Verfahren, Kit und DNA-Sonden zum Nachweis einer Pilz-Spezies in klinischem Material- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis einer Pilz-Spezies in klinischem Material, mit den Schritten : -Extraktion von Pilz-DNA aus klinischem Material, -Bereitstellen eines DNA-Segmentes der extrahierten Pilz- DNA, und -Nachweis der Pilz-Spezies durch Hybridisierung des DNA- Segmentes mit spezifischen DNA-Sonden.

Die Erfindung betrifft ferner bei den Verfahren einsetzbare DNA-Sonden sowie einen Kit, der die DNA-Sonden enthält.

Ein Verfahren der vorstehend genannten Art ist aus der WO 97/07238 bekannt. Diese Druckschrift offenbart ebenfalls Hy- bridisierungssonden, mit denen unter anderem Pilze der Spezies Candida albicans sowie Aspergillus fumigatus nachgewiesen wer- den können.

Invasive Pilzinfektionen haben als Hauptursache von Morbidität und Mortalität bei immunsupprimierten Patienten in den letzten Jahren eine erhebliche Bedeutung erlangt. Dies gilt z. B. für Patienten mit Knochenmark-oder Organtransplantation, Chemothe- rapie-Patienten, Aids-Patienten oder Patienten mit schweren Verbrennungen. Insbesondere bei hämatologischen Patienten ist die Aspergillose zur Haupttodesursache geworden.

Vor diesem Hintergrund ist eine frühe sichere Diagnose einer systemischen Pilzinfektion für eine geeignete und erfolgreiche Therapie unverzichtbar.

In der eingangs erwähnten WO 97/07238 wird zu diesem Zweck ein auf der Polymerasekettenreaktion (im folgenden : PCR) beruhendes Verfahren beschrieben, bei dem aus klinischem Material, vor- zugsweise aus Vollblut, zunächst phagozytierte Pilzzellen ex- trahiert werden, aus denen dann die Pilz-DNA aufgereinigt wird.

Mit Hilfe von Pilz-spezifischen Primern wird dann im Rahmen ei- ner PCR ein DNA-Segment aus dem Pilz-Gen für die 18ssu-rRNA hochverstärkt. Dabei wird von der Erkenntnis ausgegangen, da dieses Pilz-Gen bei verschiedenen Pilz-Stämmen und-Gattungen ein Sequenzsegment aufweist, das einerseits von zwei Bindungs- regionen für Primer flankiert wird, die für alle Pilz-Stämme und-Gattungen identisch sind, das aber andererseits die Se- quenz dieses Segmentes für die verschiedenen Pilz-Stämme und -Gattungen so verschieden ist, da sie gleichzeitig zum Nach- weis der einzelnen Pilz-Spezies und-Gattungen verwendet werden kann.

Das entsprechend hochverstärkte DNA-Segment wird dann sequenti- ell mit verschiedenen DNA-Sonden hybridisiert, die für die nachzuweisenden Pilz-Spezies jeweils spezifisch sind. Um eine erfolgreiche Hybridisierung nachzuweisen, werden die Sonden mit dem Transferase-Kit der Firma Boehringer, Mannheim, mit Digoxi- genin markiert, wobei der Nachweis nach dem Southern Blot- Verfahren mit der üblichen Farbreaktion erfolgt.

Weitere Hybridisierungssonden, die bei dem bekannten Verfahren einsetzbar sind, sind in der DE 196 35 347 Cl beschrieben.

Obwohl das bekannte Verfahren unter Anwendung der bekannten DNA-Sonden sehr zuverlässig und mit hoher Empfindlichkeit ar- beitet, besteht dennoch ein ständiger Bedarf an schneller und/oder einfacher durchzuführenden Verfahren. Ein Nachteil bei dem bekannten Verfahren sowie den bekannten Sonden besteht dar- in, da das amplifizierte DNA-Segment sequentiell und/oder par- allel in einzelnen Experimenten mit den jeweiligen DNA-Sonden inkubiert werden mu , wobei jeweils einzeln das Hybridisie- rungsergebnis zwar mit Standard-Verfahren, aber dennoch zeit- aufwendig zu überprüfen ist.

In diesem Zusammenhang ist in den letzten Jahren ein Verfahren für quantitative PCR bekannt geworden, das auf dem sogenannten LightCyclerTM von Roche Molecular Biochemicals durchgeführt werden kann. Mit diesem Verfahren ist es möglich, die Hochver- stärkung der PCR-Produkte in Echtzeit und On-line Zyklus für Zyklus zu beobachten. Zu diesem Zweck werden der PCR-Lösung ne- ben der Polymerase, den Nukleotiden, den Pufferlösungen und den Primern auch Hybridisierungssonden zugegeben, die spezifisch an die gewünschten PCR-Produkte binden. Dabei werden zwei Sequenz- spezifische DNA-Sonden verwendet, die mit verschiedenen Farb- stoffen markiert sind. Die Sequenzen der beiden Sonden sind so ausgewählt, da sie so an die Zielsequenzen des verstärkten DNA-Segmentes hybridisieren, da das 3'-Ende der einen Sonde dicht bei dem 5'-Ende der anderen Sonde liegt, wodurch die bei- den Farbstoffe nahe zueinander gebracht werden. Der Donor- Farbstoff, z. B. Fluorescin, wird durch eine kurzwellige Licht- quelle angeregt und emittiert Fluoreszenzlicht bei einer etwas längeren Wellenlänge. Wenn sich die beiden Farbstoffe dicht beieinander befinden, regt die emittierte Energie den Akzeptor- Farbstoff an, der an der zweiten Hybridisierungssonde sitzt und ein Fluoreszenzlicht bei einer anderen Wellenlänge emittiert.

Dieser Energietransfer, der auch als Fluoreszenzresonanzener- gietransfer (FRET) beteiligt wird, hängt sehr stark von dem Ab- stand zwischen den beiden Farbstoffmolekülen ab. Die Energie wird effizient nur dann transferiert, wenn die Moleküle sich in unmittelbarer Nähe (zwischen 1 und 5 Nukleotiden) befinden, wo- bei das Ma an Fluoreszenz direkt proportional zu der Menge an Ziel-DNA ist, die während des PCR-Prozesses erzeugt wird.

Aus dem Obigen ergibt sich, da der Akzeptor-Farbstoff an der zweiten Hybridisierungssonde nur dann Fluoreszenzlicht emit- tiert, wenn beide Hybridisierungssonden an die Zielsequenz hy- bridisiert haben. Solange sich die beiden Hybridisierungssonden in Lösung befinden, ist nur eine sehr geringe Hintergrundfluo- reszenz zu messen.

Durch die beiden Hybridisierungssonden wird darüber hinaus der PCR-Proze selbst nicht beeinträchtigt, denn die Hybridisie- rungssonden lösen sich jeweils wieder von der Ziel-DNA, wenn nach dem Anlagerungsschritt die Temperatur erhöht wird, um den nächsten komplementären Strang zu vervollständigen. Nach einer derartigen Replikationsrunde wird der entstandene Doppelstrang aufgeschmolzen, wobei sich im nächsten Anlagerungsschritt so- wohl die Primer als auch die Hybridisierungssonden erneut an die Ziel-DNA anlagern können.

Vom Ergebnis her bedeutet dies, da durch das soeben beschrie- bene Verfahren auf dem LightCyclerT"die Zunahme an produzier- ter DNA durch eine Zunahme im Fluoreszenzsignal on-line ver- folgt werden kann.

Eine Kombination der beiden insoweit beschriebenen Verfahren, also der PCR auf dem LightCycler mit dem Nachweisverfahren gemä der WO 97/07238 würde gegenüber dem bisher bekannten Nachweisverfahren für Pilz-Spezies somit den Vorteil mitsich- bringen, da die Bereitstellung der DNA-Segmente aus dem 18ssu-rRNA-Gen sowie die Hybridisierung mit der DNA-Sonde in einer Lösung und in einer Reaktion erfolgen könnte, wodurch sich deutliche Zeitvorteile ergeben würden.

Vor diesem Hintergrund ist es Aufgabe der vorliegenden Erfin- dung, DNA-Sonden für das eingangs erwähnte Verfahren bereitzu- stellen, die eine Durchführung des bekannten Verfahrens mit ei- ner Ausgestaltung wie bspw. auf dem LightCyclerw ermöglichen.

Erfindungsgemä wird diese Aufgabe gelöst durch die Oligonu- kleotide SEQ ID-No : 1-4 aus dem beiliegenden Sequenzprotokoll.

Dabei sind nicht nur die Oligonukleotide SEQ ID-No : 1-4 sondern auch Oligonukleotide, die mit einem dieser Oligonukleotide hy- bridisieren sowie Oligonukleotide, die mit einem mit einem der- artigen Oligonukleotid hybridisierenden Oligonukleotid hybridi- sieren, von der Erfindung umfa t. Nicht nur die Oligonukleotide mit den Sequenzen SEQ ID-No : 1-4 sondern auch deren komplemen- täre Sequenzen sowie leichte Modifikationen, die die Hybridi- sierung der Oligonukleotide mit dem DNA-Segment nicht nachtei- lig beeinträchtigen, lassen sich als DNA-Sonden verwenden.

Dabei sind Oligonukleotide mit der Sequenz SEQ ID-No : 1 und SEQ ID-No : 2 sowie entsprechende komplementäre und modifizierte Se- quenzen zum Nachweis der Pilz-Spezies Aspergillus fumigatus und die Oligonukleotide mit den Sequenzen SEQ ID-No : 3 und SEQ ID- No : 4 sowie die komplementären und modifizierten Sequenzen zum Nachweis der Pilz-Spezies Candida albicans zu verwenden.

In einem spezifischen Ausführungsbeispiel ist das Oligonukleo- tid mit der Sequenz SEQ ID-No : 1 am 5'-Ende mit einem Akzeptor und das Oligonukleotid mit der Sequenz SEQ ID-No : 3 am 3'-Ende mit einem Donor-Farbstoff markiert. In entsprechender Weise ist das Oligonukleotid mit der Sequenz SEQ ID-No : 3 an seinem 5'- Ende mit einem Akzeptor-und das Oligonukleotid mit der Sequenz SEQ ID-No : 4 an seinem 3'-Ende mit einem Donor-Farbstoff mar- kiert. Bei den jeweiligen komplementären Sequenzen sitzt der Akzeptor-Farbstoff am 3'-und der Donor-Farbstoff am 5'-Ende.

Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben erkannt, da es mit den insoweit beschriebenen DNA-Sonden möglich ist, in einem einzigen PCR-Versuch z. B. auf dem LightCycler'"Aspergillus fu- migatus und Candida albicans nachzuweisen. Sofern die Akzeptor- Farbstoffe der DNA-Sonden für Aspergillus fumigatus und Candida albicans unterschiedlich sind, lassen sich in einem einzigen Versuch beide Pilz-Spezies nachweisen bzw. gegeneinander dis- kriminieren und quantifizieren.

Die neuen DNA-Sonden sind jedoch nicht nur für den LightCy- clerTM einsetzbar, sie ermöglichen auch bei einer "konventionellen"PCR einen schnelleren und einfacheren Nach- weis der jeweiligen Pilz-Spezies als dies im Stand der Technik möglich war. In diesem Zusammenhang ist es nämlich lediglich erforderlich, nach der Hochverstärkung der DNA-Segmente die entsprechenden DNA-Sonden hinzuzugeben und dann in einem Flu- orimeter zu vermessen, ob bei der Anregungswellenlänge des Do- nor-Farbstoffes ein Fluoreszenzsignal des oder der Akzeptor- Farbstoffe erkennbar ist. Auch hier ist eine Diskriminierung zwischen Aspergillus fumigatus und Candida albicans möglich.

Vor diesem Hintergrund wird die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bei dem eingangs erwähnten Verfahren dadurch gelöst, da als DNA-Sonden eine oder mehrere der erfindungsgemä en Oli- gonukleotide verwendet werden, wobei vorzugsweise das DNA- Segment mittels einer PCR in für den Nachweis ausreichender Menge bereitgestellt wird.

Natürlich sind die neuen DNA-Sonden auch für Nachweisverfahren einsetzbar, bei denen die DNA-Segmente nicht mittels PCR son- dern z. B. durch Klonierung oder andere Verfahren bereitgestellt werden.

In diesem Zusammenhang betrifft die Erfindung auch einen Kit zum Nachweis einer Pilz-Spezies, wobei zumindest eines der er- findungsgemä en Oligonukleotide als DNA-Sonde in diesem Kit enthalten ist.

Weitere Vorteile ergeben sich aus der nachstehenden Beschrei- bung. Es versteht sich, da die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den je- weils angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombi- nationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rah- men der vorliegenden Erfindung zu verlassen.

Die folgenden Beispiele illustrieren das gesamte Verfahren zum Nachweis von Pilz-Spezies in klinischem Material.

Beispiel 1 : DNA-Extraktion Die DNA-Extraktion erfolgt so wie beschrieben in Löffler et al., Med. Mycol. 36 (1998), Seiten 275-279 : 5 ml EDTA-anticoaguliertes Blut wird zur Lyse der Erythrozyten in 15 ml einer hypertonen Lösung (10 mM Tris, 5 mM MgCl2, 10 mM NaCl) inkubiert. Daraufhin folgt eine Lyse der Leukozyten in 1 ml Lysespuffer (10 mM Tris, 10 mM EDTA, 50 mM Nacl, % SDS, 200 pg/ml Proteinase K). Nach entsprechender Zentrifugati- on befinden sich im Sediment jetzt die freigesetzten, phagozy- tierten Pilzzellen. Das Sediment wird in 500 pl Puffer aufgenommen, der rekombinan- te Lyticase (1 U/100 pl) enthält, und für 45 min bei 37°C inku- biert, um Sphaeroblasten zu erzeugen. Der Puffer enthält neben Lyticase 50 mM Tris, 1 mM EDTA und 0,2 % -Mercaptoethanol.

Lyse des Sphaeroblasten und Proteinpräzipitation erfolgt unter Verwendung des QIAmp Tissue Kit von Qiagen, Hilden, Deutsch- land, gemä dem Protokoll des Herstellers.

Die eluierte DNA wird in 100 pl des Elutionspuffers aufgenommen und unmittelbar für die PCR verwendet oder bei-80°C gelagert.

Beispiel 2 : PCR auf dem LightCyclerTM Mit Hilfe von zwei Pilz-spezifischen Primern, die bereits in der eingangs erwähnten WO 97/07238 beschrieben sind, wird jetzt ein DNA-Segment der extrahierten DNA auf den LightCyclerT" amplifiziert und gleichzeitig nachgewiesen bzw. quantifiziert.

Die PCR erfolgt dabei in Glaskapillaren, die durch diese um- strömende Luft auf die entsprechenden Reaktionstemperaturen ge- bracht werden. Die bereits erwähnten Primer (5'-ATT GGA GGG CAA GTC TGG TG und 5'-CCG ATC CCT AGT CGG CAT AG) binden an konser- vierte Bereiche des 18ssu-rRNA-Pilzgens und sorgen für die Amplifikation eines ca. 500 Basenpaare langen DNA-Segmentes, das mit Hilfe von zwei DNA-Sonden, die mit unterschiedlichen Farbstoffen markiert sind, nachgewiesen werden kann.

In Fig. 1 ist ein derartiges DNA-Segment dargestellt, das dort mit Amplicon bezeichnet ist.

Oberhalb des Amplicons sind zwei DNA-Sonden gezeigt, von denen die linke Sonde an ihrem 5'-Ende mit einem Akzeptor-Farbstoff A und die rechte Sonde an ihrem 3'-Ende mit einem Donor-Farbstoff D markiert ist. Die Sequenzen der beiden DNA-Sonden sind so ausgewählt, da die Farbstoffe A und D nur ein bis fünf Nukleo- tide voneinander entfernt sind.

Wird jetzt der Farbstoff D bei einer entsprechenden Wellenlänge Ex angeregt, so emittiert er Licht auf einer Wellenlänge Tr, das zu einer Anregung des Farbstoffes A führt, der daraufhin auf einer Wellenlänge Em emittiert. Wenn aufgrund einer Anre- gung bei der Wellenlänge Ex eine Emission der Wellenlänge Em detektiert werden kann, bedeutet dies folglich, da beide DNA- Sonden an das Amplicon hybridisiert sind, wodurch dieses Ampli- con in der Reaktionslösung nicht nur nachgewiesen sondern auch quantifiziert werden kann, denn die Intensität des Fluoreszenz- signales bei der Wellenlänge Em steigt mit der Menge an in der Lösung befindlichem Amplicon an. Durch Rückrechnung auf den Startpunkt der PCR-Reaktion kann aus dem exponentiellen Verlauf des Fluoreszenzsignales über der Zahl der Zyklen in an sich be- kannter Weise auf die Menge an ursprünglichem Amplicon in der Ausgangslösung bzw. der extrahierten DNA rückgeschlossen wer- den. Dazu wird ein externer Standard genomischer Pilz-DNA ver- wendet, die in Verdünnungsreihen mit gemessen wird.

Die PCR-Lösung enthielt Taq-Polymerase, LightCycler Hybri- dization 1 x Reaktionspuffer, dNTP-Mix, 3 mM MgCl2 und 12,5 pmol Primer. Für die Amplicondetektion wurde der LightCy- clerTM-DNA Master Hybridization Probes Kit nach den Angaben des Herstellers verwendet.

Zum Nachweis der Pilz-Spezies Aspergillus fumigatus wurden die folgenden DNA-Sonden eingesetzt : 5'-TGA GGT TCC CCA GAA GGA AAG GTC CAG C (SEQ ID-No : 1), am 5'- Ende markiert mit dem Akzeptor-Farbstoff LightCycler'-Red 640, und 5'-GTT CCC CCC ACA GCC AGT GAA GGC (SEQ ID-No : 2), am 3'-Ende mit dem Donor-Farbstoff Fluorescin markiert.

Für den Nachweis von Candida albicans wurden die folgenden DNA- Sonden eingesetzt : 5'-TGG CGA ACC AGG ACT TTT ACT TTG A (SEQ ID-No : 3), am 5'-Ende markiert mit LightCycler>-Red 640, und 5'-AGC CTT TCC TTC TGG GTA GCC ATT (SEQ ID-No : 4), am 3'-Ende mit Fluorescin markiert.

32 Proben wurden parallel verarbeitet mit jeweils 45 Zyklen von Denaturierung (1 sec bei 95°C), Annealing (15 sec bei 62°C) und enzymatische Kettenverlängerung (25 sec bei 72°C). Der PCR-Lauf benötigte 45 min.

Beispiel 3 : Ergebnisse Die Empfindlichkeit des Verfahrens gemä Beispiel 1 und 2 er- wies sich als genauso gro wie bei dem bekannten Verfahren ge- mä WO 97/07238, es konnten 5 CFU/ml ausgesäter Pilzzellen von Candida albicans bzw. Aspergillus fumigatus nachgewiesen wer- den. Der Test zeigte eine hohe Reproduzierbarkeit von 96-99 % und war linear in einem Bereich zwischen 10l und 104 Konidien.

Versuche mit klinischem Material von Patienten mit hämatologi- schen Malignitäten und histologisch nachgewiesener invasiver Pilzinfektion waren ebenfalls erfolgreich. Fünf von neun posi- tiven Proben zeigten eine Pilzlast zwischen 5 CFU/ml und 10 CFU/ml, zwei der neun Proben von zwischen 10 CFU/ml und 100 CFU/ml und die beiden letzten Proben von mehr als 100 CFU/ml.

Wenn die Sonde SEQ ID-No : 1 oder SEQ ID-No : 3 mit einem bei ei- ner anderen Wellenlänge emittierenden Farbstoff, z. B. LightCy- clerT"-Red 705 markiert wird, können Candida albicans und As- pergillus fumigatus in einer einzigen Reaktion nachgewiesen werden, indem Em sowohl bei 640 nm als auch bei 705 nm gemessen wird.