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Title:
METHOD FOR LABELLING WITH RADIONUCLIDES MURINE OR HUMAN, MONOCLONAL OR POLYCLONAL ANTI-TUMOUR NECROSIS FACTOR ANTIBODIES ASSOCIATED WITH DISEASES WITH PHYSIOPATHOGENESIS INVOLVING TUMOR NECROSIS FACTOR; REAGENT FOR IN VIVO AND/OR IN VITRO DIAGNOSIS ON THE BASIS OF MURINE OR HUMAN, MONOCLONAL OR POLYCLONAL ANTI-TUMOR NECROSIS FACTOR ANTIBODIES LINKED TO RADIONUCLIDES; METHODS FOR DIAGNOSING IN VITRO AND/OR IN VIVO DISEASES WITH PHYSIOPATHOGENESIS INVOLVING THE TUMOUR NECROSIS FACTOR, USING THE THUS OBTAINED REAGENT, AND KIT CONTAINING SAID REAGENT FOR DIAGNOSING DISEASES WITH PHYSIOPATHOGENESIS INVOLVING THE TUMOUR NECROSIS FACTOR
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2012/054997
Kind Code:
A1
Abstract:
The present invention relates to a method for labelling with radionuclides murine or human, monoclonal or polyclonal anti-tumour necrosis factor antibodies, to a reagent for in vivo and/or in vitro diagnosis on the basis of murine or human, monoclonal or polyclonal anti-tumor necrosis factor antibodies labelled with radionuclides, and to the diagnostic use thereof; to the method for diagnosing in vitro and/or in vivo diseases with physiopathogenesis involving the tumour necrosis factor, and to the kit for diagnosing diseases with physiopathogenesis involving the tumour necrosis factor, using the said reagent.

Inventors:
GUTFILEN BIANCA (BR)
BARBOSA DA FONSECA LEA MIRIAN (BR)
LOPES DE SOUZA SERGIO AUGUSTO (BR)
PROENCA LOBO LOPES FLAVIA PAIVA (BR)
Application Number:
PCT/BR2011/000392
Publication Date:
May 03, 2012
Filing Date:
October 26, 2011
Export Citation:
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Assignee:
UNIV RIO DE JANEIRO (BR)
GUTFILEN BIANCA (BR)
BARBOSA DA FONSECA LEA MIRIAN (BR)
LOPES DE SOUZA SERGIO AUGUSTO (BR)
PROENCA LOBO LOPES FLAVIA PAIVA (BR)
International Classes:
A61K51/10; A61K39/395; A61K103/10
Foreign References:
US5078985A1992-01-07
US4323546A1982-04-06
Other References:
CHIANELLI ET AL.: "New radiopharmaceuticals for imaging rheumatoid arthritis.", Q J NUCL MED MOL IMAGING, vol. 50, no. 3, 2006, pages 217 - 25
WELLING ET AL.: "Detection of Experimental InfectionS with 99mTc- Labeled Monoclonal Antibodies Against TNF-a and Interleukin-8.", NUCL. MED. & BIOL., vol. 24, 1997, pages 649 - 655, XP004092553, DOI: doi:10.1016/S0969-8051(97)00118-2
MARTINS ET AL.: "Preliminary Results of [99mTc]OKT3 Scintigraphy to Evaluate Acute Rejection in Renal Transplants.", TRANSPLANTATION PROCEEDINGS, vol. 36, 2004, pages 2664 - 2667, XP022112605, DOI: doi:10.1016/j.transproceed.2004.09.085
BERNATECK ET AL.: "The First Scintigraphic Detection of Tumor Necrosis factor-Alpha in Patients with Complex Regional Pain Syndrome Type 1.", ANESTHANALG, vol. 110, January 2010 (2010-01-01), pages 211 - 5.
MALVIYA ET AL.: "Molecular imaging of rheumatoid arthritis by radiolabelled monoclonal antibodies: new imaging strategies to guide molecular therapies.", EUR J NUCL MED MOL IMAGING., vol. 37, February 2010 (2010-02-01), pages 386 - 398, XP019778701
D'ALESSANDRIA ET AL.: "Use ota 99mTc labeled anti-TNFalpha monoclonal antibody in Crohn's disease: in vitro and in vivo studies.", Q J NUCL MED MOL IMAGING., vol. 51, no. 4, December 2007 (2007-12-01), pages 334 - 42
BARRERA ET AL.: "Scintigraphic detection of tumour necrosis factor in patients with rheumatoid arthritis.", ANN RHEUM DIS, vol. 62, 2003, pages 825 - 828
CONTI ET AL.: "Successful Treatment With Intraarticular Infliximab for Resistant Knee Monarthritis in a Patient With Spondylarthropathy.", A ROLE FOR SCINTIGRAPHY WITH 99MTC-INFLIXIMAB. ARTHRITIS & RHEUMATISM, vol. 52, no. 4, 2005, pages 1224 - 1226
HNATOWICH ET AL.: "Directly and Indirectly Technetium-99m- Labeled Antibodies A Comparison of In Vitro and Animal In Vivo Properties.", J NUCLMED, vol. 34, 1993, pages 109 - 119
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Claims:
REIVINDICAÇÕES

PROCESSO DE MARCAÇÃO COM RADIONUCLÍDEOS DE ANTICORPOS MURINOS OU HUMANOS, MONOCLONAIS OU POLICLONAIS ANTI-FATOR DE NECROSE TUMORAL ASSOCIADOS A DOENÇAS CUJA FISIOPATOGENIA ENVOLVA FATOR DE NECROSE TUMORAL; REAGENTE PARA DIAGNÓSTICO "IN VIVO" E/OU "IN VITRO" A BASE DE ANTICORPOS MURINOS OU HUMANOS, MONOCLONAIS OU POLICLONAIS ANTI-FATOR DE NECROSE TUMORAL ASSOCIADOS À RADIONUCLÍDEOS; MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO "IN VITRO" E/OU "IN VIVO" DE DOENÇAS CUJA FISIOPATOGENIA ENVOLVA FATOR DE NECROSE TUMORAL UTILIZANDO O REAGENTE ASSIM OBTIDO E KIT PARA DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS CUJA FISIOPATOGENIA ENVOLVA FATOR DE NECROSE TUMORAL A BASE DO REFERIDO REAGENTE

1 - PROCESSO DE MARCAÇÃO COM RADIONUCLÍDEOS DE ANTICORPOS MURINOS OU HUMANOS, MONOCLONAIS OU POLICLONAIS ANTI-FATOR DE NECROSE TUMORAL ASSOCIADOS A DOENÇAS IMUNOLÓGICAS, caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas:

a. Utiliza-se alíquotas de anticorpos murinos ou humanos, monoclonais ou policlonais anti-fator de necrose tumoral, 0,5 a 2 mg/mL em um volume de 10 a 500 ML;

b. Alíquotas do agente redutor, 2 a 50 g/mL em um volume de 10 a 500 μί, obtendo-se uma segunda solução límpida e incolor;

c. Incubar e homogeinizar a solução límpida e incolor da etapa (a) com a solução límpida e incolor obtida na etapa (b) a temperatura ambiente, sob baixa pressão atmosférica, obtida pela aspiração de ar com auxílio de uma seringa, por 5 a 25 minutos, sendo os tubos constantemente agitados, manualmente; d. O pH da solução obtida na etapa (c) deverá ser medido e deverá estar entre 6,9 e 7,2; e. Filtrar o reagente obtido na etapa (d) com um filtro milipore de 0,22 ou 0,45μιη, obtendo-se uma solução (e) filtrada;

f. À solução (e) são adicionados volumes de 0,1 a 2,0 ml_ de um radionuclídeo, com atividade de 2 pCi a 40 mCi, seguindo-se de uma incubação de 2 a 40 minutos, nas mesmas condições de incubação descritas anteriormente, obtendo-se uma solução límpida, incolor, estéril e apirogênica.

2- PROCESSO de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado pelo fato de que os anticorpos murinos ou humanos, monoclonais ou policlonais anti-fator de necrose tumoral da etapa (a) são o infliximab ou o adalimumab em alíquotas de 1 mg/mL em um volume de 150 μΙ_.

3- PROCESSO de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado pelo fato de que o agente redutor da etapa (b) é o cloreto estanoso em alíquotas de 12pg/ml_ em um volume de 50 μΙ_.

4- PROCESSO de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o tempo de incubação na etapa (c) é de dez minutos, a temperatura ambiente.

5- PROCESSO de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado pelo fato de que o pH da solução (c) deverá estar entre 7,0 e 7, 1 .

6- PROCESSO de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado pelo fato de que o reagente obtido na etapa (d) é filtrado com millipore de 0,22 m.

7- PROCESSO de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado pelo fato de que o radionuclídeo da etapa (e) é o tecnécio-99m (Tc-99m) num volume de 0,5 mL com atividade de 100pCi para uso "in vitro" e 10 mCi para uso "in vivo", recentemente eluídos de um gerador de Μο-99/Tc- 99m (IPEN-CNEN).

8- PROCESSO de acordo com as reivindicações 1 e 7, caracterizado pelo fato de que o tempo de incubação na dita etapa (f) é de 20 minutos.

9- REAGENTE PARA DIAGNÓSTICO "IN VIVO" E/OU "IN VITRO" A BASE DE ANTICORPOS MURINOS OU HUMANOS, MONOCLONAIS OU POLICLONAIS ANTI-FATOR DE NECROSE TUMORAL ASSOCIADOS À RADIONUCLIDEOS obtido de acordo com o processo das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de ser um anticorpo murino ou humano, monoclonal ou policlonal anti-fator de necrose tumoral marcado com radionuclídeo, utilizando um agente redutor obtendo-se uma solução translúcida.

10- REAGENTE de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o anitcorpo anti-fator de necrose tumoral é o infliximab ou o adalimumab marcado com o radionuclídeo tecnécio-99m com atividade de 100 pCi para uso "in vivo" e 10 mCi para uso "in vitro", sendo o agente redutor o cloreto estanoso obtendo-se uma eficiência de marcação superior a 90%.

1 1- REAGENTE de acordo com as reivindicações 9 e 10, caracterizado pelo fato de que o anticorpo infliximab ou o adalimumab deverão estar em uma concentração de 1 mg/mL e em um volume de 150 pL e o cloreto estanoso em alíquotas de 150 μΙ_ em uma concentração de 12 pg/mL.

12- USO DO REAGENTE de acordo com as reivindicações 9 a 1 1 , caracterizado pelo fato de ser um marcador radioativo, para diagnóstico de diversas doenças através da cintilografia em humanos, animais ou ensaios "in vitro" em pacientes com qualquer doença em que haja a presença do fator de necrose tumoral em sua fisiopatogenia, principalmente na avaliação de artrite reumatóide, artrite idiopática juvenil, osteoartrite, artrite gotosa, artrite psoriática, oftalmopatia de Graves, doença inflamatória intestinal, tumores, tumores benignos, tumores malignos e de doenças autq-imunes.

13- MÉTODO DE DIAGNÓSTICO "IN VIVO", caracterizado pelo fato de que se deve seguir um protocolo para a realização das cintilografias:

(a) Injetar 0,3 a 3 ml_ preferentemente 0,8 ml_ de anticorpos anti-fator de necrose tumoral marcados com radionuclídeos utilizando-se um agente redutor;

(b) Aquisição das imagens cintilográficas em aparelhos de garha-câmara.

14- MÉTODO de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de:

(a) Injetar 0,3 a 3 ml_ preferentemente 0,8 mL de infliximab ou adalimumab marcado com tecnécio-99m e cloreto estanoso após filtração com milipore de 0,22μιη;

(b) Atividade do radionuclídeo deverá ser de 2 pCi a 40 mCi, preferencialmente 100 pCi "in vitro" e 10mCi "in vivo"; (c) Aquisição das imagens cintilográficas, com os pacientes posicionados em decúbito dorsal, em aparelhos de gama-câmara (Janela eletrônica da Gama Câmara é centrada no canal correspondente de 140 keV com abertura de mais ou menos 20%), cerca de 15 a 30 minutos, 1 , 3, 4, 6, 12 e 24 horas após a injeção do radiofármaco, preferencialmente 15 minutos, 1 e 3 horas, em incidências anterior e posterior, visibilizando as áreas de interesse e também é realizada uma pesquisa de corpo inteiro, qualquer doença em que haja a presença do fator de necrose tumoral em sua fisiopatogenia, principalmente para diagnóstico de artrite reumatóide, artrite idiopática juvenil, osteoartrite, artrite gotosa, artrite psoriática, oftalmopatia de Graves, doença inflamatória intestinal, tumores, tumores benignos, tumores malignos e de doenças auto- imunes.

15- KIT PARA DIAGNÓSTICO DE DIVERSAS DOENÇAS ENVOLVIDAS COM FATOR DE NECROSE TUMORAL, caracterizado pelo fato de conter anticorpos murinos ou humanos, monoclonais ou policlonais anti-fator de necrose tumoral associados a um agente redutor e a um radionuclídeo.

16- KIT de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que os anticorpos murinos ou humanos, monoclonais ou policlonais anti-fator de necrose tumoral são o infliximab ou o adalimumab e o agente redutor é o cloreto estanoso.

17- KIT de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o radionuclídeo é o tecnécio-99m.

18- KIT de acordo com as reivindicações 15 a 17, caracterizado pelo fato de ser aplicado na avaliação de qualquer doença em que haja a presença do fator de necrose tumoral em sua fisiopatogenia, principalmente artrite reumatóide, artrite idiopática juvenil, osteoartrite, artrite gotosa, artrite psoriásica, oftalmopatia de Graves, doença inflamatória intestinal, tumores, tumores benignos, tumores malignos e doenças auto-imunes.

Description:
PROCESSO DE MARCAÇÃO COM RADIONUCLÍDEOS DE ANTICORPOS MURINOS OU HUMANOS, MONOCLONAIS OU POLICLONAIS ANTI-FATOR DE NECROSE TUMORAL ASSOCIADOS A DOENÇAS CUJA FISIOPATOGENIA ENVOLVA FATOR DE NECROSE TUMORAL; REAGENTE PARA DIAGNÓSTICO "IN VIVO" E/OU "IN VITRO" A BASE DE ANTICORPOS MURINOS OU HUMANOS, MONOCLONAIS OU POLICLONAIS ANTI-FATOR DE NECROSE TUMORAL ASSOCIADOS À RADIONUCLÍDEOS; MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO "IN VITRO" E/OU "IN VIVO" DE DOENÇAS CUJA FISIOPATOGENIA ENVOLVA FATOR DE NECROSE TUMORAL UTILIZANDO O REAGENTE ASSIM OBTIDO E KIT PARA DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS CUJA FISIOPATOGENIA ENVOLVA FATOR DE NECROSE TUMORAL A BASE DO REFERIDO REAGENTE

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um processo de marcação com radionuclídeos de anticorpos murinos ou humanos, monoclonais ou policlonais anti-fator de necrose tumoral, bem como ao reagente para diagnóstico "in vivo" ou "in vitro" a base de anticorpos anti-fator de necrose tumoral, murinos ou humanos, monoclonais ou policlonais marcados com radionuclídeos, ao seu uso para diagnóstico, ao método de diagnóstico "in vitro" e "in vivo" de doenças cuja fisiopatogenia envolva o fator de necrose tumoral e ao kit para diagnóstico de doenças imunológicas utilizando o referido reagente.

A invenção está relacionada precisamente às áreas médica e veterinária visando à avaliação de doenças cuja fisiopatogenia envolva o fator de necrose tumoral tais como: doenças reumatológicas, neoplasias, doenças infecciosas, doenças auto-imunes, inflamação.

Mais precisamente a invenção se relaciona a detecção de doenças cuja fisiopatogenia envolva o fator de necrose tumoral-alfa. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

O fator de necrose tumoral (TNF) é uma citocina envolvida em inflamações sistémicas e pertence a um grupo de citocinas que estimulam a reação de fase aguda. Causa a morte apoptótica da célula, proliferação celular, diferenciação, inflamação, origina tumores e também participa da replicação virai. Sua principal função é a regulação das células imunes. Cabe ressaltar que sua desregulação e, em particular, superprodução implica em diversas doenças humanas : (reumatológicas, endocrinológicas, infecciosas, auto- imunes), assim como neoplasias {Baker DE. Adalimumab: Human recombinant immunoglobulin G1 anti-tumour necrosis factor monoclonal antibody. Rev Gastroenterol Disord 2004;4:196-210; Cannela A, O' Dell J. Cytoloxic, immunoregulatory, and biologic agents In: West SG. Rheumatology secrets. Philadelphia: Hanley e Belfus;2002. p 588-97.)

O subtipo alfa (TNF- a), por ser uma glicoproteína sérica produzida por macrófagos ativados e outros leucócitos mononucleares de mamíferos, esta implicada na fisiopatogenia de diversas afecções. Possui atividade necrotizante contra linhagens de células tumorais e aumenta a habilidade de rejeitar transplantes tumorais. Possui apenas 30 por cento de homologia em relação ao subtipo beta (linfotoxina), embora compartilhem receptores de TNF (Baker DE. Adalimumab: Human recombinant immunoglobulin G1 anti-tumour necrosis factor monoclonal antibody. Rev Gastroenterol Disord 2004;4:196-210; Cannela A, O' Dell J. Cytoloxic, immunoregulatory, and biologic agents In: West SG. Rheumatology secrets. Philadelphia: Hanley e Belfus;2002. p 588-97.).

O adalimumab é o primeiro anticorpo monoclonal anti TNF-a, totalmente humano, aprovado para a redução dos sinais e sintomas e inibição da progressão do dano estrutural de articulações, indicado para adultos com artrite reumatóide (AR) ativa, de moderada a severa, e que não tenham apresentado resposta eficaz a um ou a mais de um, dos tratamentos anti- reumatóides tradicionais, como drogas modificadoras do curso da doença (DMARDs). Atualmente ainda está sendo estudado seu uso para o tratamento de outras doenças auto-imunes, como psoríase, doença de Crohn, espondilite anquilosante e artrite idiopàtica juvenil. Cabe também ressaltar que por ser um anticorpo monoclonal humano, reduz quase totalmente a possibilidade de rejeição e reação alérgica ao medicamento (Baker DE. Adalimumab: Human recombinant immunoglobulin G1 anti-tumour necrosis factor monoclonal antibody. Rev Gastroenterol Disord 2004;4:196-210; Cannela A, O' Dell J. Cytoloxic, immunoregulatory, and biologic agents In: West SG. Rheumatology secrets. Philadelphia: Hanley e Belfus;2002. p 588-97; Braun J, Sieper J, Breban M et al: Anti-tumor necrosis factor a therapy for ankylosing spondylitis: international experi-ence. Ann Rheum Dis 2002;61 (suppl Ill):iii51-iii60; Graf J. Anti-tumor necrosis factor agents: Etanercept (Embrel), Infliximab (Remicade) Adalimumab(Humira). In: Imbodem J. Current Rheumatology. Diagnosis and treatment. 1 th ed. Chicago: The Mecgraw-HHI Companier;2004.p 443-51; Haroui B, Keystone EC. Anti-TNF therapy in rheumatoid Arthritis: were the promises full filled? International journal of advances in rheumatology. 2003;1:82-90; Sandborn WJ. New concepts in anti-tumour necrosis factor therapy for inflammatory bowel disease. Rev Gastroenterol Disord 2005;5:10-8; Sandborn WJ. Strategies for targeting tumour necrosis factor in IBD. Best Pract & Clin Gastroenterol 2003; 17: 105-17).

Como todos os medicamentos, os bloqueadores de TNF possuem potenciais efeitos colaterais, tais como o risco aumentado de infecções, incluindo a tuberculose.

Artrite é um termo genérico, para aproximadamente 100 doenças que produzem inflamação no tecido conjuntivo periarticular ou degeneração não-inflamatória desse tecido, afetando, aproximadamente, 350 milhões de indivíduos em todo o mundo. As formas mais comuns são a osteoartrite e a artrite reumatóide adulta ou juvenil (Kraan MC, Versendaal H, Jonker M, e cols. Asymptomatic synovitis precedes clinically manifest arthritis. Arthritis Rheum 1998;41:1481-1488; Schumacher HR. How does one assess early rheumatoid arthritis in daily clinicai practice? Best Pract Res Clin Rheumatol 2001;15:67-7; Martins FPP, Gutfilen B, Fonseca LMB. Processo indireto de marcação de anticorpos monoclonais ou policlonais associados a doenças imunológicas com radionuclídeos, reagente para diagnóstico in vitro ou in vitro a base de anticorpos monoclonais ou policlonais marcados com radionuclídeos, uso do reagente para diagnóstico, método de diagnóstico in vitro e in vivo de processos imunológicos e kit para diagnóstico de processos imunológicos. PI0205681-0 A2, depositado em 04/10/2002).

Em pacientes com artrite reumatóide (AR), na forma adulta ou juvenil, ocorre, nas articulações afetadas, uma infiltração celular, oriunda da medula óssea, com a presença de monócitos e linfócitos, que ficam predominantemente no lado interno da membrana, e leucócitos polimorfonucleares, que migram para o líquido sinovial (King R. Rheumatoid Arthritis. Arthritis Rheum 2002;48:216-226; American College of Rheumatism Association. 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 1988;39:723-731; Felson DT, Anderson JJ, Boers M, e cols. American College of Rheumatology Preliminary definition of improvement in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 1995;38:727-735; Schneider R, Passo MH. Juvenile rheumatoid arthritis. Rheum Dis Clin North Am 2002;28:503-530. Martins FPP, Gutfilen B, Fonseca LMB. Processo indireto de marcação de anticorpos monoclonais ou policlonais associados a doenças imunológicas com radionuclídeos, reagente para diagnóstico in vitro ou in vitro a base de anticorpos monoclonais ou policlonais marcados com radionuclídeos, uso do reagente para diagnóstico, método de diagnóstico in vitro e in vivo de processos imunológicos e kit para diagnóstico de processos imunológicos. PI0205681-0 A2, depositado em 04/10/2002). A AR é uma doença auto-imune inflamatória crónica, de etiologia desconhecida com diversos quadros clínicos e evoluções. Caracteriza-se por sinovite simétrica erosiva e, algumas vezes, comprometimento sistémico. Observam-se dor e edema nas articulações e redução da mobilidade que resultam da inflamação do tecido sinovial. Essa inflamação leva à destruição das estruturas articulares, sua deterioração e perda de função. Apresenta, também, uma intensa atividade imunológica, que envolve uma infiltração de linfócitos T auxiliares e macrófagos no líquido sinovial das articulações. O mecanismo de agressão articular depende fundamentalmente de citocinas e principalmente da interleucina 1 (IL 1 ) e do fator de necrose tumoral alfa (TNF- a). Existe uma forte relação entre a intensidade do quadro da AR e os níveis dessas citocinas (King R. Rheumatoid Arthritis. Arthritis Rheum 2002;48:216- 226; American College of Rheumatism Association. 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 1988;39:723-731; Felson DT, Anderson JJ, Boers M, e cols. American College of Rheumatology Preliminary definition of improvement in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 1995;38:727-735. Martins FPP, Gutfilen B, Fonseca LMB. Processo indireto de marcação de anticorpos monocionais ou poiiclonais associados a doenças imunológicas com radionuclídeos, reagente para diagnóstico in vitro ou in vitro a base de anticorpos monocionais ou poiiclonais marcados com radionuclídeos, uso do reagente para diagnóstico, método de diagnóstico in vitro e in vivo de processos imunológicos e kit para diagnóstico de processos imunológicos. PI0205681-0 A2, depositado em 04/10/2002).

Inicialmente, a AR produz desconforto, fadiga e dor músculo- esquelética generalizada, e somente após algumas semanas ou meses as articulações são comprometidas. A ordem de comprometimento das articulações varia, mas, normalmente as pequenas articulações são as primeiras a serem afetadas (King R. Rheumatoid Arthritis. Arthritis Rheum 2002;48:216-226). A progressão da AR ocorre com o aparepimento de sinovite, atrofia muscular, destruição da cartilagem, perda de movimento, deformação progressiva até, finalmente, ocorrer a destruição óssea. Portanto, a pronta intervenção medicamentosa pode amenizar os danos ao paciente (Moreira C, Carvalho MAP. Reumatologia - diagnóstico e tratamento. 2 a ed. Rio de Janeiro: Editora Medsi, 2001. 786p; Laurindo IMM, Pinheiro GRC, Ximenes AC, e cols. Consenso brasileiro para o diagnóstico e tratamento da artrite reumatóide. Rev Bras Reumatol 2002;42:355-361. Martins FPP, Gutfilen B, Fonseca LMB. Processo indireto de marcação de anticorpos monoclonais ou policlonais associados a doenças imunológicas com radionuclídeos, reagente para diagnóstico in vitro ou in vitro a base de anticorpos monoclonais ou policlonais marcados com radionuclídeos, uso do reagente para diagnóstico, método de diagnóstico in vitro e in vivo de processos imunológicos e kit para diagnóstico de processos imunológicos. PI 0205681- 0 A2, depositado em 04/10/2002).

A mortalidade por AR está relacionada, principalmente, à deterioração generalizada da saúde do paciente, no que diz respeito a seu bem estar e sua funcionalidade. Pacientes com AR tornam-se suscetíveis a infecções e disfunções secundárias nos órgãos, podendo surgir, então, doenças pulmonares e hemorragias gastrintestinais (Laurindo IMM, Pinheiro GRC, Ximenes AC, e cols. Consenso brasileiro para o diagnóstico e tratamento da artrite reumatóide. Rev Bras Reumatol 2002;42:355-361. Martins FPP, Gutfilen B, Fonseca LMB. Processo indireto de marcação de anticorpos monoclonais ou policlonais associados a doenças imunológicas com radionuclídeos, reagente para diagnóstico in vitro ou in vitro a base de anticorpos monoclonais ou policlonais marcados com radionuclídeos, uso do reagente para diagnóstico, método de diagnóstico in vitro e in vivo de processos imunológicos e kit para diagnóstico de processos imunológicos. PI 0205681-0 A2, depositado em 04/10/2002).

Nas últimas décadas verificou-se que a AR acomete cerca de 2,1 milhões de pessoas apenas nos Estados Unidos, sendo mais comum em mulheres (proporção de três mulheres para cada homem) entre 30 e 70 anos. No Brasil, os números também são alarmantes, já que se estima que atinja cerca de 0,46 por cento da população brasileira. Contudo, as taxas de ocorrência variam de 0,5 até mais de 5%, dependendo das variações étnicas {Cohen MD. Update: treatment of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 2001;45:530-532). Os pacientes têm expectativa de vida reduzida e até 50% tornam-se inativos, de acordo com a gravidade da doença, nos primeiros anos (King R. Rheumatoid Arthritis. Arthritis Rheum 2002;48:216-226). Além disso, cabe ressaltar que as despesas com o tratamento de pacientes em estágios avançados da doença podem chegar a cinco mil reais mensais, um complicador que torna a doença particularmente preocupante, em países com condições socioeconómicas' delicadas como o Brasil (Laurindo IMM, Pinheiro GRC, Ximenes AC, e cols. Consenso brasileiro para o diagnóstico e tratamento da artrite reumatóide. Rev Bras Reumatol 2002;42:355-361; Cohen MD. Update: treatment of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 2001;45:530-532).

A AR pode ser controlada com o uso de imunossupressores e drogas citostáticas, embora ocasionem diversos efeitos colaterais. Para a melhor conduta do paciente, o médico deve estar informado sobre o grau de comprometimento em que a doença se encontra, sendo, portanto, imprescindível, para uma avaliação adequada, a utilização de métodos de diagnósticos não invasivos e específicos {Wakefield RJ, Conaghan PG, Jarrett S, Emery P. Noninvasive techniques for assessing skeletal changes in inflammatory arthritis: imaging technique. Curr Opin Rheumatol 2004; 16:435- 442; Goldsmith CH, Boers M, Bombardier C, Tugwell P. Criteria for clinically important changes in outcomes: development, scoring and evaluation of the rheumatoid arthritis patient and trial profiles. J Rheumatol 1993;20:561-565. Martins FPP, Gutfilen B, Fonseca LMB. Processo indireto de marcação de anticorpos monoclonais ou policlonais associados a doenças imunológicas com radíonuclídeos, reagente para diagnóstico in vitro ou in vitro a base de anticorpos monoclonais ou policlonais marcados com radíonuclídeos, uso do reagente para diagnóstico, método de diagnóstico in vitro e in vivo de processos imunológicos e kit para diagnóstico de processos imunológicos. PI0205681-0 A2, depositado em 04/10/2002).

Já a artrite idiopática juvenil (AU) normalmente ocorre a partir da segunda infância (em crianças menores de 16 anos). Incluem-se dentro dessa denominação, não apenas a AU, mas, também, outras formas de artrite crónica da infância, de acordo com os critérios de classificação do Colégio Americano de Reumatologia e da Liga Européia contra o Reumatismo (EULAR - European League Against Rheumatism) (Schneider R, Passo MH. Juvenile rheumatoid arthritis. Rheum Dis Clin North Am 2002;28:503-530. Martins FPP, Gutfilen B, Fonseca LMB. Processo indireto de marcação de anticorpos monocionais ou poiicionais associados a doenças imunológicas com radionuclídeos, reagente para diagnóstico in v vitro ou in vitro a base de anticorpos monocionais ou poiicionais marcados com radionuclídeos, uso do reagente para diagnóstico, método de diagnóstico in vitro e in vivo de processos imunológicos e kit para diagnóstico de processos imunológicos. PI0205681-0 A2. depositado em 04/10/2002).

Pode iniciar abruptamente (10% dos casos), mas, em geral, tem um curso lento e insidioso. Doenças infecciosas, predisposição genética, respostas auto-imunes e interações hormonais são os principais fatores associados ao seu desencadeamento (Schneider R, Passo MH. Juvenile rheumatoid arthritis. Rheum Dis Clin North Am 2002;28:503-530. Martins FPP, Gutfilen B, Fonseca LMB. Processo indireto de marcação de anticorpos monocionais ou poiicionais associados a doenças imunológicas com radionuclídeos, reagente para diagnóstico in vitro ou in vitro a base de anticorpos monocionais ou poiicionais marcados com radionuclídeos, uso do reagente para diagnóstico, método de diagnóstico in vitro e in vivo de processos imunológicos e kit para diagnóstico de processos imunológicos. PI0205681-0 A2, depositado em 04/10/2002) .

Em aproximadamente 40% das crianças com AU, somente algumas articulações são afetadas, geralmente assimetricamente (quatro ou menos), recebendo o nome de pauciarticular. Em outros 40%, muitas articulações são afetadas, podendo ter ou não fator reumatóide positivo, sendo denominada de poliarticular. Nos 20% restantes, aparecem quadros febris, rash cutâneo típico, além de sinais sistémicos (como hepatomegalia, esplenomegalia, pleurite, pericardite). É conhecida, neste caso, como doença de Still. Cabe ressaltar que o fator reumatóide raramente está presente (15% dos casos) e a doença é mais frequente no sexo feminino (Schneider R, Passo MH. Juvenile rheumatoid arthritis. Rheum Dis Clin North Am 2002;28:503-530).

Quando diagnosticada corretamente e tratada em tempo hábil, os sintomas desaparecem completamente em até 75% das crianças. O prognóstico é pior para crianças em que muitas articulações foram afetadas e que tenham fator reumatóide positivo {Schneider R, Passo MH. Juvenile rheumatoid arthritis, Rheum Dis Clin North Am 2002;28:503-530).

Embora seja uma afecção não tão comum quanto no adulto, é a doença reumática mais comum em crianças. Na Inglaterra, a incidência varia de 0,06% a 0,1 % e, nos Estados Unidos, de 0,01 % a 0, 1 1 % da população infantil até 16 anos. Seis a oito novos casos, para uma população de 100.000 crianças, abaixo de 16 anos, aparecem, anualmente, na Finlândia. Os picos de maior incidência, por idade, estão entre um a cinco e de 10 a 14 anos, acometendo mais o sexo feminino (1 ,5:1 a 3,0:1 ), embora haja um equilíbrio entre os sexos nos casos da forma sistémica (Schneider R, Passo MH. Juvenile rheumatoid arthritis. Rheum Dis Clin North Am 2002;28:503-530).

Mesmo que a etiologia das artrites reumatóides permaneça desconhecida, sabe-se que há inflamação crónica da sinóvia com infiltração de macrófagos e linfócitos B e T, o que leva à formação do pannus, gerando destruição articular. Além dessas alterações sinoviais, verifica-se que, durante o curso da doença, em muitos pacientes, há o predomínio de citocinas associadas à destruição tissular, incluindo interleucina-6 e fator de necrose tumoral (TNF - tumor necrosis factor). Dessa forma, atualmente sugere-se o uso de drogas específicas direcionadas a tais fatores, já que, em alguns casos, o tratamento convencional (uso de drogas antiinflamatórias não esteroidais) não resulta em uma resposta adequada (Richard-Miceli C, Dougados M. Tumor necrosis factor-alfa blockers in rheumatoid arthritis. Biol Drugs 2001; 15:251 - 259; Cohen MD. Update: treatment of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 2001;45:530-532; Moreira C, Carvalho MAP. Reumatologia - diagnóstico e tratamento. 2 a ed. Rio de Janeiro: Editora Medsi, 2001. 786p). O tratamento mais moderno para a AR é a utilização de anticorpos, e de bloqueador de receptores, direcionados contra o TNF-ct e que têm demonstrado alta eficiência devido à grande afinidade para a molécula alvo e são substâncias originadas da engenharia genética (Haroui B, Keystone EC. Anti-TNF therapy in Rheumatoid Arthritis: were the promises full filled? Intern J Adv Rheum 2003;1:82-90).

Por poder acometer diversos órgãos e tecidos, com apresentação clínica bastante diversa, verifica-se um amplo espectro de alterações laboratoriais. Estas, embora não específicas para a doença, podem auxiliar no diagnóstico, afastando outras doenças semelhantes, ou têm valor na avaliação da morbidade e no estabelecimento do prognóstico do paciente (Santos VM, Cunha SFC, Cunha DF. Velocidade de sedimentação das hemácias: utilidade e limitações. Rev Ass Med Bras 2000; 46:232-236).

Como na AR, as alterações ósteoarticulares, encontradas no diagnóstico por imagem, embora inespecíficas, ajudam no diagnóstico diferencial, embora tenham baixa sensibilidade nas fases iniciais da doença (Wakefield RJ, Conaghan PG, Jarrett S, Emery P. Noninvasive techniques for assessing skeletal changes in inflammatory arthritis: imaging technique. Curr Opin Rheumatol 2004;16:435-442; Goldsmith CH, Boers M, Bombardier C, Tugwell P. Criteria for clinically important changes in outcomes: development, scoring and evaluation of the rheumatoid arthritis patient and trial profiles. J Rheumatol 1993;20:561-565; van Gestel AM, Anderson JJ, van Riel PL, Boers M, Haagsma CJ, Rich B, Wells G, Lange ML, Felson DT. ACR and EULAR improvement criteria have comparable validity in rheumatoid arthritis trials. American College of Rheumatology European League of Associations for Rheumatology. J Rheumatol 1999;26:705-711; Jamar F, Chapman PT, Manicourt DH, Glass DM, Haskard DO, Peters AM. A comparison between 111 ln-anti-E-selectin mAb and 99m Tc-labelled human non-specific immunoglobulin in radionuclide imagings of rheumatoid arthritis. BJR 1997;70:473-481; Marcus C, Thakur ML, Huynh TV, e cols: Imaging rheumatic joint diseases with anti-T lymphocyte antibody 0KT3. Nucl Med Comm 1994;15:824-830. Martins FPP, Gutfilen B, Fonseca LMB. Processo indireto de marcação de anticorpos monoclonais ou policlonais associados a doenças imunológicas com radionuclídeos, reagente para diagnóstico in vitro ou in vitro a base de anticorpos monoclonais ou policlonais marcados com radionuclídeos, uso do reagente para

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diagnóstico, método de diagnóstico in vitro e in vivo de processos imunológicos e kit para diagnóstico de processos imunológicos. PI 0205681-0 A2. Depósito de patente em 04/10/2002).

Como não existe cura para a AR ou AU ou ainda meios para preveni-las, o diagnóstico precoce e o acompanhamento de sua evolução são peças-chave para o tratamento das mesmas.

Nas doenças reumáticas, os métodos de diagnóstico por imagem são utilizados a fim de que se reconheçam o processo fisiopatológico e as alterações morfológicas, sem que seja necessário um procedimento invasivo, como a biópsia. Cabe ressaltar que deve haver avaliações periódicas sobre o estágio da doença, o que é imprescindível para definir a melhor conduta a ser seguida para cada indivíduo (Goldsmith CH, Boers M, Bombardier C, Tugwell P. Criteria for clinically importa nt changes in outcomes: development, scoring and evaluation of the rheumatoid arthritis patient and trial profiles. J Rheumatol 1993;20:561-565; Schumacher HR. How does one assess early rheumatoid arthritis in daily clinicai practice? Best Pract Res Clin Rheumatol 2001;15:67-76. Martins FPP, Gutfilen B, Fonseca LMB. Processo indireto de marcação de anticorpos monoclonais ou policlonais associados a doenças imunológicas com radionuclídeos, reagente para diagnóstico in vitro ou in vitro a base de anticorpos monoclonais ou policlonais marcados com radionuclídeos, uso do reagente para diagnóstico, método de diagnóstico in vitro e in vivo de processos imunológicos e kit para diagnóstico de processos imunológicos. PI0205681-0 A2,. depositado em 04/10/200). Além disso, para a obtenção do sucesso terapêutico, é preciso diferenciar essas doenças de outras, como osteoartrite (OA) e artrite gotosa (AG), que podem apresentar sinais clínicos e/ou radiológicos semelhantes ou se apresentarem concomitantemente.

Nos últimos 20 anos, a Medicina Nuclear tem realizado diversos estudos, visando desenvolver técnicas cintilográficas capazes de avaliar o grau de intensidade da artrite e seu sucesso terapêutico. Cabe ressaltar a utilização de anticorpos murinos monoclonais e policlonais marcados com tecnécio-99m (Wakefield RJ, Conaghan PG, Jarrett S, Emery P. Noninvasive techniques for assessing skeletal changes in inflammatory arthritis: imaging technique. Curr Opin Rheumatol 2004;16:435-442; Jamar F, Chapman PT, Manicourt DH, Glass DM, Haskard DO, Peters AM. A comparison between 111 ln-anti-E-selectin mAb and 99m Tc-labelled human non-specific immunoglobulin in radionuclide imagings of rheumatoid arthritis. BJR 1997;70:473-481; Marcus C, Thakur ML, Huynh TV, e cols.: Imaging rheumatic joint diseases with anti-T lymphocyte antibody OKT3. Nucl Med Comm 1994;15:824-830. Martins FPP, Gutfilen B, Fonseca LMB. Processo indireto de marcação de anticorpos monoclonais ou policlonais associados a doenças imunológicas com radionuclídeos, reagente para diagnóstico in vitro ou in vitro a base de anticorpos monoclonais ou policlonais marcados com radionuclídeos, uso do reagente para diagnóstico, método de diagnóstico in vitro e in vivo de processos imunológicos e kit para diagnóstico de processos imunológicos. PI0205681-0 A2, depositado em 04/10/2002).

A avaliação radiográfica é limitada, devido à baixa sensibilidade do exame na detecção, na fase inicial da doença, da extensão da destruição da cartilagem e dos ossos, embora, em alguns casos, possa descartar outras doenças com quadros clínicos semelhantes. Métodos de marcação de ' anticorpos monoclonais marcados com radionuclídeos vêm sendo desenvolvidos e testados, nos últimos anos, e têm sido, em geral, mais sensíveis e específicos no diagnóstico da AR {Schumacher HR. How does one assess early rheumatoid arthritis in daily clinicai practice? Best Pract Res Clin Rheumatol 2001;15:67-76; Fonseca LMB, Cruz MGA, Gutfilen B. Cintilografia Óssea. In: Reumatologia Pediátrica. Oliveira SK, Azevedo ECL. 2 a ed. Rio de Janeiro: Revinter, 2001. 683p; Moreira C, Carvalho MAP. Reumatologia - diagnóstico e tratamento. 2 a ed. Rio de Janeiro: Editora Medsi, 2001. 786p; Laurindo IMM, Pinheiro GRC, Ximenes AC, e cols. Consenso brasileiro para o diagnóstico e tratamento da artrite reumatóide. Rev Bras Reumatol 2002;42:355-361; Wakefield RJ, Conaghan PG, Jarrett S, Emery P. Noninvasive techniques for assessing skeletal changes in inflammatory arthritis: imaging technique. Curr Opin Rheumatol 2004;16:435-442; Jamar F, Chapman PT, Manicourt DH, Glass DM, Haskard DO, Peters AM. A comparison between 111 ln-anti-E-selectin mAb and 99m Tc-labelled human non-specific immunoglobulin in radionuclide imagings of rheumatoid arthritis. BJR 1997;70:473-481; Marcus C, Thakur ML, Huynh TV, e cols.: Imaging rheumatic joint diseases with anti-T lymphocyte antibody OKT3. Nucl Med Comm 1994;15:824-830; Naredo E, Bonilla G, Gamero F, Uson J, Carmona L, Laffon A. Assessment of inflammatory activity in rheumatoid arthritis: a comparative study of clinicai evaluation with grey scale and power Doppler ultrasonography. Ann Rheum Dis 2005;64:375-381. Martins FPP, Gutfilen B, Fonseca LMB. Processo indireto de marcação de anticorpos monoclonais ou policlonais associados a doenças imunológicas com radionuclídeos, reagente para diagnóstico in vitro ou in vitro a base de anticorpos monoclonais ou policlonais marcados com radionuclídeos, uso do reagente para diagnóstico, método de diagnóstico in vitro e in vivo de processos imunológicos e kit para diagnóstico de processos imunológicos. PI 0205681- 0 A2, depositado em 04/10/2002).

Artrite psoriásica associa os dolorosos sintomas da artrite e as lesões de pele da psoríase. Artrite psoriásica geralmente afeta pacientes com psoríase, doença crónica de pele, que atinge cerca de três por cento da população mundial. Estima-se que mais de 30 por cento das pessoas com psoríase também desenvolvem artrite psoriásica (Mease P, Goffe BS. Diagnosis and treatment of psoriatic arthritis. J Am Acad Dermatol 2005; 52:01- 19; Ruderman EM. Evaluation and management of psoriatic arthritis: the role of biologic therapy. J Am Acad Dermatol 2003;49:S125-132).

O adalimumab por se ligar especificamente a molécula do TNF-a possibilitaria sua utilização em qualquer afecção na qual esta molécula esteja presente, o que tem sido estudado em diversos ensaios clínicos. Neste contexto, abrem-se perspectivas para sua utilização na oftalmopatia de Graves que também é uma condição auto-imune que afeta o conteúdo orbital, na qual há a participação do TNF. Decorre de processo inflamatório orbitário com edema dos músculos extra-oculares e tecidos conectivos, cursando com complicações oculares, as quais podem ser irreversíveis quando em fase fibrótica. Seu curso clínico pode evoluir de forma independente da atividade da doença tireoidiana. Métodos de imagem, como a tomografia computadorizada, podem evidenciar aumento dos músculos extra-oculares, porém não diferenciam edema de fibrose. A ultrassonografia das órbitas também pode mostrar edema assim como a ressonância magnética. Contudo, nenhuma delas apresenta sensibilidade ótima. Definir se há ou não inflamação é importante para tomada de decisão terapêutica já que, a resposta à terapia antiinflamatória ou imunossupressora, ou ainda à radioterapia só ocorrerá na presença de inflamação ativa. Na ausência de processo inflamatório a opção terapêutica é a cirurgia descompressiva para evitar progressão da lesão ocular, particularmente por compressão do nervo óptico (Burch HB, Wartofsky L. GravesOphthalmopathy: current concepts regarding pathogenesis and management. Endocrine Reviews. 1993; 14:747-793; Prummel MF, Wiersinga WM. Medicai management of Graves' ophthalmopathy. Thyroid. 1995; 5:231- 234; Paschke R, Ludgate M. The thyrotropin receptor in thyroid diseases. N Engl J Med .1997; 337:1675-81; Gerding MN, Van Der Zant FM, Van Royen EA, Koornneef L, Krenning EP, Wiersinga WM, Prummel MF. Octreotide- scintigraphy is a disease-activity parameter in Graves' ophthalmopathy. Clin Endocrinology. 1999; 50:373-379).

Pacientes com oftalmopatia de Graves moderada-grave são usualmente tratados com terapia imunossupressiva. Contudo, corticóides ou radioterapia retrobulbar melhoram os sintomas em 65% dos pacientes e, assim, ½ dos casos é tratado sem benefícios. A provável razão é que esta terapia é utilizada em pacientes com doença de Graves grave, porém com oftalmopatia inativa. Isto se deve ao fato de ser difícil distinguir a doença ativa da inativa, considerando-se que a doença inativa também é beneficiada com o uso do imunossupressor (Burch HB, Wartofsky L. GravesOphthalmopathy: current concepts regarding pathogenesis and management. Endocrine Reviews. 1993; 14:747-793; Prummel MF, Wiersinga WM. Medicai management of Graves' ophthalmopathy. Thyroid. 1995; 5:231-234; Paschke R, Ludgate M. The thyrotropin receptor in thyroid diseases. N Engl J Med .1997; 337:1675-81; Gerding MN, Van Der Zant FM, Van Royen EA, Koornneef L, Krenning EP, Wiersinga WM, Prummel MF. Octreotide-scintigraphy is a disease-activity parameter in GravesOphthalmopathy. Clin Endocrinology. 1999; 50:373-379).

Em face do exposto, considerando-se as características bioquímicas e imunológicas dos anticorpos anti-fator de necrose tumoral propusemos criar, neste estudo, o desenvolvimento de um método de marcação de anticorpos humanos, monoclonais com o tecnécio-99m (Tc-99m), para serem empregados como marcadores radioativos na avaliação de pacientes com doenças cuja fisiopatogenia envolva o TNF, para serem empregados como marcadores radioativos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Para desenvolvimento do processo desta invenção definiram-se concentrações e volumes ótimos do anticorpo, do agente redutor e do radionuclídeo empregado, sendo estes, em especial, respectivamente, o adalimumab ou o infliximab, o cloreto estanoso e o tecnécio-99m.

Para isso, foram utilizadas alíquotas de anticorpo monoclonal ou policlonal, murino ou humano, especificamente o infliximab ou o adalimumab, respectivamente, em várias concentrações 0,5 a 2 mg/mL, especialmente 1 mg/mL, em um volume de 10 a 500pL, especialmente 150 pL. As alíquotas foram incubadas, por 5 a 25 minutos, especialmente 10 minutos, à temperatura ambiente, com soluções de um agente redutor, particularmente o cloreto estanoso nas concentrações de 2 a 50 pg/mL, em especial 12 pg/mL, em um volume que variou de 10 a 500 pL, especificamente 150 pL. Depois, foram adicionados volumes de 0, 1 a 2,0 mL de um radionuclídeo, em especial 0,5 mL de Tc-99m, com atividade de 2 pCi a 40 mCi, particularmente 100pCi para uso "in vitro" e 10 mCi para uso "in vivo", recentemente eluídos de um gerador de Mo-99/Tc-99m (IPEN-CNEN), seguindo-se de uma incubação de 2 a 40 minutos, particularmente 20 minutos, à temperatura ambiente.

Os tubos do experimento estavam sob baixa pressão atmosférica, que foi obtida pela aspiração de ar com auxílio de uma seringa. O pH da mistura final ficou entre 6,9 e 7,2. A solução resultante apresentava-se límpida, incolor, estéril e apirogênica.

A eficiência da marcação foi determinada por cromatografia em papel Whatman n°4 e eletroforese em gel SDS-page, com subsequente exposição radioativa (auto-radiografia). Foram realizados experimentos utilizando filtro milipore 0,22μιτι ou 0,45μιη, em especial 0,22μηι, e foram comparados os resultados com as amostras não filtradas. Obteve-se como resultado final, os anticorpos marcados com tecnécio-99m, utilizando-se o método descrito nesta invenção, sob a forma do reagente.

Um segundo aspecto da invenção está relacionado ao reagente para diagnóstico obtido que apresenta as seguintes características: solução apresentando pH entre 6,9 e 7,2; volume final variando de 0,2 a 3,0 ml_, solução translúcida com eficiência de marcação superior a 90%.

Outro aspecto da invenção está voltado a um método de diagnóstico "in vitro" no qual a amostra a ser analisada é submetida a testes de radioimunoensaio com o reagente para diagnóstico da presente invenção para a verificação da manutenção da imunorreatividade do anticorpo.

Outro aspecto a ser ressaltado na presente invenção está relacionado ao método diagnóstico "in vivo" onde a aquisição de imagens cintilográficas, com o reagente diagnóstico da presente invenção, deve obedecer a um protocolo específico para cada doença que está sendo diagnosticada. A seguir estão descritos os protocolos, por nós descritos, utilizados para os pacientes com AR.

O paciente com AR é posicionado em decúbito dorsal, com o colimador de baixa energia no detector da câmara de cintilação direcionado, em incidências, anterior e posterior.

São realizadas imagens com duração de 15 e 30 minutos, 1 , 3, 4, 6, 12 e 24 horas após injeção i.v. do 99m-Tc-anti-TNF. Na imagem de 1 hora são realizadas incidências, anterior e posterior, das articulações comprometidas. Nas imagens de 15 minutos, 3 e 24 horas são realizadas, também, pesquisas de corpo inteiro, para avaliação de possíveis lesões em outras regiões. No processamento das imagens, é construída a área de interesse, em torno das articulações comprometidas e áreas de maior captação do radiofármaco e feito, pelo computador, o cálculo da contagem radioativa destas áreas. Com base neste cálculo, faz-se uma comparação entre os resultados obtidos nas diferentes aquisições, para verificação de um possível acúmulo do radiofármaco, ao longo do tempo.

O método acima descrito não é exaustivo, pode ser aplicado em outras afecções imunológicas tais como câncer, doenças infecciosas, doenças inflamatórias, doenças auto-imunes, outras doenças reumatológicas.

Um último aspecto da invenção relaciona-se a um kit de diagnóstico a base do radiofármaco acima descrito.

Seria um kit para uso em imunocintilografias. Seriam frascos com reativos liofilizados, estéreis e apirogênicos, em atmosfera de nitrogénio contendo cada um: 150 μg de anticorpo e 150 μg do agente redutor, especialmente o cloreto estanoso. Para o preparo do kit é necessária a adição de tecnécio-99m que é facilmente obtido através de geradores de Μο-99/Tc- 99m com tecnologia plenamente dominada pelo Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares (IPEN) da Comissão Nacional de Energia Nuclear (CNEN), que distribui este sistema para todos os Serviços de Medicina Nuclear do país, possibilitando uma disponibilidade deste radionuclídeo a custo reduzido.

As características da solução após o preparo são; solução límpida, incolor, estéril e apirogênica, com pH entre 7,0 e 7,2, com eficiência de marcação superior a 90% e estabilidade até 24 h após a marcação.

Para melhor compreensão da presente invenção seguem-se os seguintes exemplos ilustrativos:

EXEMPLO I : PROCESSO DE MARCAÇÃO DO ANTICORPO MONOCLONAL INFLIXIMAB COM O RADIONUCLÍDEO TECNÉCIO 99M Alíquotas do anticorpo monoclonal infliximab em concentração de 1 mg/mL em volume de 150 μΐ foram incubadas com 12 μg/mL do agente redutor cloreto estanoso em um volume de 150 μΙ_ obtendo-se uma solução límpida e incolor após incubação por 0 minutos, à temperatura ambiente. Esta solução foi incubada durante 20 minutos à temperatura ambiente, com o radionuclídeo tecnécio-99m em um volume de 0,5 mL com atividade de 100pCi para uso "in vitro" e 10 mCi para uso "in vivo", obtendo-se um reagente de diagnóstico límpido, incolor, estéril e apirogênico a base do anticorpo monoclonal marcado com o radionuclídeo. Posteriormente filtrou-se o reagente obtido com um filtro milipore de 0,22μηΊ.

EXEMPLO II : PROCESSO DE MARCAÇÃO DO ANTICORPO MONOCLONAL ADALIMUMAB COM O RADIONUCLÍDEO TECNÉCIO 99M

Alíquotas do anticorpo monoclonal adalimumab em concentração de 1 mg/mL em volume de 150 μΐ foram incubadas com 12 μg/mL do agente redutor cloreto estanoso em um volume de 150 μί obtendo-se uma solução límpida e incolor após incubação por 10 minutos, à temperatura ambiente. Esta solução foi incubada durante 20 minutos à temperatura ambiente, com o radionuclídeo tecnécio-99m num volume de 0,5 mL com atividade de 100pCi para uso "in vitro" e 10 mCi para uso "in vivo", obtendo-se um reagente de diagnóstico límpido, incolor, estéril e apirogênico a base do anticorpo monoclonal marcado com o radionuclídeo. Posteriormente filtrou-se o reagente obtido com um filtro milipore de 0,22μΐη.

EXEMPLO III: PROCESSO DE MARCAÇÃO DO ANTICORPO MONOCLONAL INFLIXIMAB COM O RADIONUCLÍDEO TECNÉCIO 99M - ESTUDO DA CONCENTRAÇÃO IDEAL DO CLORETO ESTANOSO UTILIZANDO CROMATOGRAFIA EM PAPEL WHATMAN N" 4

A concentração de cloreto estanoso é um fator de relevância no processo de marcação de moléculas com Tc-99m. Foram avaliadas as seguintes concentrações 2, 5; 10; 12; 15; 20, 25 e 50 μg/mL de SnCI 2 , por 10 minutos, à temperatura ambiente. Nesta etapa as soluções foram filtradas com milipore 0,22μιτι.

Assim, observou-se que a melhor concentração de SnCI 2 para a marcação do infliximab é de 12 μg/mL e que o melhor solvente foi a salina. EXEMPLO IV: PROCESSO DE MARCAÇÃO DO ANTICORPO MONOCLONAL ADALIMUMAB COM O RADIONUCLÍDEO TECNÉCIO 99M - ESTUDO DA CONCENTRAÇÃO IDEAL DO CLORETO ESTANOSO UTILIZANDO CROMATOGRAFIA EM PAPEL WHATMAN N° 4

A concentração de cloreto estanoso é um fator de relevância no processo de marcação de moléculas com Tc-99m. Foram testadas as seguintes concentrações 2, 5; 10; 12; 15; 20, 25 e 50 μg/mL de SnCI 2 , por 10 minutos, à temperatura ambiente. Nesta etapa as soluções foram filtradas com milipore 0,22μιτΊ.

Assim, observou-se que a melhor concentração de SnCI 2 para a marcação do adalimumab é de 12 μg/mL e que o melhor solvente foi a salina. EXEMPLO V: PROCESSO DE MARCAÇÃO DO ANTICORPO MONOCLONAL INFLIXIMAB COM O RADIONUCLÍDEO TECNÉCIO 99M - ESTUDO DA ESTABILIDADE DA MARCAÇÃO UTILIZANDO CROMATOGRAFIA EM PAPEL WHATMAN N° 4

Com este método, verificou-se através da realização de sucessivos ensaios cromatográficos, a estabilidade de marcação do complexo 99m-Tc-infliximab, tendo sido esta estável até 24 horas.

EXEMPLO VI : PROCESSO DE MARCAÇÃO DO ANTICORPO MONOCLONAL ADALIMUMAB COM O RADIONUCLÍDEO TECNÉCIO 99M - ESTUDO DA ESTABILIDADE DA MARCAÇÃO UTILIZANDO CROMATOGRAFIA EM PAPEL WHATMAN N° 4

Com este método, verificou-se através da realização de sucessivos ensaios cromatográficos, a estabilidade de marcação do complexo 99m-Tc-adalimumab, tendo sido esta estável até 24 horas. EXEMPLO VII : PROCESSO DIRETO DE MARCAÇÃO DO ANTICORPO MONOCLONAL ADALIMUMAB COM O RADIONUCLÍDEO TECNÉCIO 99M - ESTUDO CINTILOGRÁFICO EM PACIENTES COM ARTRITE REUMATÓIDE

Uma vez que os resultados obtidos experimentalmente em camundongos e hamsters foram satisfatórios, o método foi aplicado em seres humanos, após aprovação pelo Comité de Ética do Hospital e assinatura do Consentimento Livre e Esclarecido pelos pacientes.

Foram realizadas imagens 15 e 30 minutos, 1 , 3, 4, 6, 12 e 24 horas após a injeção do radiofármaco. Na figura 1 observa-se a avaliação cintilográfica em um paciente com artrite reumatóide.