D'EXOPOLYSACCH ARIDES

La présente demande de brevet revendique la priorité de la demande de brevet français FR 1909136 déposée le 12 août 2019, laquelle est incorporée par référence dans la présente demande.

DOMAINE DE L'INVENTION

La présente invention est relative à de nouvelles souches de bactéries lactiques et à leurs utilisations.

ART ANTERIEUR Les bactéries lactiques sont des bactéries à Gram positif largement utilisées dans les fermentations alimentaires en raison de leur capacité à convertir les sucres en acide lactique. Les lactocoques et les lactobacilles sont ainsi utilisés dans les fermentations de lait pour la production de fromage et de yogourts où la production d'acide lactique contribue à limiter la détérioration des aliments. En outre, ces bactéries lactiques contribuent au développement de propriétés organoleptiques, notamment de la texture et de la saveur de ces produits laitiers.

Les bactéries lactiques sont également très présentes dans le microbiote intestinal humain où elles contribuent au bon fonctionnement de la digestion. D'ailleurs certaines souches naturelles de bactéries lactiques, notamment des lactobacilles, sont commercialisées en tant que probiotiques pour leurs propriétés bénéfiques pour la santé.

Pour en revenir aux produits laitiers, leurs propriétés rhéologiques et favorables à la santé des produits laitiers seraient largement influencées par les exopolysaccharides (EPS) exprimés par les bactéries lactiques utilisées pour leur fabrication. Ces EPS, qui sont des polymères d'hydrates de carbone, ont la particularité d'être sécrétés dans le milieu de croissance ou liés de manière lâche à la surface de la cellule contrairement aux autres polysaccharides de la paroi qui sont liés de manière covalente à la paroi cellulaire. D'ailleurs, l'utilisation de bactéries productrices d'EPS a été envisagée pour la production de fromage allégé. Outre leurs propriétés texturales, il a également été suggéré que ces mêmes EPS influencent les interactions bactéries-hôte, notamment en affectant l'adhésion à la cellule hôte et à la muqueuse ou l'immunomodulation à médiation bactérienne. Il a ainsi été récemment constaté que les EPS de Lactobacillus rhamnosus étaient capables d'interférer avec la propagation de Candida et d'agir ainsi en tant qu'agent anti-candidose.

Pour ces raisons, la possibilité de disposer de nouvelles souches de bactéries lactiques présentant une surproduction d'EPS constitue une piste d'intérêt pour l'industrie agroalimentaire.

Maintenant, la seule méthode proposée pour la sélection de mutants surproducteurs d'EPS consiste à isoler des mutants de bactériophages ou résistants aux antibiotiques

(W02011092300 Al et W02013160270 Al). Il est bien évident que des méthodes nécessitant des bactériophages, non disponibles d'ailleurs pour toutes les souches B bactériennes d'intérêt, ou conférant une résistance de la bactérie aux antibiotiques, ne sont pas souhaitables en vue d'obtenir des souches adaptées à une utilisation industrielle.

SOMMAIRE DE L'INVENTION Les inventeurs ont développé une méthode d'isolation d'une souche bactérienne de type bactérie lactique capable de surproduction de exopolysaccharides, laquelle méthode n'utilise ni bactériophages, ni gène de résistance aux antibiotiques et qui comprend au moins une étape de sédimentation différentielle.

Aussi, un premier objet de l'invention se rapport à un procédé d'isolation d'une souche de bactérie lactique capable de surproduire des exopolysaccharides, lequel comprend les étapes de : i) mise en culture d'une population bactérienne de bactéries lactiques dans un milieu de culture semi-liquide, ii) identification et isolation des clones présentant une moindre mobilité dans ledit milieu de culture.

Un deuxième objet concerne une souche bactérienne susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention.

Un autre objet de l'invention concerne une composition comprenant une telle souche selon l'invention. Un objet complémentaire de l'invention se rapporte à l'utilisation d'une souche de bactérie lactique selon l'invention en tant qu'agent rhéologique.

Un dernier objet de l'invention porte sur un polysaccharide, qui est susceptible d'être obtenu par la culture de la souche CNCM-5413, lequel polysaccharide présente la structure suivante :

DESCRPTION DES FIGURES

Figure 1: Vues en microscopie électronique à transmission de paroi de souches bactériennes de référence ou isolées par le procédé selon l'invention (CWPS = polysaccharides de la paroi cellulaire ; EPS = exopolysaccharides)

Figure 2: Production relative d'exopolysaccharides par Lb. Rhamnosus VES7418 et ses dérivés surproduisants des EPS. La souche VES7517 (souche LGG) a été utilisé en tant que contrôle négatif et les souches de Lb. rhamnosus VES7642 (isolée d'un produit laitier fermenté « LACTUS » de la marque CARREFOUR) et VES764S (isolé des capsules de "TROPHIGYL" de la marque SANOFI) en tant que contrôles positifs.

Figure 3: Alignement de la séquence de la protéine EPSD de Lb. rhamnosus de la souche VES7418 (SEQ ID NO :1) et de la séquence homologue YVEL de la souche 168 de Bacillus subtilis phylogénétiquement distante (numéro d'accession P71051 ; SEQ ID NO :19). les sites de mutations sont indiqués en gras. Figure 4: Séquence de la protéine EPSC de la souche Lb rhamnosus VES7699 (SEQ ID NO :19).

Figure 5: Graphique présentant la viscosité du milieu de culture de différentes souches de bactérie lactique produisant différents EPS. La viscosité du milieu est exprimée en centipoise (cP).

Figure 6: Structures de polysaccharides purifiés à partir de Lactobacillus rhamnosus souche VES746S et VES7671.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION

Un premier objet de l'invention concerne un procédé d'isolation d'une souche de bactérie lactique capable de surproduire des exopolysaccharides, lequel comprend les étapes de : i) mise en culture d'une population bactérienne de bactéries lactiques dans un milieu de culture semi-liquide, ii) identification et isolation des clones présentant une moindre mobilité dans ledit milieu de culture.

Le principe du procédé selon l'invention repose sur la sédimentation différentielle. En effet, les clones de souches surproduisant des exopolysaccharides ont plus de difficultés à sédimenter dans un milieu de culture semi-liquide que les souches en produisant moins. Maintenant, ce différentiel de sédimentation est simplement accessible visuellement puisque plus un clone présentera une surcapacité de production d'exopolysaccharides, moins il sera mobile dans le milieu de culture semi-liquide et plus l'aspect de la colonie associée sera circulaire. A l'inverse, moins un clone présentera de capacité de production d'exopolysaccharides, plus il sera mobile dans le milieu de culture semi- liquide et plus l'aspect de la colonie associée sera effilé (racine).

Par bactérie lactique, on entend une bactérie à Gram positif, anaérobies partiellement tolérantes à l'oxygène et dont la fermentation des sucres s'accompagne d'une production d'acide, d'acide lactique pour l'essentiel (sinon acide acétique et acide propionique). Les bactéries lactiques les plus utilisées dans l'industrie agroalimentaire appartiennent à l'ordre des lactobacilles qui inclue les bactéries appartenant au genre Lactococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pseudoleuconostoc, Pediococcus, Brevibacterium, Enterococcus et Propionibacterium. De surcroît, les bactéries productrices d'acide lactique et strictement anaérobie appartenant au genre Bifidobacterium sont également classées parmi les bactéries lactiques.

Avantageusement, on entend par bactérie lactique, une bactérie appartenant au genre Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Bifidocbacterium, Leuconostoc ou Pediococcus.

De manière préférée, une telle bactérie lactique appartient à l'une des espèces suivantes :

Streptococcus thermophilus,

Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus casei,

Lactobacillus reuteri,

Lactobacillus plantarum,

Lactobacillus rhamnosus, et - Lactobacillus fermentum.

Par milieu de culture, on entend un milieu de culture adapté à la croissance de la population bactérienne criblé. Naturellement, le milieu de culture en question permet une bonne synthèse d'exopolysaccharides. A titre d'exemple, il est possible d'utiliser le milieu MRS ou Todd-Hewitt. Par « semi-liquide » pour ce qui concerne un milieu de culture, on entend la viscosité correspondant à un milieu de culture qui comprend de l'agar agarà une teneur comprise entre 0,03 et 0,2% (en poids par rapport au poids total de la composition), de préférence entre 0,1 et 0,15% et, idéalement, de l'ordre de 0,1.%. De préférence, on entend un milieu de culture qui comprend de l'agar agar à une teneur comprise entre 0,03 et 0,2% (en poids par rapport au poids total de la composition), de préférence entre 0,1 et 0,15% et, idéalement, de l'ordre de 0,1.%.

Par population bactérienne, on considère la culture pure d'une seule souche. Maintenant, cette culture peut contenir des mutants spontanés qui apparaissent à une fréquence de 10-8. Il est à noter qu'une telle fréquence peut augmenter considérablement du fait d'une étape de mutagenèse. Aussi et selon un mode de réalisation particulier, le procédé selon l'invention comprend une étape préalable de mutagenèse.

Habituellement, cette étape de mutagenèse est réalisée sur une souche de bactérie de sorte à obtenir une population bactérienne. Des techniques de mutagenèse sont bien connues de l'homme du métier et on distingue alors la mutagenèse aléatoire de la mutagenèse dirigée. Ces deux mutagenèses induisent une ou plusieurs mutations dans l'ADN bactérien.

De telles mutations peuvent consister en des substitutions (un ou plusieurs nucléotides sont remplacés par un même nombre de nucléotides différents), en des insertions (un ou plusieurs nucléotides sont ajoutés à une séquence cible), et/ou en des délétions (un ou plusieurs nucléotides sont enlevés de la séquence).

La mutagenèse aléatoire permet d'obtenir un grand nombre de mutants en ce qu'elle induit des mutations dans l'ADN de façon aléatoire. Une telle mutagenèse peut être obtenue en exposant des bactéries à un agent physique (UV, température, etc...) ou à un agent chimique (CaCI2, DMSO, etc...).

Pour ce qui est de la mutagenèse dirigée, elle permet l'induction d'une ou plusieurs mutations dans le génome bactérien, mais cette fois de façon précise.

Un deuxième objet de l'invention concerne une souche de bactérie lactique susceptible d'être obtenue par le procédé décrit précédemment. Une telle souche de bactérie lactique présente un phénotype dit de la colonie filante (ropy) dans le procédé selon l'invention et produit des quantités importantes d'exopolysaccharides.

Les inventeurs ont maintenant mis en évidence que des bactéries lactiques comprenant des variants EPSD ou EPSC, présentant une mutation dans la séquence du gène epsD ou epsC respectivement, présentaient simultanément une surexpression en exopolysaccharides.

Par protéine EPSD, on entend une protéine homologue aux tyrosine kinases des bactéries gram négative qui présente une activité tyrosine kinase localisée au niveau de son extrémité N-terminale et des sites d'autophosphorylation au sein d'un domaine localisé au niveau de son extrémité C-terminale comprenant de deux à sept résidus tyrosine. EPSD exerce son activité de régulation de la production d'exopolysaccharides (EPS) par autophosphorylation et/ou phosphorylation d'autres protéines bactériennes impliquées dans la production de ces EPS. De préférence, ladite souche de bactérie lactique présente un variant de l'EPSD présentant une activité tyrosine kinase d'au moins 10% supérieure, de préférence d'au moins 20% supérieure et, de manière particulièrement préférée, d'au moins 50% supérieure à l'EPSD de référence.

La mesure de l'activité de la protéine EPSD peut être faite simplement à l'aide de techniques bien connues de l'homme du métier. A titre d'exemple de telles méthodes, on peut citer le kit PHOSPHO-TAG™ PHOSPHOPROTEIN GEL STAIN (ABP BIOSCIENCES).

Il s'agit d'un kit utilisant un colorant fluorescent permettant de détecter sélectivement les protéines phosphorylés dans les gels de polyacrylamide. Ce colorant comprend un groupe « PHOSPHO-TAG™ » qui permet la détection directe au sein du gel des groupements phosphate attachés aux résidus tyrosine. A noter que ce colorant peut être utilisé avec des gels standards SDS-polyacrylamide gels. Par EpsD de référence, on entend la séquence majoritairement présente dans les microorganismes d'une même espèce et qui correspond à la valeur de référence pour l'activité de l'EpsD. Maintenant, l'EpsD de référence sera la séquence de la protéine EpsD telle que présente dans la souche bactérienne utilisée dans le procédé selon l'invention. A titre d'exemple, de séquences de référence pour les espèces, on peut citer les séquences des protéines correspondants aux numéros d'accession WP_011544276 (Lactobacillus delbrueckii ATCC 11842, SEQ ID NO :3), WP_015765007 (Lactobacillus rhamnosus LGG, SEQ ID NO :4) et SEQ ID NO :1 (Lactobacillus rhamnosus VES7418), WP_047105729 (Lactobacillus casei, SEQ ID NO :9), YP_004889857 (Lactobacillus plantarum WCFS1 , SEQ ID NO :5), WP_012390713 (Lactobacillus fermentum IFO 3956, SEQ ID NO :6), WP_011161880 (Lactobacillus johnsonii NCC 53, SEQ ID NO :8) et WP_003654424 (Lactobacillus gasseri ATCC 33323, SEQ ID NO :8). Sur la base de ces différentes séquences d'EPSD, une séquence consensus EPSD a été élaborée et correspond à la séquence SEQ ID NO :2.

Par "variant" de l'EpsD, on entend une séquence polypeptidique qui diffère de la séquence SEQ ID NO :2, de préférence par au moins une mutation ponctuelle.

Selon un mode de réalisation préférée, ledit variant correspond à au moins une mutation choisie dans le groupe comprenant : - un résidu phénylalanine (F) à la position correspondant à la sérine (S) en position 66 de la séquence consensus SEQ ID NO :2, laquelle équivaut à la Sérine (S) en position 63 de la séquence SEQ ID NO :1 ;

- un résidu acide glutamique (E) à la position correspondant à la lysine (K) en position 73 de la séquence consensus SEQ ID NO :2, laquelle équivaut à la lysine (K) en position

70 de la séquence SEQ ID NO :1 ;

- un résidu tryptophane (Y) à la position correspondant à la sérine (S) en position 74 de la séquence consensus SEQ ID NO :2, laquelle équivaut à la sérine (S) en position 71 de la séquence SEQ ID NO :1 ; - un résidu valine (V) à la position correspondant à l'acide aspartique (D) en position 97 de la séquence consensus SEQ ID NO :2, laquelle équivaut à l'acide aspartique (D) en position 94 de la séquence SEQ ID NO :1 ;

- un résidu sérine (S) à la position correspondant à la proline (P) en position 181 de la séquence consensus SEQ ID NO :2, laquelle équivaut à la proline (P) en position 175 de la séquence SEQ ID NO :1 ; et une insertion d'au moins un motif GY, de préférence d'au moins deux motifs GY dans la région riche en tyrosine du site d'autophosphorylation correspondant aux résidus compris entre les positions 241 à 257 de la séquence consensus SEQ ID NO :2, ce qui correspond aux résidus compris entre les positions 234 et 244 de la séquence SEQ ID NO :1.

Avantageusement, ledit variant comprend : i) au moins une insertion d'au moins un motif GY, de préférence d'au moins deux motifs GY dans la région riche en tyrosine du site d'autophosphorylation correspondant aux résidus compris entre les positions 241 à 257 de la séquence consensus SEQ ID NO :2, ce qui correspond aux résidus compris entre les positions 234 et 244 de la séquence SEQ ID NO :1, et ii) au moins une mutation choisie dans le groupe comprenant :

- un résidu phénylalanine (F) à la position correspondant à la sérine (S) en position 66 de la séquence consensus SEQ ID NO :2, laquelle équivaut à la Sérine (S) en position 63 de la séquence SEQ ID NO :1 ; - un résidu acide glutamique (E) à la position correspondant à la lysine (K) en position

73 de la séquence consensus SEQ ID NO :2, laquelle équivaut à la lysine (K) en position 70 de la séquence SEQ ID NO :1 ;

- un résidu tryptophane (Y) à la position correspondant à la sérine (S) en position 74 de la séquence consensus SEQ ID NO :2, laquelle équivaut à la sérine (S) en position 71 de la séquence SEQ ID NO :1 ;

- un résidu valine (V) à la position correspondant à l'acide aspartique (D) en position 97 de la séquence consensus SEQ ID NO :2, laquelle équivaut à l'acide aspartique (D) en position 94 de la séquence SEQ ID NO :1 ;

- un résidu sérine (S) à la position correspondant à la proline (P) en position 181 de la séquence consensus SEQ ID NO :2, laquelle équivaut à la proline (P) en position 175 de la séquence SEQ ID NO :1. 1S

Avantageusement, la souche de bactérie lactique susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'invention est choisie parmi l'une des souches déposées selon le traité de Budapest auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur, FRANCE) sous le numéro d'accession CNCM 1-5413 ou CNCM-5414 ou un mutant de l'une d'elle.

Par « mutant », on entend, au sens de la présente invention, une souche bactérienne selon l'invention ayant subi une ou plusieurs mutations, c'est-à-dire un ou plusieurs changements dans une ou plusieurs séquences d'acides nucléiques (telle que la séquence d'un gène) ou dans une ou plusieurs séquences d'acides aminés, comparé, par exemple, à la séquence d'acides nucléiques ou d'acides aminés présente dans la souche bactérienne telle que décrite dans la présente invention. Lesdites mutations sont par exemple des substitutions et/ou délétions et/ou insertions d'un ou plusieurs nucléotides ainsi que des combinaisons de celles-ci. Ces mutations peuvent apparaître spontanément ou bien être introduites en utilisant notamment des techniques de biologie moléculaire. Dans certains modes de réalisation, les mutants de la souche bactérienne de l'invention ont la ou les mêmes activités biologiques ou des activités biologiques similaires à celle de la souche bactérienne de l'invention. Le terme « mutant » peut être utilisé de manière interchangeable avec le terme « variant ».

Par protéine EPSC, on entend une protéine transmembranaire présentant des domaines extracellulaire et cytoplasmique, laquelle protéine est supposée être nécessaire à une bonne localisation de la protéine EPS D dans la bactérie. Par EPSC de référence, on entend la séquence majoritairement présente dans les microorganismes d'une même espèce et qui correspond à la valeur de référence pour l'activité de l'EPSC. Maintenant, l'EPSC de référence sera la séquence de la protéine EPSC telle que présente dans la souche bactérienne utilisée dans le procédé selon l'invention. A titre d'exemple, de séquences de référence pour les espèces, on peut citer les séquences des protéines correspondants aux numéros d'accession WP_011544277 (Lactobacillus delbrueckii ATCC 11842 ; SEQ ID NO :11), WP_014569866 (Lactobacillus rhamnosus LGG ; SEQ ID NO :12) et WP_070788833.1 (Lactobacillus rhamnosus VES 7699 ; SEQ ID NO :13), WP_025013752 (Lactobacillus casei ATCC 393 ; SEQ ID NO :14), YP_004889858 (Lactobacillus plantarum WCFS1 ; SEQ ID NO :15), WP_012390712

(Lactobacillus fermentum IFO 3956 ; SEQ ID NO :16), WP_011161879 (Lactobacillus johnsonii NCC 53 ; SEQ ID NO :17) et WP_003647150 (Lactobacillus gasseri ATCC 33323 ; SEQ ID NO :18).Sur la base de ces différentes séquences d'EPSC, une séquence consensus EPSC a été élaborée et correspond à la séquence SEQ ID NO :10 Par "variant" de l'EpsC, on entend une séquence polypeptidique qui diffère de la séquence de référence par au moins une mutation ponctuelle.

Selon un mode de réalisation préférée, ledit variant correspond à au moins une insertion d'un résidu isoleucine (I) avant la position correspondant à la glycine (G) 234 de la séquence SEQ ID NO :10 ; laquelle équivaut à la glycine (G) en position 224 de la séquence SEQ ID NO :13.

Avantageusement, la souche de bactérie lactique susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'invention est la souche déposée selon le traité de Budapest auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur, FRANCE) sous le numéro d'accession CNCM-5415 ou un mutant de celle-ci.

De manière préférée, la souche bactérienne probiotique de l'invention, peut être administrée à l'homme ou à l'animal sans risque pour sa santé. Un autre objet de l'invention concerne une composition comprenant une souche de bactérie lactique telle que décrite précédemment.

Dans cette composition, les bactéries peuvent être utilisées entières, vivantes ou non, ou sous forme de lysat bactérien, ou encore sous forme de fractions bactériennes.

Selon un mode de réalisation préféré, la composition de l'invention comprend au moins 105, de préférence au moins 106, et au plus 1010 cellules de la souche bactérienne selon l'invention par mL de composition.

De manière préférée, la souche de l'invention peut être utilisée en association avec une ou plusieurs autres espèces probiotiques pour la préparation des compositions probiotiques. Par "probiotique", on entend, au sens de la présente invention, des microorganismes vivants ou morts qui, administrés en quantité suffisante à un hôte, animal notamment, ont un effet bénéfique sur la santé de l'hôte. Plus particulièrement, les probiotiques sont connus pour avoir un effet bénéfique sur le microbiote intestinal (anciennement flore intestinale) en maintenant son équilibre. Le microbiote intestinal a quatre fonctions reconnues : une fonction physiologique, à la fois sur l'anatomie et l'histologie du tube digestif et sur le transit intestinal ; une fonction digestive, par la digestion de certains types de molécules telles que les lipides et les protéines ; une fonction de protection anti-infectieuse, en empêchant le développement de germes potentiellement pathogènes dans les intestins et enfin une fonction immunitaire, par l'activation du système immunitaire. Par « composition probiotique » on entend, au sens de la présente invention un complément alimentaire qui a des effets bénéfiques pour la santé de l'hôte auquel il est administré. Une composition probiotique contient des microorganismes probiotiques qui doivent être ingérés pour induire des effets bénéfiques chez l'Homme selon la définition de l'OMS (2001) ; lesquels microorganismes peuvent être vivants ou morts. Les probiotiques vivants peuvent sécréter une gamme complète d'antigènes, se multiplient pour promouvoir les interactions avec la muqueuse intestinale et adhèrent aux tissus intestinaux pour stimuler la réponse immunitaire.

De manière préférée, la composition selon l'invention comprend un ou plusieurs excipients acceptables. Par « excipient » on entend, au sens de la présente invention toute substance, autre que le principe actif de la composition probiotique, destinée à conférer à ladite composition probiotique des caractéristiques physiques, chimiques ou gustatives particulières et n'interagissant pas avec le principe actif. Lesdits excipients peuvent être d'origine naturelle ou d'origine synthétique. Un homme du métier sera à même, au regard de ses connaissances, d'identifier un excipient acceptable pour une composition probiotique. Des exemples d'excipients acceptables incluent : des sucres tels que le saccharose, le glucose, le fructose, le palatinose, le tréhalose, le lactose et le xylose ; des polyols tels que le sorbitol, le xylitol, l'érythritol, et le lactitol ; des émulsifiants tels que les esters de saccharose d'acides gras, les esters de glycérol d'acides gras et la lécithine ; des épaississants et stabilisants tels que le carraghénane, la gomme de xanthane, la gomme de guar, la pectine et la gomme de caroube ; des acidifiants tels que l'acide citrique, l'acide lactique et l'acide malique ; des jus de fruits tels que le jus de citron, le jus d'orange et des jus de baies ; des vitamines telles que la vitamine A, la vitamine B, la vitamine C, la vitamine D et la vitamine E ; et des minéraux tels que le calcium, le fer le manganèse et le zinc.

Selon un autre mode de réalisation préféré, la composition de l'invention se présente sous une forme administrable par voie orale.

De telles compositions peuvent prendre la forme de gélules, de comprimés, de poudres, de pastilles, de granules, de capsules molles, de poudres reconstituables, de suspensions, de compositions surgelées, de préparations liquides orales ou encore de produits alimentaires conventionnels. De préférence, la composition de l'invention se présente sous la forme d'une gélule.

Les comprimés et les gélules à administration orale peuvent être unidoses et peuvent contenir un ou plusieurs excipients acceptables tels que des liants, des agents de remplissage, des lubrifiants, des agents mouillant ou encore des agents désintégrant. Les comprimés peuvent être enrobés par des méthodes bien connues dans le domaine pharmaceutique.

Les préparations orales liquides peuvent par exemple être sous la forme de suspensions aqueuses ou huileuses, de solutions, d'émulsions, de sirops ou encore d'élixirs sous la forme de produits déshydratés reconstituables avec de l'eau ou tout autre véhicule acceptable. De telles préparations liquides peuvent contenir des additifs communément utilisés tels que des agents de suspension, des émulsifiants, des véhicules non aqueux, des conservateurs et éventuellement des arômes et/ou des colorants. Selon un mode de réalisation préférée, la composition de l'invention se présente sous la forme d'un produit alimentaire.

Par « produit alimentaire », on entend, au sens de la présente invention, toute substance ou produit, ayant été transformé, partiellement transformé ou non transformé et destiné à être ingéré par l'homme ou l'animal. Les produits alimentaires peuvent être d'origine animale, végétale ou minérale. Les produits alimentaires apportent à l'organisme l'énergie et les nutriments nécessaires à son fonctionnement. Le produit alimentaire selon l'invention peut être un liquide, donc une boisson, ou solide.

De préférence, la composition de l'invention se présente sous la forme d'un produit laitier.

Les produits laitiers selon l'invention peuvent être à base de lait cru. Les laits utilisés peuvent être par exemple des laits de vache, de chèvre, de brebis, de yack, de bufflonne ou encore du lait de soja. Les produits laitiers selon l'invention peuvent être sous forme liquide, solide ou de poudre. Les produits laitiers selon l'invention peuvent être par exemple du lait, du beurre, du fromage ou encore de la crème. Les produits laitiers selon l'invention peuvent également être à base de laits végétaux. Les laits végétaux comprennent mais ne sont pas limités au lait de soja, de riz, d'avoine ou encore d'amande.

La composition de l'invention peut se présenter sous la forme d'un produit laitier fermenté.

Un produit laitier fermenté est par exemple un yaourt.

La souche de l'invention peut être utilisée en association avec des ferments du yaourt, à savoir Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus et Streptococcus thermophilus.

Un autre objet de l'invention porte sur l'utilisation d'une souche de bactérie lactique telle que décrite précédemment en tant qu'agent rhéologique.

On entend par « agent rhéologique », un agent qui vise à augmenter la viscosité de la composition dans laquelle il est introduite.

Enfin, un dernier objet de l'invention porte sur un polysaccharide, qui est susceptible d'être obtenu par la culture de la souche CNCM-5413, lequel polysaccharide présente la structure suivante :

Les exemples qui suivent sont fournis à titre d'illustration et ne sauraient limiter la portée de la présente invention.

EXEMPLES Le procédé d'isolation selon l'invention a été testé en premier lieu en vue de sélectionner des mutants de Lactobacillus rhamnosus surproduisant des exopolysaccharides (EPS).

La souche INRA Lactobacillus rhamnosus VES7418 a d'abord été cultivée dans un milieu de TODD-HEWYTT avec une teneur de 0,1 % en agar agar. Durant sa croissance dans ce milieu de culture, cette souche a formé des chaînes d'environs 20 à S0 cellules sédimentant relativement lentement dans ce milieu semi-liquide.

En vue d'optimiser le procédé d'identification de souches surproduisant des exopolysaccharides, les inventeurs ont sélectionné un témoin négatif correspondant au mutant VES7443 issu de la souche VES7418, lequel sédimente rapidement et ne formait pas de chaînes. Une observation de cette bactérie au microscope électronique à transmission (TEM) a montré que les cellules de cette souche avaient une paroi cellulaire aussi fine que celle de VES7418. (Figure 1).

En partant d'une large population bactérienne de Lactobacillus rhamnosus issu de la souche VES7443, il a ensuite été possible d'isoler de nombreux clones ne présentant qu'une très faible sédimentation dans ce milieu semi-liquide et correspondant à des souches de bactéries lactiques surproduisant les exopolysaccharides.

Parmi ces souches, la souche VES7494 a présenté un phénotype extrêmement filant (visqueux : « ropy »). L'observation au TEM de cette souche VES7494 a montré que si elle présente une paroi cellulaire très fine. Il est possible d'observer la présence de matériel coloré autour de celle-ci qui peut être identifié comme étant des exopolysaccharides (EPS). La même caractéristique peut être observée avec d'autres mutants surexprimant des EPS (VES746S, Figure 1).

Pour affiner cette analyse au TEM, la quantification des sucres neutres totaux pour 50 DO de culture de différentes souches bactériennes isolées a été réalisée par des méthodes bien connues de l'homme du métier (figure 2). En lien avec cette quantification, ont été utilisées en tant que contrôles positifs les souches « ropy » de Lactobacillus rhamnosus que sont VES7642 (isolée de produits laitiers fermentés "LACTUS"(CARREFOUR)) et VES7643 (isolée des capsules "Trophigylla souche " (SANOFI)) et en en tant que contrôle négatif, la souche VES7517 (Lb. rhamnosus souche LGG). Les résultats sont présentés dans les figures 2A et 2B et montrent que les souches VES7463, VES7494, VES7752 et VES7671 produisent significativement plus d'EPS que le témoin négatif VES 7517 (LGG). Dans le détail, il faut noter que les souches VES7752 et VES7671 produisent respectivement deux et trois fois plus d'EPS que la souche utilisée dans l'industrie pharmaceutique (VES7643). Par la suite des mutants complémentaires ont pu être identifiés.

En vue de déterminer la ou les mutations impliquées dans cette surexpression d'EPS, le génome des différents mutants identifiés a été séquencé. Le détail des mutations identifiées est présenté dans le tableau 1 qui suit.

Tableau 1 : Mutations impliquées dans la surexpression d'exopolysaccharides Il ressort de ces séquençages que la très grande majorité des mutants présentent des mutations au sein du gène Eps D. L'alignement des séquences en acides aminés de la protéine EPSD de VES7418 et de la protéine apparentée YVE L d'une souche phylogénétiquement éloignée (Bacillus subtilis 168) permet de mettre en évidence les domaines conservés au sein de la séquence de la protéine EPSD. Il est ainsi intéressant de noter que tous les changements d'acides aminés (sauf le site d'autophosphorylation de GYGYGYGYGY) chez les mutants surexprimant les EPS sont tous situés dans des domaines conservés de la protéine EPSD, ce qui indique l'importance de ces domaines dans la fonction EPSD (Figure B).

Il est à noter également que les mutations entraînant des décalages de phases de lecture, qui devraient complètement supprimer l'activité d'EPSD, sont associés à des mutants EPS négatifs VES7709 et VES7713. Le profil de ces mutants conforte donc l'idée que l'activité d'EPSD semble requise pour permettre l'expression d'EPS. Enfin, les résultats ont également permis d'identifier un mutant présentant une mutation au sein du gène Eps C. La protéine EPS C dont la séquence est donnée en figure 4 est à priori essentielle en vue de permettre la bonne localisation et activité de la protéine EPSD.

La viscosité d'échantillons de milieu de culture contenant les différentes souches a été mesurée à l'aide d'un viscosimètre BROOKFIELD DIGITAL DVE.

La figure 5 présente les résultats obtenus avec les différentes souches testées. On observe ainsi que la viscosité des milieux de culture où les différentes souches sont cultivées varie considérablement en fonction de la production d'EPS de ces dernières. Dans le détail, il apparaît que les souches identifiées confèrent à leur milieu de culture une viscosité intéressante et, particulièrement, les souches VES7752, VES7671, VES7494 et VES 7463. Les inventeurs ont également mis en exergue que les souches ayant les productions d'EPS les plus importantes sont celles qui induisent les plus hauts niveaux de viscosités dans leurs milieux de culture respectifs.

En vue de parfaire l'analyse de la production de polysaccharides dans ces souches, les inventeurs ont également effectué une analyse structurale de ces derniers. Au préalable, les EPS produits par les différentes souches de Lactobacillus rhamnosus ont été purifiés par des techniques bien connues de l'Homme du métier. A titre d'exemple, une technique de purification pouvant être utilisée consiste en la précipitation des polysaccharides sécrétés par ajout graduel d'éthanol froid, puis centrifugation et/ou chromatographie par perméation sur gel. La structure des EPS ainsi purifiés est ensuite caractérisée par des techniques également bien connue de l'Homme du métier. A titre d'exemple, une analyse par spectroscopie RMN ou par chromatographie de partage liquide-gazeuse peut être réalisée. La structure des EPS produits par les souches de Lactobacillus rhamnosus VES7463 et VES7671 est ainsi présentée dans la figure 6.

Les résultats montrent que l'on trouve, pour chaque souche, un polysaccharide neutre et un polysaccharide chargé. En outre, il est à noter que l'EPS PS2 produit par la souche VES7463 n'a jamais été identifié. Il est probable que cet EPS PS2 résulte de la substitution EPSD D94>L, également présente dans la souche CNCM-I 5413 et qu'il est certainement impliqué dans la viscosité augmentée du milieu de culture pour cette souche. PCT

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