技术领域

本发明涉及化学合成领域，更具体涉及可用于 制备氘代二苯基脲的中间体及 所述中间体的合成方法和应用。 背景技术

已知的 ω-二苯基脲衍生物是 c-RAF 激酶活性的化合物。 例如在 WO 2000/042012中公开了一类 ω-羧基芳基取代的二苯基脲， 及其在治疗癌症以及相 关疾病中的用途。 ω-二苯基脲化合物如索拉非尼 (Sorafenib)最先被发现是 c-RAF 激酶的抑制 剂， 之后不断的研究发现它还能抑制 MEK和 ERK信号传导通路、血管内皮生长 因子 -2(VEGFR-2)、 血管内皮生长因子 -3(VEGFR-3)、 以及血小板源生长因子 - β (PDGFR- β )的酪氨酸激酶的活性 (Curr Pharm Des 2002;8:2255 - 2257), 因此它被 称之为多激酶抑制剂， 具有双重抗肿瘤作用。

索拉非尼 (Sorafenib), 商品名 Nexavar, 是由拜耳公司和 ONXY公司共同研 制的一种新型的口服多激酶抑制剂， 由于它在一项针对晚期肾癌的 III期临床研 究中的卓越表现， 2005年 12月被 FDA快速批准用于治疗晚期肾细胞癌， 2006 年 11月在中国上市。 然而，索拉非尼 (Sorafenib) 具有多种副作用， 例如高血压、 体重减轻、 皮疹等。 然而， 现有的制备氘代二苯基脲化合物的工艺尚不成 熟， 存在成本高、 得率 低、 产物纯度低或不易分离等缺点， 因此本领域迫切需要开发新的高效地制备高 纯度的二苯基脲化合物的工艺。 发明内容

本发明的目的就是提供一种高效地制备高纯度 的二苯基脲化合物的工艺以 及用于该工艺的中间体。 在本发明的第一方面，提供了一种制备 N-(l，l，l-三氘代甲基)苯并丁二酰亚胺 的方法， 包括步骤： (a)在惰性溶剂中， 将邻苯二甲酰亚胺的碱金属盐与式 A化合物进行反应， 式中， Z为 CH ₃ ， O-CD ₃ ，或 , 其中 R为甲基、 硝基或卤素 (F、 C1或 Br)， 从而形成 N-(l，l，l-三氘代甲基)苯并丁二酰亚胺： 。

在另一优选例中， 所述的惰性溶剂包括： N， N-二甲基甲酰胺 (DMF)、 N， N-二甲基乙酰胺 (DMA)、 二甲基亚砜 (DMSO)、 N-甲基吡咯垸酮 (NMP)、 四氢呋 喃、 1， 4-二氧六环、 或其组合。

在另一优选例中， 步骤 (a)中， 反应温度为 -10°C至回流温度， 较佳地为 -4°C 至 100°C， 更佳地为 20-80°C。

在另一优选例中，反应时间为 0.1-24小时，较佳地为 0.3-5小时，更佳地为 0.5-2 小时。

在另一优选例中， 步骤 (a)中， 所述的邻苯二甲酰亚胺碱金属盐包括 (但并不 限于)： 邻苯二甲酰亚胺钾盐、 邻苯二甲酰亚胺钠盐、 邻苯二甲酰亚胺锂盐或其 组合。

在另一优选例中， 步骤 (a)中， 所述的式 A化合物包括 4-甲基苯磺酸 -(1，1，1-三 氘代甲基)酯、 3-硝基苯磺酸 -(1，1，1-三氘代甲基)酯， 或 4-硝基苯磺酸 -(1，1，1-三氘 代甲基)酯。

在另一优选例中， 所述方法在步骤 (a)之前还包括步骤 (al):

在碱性条件下和惰性溶剂中， 将氘代甲醇与对甲苯磺酰氯进行反应， 从而形 成 4-甲基苯磺酸 -(1，1，1-三氘代甲基)酯。

在另一优选例中， 步骤 (al)中所述的惰性溶剂包括水、 四氢呋喃、 或其混合 溶剂。

在本发明的第二方面， 提供了一种制备 1，1，1-三氘代甲胺盐的方法， 包括步 骤：

在惰性溶剂或水性溶剂中，将 N-(l，l，l-三氘代甲基)苯并丁二酰亚胺与酸进� �� 反应， 从而形成 1，1，1-三氘代甲胺盐， 其中所述的酸包括： 盐酸、 硫酸、 氢溴酸、 三氟乙酸、 或其组合。 在另一优选例中， 所述的反应温度为 30至回流温度 (如 120 °C )， 较佳地为 40-1 10°C。

在另一优选例中， 反应时间为 0.5-48小时，较佳地为 1-36小时， 更佳地为 2-24 小时。

在本发明的第三方面， 提供了一种可用于制备氘代二苯基脲的中间体 ， 所述 的中间体是 N-(l，l，l-三氘代甲基)苯并丁二酰亚胺。

在另一优选例中， 用于制备氘代二苯基脲或用作制备氘代二苯基 脲的原料。 在另一优选例中，

式中：

X 是 N或者 N ⁺ -O—；

R ¹ 是卤素 (如 F，C1或 Br)， 一个或多个氘代的或全氘代的 C1-C4垸基； R ² 是未氘代的、 一个或多个氘代的或全氘代的 C1-C4垸基， 或者部分或全 部卤素取代的 C1-C4垸基；

R ³ 、 R R ⁵ 、 R ⁸ 、 R ⁹ 、 R ^1Q 、 R"、 R ¹² 、 R ¹³ 、 R ¹⁴ 分别是氢、 氘、 或卤素 (如 F，C1，或 Br);

R ⁶ 是氢、 氘、 或一个或多个氘代的或全氘代的 C1-C4垸基；

R ⁷ 是氢、 氘、 或一个或多个氘代的或全氘代的 C1-C4垸基；

附加条件是 R ² 、 R ³ 、 R ⁴ 、 R ⁵ 、 R ⁶ 、 R R ⁸ 、 R ⁹ 、 R ¹⁰ 、 R ^l R ¹² 、 R ¹³ 或 R ¹⁴ 中 至少一个是氘代的或氘。

更佳地， 所述的氘代二苯基脲选自下组：

4-(4-(3-(4-氯 -3- (三氟甲基)苯基]酰脲) -苯氧基) -2-( N-l，，r，r-三氘代甲基)口比 啶酰胺 (CM4307);

4-(4-(3-(4-氯 -3- (三氟甲基)苯基]酰脲) -苯氧基) -2-( N-l，，r，r-三氘代甲基)口比 啶酰胺对甲苯磺酸盐 (CM4307 · TsOH);

4-(4-(3-(4-氯 -3- (三氟甲基)苯基]酰脲) -3-氟-苯氧基) -2-( N-l，，r，r-三氘代甲 基)吡啶酰胺 (CM4309);

4-(4-(3-(4-氯 -3- (三氟甲基)苯基]酰脲) -3-氟-苯氧基) -2-( N-l，，r，r-三氘代甲 基)吡啶酰胺对甲苯磺酸盐 (CM4309 · TsOH)o 应理解， 在本发明范围内中， 本发明的上述各技术特征和在下文 (如实施例) 中具体描述的各技术特征可以互相组合， 从而构成新的或优选的技术方案。 限于 篇幅， 在此不再一一累述。 附图说明

图 1是雄性 SD大鼠口服 3mg/kg对照化合物 CM4306后的血清药物浓度 (ng/ml) 曲线图。

图 2是雄性 SD大鼠口服 3mg/kg本发明化合物 CM4307后的血清药物浓度 (ng/ml)曲线图。

图 3是 CM4306和 CM4307对人肝细胞癌 SMMC-7721裸鼠移植模型的抑制作 用曲线图。 图中， " treatment"表示治疗的时间为 14天。 随后为停药后的观察 期。 治疗前 5天是模型制备期。 具体实施方式

本发明人经过研究， 意外地发现， 本发明的氘代的 ω-二苯基脲及其药学上可 接受的盐与未经氘代的化合物相比， 具有明显更优异的药物动力学和 /或药效学 性能， 因此更适合作为抑制 rafm酶的化合物， 进而更适用制备治疗癌症以及相关 疾病的药物。

此外，本发明人还发现，采用新的中间体 N-(l，l，l-三氘代甲基)苯并丁二酰亚 胺， 可以更高效地、 更简便地制备高纯度的二苯基脲化合物。 在此基础上完成了 本发明。 术语

如本文所用， "卤素"指？、 Cl、 Br、 和 I。 更佳地， 卤原子选自 F、 C1和

Br。 如本文所用， "垸基 "包括直链或支链的垸基。 优选的垸基是 C1-C4垸基， 例如甲基、 乙基、 丙基、 异丙基、 丁基、 异丁基、 叔丁基等。 如本文所用， "氘代"指化合物或基团中的一个或多个氢被氘� ��取代。 氘代 可以是一取代、 二取代、 多取代或全取代。 术语 "一个或多个氘代的"与 "一次 或多次氘代" 可互换使用。 在另一优选例中，氘在氘取代位置的氘同位素 含量是大于天然氘同位素含量

(0.015%),更佳地大于 50%，更佳地大于 75%，更佳地大于 95%，更佳地大于 97%， 更佳地大于 99%， 更佳地大于 99.5%。

在另一优选例中， 式 (I)化合物至少含有 1个氘原子， 更佳地 3个氘原子， 更 佳地 5个氘原子。

如本文所用， 术语 "化合物 CM4306"指化合物 4-(4-(3-(4-氯 -3- (三氟甲基)苯 基]酰脲) -苯氧基) -N-甲基吡啶酰胺。

如本文所用， 术语 "化合物 CM4307"指化合物 4-(4-(3-(4-氯 -3- (三氟甲基)苯 基]酰脲) -苯氧基) -2-( N-1 ', Ι ', Ι，-三氘代甲基)吡啶酰胺。

如本文所用， 术语 "化合物 CM4308 "指化合物 4-(4-(3-(4-氯 -3- (三氟甲基)苯 基]酰脲) -3-氟-苯氧基) -N-甲基吡啶酰胺。

如本文所用， 术语 "化合物 CM4309"指化合物 4-(4-(3-(4-氯 -3- (三氟甲基)苯 基]酰脲) -3-氟-苯氧基) -2-( N-l，，r，r-三氘代甲基)吡啶酰胺。

如本文所用， 术语 " TsOH"表示对甲苯磺酸。 因此， CM4307 · TsOH表示 化合物 CM4307的对甲苯磺酸盐。 CM4309 * TsOH表示化合物 CM4309的对甲苯磺 酸盐。 氘代二苯基脲

在本发明的优选的氘

(I)

式中：

X 是 Ν或者 Ν ⁺ -Ο—；

R ¹ 是卤素 (如 F，C1或 Br)， 一个或多个氘代的或全氘代的 C1-C4垸基；

R ² 是未氘代的、 一个或多个氘代的或全氘代的 C1-C4垸基， 或者部分或全 部卤素取代的 C1-C4垸基；

R ³ 、 R R ⁵ 、 R ⁸ 、 R ⁹ 、 R ^1Q 、 R"、 R ¹² 、 R ¹³ 、 R ¹⁴ 分别是氢、 氘、 或卤素 (如

F，C1，或 Br);

R ⁶ 是氢、 氘、 或一个或多个氘代的或全氘代的 C1-C4垸基；

R ⁷ 是氢、 氘、 或一个或多个氘代的或全氘代的 C1-C4垸基； 附加条件是 R ² 、 R ³ 、 R R ⁵ 、 R ⁶ 、 R ⁷ 、 R ⁸ 、 R ⁹ 、 R ^1Q 、 R ^l R ¹² 、 R ¹³ 或 R ¹⁴ 中至少一个是氘代的或氘。

在另一优选例中，氘在氘取代位置的氘同位素 含量至少是大于天然氘同位素 含量 (0.015%)， 较佳地大于 30%， 更佳地大于 50%， 更佳地大于 75%， 更佳地大 于 95%， 更佳地大于 99%。

在另一优选例中， 式 (I)化合物中的除 H之外的其他元素 (如 N、 C、 O、 F等) 全部或基本上 (>99wt%)为丰度最高的天然存在的元素，例如 ¹⁴ N、 ¹² C：、 ¹⁶ O和 ¹⁹ F。

在另一优选例中， 式 (I)化合物至少含有 1个氘原子， 更佳地 3个氘原子， 更 佳地 5个氘原子。

在另一优选例中， R ¹ 选自卤素； 更佳的是氯；

在另一优选例中， R ² 是三氟甲基；

在另一优选例中， R ⁶ 或 R ⁷ 分别独立地选自： 氢、 氘、 氘代的甲基、 或氘代 的乙基； 更佳地， 选自一氘甲基、 二氘甲基、 三氘甲基、 一氘乙基、 二氘乙基、 三氘乙基、 四氘乙基、 或五氘乙基。

在另一优选例中， R ⁶ 或 R ⁷ 分别独立地选自： 氢、 甲基或三氘甲基。

在另一优选例中， R ³ 、 R ⁴ 或 R ⁵ 分别独立地选自： 氢或氘。

在另一优选例中， R ⁸ 、 R ⁹ 、 R ^1Q 或 R ^{1 1} 分别独立地选自： 氢或氘。

在另一优选例中， R ¹² 、 R ¹³ 或 R ¹⁴ 分别独立地选自： 氢或氘。

在另一优选例中， 所述化合物是选自下组的优选化合物：

N-(4-氯 -3- (三氟甲基)苯基) -Ν，-(4-(2-(Ν-Γ，Γ，Γ-三氘甲基氨基甲酰基 )-4-吡 啶基氧)苯基)脲；

4-(4-(3-(4-氯 -3- (三氟甲基） 苯基)脲基)苯氧基 )-2-(Ν-Γ，Γ，Γ-三氘甲基氨基 甲酰基)吡啶 -1-氧化物；

Ν-(4-氯 -3- (三氟甲基)苯基) -Ν，-(2，6-二氘 -4-(2-(Ν-Γ，Γ，Γ-三氘甲基氨基甲酰 基) -4-吡啶基氧)苯基)脲；

N-(4-氯 -3- (三氟甲基）苯基) -N，-(4-(2-氘 -6-(Ν-Γ，Γ，Γ-三氘甲基氨基甲酰 基) -4-吡啶基氧)苯基)脲；

或 Ν-(4-氯 -3- (三氘甲基)苯基) -Ν，-(4-(2-(Ν-Γ，Γ，Γ-三氘甲基氨基甲酰基 )-4- 吡啶基氧)苯基)脲；

或 4-(4-(3-(4-氯 -3- (三氟甲基)苯基]酰脲) -3-氟-苯氧基) -2-( N-l，，r，r-三氘代甲 基)吡啶酰胺。

中间体

如本文所用， 术语"本发明的中间体"指 N-(l，l，l-三氘代甲基)苯并丁二酰亚

该中间体也可称为 "氘代甲基邻苯二甲酰亚胺" 。

上式化合物中的除 H之外的其他元素 (如 N、C、O等)全部或基本上 (>99wt%) 为丰度最高的天然存在的元素， 例如 ¹⁴ N、 ¹² C和 ¹⁶ O。

制备方法 下面更具体地描述本发明中间体以及式 ω结构化合物的制备方法， 但这些具 体方法不对本发明构成任何限制。 本发明化合物还可以任选将在本说明书中描述 的或本领域已知的各种合成方法组合起来而方 便的制得， 这样的组合可由本发明 所属领域的技术人员容易的进行。

本发明使用的未氘代的 ω-二苯基脲及其生理上相容的盐的制备方法是 已知 的。对应氘代的 ω-二苯基脲的制备可以用相应的氘代起始化合 物为原料，用同样 的路线合成。 例如， 本发明式 (I)化合物可按 WO 2000/042012中所述的制备方法 制备， 不同点在于在反应中用于氘代的原料代替非氘 代的原料。

通常， 在制备流程中， 各反应通常在惰性溶剂中， 在室温至回流温度 (如 0°C -80 °C , 优选 0°C -50°C)下进行。 反应时间通常为 0.1小时 -60小时， 较佳地为 0.5-48 小时。

以化合 CM4307为例， 一种特别优选的制备流程如下：

此外， 用化合物 3-氟 -4-氨基-苯酚替换化合物 4， 采用上述合成路线， 可制 得 CM4309。

氘代可以通过氘代甲胺引入的。

可通过以下反应得到氘代甲胺或其盐酸盐。 硝基甲垸在碱 (氢化钠、 氢化钾、 氘代氢氧化钠、 氘代氢氧化钾、 碳酸钾等)， 或在相转移催化剂下， 和氘水反应 得到氘代硝基甲垸， 如有必要， 重复上述实验， 以得到高纯度的氘代硝基甲垸。 氘代硝基甲垸还原， 如锌粉、镁粉、铁或镍等作用下， 得到氘代甲胺或其盐酸盐。

D ₂ 0 还原

CH-,ΝΟ· 2 *- CD ₃ N0 ₂ CD ₃ NH ₂ -HCI 或 CD ₃ NH ₂ 再者可以通过以下反应得到氘代甲胺或其盐酸 盐。

TsCI

CD3OD - CD ₃ OTs CD ₃ NH ₂ -HCI 或 CD ₃ NH ₂

关键中间体 3也可以通过如下方法从氘代甲醇合成。

3

其具体合成方法在实施例 1中有详细的说明。 本发明的主要优点包括：

(1) 通过改进工艺，可更高效地和高纯度地制得中 间体 N-(l，l，l-三氘代甲基) 苯并丁二酰亚胺， 有助于后续反应。

(2) 通过本发明中间体， 可以方便高效地制备多种氘代二苯基脲。

(3) 反应条件更加温和， 操作过程更为安全。 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件， 或按照制造厂商所建议的条件。 除非另外说明， 否则份数和 百分比为重量份和重量百分比。 中间体制备例 1

(1)合成中间体 7V-(1,1,1-三氘代甲基)苯并丁二酰亚胺

1： 4-甲基苯磺酸 -(1,1,1-三氘代甲基)酯的制备

将氢氧化钠（180g， 4.5 mol， 5.0eq)加入到水 (288 mL)中， 在 0°C下， 加入氘 代甲醇 (32.4g， 900mmol， l .Oeq),并缓慢滴加对甲苯磺酰氯 (206 g，l .l mmol， 1.2eq) 的四氢呋喃 (288 mL)溶液。 升至室温搅拌过夜。 在 25°C以下滴加醋酸 (206 g)中和 至中性， 对反应混合物进行过滤， 分液， 水层用乙酸乙酯 (100 mL)萃取， 滤饼用 水 (300 mL)溶解， 并用乙酸乙酯萃取 (200 mL)并有机相， 用饱和碳酸钠 (100 mL) 洗涤， 用饱和食盐水 (100 mL)洗涤， 有机相无水硫酸钠干燥， 过滤， 减压除去溶 剂， 得到标题化合物， 为浅黄色液体 160.5 g， 纯度 99%， 收率 94%。

1H NMR(CDC1 ₃ ， 400 MHz): δ 3.20 (s, 3H), 7.71-7.75(m, 2H), 7.84-7.88(m,

2H).

2： N-(l,l,l-三氘代甲基)苯并丁二酰亚胺的制备

将邻苯二甲酰亚胺钾盐（166.7 g， 0.9 mol, 2.0eq)加入至 N， N-二甲基甲酰胺 (DMF, 225 mL)中，室温下滴加上一步骤制备的 4-甲基苯磺酸 -(1，1，1-三氘代甲基) 酯 (85.2 g， 0.45 mmol, l .Oeq),在 60°C下搅拌 0.5小时。趁热过滤，滤饼用 DMF(250 mL)洗涤， 过滤取出滤饼， 再次用 DMF(lOO mL)洗涤， 合并 DMF溶液， 在 0 °C 下， 滴加水 (1150 mL)， 析出白色固体， 过滤， 并用水 (100 mLX 2)洗涤， 真空干 燥得到标题化合物， 为白色固体 66g， 纯度 99.6%， 收率 88%。

1H NMR(CDC1 ₃ ， 400 MHz): δ 7.71-7.77(m, 2H), 7.84-7.88(m, 2H).

3： 1,1,1-三氘代甲胺盐酸盐的制备

在室温下， 将 N-(l，l，l-三氘代甲基)苯并丁二酰亚胺 (82g， 0.5mol， leq)加入 至蒸馏水 (625 mL)与浓盐酸 (625mL， 7.5mol， 15eq)的混合液中， 升温至 105度 回流过夜。 冷却至室温， 过滤， 并用蒸馏水洗涤 (50 mLX 2)， 减压除去盐酸， 得 到淡黄色固体， 加入无水乙醇 (140 mL)， 回流 1小时， 冷却至室温， 过滤， 并用 乙醇 (30mL)洗涤，滤饼真空干燥得到标题化合物， 为白色固体 28 g，纯度 >99.5%， 收率 80%。

1H NM (DMSO-d6, 400 MHz): δ 8.05(br, 2H). 中间体制备例 2 亚胺

1： N-(l,l,l-三氘代甲基)苯并丁二酰亚胺的制备

重复实施例 1 的步骤 2， 不同点在于： 用邻苯二甲酰亚胺 (5.9g， 40mmol， 2.0eq)替换邻苯二甲酰亚胺钾盐， 并且在 0°C下分批加入氢氧化钾固体 (2.2g， 40mmol， 2.0eq)， 搅拌 30分钟后，滴加 4-甲基苯磺酸 -(1，1，1-三氘代甲基)酯 (3.8g， 20mmol， l .Oeq)的 DMF(lOmL)溶液， 滴加完毕升温至 60°C搅拌 30分钟。 相同方 法进行过滤、 洗涤和真空干燥， 得到标题化合物， 为白色固体， 2.1g， 纯度 81%， 收率约 62%。

中间体制备例 3

1： N-(l,l,l-三氘代甲基)苯并丁二酰亚胺的制备

重复实施例 1的步骤 2，不同点在于：用邻苯二甲酰亚胺 (5.9g，40mmol，2.0eq) 替换邻苯二甲酰亚胺钾盐， 并且在 0°C下分批加入氢化钠 (80%， 1.2g， 40mmol， 2.0eq)， 搅拌 30分钟后， 滴加 4-甲基苯磺酸 -(1，1，1-三氘代甲基)酯 (3.8g， 20mmol, l .Oeq)的 DMF(lOmL)溶液，滴加完毕升温至 60°C搅拌 30分钟。相同方法进行过滤、 洗涤和真空干燥， 得到标题化合物， 为白色固体， 2.7g， 纯度 86%， 收率 80%。

从上述实验可以看出， 上述 3种方法都可制得新的中间体 N-(l，l，l-三氘代甲 基)苯并丁二酰亚胺。 然而， 采用邻苯二甲酰亚胺钾盐作为中间体， 与采用邻苯 二甲酰亚胺 +氢氧化钾或氢化钠的生产工艺相比，一方面� �以更高效地和高纯度 地获得 N-(l，l，l-三氘代甲基)苯并丁二酰亚胺， 有助于后续反应； 另一方面， 由于 不使用氢化钠， 导致反应条件更加温和， 操作过程更为安全。

对于中间体制备例 1的步骤 3而言， 由于采用了高纯度的 N-(l，l，l-三氘代甲 基）苯并丁二酰亚胺， 因此可以获得高纯度的 1，1，1-三氘代甲胺盐酸盐（纯度 实施例 1 : ^(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)-^-(4-(2-(^1，,1，,1，-三 氘甲基氨基甲酰 基) _ ⁴ _吡啶基氧)苯基)脲 (化合物 CM ⁴ 307)

1、 4-氯吡啶-2-^-1，,1，,1，-三氘代甲基)甲酰胺(3)� ��制备

在配有尾气处理装置的 250 mL单颈圆底烧瓶中， 加入氯化亚砜 (60 mL)， 维 持温度在 40〜50°C之间， 向其中缓慢的滴加无水 DMF(2 mL)， 滴加完毕后，继续 搅拌 10分钟， 在 20分钟内向其中分批加入烟酸 (20 g， 162.6 mmol) , 溶液的颜 色逐渐由绿色转变为浅紫色。 将温度升到 72°C， 搅拌回流 16小时， 产生大量的 固体沉淀物。 冷却到室温， 用甲苯 (100 mL)稀释， 浓缩至近干， 然后再用甲苯稀 释， 浓缩至干。 过滤， 用甲苯洗涤， 得到淡黄色的 3-氯 -吡啶 -2-甲酰氯固体。 冰 浴下将此固体慢慢的加入到氘代甲胺的四氢呋 喃饱和溶液中，维持温度低于 5 °C， 继续搅拌 5小时。 浓缩， 加乙酸乙酯， 析出白色固体， 滤除， 滤液用饱和食盐水 洗涤， 无水硫酸钠干燥， 浓缩至干， 得到淡黄色的 4-氯吡啶 -2-(N- l，，r，r-三氘代 甲基)甲酰胺 (3) (20.68 g)， 收率 73%。

1H NM (CDC1 ₃ , 300 MHz): 8.37 (d, 1H)， 8.13 (s, 1H)， 7.96(br, 1H)， 7.37(d,

1H). 2、 4-(4-氨苯氧基)-2-吡啶-(^-1，,1，,1，-三氘代甲� �)甲酰胺(5)的制备

向 100 mL干燥的无水 DMF中依次加入对氨基苯酚 (9.54 g， 0.087 mol)，叔丁 醇钾（10.3 g， 0.092 mol)， 溶液变成深褐色， 室温下搅拌 2小时后， 向其中加入 4- 氯吡啶 -2-(N- l，，r，r-三氘代甲基)甲酰胺 (3)(13.68 g， 0.079 mol)，无水碳酸钾 (6.5 g， 0.0467 mol) , 将反应液温度升到 80°C后继续搅拌过夜。 TLC检测反应完毕， 冷 却到室温，将反应液倒入乙酸乙酯 (150 mL)和饱和食盐水 (150 mL)的混和溶液中， 搅拌分层， 静置后分液， 水层用乙酸乙酯萃取 (100 mLx3)， 合并萃取液， 用饱和 水洗涤 (100 mLx3)， 无水硫酸钠干燥， 浓缩， 得到淡黄色的 4-(4-氨苯氧基) -2-吡 啶 -(N- l，，r，r-三氘代甲基)甲酰胺 (18.00 g)， 收率 92%。

1H NM (CDC1 ₃ , 300 MHz): 8.32 (d, 1H)， 7.99 (br, 1H)， 7.66 (s, 1H)， 6.91— 6.85 (m, 3H), 6.69 (m, 2H), 3.70 (br, s， 2H).

3、 N-(4-氯 -3- (三氟甲基)苯基) -Ν，-(4-(2-(Ν-1，,1，,1，-三氘甲基氨基甲酰基) -4- 吡啶基氧)苯基)脲 (CM4307)的制备

向 120 mL二氯甲垸中加入 5-氨基 -2-氯 -三氟甲基苯（15.39 g， 78.69 mol) , NN'-羰基二咪唑 (CDI)(13.55 g， 83.6 mmol) , 室温搅拌 16小时后， 向其中缓慢的 滴加 4-(4-氨苯氧基) -2-吡啶 -(N- l，，r，r-三氘代甲基）甲酰胺 (18 g， 73 mmol)的二氯 甲垸 (180 mL)溶液， 室温下继续搅拌 18小时。 TLC检测反应完毕， 旋去部分二 氯甲垸溶剂至 100 mL左右， 室温放置数小时， 有大量白色固体析出， 抽滤， 固 体用大量二氯甲垸洗涤。 滤液浓缩去除部分溶剂后， 又析出部分固体， 合并两次 固体， 用大量二氯甲垸再次洗涤， 得到白色粉状的 Ν-(4-氯 -3- (三氟甲基)苯 基) - _Ν ，-(4-(2-(Ν- Γ，Γ，Γ-三氘甲基氨基甲酰基 )-4-吡啶基氧)苯基)脲 CM4307纯品 (20.04 g) , 收率 58%。

1H NMR (CD ₃ OD， 300 MHz): 8.48 (d, 1H)， 8.00 (d, 1H)， 7.55 (m, 5H)， 7.12 (d,

1H)， 7.08 (s, 2H), ESI-H MS m/z: C21H13D3C1F3N4O3, Calcd. 467.1 1 , Found 490.07 (M+Na) ⁺ .

另外， 可将化合物 CM4307溶于二氯甲垸中， 与间氯过氧苯甲酸进行反应， 制得相应的氧化产物： 4-(4-(3-(4-氯 -3-(三氟甲基） 苯基）脲基）苯氧 基) -2-(Ν- Γ，Γ，Γ-三氘 实施例 2: 4-氯吡啶-2-(^-1，,1，,1，-三氘代甲基)甲酰胺(3) 的制备 ₃

3 a) 将邻苯二甲酰亚胺（14.7g， O. lmol), 氘代甲醇 (3.78g， 0.105mol， 1.05eq)， 三苯 基膦 (28.8g， O. l lmol, l . l eq)溶于无水四氢呋喃中， 冰浴下滴加 DEAD(l . leq)的四 氢呋喃溶液， 滴加完毕后室温搅拌一小时。 过柱提纯， 或者溶剂旋干后， 加适量 DCM 于冰箱冷冻析出固体后过滤， 滤液旋干， 再快速过柱， 得纯品氘代甲基邻 苯二甲酰亚胺 14.8g。 收率 90%。

上述工艺虽然可制备本发明中间体， 反应后产物纯度较低， 需要过柱纯化， 后处理过程繁锁， 三苯基膦和偶氮二甲酸二乙酯 (DEAD)等试剂等对环境不友好， 因此不适合工业化生产。

b) 氘代甲基邻苯二甲酰亚胺（12.5g， 0.077mol)溶于适量盐酸 (6N， 50ml)中， 于封管中回流 24-30小时， 反应液冷却至室温后， 置于冰箱中冷却到零度以下， 过滤析出的固体， 用冷的去离子水洗涤， 收集滤液， 旋蒸除水并干燥得到氘代甲 胺盐酸盐。 加入无水 DCM(l OOml)于氘代甲胺盐酸盐中， 并加入 4-氯烟酸甲酯盐 酸盐 (6.52g， 0.038mol， 0.5 eq)， 碳酸钠（12.2g， 0.12mol， 1.5eq)， 反应瓶密封， 置于 冰箱中反应一天。 TLC检测反应， 完毕后水洗， 干燥， 浓缩， 过柱提纯。 得化合 物 4-氯吡啶 -2-(N- l，，r，r-三氘代甲基)甲酰胺 (3)，5.67g， 收率 86% 。其结构特征与 实施例 1一致。 实施例 3

通过中间体 7V-(1,1,1-三氘代甲基)苯并丁二酰亚胺合成二苯� ��脲化合物

CM4307

1: 4-氯吡啶-2-(^-1，,1，,1，-三氘代甲基)酰胺 2的制备

将 4-氯 -2-吡啶甲酸甲酯 (50g， 291 mmol, leq)置入盛有 250mL四氢呋喃的三 口瓶中， 搅拌并加入 1，1，1-三氘代甲胺盐酸盐 (31g， 437mmol, 1.5eq)， 400目的无 水碳酸钾 (80g， 583mmol， 2eq), 室温搅拌 20小时后加入水 (250mL)和甲基叔丁基 醚 (150mL)， 搅拌分层， 分液， 水相用甲基叔丁基醚萃取 (100mL)， 合并有机相并 加入无水硫酸钠干燥并过滤， 减压除去溶剂得到浅黄色液体 48g， 纯度 99%， 收 率 96%。

1H NM (DMSO-d6, 400 MHz): δ 7.64(dd, J = 2Hz, 5.2Hz, 1H)， 7.97(d, J = 1.6Hz, 1H)， 8.54(d, J = 5.2Hz, 1H)， 8.74(br, 1H).

MS (ESI, m/z) calcd. for C ₇ H ₄ D ₃ ClN ₂ O: 173, found： 174 [M +H]+

2: 4-(4-氨苯氧基) - 2-吡啶-( 1，,1，,1，-三氘代甲基)酰胺 3制备

在氮气保护下，将 4-氯吡啶 -2-(N-l，，r，r-三氘代甲基)酰胺 (2.4 g， 13.8 mmol, 169)溶于二甲亚砜（1011^)， 加入 4-氨基苯酚（1.6 g， 14.9 mmol, 1.08eq)， 再分批 加入叔丁醇钾（1.7 g， 15.2 mmol, l . leq), 待内温稳定后， 升温并保持内温 80°C反 应 4小时。 降至室温加入异丙醇 (10mL)搅拌稀释反应液， 在氮气保护下滴加浓盐 酸 (37%， 10mL), 搅拌 1小时后过滤。取出固体溶入水 (20 mL)， 加入活性炭 (0.1g)， 搅拌 1小时， 过滤， 向滤液中缓慢滴加碳酸钾溶液 (2g碳酸钾溶于 6mL水)， 观察到 固体析出， 过滤并用水 (5mL)洗涤， 真空干燥得到淡棕色晶体 2.7g， 纯度 99.9%， 收率 78%。

1H NM (DMSO-d6, 400 MHz): δ 5.19(br, 2H), 6.66-6.68(m, 2H), 6.86-6.88(m, 2H), 7.07(dd, J = 2.8Hz, 5.6Hz, 1H)， 7.36(d, J = 2.8Hz, 1H)， 8.45(d, J = 5.6Hz, 1H)， 8.72(br, 1H). MS (ESI, m/z) calcd. for C ₁₃ H ₁₀ D ₃ N ₃ O ₂ C1: 246, found： 247[M +H] ⁺ 3: 4-(4-(3-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基】酰脲)-苯氧基)-2 -( 1，,1，,1，-三氘代甲基) 吡啶酰胺 CM4307的制备

在氮气保护下， 将 4-(4-氨苯氧基) - 2-吡啶 -(Ν-Γ，Γ，Γ-三氘代甲基)酰胺 (2.6g， 10.6 mmol, leq)溶于二氯甲垸 (10 mL)与二甲亚砜 (3 mL)中， 室温下并将 4-氯 -3- 三氟甲基苯基异氰酸酯 (2.5 g， l l . lmol, 1.05eq)的二氯甲垸 (8mL)溶液滴加至上 述溶液， 搅拌 20分钟。 降温至 2°C， 并滴加水 (10mL)， 搅拌 0.5小时， 过滤， 并用 二氯甲垸（10mL)洗涤产品， 真空干燥得到类白色固体 4.7g， 纯度 99.8%， 收率 95.4%。

1H NM (DMSO-d6， 400 MHz): δ 7.15(dd, J = 2.8Hz, 5.6Hz, 1H)，

7.17-7.19(m,2H), 7.40(d, J = 2.4Hz, 1H)， 7.59-7.69(m, 4H)， 8.13(d, J = 2.4Hz, 1H)， 8.51(d, J = 6Hz， 1H)， 8.75(br, 1H)， 8.90(br, 1H)， 9.22(br, 1H).

MS (ESI, m/z) calcd. for C ₂₁ H ₁₃ D ₃ ClF ₃ N ₄ O ₃ : 467， found： 468[M +H]+ 实施例 4

4-(4-(3-(4-氯 -3- (三氟甲基)苯基】酰脲) -苯氧基) -2-( 7V-1，,1，,1，-三氘代甲基)吡 啶酰胺对甲苯磺酸盐 (CM4307 · TsOH)的制备

将对甲苯磺酸一水合物（1.6g， 8.5mmol， 0.88eq)溶解于无水乙醇 (5mL)中， 过滤， 并升温至 70 °C并保温暂存待用。 将 4-(4-(3-(4-氯 -3- (三氟甲基)苯基]酰脲) - 苯氧基 )-2-( Ν-Γ，Γ，Γ-三氘代甲基)吡啶酰胺 (4.5 g， 9.6mol， leq)和对甲苯磺酸一 水合物 (0.66g， 3.5mmol, 0.36eq)悬浮于乙醇 (50mL)中， 升至内温 78°C回流 40分 钟， 观察到固体全部溶解， 稍降温后趁热过滤， 将滤液升至内温 78°C使溶液重新 回流 1小时， 使之重新全部溶解澄清， 将前述 70°C的无水乙醇溶液通过快速一次 性加入至澄清溶液中， 停止加热并自然降温并在 (TC下搅拌 0.5小时， 过滤， 用无 水乙醇 (5mL X 2)洗涤， 50°C真空干燥 24小时， 得到白色至类白色固体 5.8g， 纯度 99.3%, 收率 93%。

1H NM (DMSO-d6, 400 MHz): δ 2.30(s, 3H), 7.15(d, J = 8.8Hz, 2H), 7.20(d, J = 8.8Hz, 2H), 7.23(dd, J = 2.8Hz, 6Hz， 1H)， 7.52(d, J = 8Hz， 2H), 7.55(d, J = 2.8Hz, 1H)， 7.63(d, J = 8.8Hz, 3H), 7.68(dd, J = 2.4Hz, 9.2Hz, 1H)， 8.03(br, 1H)， 8.14(d, J = 2.4Hz, 1H)， 8.56(d, J = 6Hz， 1H)， 8.91(br, 1H)， 9.17(br, 1H)， 9.36(br, 1H). ¹³ C NM (DMSO-d6, 400 MHz): δ 21.1, 26.1, 1 1 1.7, 1 15.2, 1 17.0, 120.7(2C), 121.6 (2C), 121.9, 122.8, 123.2, 124.6, 125.6 (2C), 127.2, 129.0(2C), 132.3, 138.8, 139.5, 139.9, 144.1, 146.6, 147.2, 152.8, 159.9, 170.7 ppm.

液相条件： Agilent 1 100 Series; 色谱柱： Synergi 4 μ POLA - P 80A, 250 X 4.6 mm, 4 μ m; 柱温： 25 °C ; 检测波长： UV 210 nm; 流动相： A: 磷酸二氢铵 10 mmol/L, B : 甲醇； 进样量： 10 L; 流速： 0.8 mL/min; 分析时间： 70min; 梯度程序： 0至 15分钟 50% 流动相 B， 15至 32分钟流动相 B增加到 75%， 然后 32 至 55分钟 75%流动相 B洗脱 23分钟。 保留时间： 4.95min(对甲苯磺酸)； 47.1 1min(CM4307)。 实施例 5

通过中间体 Ν-(ί,ί,ί- ：氘代甲基)苯并丁二酰亚胺合成二苯基脲化� �物 CM4309

CM4309

1: 4-氯吡啶-2-(^-1，,1，,1，-三氘代甲基)酰胺 2的制备

制备方法同实施例 3。

2： 4-(4-氨基 -3-氟-苯氧基) -吡啶 -2-^-1，,1，,1，-三氘代甲基)酰胺 B1的制备 将叔丁醇钾（15g， 130mmol， 1.3eq)置入盛有 N， N-二甲基乙酰胺 (DMA, 50mL) 的溶液中， 在 0〜5度下缓慢滴加 3-氟 -4-氨基 -苯酚（16g， 127mmol， 1.3eq)的 DMA(50mL)溶液， 在室温下搅拌 20分钟， 升温至 100 °C并缓慢滴加 4-氯吡啶 -2-(N-r，l，，r-三氘代甲基)酰胺 3(17g， 97mmol, leq)的 DMA(50mL)， 滴加完毕后 继续搅拌 0.5小时， 冷却至室温， 向反应液中加入乙酸乙酯 (1.5L)稀释并搅拌 0.5 小时， 过滤除去无机盐， 用水洗涤 (500mL X 3)， 无水硫酸钠干燥， 减压除去溶剂， 向粗品中加入乙醇 (100mL)并回流打浆 2小时，冷却至室温过滤得到褐色固体 20g， HPLC纯度 96%， 收率 80%。

1H NM (CD ₃ OD-d4, 400 MHz): δ 6.74-6.77(m, 1H)， 6.87(dd, J = 2.4Hz, 1 1.6Hz, 1H)， 6.93(t, J = 10Hz, 1H)， 7.02(dd, J = 2.8Hz, 6Hz， 1H)， 7.54(d, J = 2.4Hz, 1H)， 8.44(d, J = 6Hz, 1H). MS (ESI, m/z) calcd. for C ₁₃ H ₉ D ₃ ClN ₃ O2: 264, found： 265 [M +H] ⁺ 3： 4-(4-(3-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基】酰脲)-3-氟-苯氧 基)-2-( -1，,1，,1，-三氘代 甲基)吡啶酰胺 CM4309的制备

在室温下， 将 4-氯 -3-三氟甲基苯基异氰酸酯 (13g， 58mmol， 1. l eq)置入盛有 二氯甲垸 (70mL)的单口瓶中，并将 4-(4-氨基 -3-氟-苯氧基) -吡啶 -2-(Ν- Γ，Γ，Γ-三氘 代甲基)酰胺 (14g， 53mmol， leq)的二氯甲垸 (350mL)溶液缓慢滴加至上述溶液中， 室温搅拌 20小时， 反应完毕过滤并用二氯甲垸 (20mL X 2)洗涤， 得到浅褐色固体 13g, 纯度 98%， 收率 50%。

1H NM (DMSO-d6, 400 MHz): δ 7.06-7.10(m, 1H)， 7.19(dd, J = 2.4Hz, 5.6Hz, 1H)， 7.35(dd, J = 2.8Hz, 12Hz, 1H)， 7.43(d, J = 2.4Hz, 1H)， 7.63(m, 2H), 8.14(br, 1H)， 8.17(t, J = 8.8Hz, 1H)， 8.53(d, J = 5.6Hz, 1H)， 8.75(d, J = 1.6Hz, 1H)， 8.78(br, 1H), 9.54(br, 1H).

MS (ESI, m/z) calcd. for C ₂₁ H ₁₂ D ₃ ClF ₄ N4O ₃ :485， found： 486 [M +H]+ 实施例 6

⁴ -( ⁴ -(3-( ⁴ _氯 -3- (三氟甲基)苯基】酰脲) -3-氟-苯氧基) - ² -( 7V-1，,1，,1，-三氘代甲 基)吡啶酰胺对甲苯磺酸盐 (CM4309 · TsOH)的制备

将 4-(4-(3-(4-氯 -3- (三氟甲基)苯基]酰脲) -3-氟-苯氧基) -2-( Ν- Γ，Γ，Γ-三氘代 甲基)吡啶酰胺 (2.16 g， 4.33 mmol, leq)悬浮于乙醇 (50 mL)中， 加热回流至溶液 澄清， 趁热过滤除去不溶物后， 将滤液加热回流溶清， 一次性快速加入甲磺酸 (70% , 8.66mmol, lmL, 2 eq)， 澄清液保持 0.5分钟左右， 关掉油浴自然冷却至 室温， 搅拌 1小时， 过滤得到不溶物， 50度真空干燥 20小时， 得到白色晶体 2.36g， 收率为 83%。

1H NM (DMSO-d6, 400 MHz): δ 2.30(s, 3H), 7.09-7.14(m, 3H), 7.24(dd, J = 2.4Hz, 5.2Hz, 1H), 7.37(dd, J = 2.4Hz, 1 1.6Hz, 1H), 7.48-7.50(m, 3H), 7.61 -7.66(m, 2H), 8.15-8.19(m, 2H), 8.56(d, J = 5.6Hz, 1H)， 8.79(br, 1H)， 8.85(br, 1H)， 9.56(br, 1H)， 10.38(br, 1H).

熔点： 240.7 °C〜241 °C 实施例 7 化合物 N-(4-氯 -3- (三氟甲基)苯基) -N，-(2，6-二氘 -4-(2-(Ν- Γ，Γ，Γ- 三氘甲基氨基甲酰基 )-4-吡锭基氧)苯基)脲的制备

按实施例 1中所述的方法， 不同点在于： 用 3， 5-二氘 -4-氨基苯酚替换对氨 基苯酚， 从而制得目标化合物。 实施例 8 化合物 N-(4-氯 -3- (三氟甲基)苯基) -N，-(4-(2-氘 -6-(Ν-Γ，Γ，Γ-三氘 甲基氨基甲酰基) -4-吡啶基氧)苯基)脲的制备

按实施例 1 中所述的方法， 不同点在于： 用 2-氘 -6-羧基吡啶替换烟酸， 从 而制得目标化合物。 实施例 9 化合物 Ν-(4-氯 -3- (三氘甲基)苯基) -Ν，-(4-(2-(Ν-Γ，Γ，Γ-三氘甲基 氨基甲酰基) -4-吡啶基氧)苯基)脲的制备：

按实施例 1中所述的方法， 不同点在于： 用 5-氨基 -2-氯-三氘甲基苯替换 5- 氨基 -2-氯-三氟甲基苯， 从而制得目标化合物。 实施例 10:

氘代二苯基脲化合物在大鼠中的药代动力学评 价

8只雄性 Sprague-Dawley大鼠， 7-8周龄， 体重约 210g， 分成 2组， 每组 4 只 (大鼠编号： 对照组为 13-16; 实验组为 9-12)， 单次口服给予 3mg/kg剂量的 (a) 对组合物： 未氘代的 N-(4-氯 -3- (三氟甲基)苯基) -N，-(4-(2-(N-甲基氨基甲酰基) -4- 吡啶基氧)苯基)脲 (对照化合物 CM4306)或 (b)实施例 1制备的 N-(4-氯 -3- (三氟甲 基)苯基) -Ν，-(4-(2-(Ν-Γ，Γ，Γ-三氘甲基氨基甲酰基 )-4-吡啶基氧)苯基)脲 （本发明 化合物 CM4307), 比较其药代动力学差异。

大鼠采用标准饲料饲养， 给予水和利眠宁。 实验的前一天晚上停止给予利眠 宁，给药后 2小时重新给予利眠宁。试验前 16小时开始禁食。药物用 30% PEG400 溶解。 眼睚采血， 采血的时间点为给药后 0.083 小时， 0.25 小时， 0.5 小时， 1 小 时， 2 小时， 4 小时， 6小时， 8小时和 24小时。

令大鼠吸入乙醚后短暂麻醉， 眼睚采集 300 uL血样于试管。 试管内有 30 ul

1% 肝素盐溶液。 使用前， 试管于 60°C烘干过夜。 在随后一个时间点血样采集完 成之后， 大鼠乙醚麻醉后处死。

血样采集后， 立即温和地颠倒试管至少 5次， 保证混合充分后放置于冰上。 血样在 4°C 5000 rpm离心 5分钟， 将血清与红细胞分离。 用移液器吸出 100 uL 血清到干净的塑料离心管中， 表明化合物的名称和时间点。 血清在进行 LC-MS 分析前保存在 -80°C。

其结果如图 1-2所示。 结果显示， CM4307比 CM4306的半衰期 T _1/2 延长 [分 别为 1 1.3 ±2.1小时和 8.6 ± 1.4小时]，曲线下面积 AUC _∞ CM4307比 CM4306显 著增加 [分别为 1 1255 ± 2472 ng'h/mL和 7328 ± 336 ng-h/mL] , CM4307比 CM4306 表观清除率减少 [分别为 275 ± 52mL/h/kg和 410 ± 18.7 mL/h/kg]。

从上面结果看出， 本发明化合物在动物体内具有更好的药物动力 学， 因而具 有更好的药效学和治理效果。

另外， 通过氘化， 本发明化合物在生物体中的代谢过程有所改变 。 特别地使 苯基上的羟化变得困难， 这导致初次通过效应 (First-pass effect)的降低。在这种情 况下， 可以改变剂量并形成长效制剂， 其也可以长效制剂的形式改善适用性。

另外， 通过氘化还改变了药物动力学作用， 因为氘代化合物完全形成另一水 合物膜， 以致在生物体中的分布明显不同于未氘代的化 合物。 实施例 11: CM4307对人肝细胞癌 SMMC-7721裸小鼠移植瘤生长抑制的 药效学评价

Balb/c nu/nu裸小鼠， 6周龄， 雌性， 70只， 购自上海试验动物资源中心 (上海 西普尔-必凯实验动物有限公司）。

SMMC-7721细胞购自中科院上海生命科学院 (上海， 中国)。

肿瘤裸鼠移植模型的建立： 收获对数生长期的 SMMC-7721细胞， 计数后将 细胞悬于 I xPBS, 调整细胞悬液浓度至 1.5x l0 ⁷ /ml。 用 lml注射器在裸鼠右侧腋下 皮下接种肿瘤细胞， 3x l0 ⁶ /0.2ml/鼠。 共接种 70只裸鼠。

在肿瘤体积达到 30-130mm ³ 时， 将动物进行随机分组， 共获得 58只动物， 使 各组肿瘤差异小于均值的 10%， 并开始给药。

试验剂量分组设置见下表：

组别 动物 化合物 给药方式 齐 ¹ J量 (mg/kg) 方案

1 10 空白对照 (溶剂） po O. lml/lOgBW qdx2周

2 8 CM4306 po 10 mg/kg qdx2周

3 8 CM4306 po 30 mg/kg qdx2周

4 8 CM4306 Po 100 mg/kg qdx2周

5 8 CM4307 po 10 mg/kg qdx2周

6 8 CM4307 po 30 mg/kg qdx2周

7 8 CM4307 po 100 mg/kg qdx2周 试验期间每周测定两次动物体重和肿瘤大小。 每日观察记录临床症状。 给药 结束时， 拍照记录肿瘤大小。 每组处死一只小鼠取肿瘤组织， 固定于 4%多聚甲 醛。 给药结束后， 继续观察， 当肿瘤均值大于 2000mm ³ ， 或动物出现濒死状态时， 处死动物， 做大体解剖， 取肿瘤组织固定于 4%多聚甲醛。

肿瘤体积 (Tumor volume, TV)的计算公式为： TV=axb ² /2。 其中 a、 b分别代 表肿瘤测量长和宽。 相对肿瘤体积 (relative tumor volume, RTV)计算公式为： TV=Vt/V 其中 V _Q 为分组给药时的肿瘤体积， Vt为测量时的肿瘤体重。 抗肿瘤 活 性 的 评 价 指 标 为 相 对 肿 瘤 增 值 率 T/C(%) ， 计 算 公 式 为 ： T/C(%)=(T _RTV /C _RTV )xl00%。 T _RTV 为治疗组 RTV， C _RTV 为阴性对照组 RTV。

疗效评价标准：相对肿瘤增值率 T/C(%)≤ 40%并经统计学分析 p<0.05为有效。 结果如图 3所示。 CM4306和 CM4307单剂量 10、 30、 100mg/kg 每日灌胃给药 连续 2周， 两个化合物均表现剂量依赖性的抑制肿瘤生长 作用。 给药结束时， CM4306的 T/C%分别为 56.9%、 40.6%和 32.2%。 CM4307的 17(3(%)分别为 53.6%、 40.8%和 19.6%。 其中 100mg/kg剂量组的 17 %均<40%， 肿瘤体积与对照组比较有 显著差异 (p<0.01)，表现显著的抑制肿瘤生长的作用。

CM4307的高剂量 100mg/kg组比 CM4306高剂量组肿瘤抑制作用强（最佳 T/C%分别为 19.6%和 32.2%，dl5)，瘤体积组间比较有显著差异 (p<0.01)。与 CM4306 相比， CM4307的抑瘤率的绝对值提高 10%以上， 相对幅度提高约 60%(32.2%/ 19.6%- 1 =64%) , 表现出更为显著的抑制肿瘤生长的作用。

此外， 试验过程中未见其他药物相关毒性反应。 实施例 12

对于 c-Kit、 PDGF -β蛋白酪氨酸激酶分子水平抑制活性

1、 实验方法

本实施例采用酶联免疫吸附法 (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)测定二苯基脲化合物对 c-Kit、 PDGFR-β蛋白酪氨酸激酶分子水平抑制活 性。 测定的化合物： CM4306、 CM4308CM4309。 主要试剂：

反应底物 Poly(Glu，Tyr) _4:1 购自 Sigma 公司； 抗磷酸化酪氨酸的单克隆抗体 PY99 购自 Santa Cmz公司；辣根过氧化物酶标记羊抗鼠的 IgG 购自 Calbiochem 公司； ATP、 DTT、 OPD 购自 Amresco 公司；酶标板购自 Corning 公司； Sul l248 购自 Merk公司。

实验方法：

参见 oskoski, ., Jr. Sunitinib: a VEGF and PDGF receptor protein kinase and angiogenesis inhibitor. Biochem Biophys Res Commun, 356: 323-328, 2007， 具体包 括：

激酶反应底物 Poly(Glu，Tyr) _{4: 1} 用无钾离子的 PBS稀释成 20 g/ml， 包被酶 标板。 在包被好酶标板孔内加入受试的二苯基脲样品 (受试样品先用 DMSO配制 成 10— ² Μ的储存液， 临用前用反应缓冲液稀释到所需浓度， 加至实验孔内， 使其 在 100 μΐ反应体系的终浓度为 10_ ⁵ mol/L)。 同时设立阳性对照孔， 加入阳性对照 化合物 Sul l248。

加入用反应缓冲液稀释的 ATP溶液 （ATP终浓度 5 μΜ)， 最后， 加入用反应 缓冲液稀释的受试酪氨酸激酶。 反应体系总体积为 100 μ1。 同时设立阴性对照孔 和无酶对照孔。

将反应体系置于湿盒内， 37°C摇床避光反应 1 h，反应结束后 T-PBS洗板三次。 加入抗体 PY99 ΙΟΟ μΙ/孔， 37°C摇床反应 30 min。 T-PBS洗板三次。 加入辣根过 氧化物酶标记的羊抗鼠的 IgG 100 μΐ/孔， 37°C摇床反应 30 min。 T-PBS洗板三 次。 加入 OPD显色液 ΙΟΟ μΙ/孔， 室温避光反应 l-10 min。 加入 2 M H ₂ SO ₄ 50 l 中止反应， 用可调波长式微孔板酶标仪 VERSAmax测 ₄₉₂ 值。

通过下列公式计算样品的抑制率：

丄 + 化合物 OD值 -无酶对照孔 OD值

抑制率％ = (1- )χ 100%

阴性对照 OD值 -无酶对照孔 OD值

2、 实验结果

以上实验结果为两次试验的均值。 3、 评价标准和结果评价

在阳性对照化合物的抑制活性符合参考范围的 前提下，受试化合物在实验浓 度 10— ⁵ mol/L下， 抑制率大于 50%判定其有效； 抑制率小于 50%判定无效。

结果显示， CM4306、 CM4308、 CM4309对蛋白酪氨酸激酶 c-Kit、 PDGF -β 的抑制率大于 50%， 故在分子水平具有显著的针对 c-Kit、 PDGFR-β酪氨酸激酶 的抑制活性。 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作 为参考，就如同每一篇文献被 单独引用作为参考那样。 此外应理解， 在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本 领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改 ，这些等价形式同样落于本申请所 附权利要求书所限定的范围。