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Title:
METHOD FOR PREPARING HIGH-PURITY RIBOFLAVIN SODIUM PHOSPHATE
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2020/056714
Kind Code:
A1
Abstract:
A method for preparing high-purity riboflavin sodium phosphate, comprising: adjusting the pH value to 5.0-7.0; controlling the solution temperature at 20-40℃, and adding an ethanol aqueous solution with a concentration of 95% (ml/ml); reducing the temperature to 3-5℃ and waiting for a solid to precipitate; filtering the solid, and drying a filter cake to obtain a pure product, the riboflavin sodium phosphate. The method is suitable for the large-scale isolation and purification of a riboflavin sodium phosphate product with a purity of at least 99% from a biological enzyme reaction liquid or biological fermentation broth.

Inventors:
GUO TAO (CN)
ZHANG QI (CN)
ZHANG DONGMIN (CN)
CHENG SHUANG (CN)
Application Number:
PCT/CN2018/106904
Publication Date:
March 26, 2020
Filing Date:
September 21, 2018
Export Citation:
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Assignee:
BONTAC BIO ENG SHENZHEN CO LTD (CN)
BONTAC INVITROLIFE BIO TECH SHENZHEN CO LTD (CN)
JIANGXI BONZYMES BIOTECHNOLOGY CO LTD (CN)
International Classes:
C07F9/6561; C07D475/14; C07F9/08
Foreign References:
CN103435651A2013-12-11
US5017700A1991-05-21
Other References:
CHIEF EDITOR: ZHAO LINXIANG, CHEMICAL PHARMACEUTICAL TECHNOLOGY (M) THE FOURTH EDITION, BEIJING: CHINA MEDICAL SCIENCE PRESS, 31 August 2015 (2015-08-31), pages 102 - 104
WEI, ZHUAN ET AL.: "Preparation of Riboflavin 5'-Phosphate Sodium from Crude Riboflavin", CHINA FOOD ADDITIVES, 15 December 2011 (2011-12-15)
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Claims:
权利要求书

[权利要求 1] 高纯度核黄素磷酸钠的制备方法, 其特征在于包括如下步骤: i) 将 核黄素磷酸钠和 /或黄素单核苷酸的粗品溶液的 pH值调节至 5.0 7.0; 2 ) 控制溶液温度为 20~40°C, 并加入占粗品溶液体积 0.5~1.5倍的浓度 为 95% (ml/ml) 的乙醇水溶液; 3) 降温至 3~5°C, 等待固体析出; 4 ) 过滤, 除去滤液, 滤饼经干燥处理后即得核黄素磷酸钠纯品。

[权利要求 2] 根据权利要求 1所述的高纯度核黄素磷酸钠的制备方法, 其特征在于

: 所述核黄素磷酸钠和 /或黄素单核苷酸的粗品溶液的浓度以核黄素 磷酸钠计为 7.5g/L以上。

[权利要求 3] 根据权利要求 1所述的高纯度核黄素磷酸钠的制备方法, 其特征在于

: 所述步骤 1) 中, 将溶液的 pH值调节为 5.5~6.5。

[权利要求 4] 根据权利要求 1所述的高纯度核黄素磷酸钠的制备方法, 其特征在于

: 所述步骤 2) 中, 加入占溶液体积 0.5~0.9倍的浓度为 95% (ml/ml) 的乙醇水溶液。

[权利要求 5] 根据权利要求 1所述的高纯度核黄素磷酸钠的制备方法, 其特征在于 , 所述步骤 3) 的降温过程按如下步骤操作: 先降温至 12~15°C, 待溶 液中的固体析出率达 40%以上后, 再降温至 3~5°C。

[权利要求 6] 根据权利要求 1所述的高纯度核黄素磷酸钠的制备方法, 其特征在于

: 所述步骤 3) 中, 待溶液中的固体析出率达 40%以上后, 再加入占 粗品溶液体积 0.3~0.5倍的浓度为 95% (ml/ml) 的乙醇水溶液。

[权利要求 7] 根据权利要求 1所述的高纯度核黄素磷酸钠的制备方法, 其特征在于

: 所述步骤 4) 中, 在干燥处理前, 用浓度为 75% (ml/ml) 的乙醇水 溶液对所述滤饼进行洗涤。

[权利要求 8] 根据权利要求 7所述的高纯度核黄素磷酸钠的制备方法, 其特征在于

: 在洗涤滤饼之前, 先用 50%乙醇水溶液对所述滤饼进行打浆, 然后 过滤收集滤饼。

[权利要求 9] 根据权利要求 1所述的高纯度核黄素磷酸钠的制备方法, 其特征在于

: 所述步骤 1) 中, 核黄素磷酸钠和 /或黄素单核苷酸的粗品溶液为生 物催化法制备黄素单核苷酸得到的粗产物溶液。

[权利要求 10] 根据权利要求 9所述的高纯度核黄素磷酸钠的制备方法, 其特征在于 , 在步骤 1) 之前, 对核黄素磷酸钠和 /或黄素单核苷酸的粗品溶液进 行如下前序处理: a) 将核黄素磷酸钠和 /或黄素单核苷酸的粗品溶液 的 pH值调节至 11.0~12.0; b) 将溶液温度升温至 40±1°C, 并于 40±1°C 温度下保持 2h; c) 除去不溶物。

[权利要求 11] 根据权利要求 10所述的高纯度核黄素磷酸钠的制备方法, 其特征在于 所述前序处理还包括将步骤 c) 获得的去除不溶物后的溶液进行预处 理的步骤, 所述预处理是指用离子交换树脂对去除不溶物后的溶液进 行纯化, 或者将去除不溶物后的溶液依次经微滤处理和超滤处理。

[权利要求 12] 根据权利要求 11所述的高纯度核黄素磷酸钠的制备方法, 其特征在于

: 所述离子交换树脂为阴离子交换树脂。

[权利要求 13] 根据权利要求 11所述的高纯度核黄素磷酸钠的制备方法, 其特征在于

: 用 0. l~0.4mol/L氯化钠水溶液作为离子交换树脂的洗脱液。

[权利要求 14] 根据权利要求 11所述的高纯度核黄素磷酸钠的制备方法, 其特征在于

: 在步骤 1) 之前, 将所述预处理后的溶液进行浓缩处理。

[权利要求 15] 根据权利要求 11所述的高纯度核黄素磷酸钠的制备方法, 其特征在于 , 通过如下方法对所述离子交换树脂进行再生处理: A、 用 2mol/L氯 化钠溶液与 0.5mol/L盐酸溶液的混合液淋洗树脂至流出液中无杂质残 留; B、 用纯化水淋洗至洗脱液的 pH值为 5.00~7.00; C、 用 0.5mol/L 氢氧化钠溶液淋洗至洗脱液呈强碱性; D、 用纯化水淋洗至洗脱液的 pH值为 9.00~10.00。

Description:
高纯度核黄素磷酸钠的制备方法 技术领域

[0001] 本发明涉及医药单体制备的技术领域, 具体涉及采用分离纯化技术制备高纯度 核黄素磷酸钠的方法。

背景技术

[0002] 核黄素磷酸钠 (Riboflavin Sodium Phosphate, 英文缩写 RSP) 是核黄素(维生 素 B2)的磷酸盐形式, 又名维生素 B2磷酸钠、 黄素单核苷酸钠、 核黄素 -5'- (二 氢磷酸酯) 单钠盐等, 其 CAS号为 130-40-5, 其结构式如下图所示。

[0004] 核黄素磷酸钠目前普遍用作核黄素补充剂, 用于治疗因核黄素缺乏弓 I起的口角 炎、 唇炎、 舌炎、 眼结膜炎及阴囊炎等疾病, 临床上常见剂型为注射剂和口服 片剂。

[0005] 目前, 国内制备核黄素磷酸钠的方法主要为化学合成 法, 其一般是以高纯度的 核黄素为起始原料, 以三氯氧磷为磷酸化试剂, 在四氢呋喃、 乙腈和吡啶等有 机溶剂的环境中发生化学反应生成黄素单核苷 酸, 黄素单核苷酸再经进一步转 化生成核黄素磷酸钠。 但是化学合成法对环境的污染较为严重, 随着国家对环 境保护的逐渐重视, 取而代之的生物催化法逐渐兴起, 其是利用生物酶催化底 物转化成黄素单核苷酸, 黄素单核苷酸再经进一步转化生成核黄素磷酸 钠, 该 方法具有产品定向转化率高、 节能环保的优点。

[0006] 无论是化学合成法还是生物催化法, 其制备得到的核黄素磷酸钠产品的纯度往 往不够高, 尚需进行进一步的分离纯化处理。 如中国发明专利文献 CN106674225 A和 CN103396452B中均公开了一种通过结晶工艺制备高 纯度核黄素磷酸钠的方 法, 但是其制备过程中需要使用大量有毒有害的有 机溶剂, 如, CN106674225A 中需要使用乙酸甲酯、 丙酮、 环己醇和甲醇, 而 CN103396452B中需要使用乙腈 、 甲醇和氯仿, 不符合可持续发展的环保理念。

发明概述

技术问题

问题的解决方案

技术解决方案

[0007] 本发明的目的在于提供一种节能环保、 成本低廉的制备高纯度核黄素磷酸钠的 新方法。

[0008] 为实现上述目的, 本发明提供了如下一种高纯度核黄素磷酸钠的 制备方法, 包 括如下步骤: 1) 将核黄素磷酸钠和 /或黄素单核苷酸的粗品溶液的 pH值调节至 5. 0-7.0; 2) 控制溶液温度为 20~40°C, 并加入占粗品溶液体积 0.5~1.5倍的浓度为 9 5% (ml/ml) 的乙醇水溶液; 3) 降温至 3~5°C, 等待固体析出; 4) 过滤, 除去 滤液, 滤饼经干燥处理后即得核黄素磷酸钠纯品。

[0009] 黄素单核苷酸 (Flavin Mononucleotide, 英文缩写 FMN) , 亦称核黄素 -5 -磷酸 , 是黄素蛋白的辅基, 对呼吸等生物氧化过程的电子传递起着重要的 作用, 即 作为黄素酶组的辅基, 以与酶蛋白 (apo— enzyme) 的结合状态, 参与电子从底 物向电子接受体传递, 在基础代谢中起重要作用, 其 CAS号为 146-17-8 , 其结构 式如下图所示。

[] [0010] 本发明方法中, 步骤 1) 的核黄素磷酸钠和 /或黄素单核苷酸的粗品溶液是指除 了含有核黄素磷酸钠和 /或黄素单核苷酸之外还含有大量杂质的溶液 包括: 将 从市场中购买的纯度不够高的核黄素磷酸钠和 /或黄素单核苷酸溶解于水后得到 的溶液, 生物催化法制备黄素单核苷酸得到的粗产物溶 液。

[0011] 优选地, 控制核黄素磷酸钠和 /或黄素单核苷酸的粗品溶液的浓度以核黄素 酸钠计为 7.5g/L以上, 以确保后期能够析出足够多的固体, 从而保证足够高的收 率。

[0012] 生物催化 (biocatalysis) 是指利用生物酶或者生物有机体 (细胞、 细胞器、 组 织等) 作为催化剂进行物质转化的过程 (分别称为酶催化和生物发酵) , 这种 反应过程又称为生物转化 (biotransformation) 。 生物催化中常用的生物有机体 主要是微生物, 其本质是利用微生物细胞内的酶进行催化, 促进生物转化的进 程。 生物催化法具有作用条件温和 (基本上在常温、 中性、 水等环境中完成)

; 独特、 高效的底物选择性 (因为催化过程中的酶具有专一性的特点, 即一种 酶只能催化一种特定的底物发生反应, 但是一种底物则可能被多种酶催化) ; 对于手性活性药物成分的合成具有独特性的优 点。

[0013] 本发明所谓生物催化法制备黄素单核苷酸得到 的粗产物溶液具体是指利用生物 酶催化底物转化成黄素单核苷酸后的酶反应液 , 或者是利用含有生物酶的生物 有机体经发酵培养和诱导表达后去除生物有机 体后的含有黄素单核苷酸的生物 发酵液。 其中所谓生物酶是指可以特异性催化底物转化 成黄素单核苷酸的酶, 所谓底物是指可以转化成黄素单核苷酸的前体 物质。 譬如, 底物可以是核黄素 和 ATP, 也可以是能够转化成核黄素和 /或 ATP的前体物质, 与之对应的生物酶 则是核黄素激酶 (EC 2.7.1.26) , 或者是核黄素激酶 (EC 2.7.1.26) 和一种或者 多种其他酶的联合使用。 又譬如, 底物还可以是核黄素和 D-葡萄糖 -1-磷酸, 或 者是能够转化成核黄素和 /或 D-葡萄糖 -1-磷酸的前体物质, 与之对应的生物酶则 是核黄素磷酸转移酶 (EC2.7.1.42) , 或者是核黄素磷酸转移酶 (EC2.7.1.42) 和一种或者多种其他酶的联合使用。

[0014] 本发明方法的步骤 1) 中, 将 pH值调节为 5.0~7.0的原因在于, 在该 pH值范围内 , 可定向形成核黄素磷酸一钠盐。 当调节对象为黄素单核苷酸的粗品溶液时, 则加入氢氧化钠进行调节; 当调节对象为核黄素磷酸钠的粗品溶液时, 则根据 溶液 pH值的不同加入氢氧化钠或者盐酸进行调节。 为了提高目标产物的收率、 获得外观形态更好的核黄素磷酸钠产品, 优选地, 将溶液的 pH值调节为 5.5~6.5 , 更优选地, 将溶液的 pH值调节为 6.0~6.3。

[0015] 本发明方法的步骤 2) 中, 加入 95%乙醇作为不良溶剂, 同时降低水溶液的极 性, 以使核黄素磷酸钠在溶液中的溶解度降低, 从而达到过饱和状态而沉淀析 出。 优选地, 加入占溶液体积 0.5~0.9倍的浓度为 95% (ml/ml) 的乙醇水溶液, 一方面可节约成本, 另一方面可提高不同批次间产品的均一性。

[0016] 本发明方法的步骤 3) 中, 降温至 3~5°C时可获得收率和含量均较高的核黄素磷 酸钠产品, 温度高于此范围则收率较低, 温度低于此范围则含量降低。

[0017] 发明人研究发现, 固体的析出受温度的影响比较大, 如若降温速度过快, 则会 导致固体短时间内爆发性析出, 从而颗粒大小不一, 影响产品的形态, 甚至会 造成固体聚团析出, 从而包埋大量杂质, 以致产品含量不高。 为了获得含量更 高、 形态更好的产品, 优选地, 步骤 3) 的降温过程控制在 l~2h内完成。

[0018] 更优选地, 步骤 3) 的降温过程按如下步骤操作: 先降温至 12~15°C, 待溶液中 的固体析出率达 40%以上后, 再降温至 3~5°C。

[0019] 为了进一步提高步骤 3) 中析出固体的量, 优选地, 待溶液中的固体析出率达 4 0%以上后, 再加入占粗品溶液体积 0.3~0.5倍的浓度为 95% (ml/ml) 的乙醇水溶 液。

[0020] 本发明方法步骤 4) 中的过滤是指采用物理方法将溶液中的固体和 液体进行分 离的过程, 常见的过滤方法均适用于本发明方法, 包括常压过滤、 减压过滤、 离心过滤等。

[0021] 本发明方法的步骤 4) 中, 优选地, 在干燥处理前, 用浓度为 75% (ml/ml) 的 乙醇水溶液对所得滤饼进行洗涤。

[0022] 更优选地, 待用浓度为 75% (ml/ml) 的乙醇水溶液洗涤后, 再用浓度为 95% ( ml/ml) 的乙醇水溶液洗涤, 可最大程度确保附着在产品表面的杂质被洗涤 干净

[0023] 为进一步降低杂质残留、 提高产品含量, 优选地, 在洗涤滤饼之前, 先用 50% 乙醇水溶液对所得滤饼进行打浆, 然后过滤收集滤饼。 所谓打浆, 是指向固体 物质中加入某种对目标物质溶解度较低而对其 他有关物质有较高溶解度的溶剂 , 通过搅拌使其他不需要的有关物质溶解在溶剂 中, 而目标物质与溶剂呈悬浊 状态的过程。

[0024] 优选地, 本发明方法的步骤 4) 中, 干燥处理的方式为于 30°C的温度下真空干 燥 5~ 10小时。

[0025] 为了进一步提高核黄素磷酸钠纯品的纯度, 优选地, 将步骤 4) 所得的滤饼或 者核黄素磷酸钠纯品用纯化水溶解后重复本发 明方法步骤 1) 至步骤 4) 的操作

[0026] 当本发明方法步骤 1) 的核黄素磷酸钠和 /或黄素单核苷酸的粗品溶液为生物催 化法制备黄素单核苷酸得到的粗产物溶液时, 溶液中往往会含有残留的部分生 物酶, 为防止在对核黄素磷酸钠的分离纯化过程中残 留酶使目标产物发生降解 , 优选在步骤 1) 之前, 对核黄素磷酸钠和 /或黄素单核苷酸的粗品溶液进行如下 前序处理: a) 将核黄素磷酸钠和 /或黄素单核苷酸的粗品溶液的 pH值调节至 11.0 -12.0; b) 将溶液温度升温至 40±1°C, 并于 40±1°C温度下保持 2h; C) 除去不溶 物。

[0027] 上述前序处理中, 通过将溶液的 pH值调节至 11.0~12.0, 再辅以 40±1°C温度下 加热处理, 可使溶液中残留的生物酶失活。 优选地, 使用氢氧化钠调节 pH值, 可使黄素单核苷酸转化为核黄素磷酸钠; 特别地, pH值的优选范围为 11.0~11.5 , 此范围内目标产物的稳定性最好。 [0028] 上述前序处理的步骤 c) 中, 除去不溶物的方法优选为: 将步骤 b) 加热后的溶 液进行离心处理, 收集上清液。

[0029] 当本发明方法步骤 1) 的核黄素磷酸钠和 /或黄素单核苷酸的粗品溶液为生物催 化法制备黄素单核苷酸得到的粗产物溶液时, 往往后续步骤 4) 的过滤操作会比 较困难, 容易造成过滤膜的堵塞, 为了使过滤操作更容易, 优选地, 上述前序 处理还包括将步骤 c) 获得的去除不溶物后的溶液进行预处理的步骤 , 以除去粗 产物溶液中残留的杂质; 所谓预处理是指用离子交换树脂对去除不溶物 后的溶 液进行纯化, 或者将去除不溶物后的溶液依次经微滤和超滤 处理。

[0030] 微滤又称微孔过滤, 以微孔滤膜为过滤介质, 在 0.1〜 0.3MPa的压力推动下, 截留 0.1〜 1微米之间的颗粒和细菌, 但能允许大分子有机物和无机盐等通过。 本 发明方法中使用的微滤膜优选为 0.1pm孔径的中空纤维膜。

[0031] 超滤又称超过滤, 其原理与微滤相同, 区别仅在于, 超滤使用的超滤膜的孔径 小于微滤膜, 一般在 0.01微米以下。

[0032] 优选地, 上述离子交换树脂为阴离子交换树脂。

[0033] 更优选地, 上述阴离子交换树脂为弱碱性阴离子交换树脂 或大孔吸附树脂。

[0034] 优选地, 用 0.1~0.4mol/L氯化钠水溶液作为离子交换树脂的洗 脱液; 为提高产 品收率, 更优选地, 氯化钠水溶液的浓度为 0.3~0.35mol/L。

[0035] 优选地, 对离子交换树脂进行再生处理的方法包括如下 步骤: A、 用 2mol/L氯 化钠溶液与 0.5mol/L盐酸溶液的混合液淋洗树脂至流出液中 杂质残留; B、 用 纯化水淋洗至洗脱液的 pH值为 5.00~7.00; C、 用 0.5mol/L氢氧化钠溶液淋洗至洗 脱液呈强碱性; D、 用纯化水淋洗至洗脱液的 pH值为 9.00~10.00。

[0036] 为了提高后续操作的效率, 减少溶剂的使用量, 并提高目的产物的收率, 优选 地, 在步骤 1) 之前, 将上述预处理后的溶液进行浓缩处理, 以除去大量的水分

[0037] 本发明方法中的浓缩处理是指采用物理方法使 溶剂减少而提高溶液的浓度的过 程, 包括减压蒸馏法、 超过滤法、 透析法、 吸附法、 冷冻干燥法等。

[0038] 优选地, 本发明方法的浓缩处理方式为纳滤浓缩。 纳滤是一种介于反渗透和超 滤之间的压力驱动膜分离过程, 以纳滤膜为过滤介质, 纳滤膜的孔径范围在几 个纳米左右, 允许溶剂分子或某些相对分子质量较小的溶质 或低价离子透过, 从而达到分离和浓缩的效果。 优选地, 本发明方法选用的纳滤膜的截留分子量 为 300±50道尔顿。

[0039] 为获得较高的产品收率, 优选地, 将上述预处理后的溶液浓缩至溶液中核黄素 磷酸钠的浓度在 7.5g/L以上。

发明的有益效果

有益效果

[0040] 与现有的纯化方法相比, 本发明提供的高纯度核黄素磷酸钠的制备方法 具有如 下优点:

[0041] 1、 全程无需使用有毒有害溶剂, 绿色无污染, 且对生产操作人员不会造成健 康损害;

[0042] 2、 工艺简单易操作, 无特殊技能要求及安全防护要求;

[0043] 3、 工艺步骤较少, 效率和收率高, 成本低廉, 经济效益显著;

[0044] 4、 可制备得到纯度在 99%以上的核黄素磷酸钠产品。

发明实施例

本发明的实施方式

[0045] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细 说明, 以下实施例是对本发明的 解释, 本发明并不局限于以下实施例。

[0046] 以下实施例中所使用的原料及试剂, 除特别指明的以外, 均为从市场中购入。

[0047] 以下实施例中, 实施例 1的纯化对象为从市场中购入的黄素单核苷酸 产品, 实施例 2至实施例 5的纯化对象为邦泰生物工程 (深圳) 有限公司采用生物酶催 化法 (以核黄素和 ATP为底物, 用核黄素激酶进行催化) 制备黄素单核苷酸得到 的粗产物溶液。

[0048] 实施例 1

[0049] 经检测, 待纯化的黄素单核苷酸粗产品的纯度为 30.20%, 含量为 40.14%。

[0050] 纯化过程为: 取待纯化的黄素单核苷酸粗产品 30.01g, 溶解于 1.0L纯化水中, 待充分溶解后用氢氧化钠将溶液的 pH值调节至 6.0; 升温至 30°C后, 加入 0.5L浓 度为 95% (ml/ml) 的乙醇水溶液, 混合均匀; 缓慢降温至 13°C, 等待固体析出 ; 通过 HPLC进行在线检测, 待溶液中的固体析出率达 40%以上后, 再缓慢降温 至 4°C, 并加入 0.4L浓度为 95% (ml/ml) 的乙醇水溶液, 混合均匀, 继续等待固 体析出; 通过 HPLC进行在线检测, 待溶液中的固体析出率达 90%以上后, 过滤 , 收集滤饼, 并用浓度为 75% (ml/ml) 的乙醇水溶液洗涤滤饼, 最后将洗涤后 的滤饼置于 30°C的温度下真空干燥 5小时后得橙黄色核黄素磷酸钠固体粉末 10.72 g, 干燥失重 4.48%, 钠离子含量 4.50%, 比旋光度为 +38.37°, 纯度为 99.33%; 含 量 (以核黄素为外标, 以干品计) 为 77.28% (药典要求范围为 74.0%-79.0%) , 总收率以黄素单核苷酸计为 80.97%。

[0051] 实施例 2

[0052] 经检测, 待纯化的粗产物溶液的 pH值为 6.60, 体积为 27L, 溶液中黄素单核苷 酸的含量为 186.02g。

[0053] 纯化过程为: 用氢氧化钠调节粗产物溶液的 pH值为 11.50, 升温至 40°C加热 2h 后离心, 上清液通过蠕动泵泵入型号为 LXQ510的阴离子树脂柱中, 0.3mol/L氯 化钠水溶液 120L洗脱杂质, 0.35mol/L氯化钠水溶液 120L洗脱产品, 得产品洗脱 液 122L, 产品含量 175.04g, 收率 94.10% ; 将产品洗脱液纳滤浓缩, 纳滤膜允许 分子量低于 300的小分子通过, 纳滤膜体积容量为 6L, 洗脱液体积最终浓缩至 19. 5L, 浓缩液中产品含量以黄素单核苷酸计为 172.74g, 质量浓度为 8.85g/L; 用 6m ol/L盐酸溶液将浓缩液的 pH值调节为 6.25, 转入 50L玻璃反应釜中, 缓慢加入 25. 6L ( 1.3BV) 95% (ml/ml) 乙醇水溶液, 温度控制在 25~30°C, 加毕, 缓慢降温 至 13°C, 通过 HPLC进行在线检测, 待溶液中的固体析出率达 40%以上后, 继续 降温至 4°C, 维持 4°C搅拌 4h, 过滤, 滤饼用少量 75% (ml/ml) 乙醇水溶液洗涤 , 30°C真空干燥 10h得橙黄色核黄素磷酸钠固体粉末 166.59g, 干燥失重 4.34%, 钠离子含量 4.72%, 比旋光度为 +38.68°, 纯度为 99.28%; 含量 (以核黄素为外标 , 以干品计) 为 77.86% (药典要求范围为 74.0%-79.0%) , 总收率以黄素单核苷 酸计为 81.44%。

[0054] 实施例 3

[0055] 经检测, 待纯化的粗产物溶液的 pH值为 6.87, 体积为 38L, 溶液中黄素单核苷 酸的含量为 255.29g。 [0056] 纯化过程为: 用氢氧化钠调节粗产物溶液的 pH值为 12.00, 升温至 40°C加热 2h 后离心, 取上清液备用; 将阴离子树脂 (LXQ510) 90L再生处理, 处理方法为

: 用 2mol/L

氯化钠 +0.5mol/L盐酸水溶液 90L淋洗树脂, 纯化水淋洗至 pH为 5.00~7.00, 再用 0. 5mol/L氢氧化钠溶液 90L淋洗至流出液呈强碱性, 最后用纯化水淋洗至 PH9.00~ 1 0.00; 将前述备用的上清液通过蠕动泵泵入再生好的 阴离子树脂柱中, 0.3mol/L 氯化钠水溶液 180L洗脱杂质, 0.3mol/L氯化钠水溶液 180L洗脱产品, 得产品洗脱 液 250L, 产品含量 243.31g, 收率 95.31% ; 将产品洗脱液纳滤浓缩, 纳滤膜允许 分子量低于 300的小分子通过, 纳滤膜体积容量为 6L, 洗脱液体积最终浓缩至 16 L, 浓缩液中产品含量以黄素单核苷酸计为 242.42g, 质量浓度为 15.15g/L; 用 6m ol/L盐酸溶液将浓缩液的 pH值调节为 5.86 , 转入 50L玻璃反应釜中, 缓慢加入 11. 6L (0.73BV) 95% (ml/ml) 乙醇水溶液, 温度控制在 25~30°C, 加毕, 缓慢降温 至 13°C, 通过 HPLC进行在线检测, 待溶液中的固体析出率达 40%以上后, 继续 降温至 4°C, 并加入 6.4L (0.4BV) 95% (ml/ml) 的乙醇水溶液, 混合均匀, 维 持 4°C搅拌 4h, 过滤, 滤饼用少量 75% (ml/ml) 乙醇水溶液洗涤, 30。(:真空干燥 10h得橙黄色核黄素磷酸钠固体粉末 233.86g, 干燥失重 4.40%, 钠离子含量 4.32% , 比旋光度为 +38.20°, 纯度为 99.09%; 含量 (以核黄素为外标, 以干品计) 为 7 6.04% (药典要求范围为 74.0%-79.0%) , 总收率以黄素单核苷酸计为 83.62%。

[0057] 实施例 4

[0058] 经检测, 待纯化的粗产物溶液的 pH值为 6.77, 体积为 35L, 溶液中黄素单核苷 酸含量为 265.81g。

[0059] 纯化过程为: 用氢氧化钠调节粗产物溶液的 pH值为 11.00, 升温至 40°C加热 2h 后离心, 取上清液备用; 将上清液用孔径为 O. lum的微滤膜微滤, 微滤液再用超 滤膜进行超滤, 超滤液直接泵入纳滤机进行纳滤浓缩, 纳滤膜允许分子量低于 3 00的小分子通过, 纳滤膜体积容量为 12L, 洗脱液体积最终浓缩至 18L, 浓缩液 中产品含量以黄素单核苷酸计为 255.74g, 质量浓度为 14.21g/L, 收率 96.21% ; 用 6mol/L盐酸将浓缩液的 pH值调节为 6.10, 转入 50L玻璃反应藎中, 用 1L纯化水 洗涤桶壁, 缓慢加入 11.4L (0.6BV) 95% (ml/ml) 乙醇水溶液, 温度控制在 25~ 35°C, 加毕, 缓慢降温至 13°C, 通过 HPLC进行在线检测, 待溶液中的固体析出 率达 40%以上后, 继续降温至 6°C, 维持 6°C搅拌 4h, 过滤, 滤饼先用少量 75% ( ml/ml) 乙醇水溶液洗涤, 再用少量浓度为 95% (ml/ml) 的乙醇水溶液洗涤, 30 °(:真空干燥 10h得橙黄色核黄素磷酸钠固体粉末 266.95g, 干燥失重 4.60%, 钠离 子含量 4.54%, 比旋光度为 +38.89°, 纯度为 99.43%; 含量 (以核黄素为外标, 以 干品计) 为 77.64% (药典要求范围为 74.0%-79.0%) , 总收率以黄素单核苷酸计 为 91.25%。

[0060] 实施例 5

[0061] 经检测, 待纯化的粗产物溶液的 pH值为 6.65, 体积为 41L, 溶液中黄素单核苷 酸含量为 341.94g。

[0062] 纯化过程为: 用氢氧化钠调节粗产物溶液的 pH值为 11.75, 升温至 40°C加热 2h 后离心, 取上清液备用; 将上清液用膜孔径为 O. lum的微滤膜过滤, 滤液经超滤 后直接转入纳滤机进行纳滤浓缩, 超滤膜主要截留分子量超过 1000的多肽及杂 蛋白, 纳滤膜允许分子量低于 300的小分子通过, 纳滤膜体积容量为 12L, 洗脱 液体积最终浓缩至 21L, 浓缩液中产品含量以黄素单核苷酸计为 338.24g, 质量浓 度为 16.11g/L; 用 6mol/L盐酸溶液将浓缩液的 pH值调节为 5.10, 转入 50L玻璃反 应釜中, 缓慢加入 11.00L (0.6BV) 95% (ml/ml) 乙醇水溶液, 温度控制在 25~3 0°C, 加毕, 缓慢降温至 10°C, 通过 HPLC进行在线检测, 待溶液中的固体析出率 达 40%以上后, 继续降温至 6°C, 并加入 6.4L (0.4BV) 95% (ml/ml) 的乙醇水 溶液, 混合均匀, 维持 6°C搅拌 4h, 过滤, 滤饼用 50%乙醇水溶液 2L打浆 2h, 温 度控制在 10~15°C, 过滤, 滤饼用少量 75% (ml/ml) 乙醇水溶液洗涤, 30°C真空 干燥 10h得橙黄色核黄素磷酸钠固体粉末 339.07g, 干燥失重 4.86%, 钠离子含量 4 .45% , 比旋光度为 +38.83°, 纯度为 99.34%; 含量 (以核黄素为外标, 以干品计 ) 为 77.30% (药典要求范围为 74.0%-79.0%) , 总收率以黄素单核苷酸计为 89.93

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