0350374A11990-01-10
FR2812655A12002-02-08
Other References:
YOKOTSUKA K ET AL: "CONTROLLED SIMULTANEOUS DEACIDIFICATION AND ALCOHOL FERMENTATION OF A HIGH-ACID GRAPE MUST USING TWO IMMOBILIZED YEASTS, SCHIZOSACCHAROMYCES POMBE AND SACCHAROMYCES CEREVISIAE", AMERICAN JOURNAL OF ENOLOGY AND VITICULTURE, XX, XX, vol. 44, no. 4, 1993, pages 371 - 377, XP000956002, ISSN: 0002-9254
DIVIES CHARLES ET AL: "Theme 4: Immobilized cell technology in wine production.", CRITICAL REVIEWS IN BIOTECHNOLOGY, vol. 14, no. 2, 1994, pages 135 - 153, XP009017645, ISSN: 0738-8551
Attorney, Agent or Firm:
Pelayo De, Sousa Henriques Rui (706-2°. Esq°, Porto, PT)
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Claims:
REVENDICATIONS
1. Procédé d'immobilisation de micro. organismes caractérisé en ce qu'on incorpore dans un milieu de fixation des micro. organismes une réserve nutritive adéquate aux dits micro. organismes et on réalise une réticulation de ce milieu de support.
2. Procédé selon la revendication antérieure, caractérisé en ce qu'on place la réserve nutritive dans la zone la plus éloignée de la frontière externe du milieu de fixation des micro. organismes.
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la réserve nutritive est physiquement séparée en zones distinctes, se positionnant dans le milieu de fixation des micro. organismes avec une densité plus grande dans les zones plus distantes de la frontière externe du dit milieu.
4. Procédé selon quelconque des revendications antérieures, caractérisé en ce que la réserve nutritive inclue les éléments nutritifs fournissant, notamment, une source d'azote (ammoniacale ou aminé selon les micro. organismes), sels minéraux (entre autres, phosphates, sulfates, potassium, magnésium) oligo. éléments (entre autres, fer, cuivre, zinc) et vitamines (entre autres, thiamine, biotine).
5. Procédé selon quelconque des revendications antérieures, caractérisé en ce qu'on utilise des sources nutritives complexes comme les extraits de levures autolysées.
6. Procédé selon quelconque des revendications, caractérisé en ce que la réserve nutritive contienne un substrat carboné comme un sucre fermentable ou encore un milieu de culture complet comme un moût de raisin dilué ou pas.
7. Procédé selon quelconque des revendications antérieures, caractérisé en ce que la réserve nutritive est mélangée à un polymère susceptible de ce transformer en gel, notamment l'alginate de sodium.
8. Procédé selon la revendication antérieure, caractérisé en ce que la solution susceptible de se transformer en gel possède une concentration en polymère variant entre 1 % et 3%.
9. Procédé selon quelconque des revendications antérieures, caractérisé en ce que la ou les couche (s) contiguë (s) à la réserve nutritive est (sont) constituée (s) d'une solution susceptible de se transformer en gel et des micro. organismes en suspension dans cette solution.
10. Procédé selon la revendication antérieure, caractérisé en ce que la solution susceptible de se transformer en gel a une concentration en polymère variant entre 1 % et 50%.
11. Procédé selon les revendications 9 et 10, caractérisé en ce que les micro. organismes sont des levures ou des bactéries.
12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'on utilise des souches de levures sélectionnées de Saccharomyces cerevisiae ou Saccharomyces uvarum, lors des fermentations en bouteilles de vins mousseux ou lors de la reprise de fermentation de moûts présentant un ralentissement ou un arrt de la fermentation alcoolique.
13. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'on utilise des levures du genre Schizosaccharomyces, lors de la désacidification des moûts de raisins acides.
14. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'on utilise des bactéries Oenococcus oe/ou Lacobac///Ms, ! ors de) a fermentation malolactique.
15. Procédé selon la revendication 11, caractérisé ce qu'on utilise des levures du genre Candida, lors de la bioconversion du xylose en xylitol.
16. Procédé selon quelconque des revendications antérieures, caractérisé en ce qu'on additionne une couche externe stérile, sans micro. organismes et sans perméabilité pour les micro. organismes existant dans le milieu de fixation, au milieu de fixation des micro. organismes, simultanément ou après l'étape de réticulation de celui. ci.
17. Procédé selon la revendication antérieure, caractérisé en ce que la couche externe est élaborée à partir d'un polymère d'une nature identique aux couches intérieures et susceptible de se transformer en gel et possédant une concentration identique à celle des autres couches.
18. Procédé selon les revendications 16 et 17, caractérisé en ce qu'on introduit une préparation enzymatique ou une préparation de composés organiques, dans la couche externe.
19. Procédé selon la revendication antérieure, caractérisée en ce qu'on additionne une solution de lysozyme à la dite couche externe, empchant le développement d'espèces indésirables qui sont sensibles à cette enzyme, notamment des bactéries lactiques en vinification.
20. Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'on additionne à ! a dite couche externe des parois de levures qui vont fixer les acides gras inhibiteurs de l'activité des micro. organismes fixés, lors du traitement d'arrt de fermentation.
21. Produit avec des micro. organismes immobilisés, caractérisé en ce qu'il possède une réserve nutritive incorporée dans le milieu de fixation des micro. organismes.
22. Produit selon la revendication antérieure, caractérisé en ce qu'il possède trois couches, la couche interne étant constituée par la réserve nutritive, la couche intermédiaire étant constituée par les micro. organismes et par le milieu de fixation, et étant la couche externe stérile dépourvue de micro. organismes et imperméable aux micro. organismes cités.
23. Procédé selon les revendications 1 à 20, pour la production du produit selon la revendication antérieure, caractérisé en ce que le produit est fait dans une seule étape avec trois couches, en utilisant des tubes concentriques qui définissent deux zones annulaires concentriques autour d'une zone centrale également concentrique et en réalisant l'incorporation de la réserve nutritive à travers de l'intérieur du tube central, l'incorporation des micro. organismes et du respectif milieu de fixation, à travers de la zone annulaire définie par la partie externe du tube central et par la partie interne du tube intermédiaire, et en faisant l'incorporation de la couche externe à travers de la zone annulaire définie par la partie externe du tube intermédiaire et par la partie interne du tube externe.
24. Procédé selon la revendication antérieure, caractérisé en ce que la réticulation du produit dispensé par le système de tubes est faite par le passage de celui. ci sur une solution d'un agent de réticulation.
25. Procédé selon la revendication antérieure, caractérisé en ce que le polymère susceptible de se transformer en gel est de nature identique dans les trois couches du produit et en ce que lorsque celui. ci est un alginate de sodium, l'agent de réticulation est le chlorure de calcium, en se faisant ainsi la réticulation du dit produit exclusivement de l'extérieur vers l'intérieur.
26. Procédé selon quelconque des revendications 23 à 25, caractérisé en ce que le produit dispensé par le dispositif de tubes concentriques est coupé par un dispositif de vibration, formant ainsi des sphères.
27. Procédé selon quelconque des revendications 23 à 26, caractérisé en ce qu'ensuite le produit subit une déshydratation partielle jusqu'à une AW finale de 0,1 à 0,5, de préférence de 0,3 à 0,4, notamment en utilisant une technique de séchage, à lit fluidisé ou l'utilisation d'étuves.
28. Produit selon la revendication 22, produit selon le procédé de la revendication 26, caractérisé en ce qu'il possède une forme sphérique et trois couches.
29. Produit selon la revendication antérieure, caractérisée en ce que le diamètre externe des sphères humides est compris entre 1 mm et 5 mm.
30. Utilisation caractérisée par l'emploi du produit de quelconque des revendications 21 à 22 ou 28 à 29, pour la fermentation de boissons en bouteille.
31. Utilisation caractérisée par l'emploi du produit de quelconque des revendications 21 à 22 ou 28 à 29, pour la reprise de fermentation de moûts présentant un ralentissement ou un arrt de la fermentation alcoolique.
Description:
DESCRIPTION PROCEDE D'IMMOBILISATION DE MICRO-ORGANISMES, PRODUIT CORRESPONDANT ET UTILISAT ION DE CELUI-CI

Champ d'appHcation de htwention La présente invention propose un procédé nouveau et innovateur pour l'immobilisation de micro-organismes (en particulier, levures ou bactéries) le respectif produit et son utilisation dans des procédés de fermentation ou de bioconversion.

En particulier, cette invention concerne l'immobilisation de micro- organismes dans des sphères de polymeres constituées par deux ou plusieurs couches, ces sphères étant susceptibles d'tre déshydratées.

Ces sphères peuvent tre utilisées dans l'élaboration de boissons fermentées, ou dans la réalisation de réactions de bioconversion. On appelle réactions de bioconversion aux transformations provoquées par les micro- - organismes, mais qui ne nécessitent pas du développement de ces micro- - organismes mmes. Sont particulièrement visées les applications dans le domaine des boissons fermentées comme, notamment : les vins tranquilles, la bière, les vins mousseux, les boissons gazeuses, l'hydromel et l'alcool (éthylique).

Arrière-plan technologique Il est bien connu qu'il existe diverses façons d'immobiliser des micro- - organismes :

Des sphères homogènes, ou encore appelées « monocouche » ou « couche simple ». Elles sont constituées par un gel qui contient les micro-organismes, étant décrites dans les documents de brevet : FR2320 349 et FR2359202. Il est connu que ces sphères n'empchent pas la sortie des micro-organismes (appelé relargage) vers le milieu de réaction, ce qui dans certains cas n'est pas compatible avec les exigences du procédé (vins mousseux par exemple, à cause du trouble indésirable que le relargage occasionne).

Le brevet EP0173915 décrit la réalisation d'une couche stérile autour du noyau de gel qui contient les micro-organismes, destinée à éviter ce phénomène de relargage, et développe l'application des sphères ou fils obtenus, appelés « double couche », dans les vins mousseux. Ce type de produit peut tre humide ou partiellement déshydraté, comme expliqué au brevet EP0350374.

Le problème qui se pose actuellement est que, comme il est connu et prouvé, dans les sphères qui présentent une telle structure (mono-couche ou double-couche) seulement une petite fraction de la population totale de micro-organismes sont réellement en activité. En effet, les substrats nutritifs sont consommés par les micro-organismes situés dans la périphérie de la couche. D'autre part, pour certains cas, le milieu ne contient pas tous les éléments nutritifs nécessaires à la bonne activité de ces micro-organismes immobilisés. Évidemment, ce problème est commun aux biocatalyseurs configurés sous d'autres formes, comme ceux présentés sous la forme de fils comme il est décrit dans le dit document EP0173915. Dans le cas des biocatalyseurs où les micro-organismes se trouvent immobilisés, ceux qui se trouvent à la périphérie ou plus proche de celle-ci (dans le cas de l'existence d'une couche protectrice externe sans micro-organismes) consomment la plupart des éléments nutritifs qui viennent de l'extérieur, rendant impossible

ou diminuant l'accès aux micro-organismes situés plus vers l'intérieur ce qui fait que ces micro-organismes restent relativement inactifs.

Description de l'invention Malgré le fait que la description qui suit soit basée sur le cas d'un produit avec les micro-organismes immobilisés, dorénavant nommé biocatalyseur, se trouvant sous forme de sphères, cette forme étant utilisée à titre d'exemple, on peut matérialiser cette invention sous n'importe quelle autre forme, fils ou plaques, dès quelle soit compatible avec les principes généraux énoncés et avec le champ d'application défini dans les revendications.

Selon la présente invention, le problème énoncé précédemment est résolu au moyen de la création d'une réserve nutritive au centre de la sphère et du placement des micro-organismes dans une couche contiguë à celle-ci, l'ensemble étant suivi éventuellement par le recouvrement au moyen d'une couche stérile qui définit, dans ce cas, une sphère à trois couches.

De la mme façon que ce qui est indiqué au-dessus pour le biocatalyseur, la description qui suit avec les 2 ou 3 couches est utilisée à titre d'exemple, constituant, en général, la forme préférée d'exécution, une fois qu'il peut se concevoir, selon le principe général de la présente invention, un biocatalyseur multi-couches, avec plus de couches, en alternant par exemple les couches de réserves nutritives, avec les couches qui contiennent les micro-organismes, l'ensemble étant éventuellement entouré par une couche stérile. Bien que les couches doivent tre de préférence concentriques, cela n'est pas obligatoire.

De cette façon, la réserve nutritive peut tre configurée comme un groupe d'endroits distincts entourés par la couche qui inclue les micro- - organismes, l'ensemble pouvant tre entouré par une couche stérile.

Selon une forme préférée d'exécution de l'invention, la couche externe stérile, quand elle existe, devra tre exempte de micro-organismes et ne devra pas tre perméable aux micro-organismes.

Selon une forme préférée d'exécution, l'objet de cette invention est une sphère à double ou triple couche avec les caractéristiques suivantes : 1. Une réserve nutritive qui a pour but de fournir aux micro- - organismes immobilisés, dans la couche contiguë, les éléments nutritifs qui leur assurent une bonne activité mais dont le milieu où seront introduites les sphères n'est pas capable de fournir en quantité suffisante. Ces éléments nutritifs peuvent tre légèrement différents en nature et en concentration selon la législation en vigueur dans les pays d'utilisation ; mais d'une façon générale ils fournissent une source d'azote (ammoniacal, aminé, selon le micro- -organisme), des sels minéraux (phosphate, sulfates, potassium, magnésium, etc....) des oligo-éléments (fer, cuivre, zinc, etc....) et des vitamines (thiamine, biotine, etc....). Les extraits de levures autolysés seront avantageusement utilisés en tant que source nutritive.

Selon le type d'utilisation, cette réserve nutritive peut aussi contenir un substrat carboné comme un sucre fermentaire ou encore un milieu naturel complet comme un moût de raisin dilué ou pas.

Selon cette invention, cette solution nutritive est mélangée avec un polymère susceptible de se transformer en gel, par exemple un alginate de sodium. Une concentration adéquate de ce polymère se situe entre 1 % et 3% en solution aqueuse.

2. Une couche contiguë à la réserve nutritive constituée d'une solution susceptible de se transformer en gel (dorénavant nommé milieu de fixation) et d'une population de micro-organismes en suspension dans cette solution. Les micro-organismes peuvent tre, notamment, des levures ou des bactéries. Pour une application du type fermentation en bouteille de vin mousseux, ou de reprise de fermentation de moûts en arrt de fermentation, il convient d'utiliser des souches sélectionnées de levures Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces uvarum.

Mis à part Saccharomyces, on peut aussi utiliser d'autres genres de levures, par exemple dans l'élaboration de bière, ou de boissons de faible teneur alcoolique ou encore dans les réactions de bioconversion. Par exemple, le genre Schizosaccharomyces sera plus utilisé pour la désacidification de moût de raisin acide ; les bactéries Oenococcus oeni ou Lactobacillus pour la fermentation malolactique et le genre Candida pour la bioconversion de xylose en xylitol.

Selon une autre caractéristique de l'invention, la concentration du polymère varie entre 1 % et 50%.

Les micro-organismes peuvent venir d'une culture fraîche réalisée selon les normes en vigueur à l'industrie ou bien d'une préparation commerciale sèche active ou lyophilisée et utilisée selon les conseils du fabricant.

3. Une couche externe additionnelle (dans le cas des sphères à 3 couches), qui est élaborée à partir d'un polymère de nature identique aux deux autres couches et susceptible de se transformer en gel. La concentration du polymère est identique à celle utilisée pour les autres couches. Selon une caractéristique supplémentaire

de l'invention, dans la couche externe, dans certaines applications, une préparation enzymatique ou une préparation de composants organiques pourra tre introduite : Par exemple (i), une solution de lysozyme additionnée dans la couche externe pour empcher le développement de bactéries indésirables qui sont sensibles à cette enzyme (exemple connu des bactéries lactiques en vinification) et qui pourraient tre à l'origine d'un trouble difficile à éliminer dans le cas des vins mousseux.

Par exemple (ii), les parois de levures qui vont fixer les acides gras, inhibiteurs de l'activité des micro- - organismes fixés, dans le cas des traitements d'arrt de fermentation.

Selon une autre caractéristique de l'invention les particules ainsi constituées, appelées de sphères triple couche, sont produites dans une seule étape.

La réalisation simultanée de trois couches concentriques peut tre faite recourrant à un dispositif de tubes concentriques qui définit deux zones annulaires concentriques autour d'une zone centrale également concentrique, faisant l'incorporation de la réserve nutritive par le tube central, l'incorporation des micro- - organismes et du milieu de fixation, à travers de la zone annulaire définie par la partie externe du tube central et par la partie interne du tube intermédiaire et en faisant l'incorporation de la couche externe à travers de la zone annulaire définie par la partie externe du tube intermédiaire et par la partie interne du tube externe.

Le diamètre des sphères humides est compris entre 1 et 5 mm.

La gélification est faite au moyen du passage d'un agent de réticulation, notamment le chlorure de calcium, sur une solution selon une procédure déjà connue, et préférentielle, où la réticulation de la sphère est faite de l'extérieur vers l'intérieur. Selon une autre caractéristique de l'invention, ces sphères peuvent tre plus ou moins déshydratées jusqu'à une activité de l'eau (AW) finale de 0,1 à 0,5, de préférence de 0,3 à 0,4. Cette déshydratation est réalisée avec une technique de séchage, à lit fluidisé ou l'utilisation d'étuve.

Ces sphères sont conservées dans un emballage résistant à la vapeur et à l'air et de préférence maintenu à une température relativement basse, étant l'idéale 4° C. Dans ces conditions il est possible de conserver le produit plusieurs mois.

Les exemples qui suivent illustrent quelques-unes des applications, caractéristiques et avantages de l'invention.

Exemple 1 : Préparation de sphères avec triple couche d'alginate, contenant des levures Saccharomyces cerevisiae, immobilisées et au préalable préparées pour résister à un milieu riche en alcool Les sphères sont préparées à partir d'une solution d'alginate de sodium, polymère linéaire extrait d'algues et composé par l'acide a-D- manuronique et p-D-guluronique. Les levures, au préalable acclimatées à l'alcool ou non, sont mélangées avec une partie de cette solution dans une cuve. Pour cet exemple il sera utilisé une souche de Saccharomyces cerevisiae EC1118 commercialisée sous la marque Lalvin.

Ensuite et grâce à un dispositif de tubes concentriques, cette solution passe par un système de vibration qui permet la formation de sphères.

Elles sont tout de suite gélifiées lors de la mise en contact avec une solution 0,2 M de chlorure de calcium, étant le temps de contact d'une demi- -heure.

Les sphères ainsi formées sont lavées par immersion pendant 10 minutes dans de l'eau déminéralisée.

Ensuite, les sphères sont déshydratées partiellement en lit fluidisé. Ce séchage permet d'obtenir une activité de l'eau (AW) comprise entre 0,3 et 0,4. La température de séchage est inférieure ou égale à 40°C. Le diamètre des sphères qui sont obtenues est de 1,5 à 4 mm. Après le contrôle qualité, les levures immobilisées et déshydratées sont emballées et stockées à 4°C avant leur utilisation.

Exemple 2 : Stabilité des levures pendant le stockage Afin de valider la préservation de l'activité des sphères, possédant la couche de Saccharomyces cerevisiae, suite à une conservation de 6 mois à 4'C, le contrôle est réalisé de la façon suivante : - 30 g de sphères préparées selon l'exemple 1, recouvertes d'une solution de saccharose à 50gel-1 (volume 100mut) à 37°C.

- La solution est maintenue à 37°C et l'évolution de la concentration en sucre est à suivre au long du temps.

- Après deux heures, la concentration du sucre est inférieure à 2gl-1, ce qui correspond à la fin de fermentation.

Ce contrôle de référence est effectué au temps 0 (immédiatement après la production des sphères) et aussi après 6 mois de stockage à 4°C.

La fin de la fermentation est effective après le mme temps de fermentation de 2 heures. Donc les levures immobilisées préparées selon l'exemple 1, paraissent tre stables pendant 6 mois de stockage à 4°C.