La présente invention concerne un procédé de préparation de la marmycine A et de ses analogues, de nouveaux analogues de la marmycine A, ainsi que leurs utilisations en tant que biomarqueurs, et notamment comme marqueurs d'organites, et en pharmacie, notamment en tant qu'antibiotiques, anticancéreux et antipaludiques.

La marmycine A appartient à la famille des angucyclines, aux propriétés antibactérienne et cytotoxique. Elle est caractérisée par une structure polyaromatique, incluant un motif anthraquinone fusionné à un cycle aminopyranose par une liaison C- glycoside ainsi qu'une liaison N-glycoside sur ce même groupement osidique. La marmycine A possède donc une structure hexacyclique unique.

Cette molécule naturelle a été isolée pour la première fois par Fenical et al. (W. Fenical, J. Nat. Prod. 2007, 70, 1406-1409) à partir de cultures d'un actinomycète issu de sédiments marins du genre Streptomyces. Ce produit naturel n'est donc que très peu disponible dans la nature et n'est actuellement plus disponible commercialement. De plus, la synthèse totale de cette molécule, qui permettrait son développement pharmaceutique, n'a pas encore été réalisée jusqu'à ce jour.

Il existe donc un besoin pour un procédé de préparation de la marmycine A et de ses analogues, y compris pour de nouveaux analogues de la marmycine A.

La présente invention a pour but de fournir un procédé de préparation par synthèse chimique de la marmycine A et de ses analogues. Il s'agit en particulier de fournir à partir de composés commerciaux une synthèse totale de la marmycine A et de ses analogues. La présente invention a également pour but de fournir de nouveaux analogues de la marmycine A. La présente invention a pour but de fournir des composés utiles en pharmacie, notamment dans le traitement des cancers, d'infections bactériennes et/ou du paludisme. La présente invention a également pour but de fournir des composés utiles en tant que biomarqueurs, et notamment comme marqueurs d'organites, en particulier en tant que marqueurs des lysosomes.

La présente invention concerne un procédé pour la préparation d'un composé de formule (II) :

dans laquelle R _{1 ;} R ₂ , R ₃ , R ₄ , R ₅ , R ₆ , Ra, Rb, Rc, Rd et Re sont indépendamment les uns des autres un atome ou un groupe d'atomes ; n représentent le nombre de radicaux Ra, Rb, Rd et Re et valent 2 ;

ledit procédé comprenant une étape de couplage B d'un composé de formule (III) :

dans laquelle les radicaux R- _\ à R ₆ sont tels que définis pour le composé de formule (II) et Rg est un groupe réactif avec le groupement NH ₂ du composé de formule (IV), en particulier un groupe triflate,

avec un composé de formule (IV) :

(IV)

dans laquelle les radicaux Ra à Re et n sont tels que définis pour le composé de formule (II), ladite étape de couplage étant réalisée en présence d'un composé comprenant du cuivre.

La présente invention concerne selon une variante un procédé de préparation d'un composé de formule (II) :

dans laquelle :

- R R ₂ , R ₃ , R ₄ , R ₅ et R ₆ sont indépendamment les uns des autres choisis parmi le groupe constitué de :

H, OH, halogène, C(0)OH, =0 (=0 représente un atome d'oxygène lié par une double liaison covalente et la représentation des doubles liaisons aromatiques des composés est modifiée en conséquence), (CrCio)alkyle, O(CrCi ₀ )alkyle, OC(0)(CrCio)alkyle, (C ₂ -Ci ₀ )alcényle, C(O)O(Ci-Ci ₀ )alkyle, NH ₂ , NH(C Cio)alkyle, N[(Ci-Ci ₀ )alkyle] ₂ , NHC(O)(Ci-Ci ₀ )alkyle, N(Ci-Ci ₀ )alkyle-C(O)(Ci- Cio)alkyle, C(0)NH2, C(O)N(Ci-Ci ₀ )alkyle, C(O)N[(Ci-Ci ₀ )alkyle] ₂ ,les oses et les groupes époxy, dans lesquels lesdits alkyles et/ou lesdits oses peuvent être substitués ; ou

Ri avec R ₂ et/ou R ₃ avec R ₄ et/ou R ₄ avec R ₅ et/ou R ₅ avec R ₆ forment avec les atomes de carbone auxquels ils se rattachent un groupement (C ₃ -Ci ₀ )cycloalkyle ou (C ₆ -C ₁₀ )aryle, lesdits groupements cycloalkyles ou aryles étant éventuellement substitués et dans lesquels au moins l'un des atomes de carbone peut éventuellement être remplacé par un hétéroatome, de préférence par un atome d'oxygène ; les radicaux Ra sont indépendamment choisis les uns des autres parmi le groupe constitué de : H, OH, halogène, C(0)OH, =0, (CrC ₁₀ )alkyle, O(CrC ₁₀ )alkyle, OC(0)(Ci-Cio)alkyle, (C ₂ -C ₁₀ )alcényle, C(O)O(CrC ₁₀ )alkyle, NH ₂ , NH(C Cio)alkyle, N[(CrC ₁₀ )alkyle] ₂ , NHC(O)(CrC ₁₀ )alkyle, N(C ₁ -C ₁₀ )alkyle-C(O)(C ₁ - Cio)alkyle, C(0)NH2, C(O)N(Ci-Ci ₀ )alkyle, C(O)N[(Ci-Ci ₀ )alkyle] ₂ , et les groupements réactifs permettant de former une liaison C-C glycosidique, dans lesquels lesdits alkyles peuvent être substitués ; - les radicaux Rb, Rc et Re sont indépendamment choisis les uns des autres parmi le groupe constitué de : H, OH, halogène, C(0)OH, =0, (CrCi ₀ )alkyle, 0(d- Cio)alkyle, OC(O)(CrCi ₀ )alkyle, (C ₂ -Ci ₀ )alcényle, C(O)O(CrCi ₀ )alkyle, NH ₂ , NH(C Cio)alkyle N[(Ci-Ci ₀ )alkyle] ₂ , NHC(O)(CrCi ₀ )alkyle, N(C Cio)alkyle- C(0)(CrCio)alkyle, C(0)NH2, C(O)N(CrCi ₀ )alkyle, et C(O)N[(Ci-Ci ₀ )alkyle] ₂ ,dans lesquels lesdits alkyles peuvent être substitués ;

- les radicaux Rd sont indépendamment choisis les uns des autres parmi le groupe constitué de : H, OH, halogène, C(0)OH, =0, (CrC ₁₀ )alkyle, O(CrC ₁₀ )alkyle, OC(O)(CrC ₁₀ )alkyle, (C ₂ -C ₁₀ )alcényle, C(O)O(CrC ₁₀ )alkyle, NH ₂ , NH(C C ₁₀ )alkyle, N[(CrC ₁₀ )alkyle] ₂ , NHC(O)(CrC ₁₀ )alkyle, N(C ₁ -C ₁₀ )alkyle-C(O)(C ₁ - C ₁₀ )alkyle, C(0)NH2, C(O)N(CrC ₁₀ )alkyle, C(O)N[(C ₁ -C ₁₀ )alkyle] ₂ , (CrC ₁₀ )alkyle- COO ^" , le méthoxyméthyloxygène, et les groupements réactifs permettant de former une liaison 0-C tel que AcO , dans lesquels lesdits alkyles peuvent être substitués ;

- n représentent le nombre de radicaux Ra, Rb, Rd et Re et valent 2 ;

L'indice n des composés de l'invention souligne que les radicaux Ra, Rb, Rd et Re présents peuvent être identiques ou différents.

Plusieurs tentatives de synthèse totale de la marmycine A ont été effectuées. Cependant, la synthèse totale de ce produit naturel n'a jamais été à ce jour décrite, seule la C-3-desméthyl-marmycine A ayant été synthétisée de façon totale (N. Maugel et B.B. Snider, Organic Letters, 2009, vol.1 1 , n°21 , 4926-4929 et A. Zhang et al., J. Org. Chem. 2009, 74, 61 1 1 -61 19). Cependant, la C-3-desméthyl-marmycine A ne présente pas les mêmes difficultés de synthèse car cette dernière ne comprend pas d'amine néopentylique contrairement à la marmycine A. En effet, la C-3-desméthyl-marmycine A ne comprend pas le groupement méthyle en position 3 sur l'ose. Or, les composés comprenant des alcools ou des aminés néopentyliques tels que la marmycine A sont connus pour avoir une faible réactivité.

Les présents inventeurs ont découvert de manière totalement inattendue un nouveau procédé permettant la synthèse totale de la marmycine A et d'analogues.

En particulier et de façon surprenante, les inventeurs ont découverts que le couplage B du noyau anthraquinone avec l'aminopyranose par la formation d'une liaison C-N glycosidique pouvait être réalisé en présence de cuivre, par exemple selon le principe du couplage d'Ullmann. Cette réaction est très surprenante car le couplage de type Buchwald-Hartwig usuel pour ce type de réaction (cf. Org. Synth. 2002, 78, 23 DOI: 10.15227/orgsyn.078.0023), effectué en présence de palladium, ne permet pas d'obtenir la liaison glycosidique C-N dans le présent cas.

Le couplage B selon l'invention permet notamment d'obtenir un bon rendement, de préférence au moins 30 % en composé de formule (II) selon l'invention.

De plus, pour la formation de l'anthraquinone, les inventeurs ont réalisé un couplage A de type Diels-Alder de façon surprenante en un seul réacteur. En effet, la réaction de Diels-Alder s'effectue normalement dans plusieurs réacteurs (J. Org. Chem., 2007, 72 (16), pp 61 16-6126). Le procédé selon l'invention est donc simplifié par rapport aux réactions de Diels-Alder classiques.

En troisième étape du procédé selon l'invention, les inventeurs ont mis au point de façon inattendue une étape de cyclisation C permettant d'aboutir à une structure pentacyclique. Cette étape de cyclisation peut notamment être réalisée selon deux alternatives.

Selon une première alternative de cyclisation Ca, une liaison C-C glycosidique est formée avec cyclisation intramoléculaire. De façon surprenante, cette cyclisation est notamment possible en présence d'acide tétrafluoroborique. Cette première alternative est particulièrement adaptée à la préparation de la marmycine A et de ses analogues, en particulier les composés selon l'invention de formule (la).

Selon une seconde alternative de cyclisation Cb, une liaison O-C est formée avec cyclisation intramoléculaire. De façon surprenante, cette cyclisation est notamment possible en présence d'une base pour la préparation de l'oxamarmycine A et de ses dérivés, en particulier pour obtenir les composés selon l'invention de formule (Ib).

Une quatrième étape d'addition, permettant de former de nouveaux analogues de la marmycine A, et en particulier les composés selon l'invention de formules (laD), a également été mise au point par les inventeurs.

La présente invention a donc notamment pour avantage de permettre la synthèse totale de la marmycine A ou d'analogues, à partir de réactifs de départ disponibles commercialement. Ce procédé pouvant être mis en place à l'échelle industrielle, il permet donc d'obtenir la marmycine A et ses analogues en quantité suffisante pour leur développement pharmaceutique et leur commercialisation. Le procédé selon l'invention permet notamment d'obtenir un rendement suffisant en marmycine A ou analogues.

De nouveaux analogues, en particulier l'oxamarmycine A et ses dérivés, ont également ainsi pu être découverts. Les inventeurs ont également mis en évidence les propriétés de marquage d'organites présents notamment dans le cytosol, tels que par exemple les lysosomes, par les composés de l'invention, et ainsi les propriétés anticancéreuse, antibiotique et antipaludique des composés selon l'invention.

Les inventeurs ont découvert que les composés selon l'invention ne s'accumulaient pas dans le noyau des cellules mais dans les organites cellulaires tels que les lysosomes.

En particulier et sans vouloir être lié par une théorie, il semble que la marmycine A et ses analogues s'accumulent dans les organites tels que par exemple les lysosomes et produisent des espèces réactives de l'oxygène (également appelées ROS - Reactive Oxygen Species). Ces espèces réactives de l'oxygène induiraient la perméabilisation des organites, en particulier de la membrane lysosomale, pouvant conduire à la libération de catepsines et d'autres hydrolases dans le cytosol. Cette perméabilisation pourrait dans certains cas également conduire à la perméabilisation de la membrane externe des mitochondries. La perméabilisation des membranes de ces organites induirait alors l'apoptose des cellules (cf. Oncogene (2008) 27, 6434-6451 ).

De façon surprenante, les inventeurs ont découvert que les composés de formule (laD) présentent une activité anti-proliférative supérieure à l'activité de la marmycine A.

De façon encore plus surprenante, les inventeurs ont découvert que le greffage covalent entre la marmycine A et ses analogues et un composé hétérocyclique précurseur de radicaux libres permet d'obtenir une action anti-proliférative de type synergique des composés obtenus, en particulier des composés de formule (laD) selon l'invention. En effet, l'activité anti-proliférative de ces composés est supérieure à l'activité de la marmycine A et des composés hétérocycliques pris isolément, ainsi qu'à l'activité anti- proliférative de leur combinaison.

Ainsi la présente invention concerne des compositions pharmaceutiques comprenant des composés de l'invention, et les composés de l'invention pour leurs utilisations thérapeutiques ou comme médicament.

Ainsi la présente invention concerne une méthode de traitement thérapeutique. Ces applications sont décrites plus en détails dans les applications des composés de l'invention.

Définitions

Dans le cadre de la présente invention, le terme « (CrCi ₀ )alkyle » désigne des radicaux hydrocarbonés aliphatiques saturés, en chaîne droite ou ramifiée, comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, de préférence de 1 à 5 atomes de carbone. Une chaîne ramifiée signifie qu'un ou plusieurs groupes alkyles inférieurs, tels que le méthyle, l'éthyle ou le propyle, sont liés à la chaîne alkyle linéaire principale. Les groupements alkyles préférés sont le méthyle, l'éthyle, le propyle ou l'isopropyle, en particulier le méthyle. Le terme « alkyle » comprend les groupes alkyles substitués dans lesquels un ou plusieurs atomes d'hydrogène sont substitués par un autre atome ou un groupe d'atomes.

Le terme « (CrCio)alkylène » désigne un radical (CrCi ₀ )alkyle divalent tel que défini ci-dessus.

Le terme « (C ₂ -C ₁₀ )alcényle » désigne un groupe alkyle comprenant de 2 à 10 atomes de carbone, de préférence de 2 à 5 atomes de carbone, insaturé, c'est-à-dire comprenant au moins une double liaison carbone-carbone, et qui peut être linéaire ou ramifié. Comme exemple de groupe alcényle, on peut citer notamment l'éthényle, le propényle, le n-butényle, l'/-butényle, le 3-méthylbut-2-ényle, ou le n-pentényle. Le terme « alcényle » comprend les groupes alcényles substitués dans lesquels un ou plusieurs atomes d'hydrogène sont substitués par un autre atome ou un groupe d'atomes.

Le terme « (C ₃ -C ₁₀ )cycloalkyle » signifie un système de cycle non aromatique mono- ou multicyclique de 3 à 10 atomes de carbone, de préférence de 5 à 6 atomes de carbone dans lequel chaque atome substituable du cycle est éventuellement substitué. A titre d'exemple de cycloalkyle monocyclique, on peut citer notamment le cyclopentyle, le cyclohexyle ou le cycloheptyle. Le terme « cycloalkyle » comprend les groupes cycloalkyles substitués dans lesquels un ou plusieurs atomes d'hydrogène sont substitués par un autre atome ou un groupe d'atomes.

Le terme « aryle » désigne un système cyclique monocyclique ou multicyclique aromatique de 6 à 10 atomes de carbone dans lequel chaque atome substituable du cycle est éventuellement substitué par un autre atome ou un groupe d'atomes. Comme exemple de groupes aryle, on peut citer notamment le phényle, le naphtalène et l'anthracène.

Le terme « (C ₃ -C ₂₀ )hétérocycle » désigne un système de cycle non aromatique, mono- ou multicyclique de 3 à 20 atomes de carbone, dans lequel chaque atome substituable du cycle est éventuellement substitué et dans lesquels au moins l'un des atomes de carbone est remplacé par un hétéroatome, de préférence par un atome d'oxygène. De préférence, l'hétérocycle est un système de cycle non aromatique multicyclique, par exemple quadricyclique, comprenant au moins une fonction peroxyde organique (-C-0-0-C).

Le terme « ose » (ou monosaccharide) désigne un monomère de glucides. Les oses possèdent au moins 3 atomes de carbone et comprennent notamment les trioses, tétroses, pentoses, hexoses, désoxy-hexoses (fucose ou rhamnose), heptoses et nonoses. Les oses préférés selon l'invention sont les hexoses tels que pyranose, allose, altrose, galactose, glucose, gulose, idose, mannose, talose, fructose, sorbose et tagatose, de préférence le pyranose. Selon un mode particulier de réalisation, on entend par « ose » les composés de formule (IV) selon l'invention.

Le terme « époxy » désigne des groupements de formule suivante :

, dans laquelle R et R' sont indépendamment l'un de l'autre choisis parmi les groupements (CrC ₁₀ )alkyle, O(CrC ₁₀ )alkyle, OC(O)(CrC ₁₀ )alkyle, (C ₂ -C ₁₀ )alcényle, C(0)0(Ci-Cio)alkyle, NH(CrC ₁₀ )alkyle et N[(C ₁ -C ₁₀ )alkyle] ₂ , dans lesquels lesdits alkyles peuvent être substitués.

Le terme « halogène » désigne un atome de chlore, brome, iode ou fluor.

Le terme « hétéroatome » désigne un atome choisi parmi O, N, S ou P, de préférence O ou N.

Par « groupe réactif avec un groupement NH ₂ du composé de formule (IV) », on entend tout groupement permettant la formation d'une liaison C-N entre le composé de formule (III) et le composé de formule (IV) selon l'invention, en particulier un groupe triflate.

Par « groupe réactif avec un groupement OH » du composé de formule (le), on entend tout groupement permettant la formation d'une liaison covalente, par exemple de type O-C, entre le composé de formule (la) et le groupement espaceur L, en particulier un groupement C(0)OH ou OH.

Le terme « groupement protecteur » désigne un groupement protégeant des groupements chimiques fonctionnels, en particulier les fonctions alcools, contre des réactions indésirables durant les réactions de synthèse. Des exemples de groupements protecteurs sont donnés dans T.W. Greene and P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd édition, John Wiley & Sons, New York (1999), et sont connus de l'homme du métier. On peut notamment citer CH ₃ -C(0).

Par fonction ester, on entend un groupement C-C(0)-0-C. Par fonction étheroxyde, on entend un groupement C-O-C. Par fonction carbonate, on entend un groupement C-O- C(0)-0-C. Par fonction carbamate, on entend un groupement C-NH-C(0)-0-C. Procédé de préparation des composés de formule (II)

Etape de couplage B

Selon un mode de réalisation, le procédé de préparation d'un composé de formule (II) selon l'invention est caractérisé en ce que l'étape de couplage B est effectuée en présence d'un composé comprenant du cuivre, de formule Cu-X, X étant choisi parmi le groupe constitué de Cl, Br, I, S0 ₄ et OAc, de préférence de formule Cu-I.

Selon un mode de réalisation l'étape de couplage B est effectuée en présence de 5 mol% à 25 mol%, de préférence entre 10 mol% et 20 mol%, de composé comprenant du cuivre. De préférence, l'étape de couplage B est effectuée en présence de 10 mol% ou 20 mol% de Cu-X. Selon un mode de réalisation, ladite étape de couplage B est réalisée en présence de 1 à 6 eq. du composé de formule (IV) tel que défini ci-dessus, de préférence 2, 3, 4 ou 5 eq.

Selon un mode de réalisation, ledit couplage B est effectué en présence d'une base, par exemple K ₂ C0 ₃ , de préférence en présence d'un solvant, par exemple le benzène, le xylène, le toluène ou l'acétonitrile.

Selon un mode réalisation, ladite étape de couplage B est réalisée en présence d'une base, par exemple de K ₂ C0 _3, en quantité comprise entre 1 eq. et 4 eq., de préférence 2 eq.

Selon un mode de réalisation, ladite étape de couplage B est réalisée en présence d'un solvant tel que le toluène ou l'acétonitrile, de préférence en présence de toluène.

Selon un autre mode de réalisation, ladite étape de couplage B est réalisée en présence de Cu-I en tant que catalyseur, de K ₂ C0 ₃ en tant que base et de toluène en tant que solvant, de préférence en reflux.

Selon un mode de réalisation, ladite étape de couplage B est réalisée à une température comprise entre 75°C et 170°C, de préférence entre 130°C et 170°C, plus préférentiellement entre 140°C et 160°C. Selon un mode de réalisation, ladite étape de couplage B est réalisée à une température de 140°C, 150°C ou 160°C.

Selon un autre mode de réalisation, ladite étape de couplage B est réalisée pendant au moins 24h, de préférence entre 24h et 72h.

Selon un mode de réalisation particulier, la réaction est effectuée en présence de 20 mo% de Cu-I, 2 eq. de K ₂ C0 ₃ et de toluène, à 160°C.

Etape de couplage A

Selon un mode de réalisation, le procédé selon l'invention comprend en outre l'étape de couplage A d'un composé de formule (V) :

dans laquelle Ri et R ₂ sont tels que définis pour la formule (II), Y étant un groupe réactif avec l'atome de carbone porteur du groupement R ₃ du composé de formule (VI) et Rh étant un groupement protecteur, de préférence un groupement CH ₃ -C(0),

avec un composé de formule (VI) :

pour obtenir un composé de form

(NO

en présence d'un solvant organique de préférence de toluène ou de xylène, de préférence en présence de toluène.

Selon un mode de réalisation, Y est choisi par F, Cl, Br et I, de préférence Br. Selon un mode de réalisation, la réaction est réalisée en reflux.

Selon un mode de réalisation, ladite étape de couplage A est réalisée à une température comprise entre 80°C et 120°C.

Selon un mode de réalisation particulier, l'étape de couplage A comprend les étapes suivantes :

i) étape de couplage A telle que décrite ci-dessus ;

ii) évaporation du milieu, de préférence dans un bain à une température comprise entre 50°C et 70°C, par exemple 60 °C ;

iii) ajout d'au moins un alcool, de préférence le méthanol ou l'éthanol, de préférence le méthanol ;

iv) ajout d'une base, par exemple le carbonate de potassium et déprotection de la fonction alcool avec départ du groupement Rh ; et

v) obtention du composé de formule (ΙΙΓ) tel que défini ci-dessus. De préférence l'étape iii) est réalisée sous agitation pendant au moins 1 h. Selon un mode de réalisation, l'ensemble des étapes i) à iv) de l'étape de couplage A est effectué dans un seul réacteur (« one pot »).

Selon un mode réalisation, le procédé selon l'invention comprend en outre une étape supplémentaire d'activation du composé de formule (ΙΙΓ) par substitution de l'atome d'hydrogène de l'alcool par un groupement Rg réactif avec le groupement NH ₂ du composé de formule (IV) selon l'invention, par exemple -S0 ₂ -CF ₃ obtenu typiquement par réaction avec l'anhydride triflique, de formule F ₃ C-SO ₂ -O-SO ₂ -CF ₃ , pour obtenir un composé de formule (III) suivante :

Selon un mode de réalisation, cette étape supplémentaire d'activation est réalisée en présence d'une base, notamment une base aminée comme par exemple la triéthylamine, de préférence en présence de d'un solvant apolaire tel que par exemple le dichlorométhane.

Selon un mode de réalisation, ladite réaction d'activation est conduite à une température comprise entre -65°C et -85°C.

Procédé de préparation des composés de formules (la) et (Ib)

Etape de cyclisation C

Selon un mode de réalisation, le procédé selon l'invention comprend en outre une étape de cyclisation C dudit composé de formule (II), pour former une structure pentacyclique.

Selon un mode de réalisation particulier, le procédé selon l'invention est un procédé de préparation d'un composé de formule (la) suivante :

dans laquelle les radicaux Ri à R ₆ et Ra à Re sont tels que définis pour les composés de formule (I I), ledit procédé comprenant une étape de cyclisation Ca par glycosylation C-C d'un composé de formule (I I) tel qu'obtenu selon l'invention, par exemple en présence d'HBF ₄ pour former le composé de formule (la).

Selon un mode de réalisation particulier, l'étape de cyclisation Ca est réalisée en présence d'HBF ₄ OEt ₂ ou HBF ₄ par exemple à 50% m/m en solution aqueuse. Selon un mode particulier de réalisation, l'étape de cyclisation Ca est réalisée avec une quantité comprise entre 0,5 eq. et 5 eq d'HBF ₄ OEt ₂ et plus particulièrement 1 , 2 ou 3 eq. d'HBF ₄ OEt ₂ .

Selon un autre mode de réalisation, l'étape de cyclisation Ca est réalisée en présence de 50 % à 70 % m/m en solution aqueuse d'H BF ₄ , de préférence 60% m/m en solution aqueuse d'HBF ₄

Selon un mode de réalisation, la réaction est réalisée en présence d'acétonitrile, de préférence en reflux. De préférence, la réaction est conduite pendant au moins 3h, de préférence entre 4h et 24h.

Selon un mode de réalisation, l'étape de cyclisation Ca est réalisée de façon indirecte en faisant réagir un composé de formule (I I) tel que défini ci-dessus avec HBF ₄ , puis en faisant réagir le produit de la réaction en présence d'HBF ₄ et d'acétonitrile, de préférence en reflux, afin d'obtenir un composé de formule (la) selon l'invention.

Selon un autre mode de réalisation, l'étape de cyclisation Ca est réalisée de façon directe, en faisant réagir un composé de formule (I I) en présence d'HBF ₄ ou d'HCI et d'acétonitrile, de préférence en reflux.

Selon un autre mode de réalisation particulier, le procédé selon l'invention est un procédé de préparation de composés de formule (Ib) suivante :

dans laquelle les radicaux R- _\ à R ₆ et Ra à Re sont tels que définis pour les composés de formule (II), et comprenant une étape de cyclisation Cb par formation d'une liaison O-C d'un composé de formule (I I) tel qu'obtenu selon l'invention, en milieu basique, de préférence en présence de NaH par former le composé de formule (Ib). Selon un mode de réalisation, on utilise au moins une base pouvant déprotoner un alcool. On utilise de préférence NaH.

Selon un mode de réalisation, l'étape de cyclisation Cb est effectuée en présence de dichlorométhane. Selon un autre mode de réalisation, la réaction de cyclisation Cb est réalisée à une température comprise entre -20°C et 0°C, de préférence entre -5°C et 0°C, plus préférentiellement à 0°C.

Selon un mode particulier de réalisation, le procédé de préparation des composés de formule (la) selon l'invention comprend les étapes suivantes :

i) étape de couplage A selon l'invention,

ii) étape de couplage B selon l'invention, et

iii) étape de cyclisation Ca selon l'invention.

Selon un autre mode particulier de réalisation, le procédé de préparation des composés de formule (Ib) selon l'invention comprend les étapes suivantes :

i) étape de couplage A selon l'invention,

ii) étape de couplage B selon l'invention, et

iii) étape de cyclisation Cb selon l'invention.

Procédé de préparation des composés de formule (laD)

Etape d'addition D

Selon un mode de réalisation, le procédé selon l'invention comprend en outre une étape d'addition D.

Selon un mode de réalisation, l'étape d'addition D est choisie parmi le groupe constitué des étapes d'estérification, d'éthérification, de formation de carbonate et de formation de carbamate. Ces étapes sont connues de l'homme du métier qui peut déterminer les conditions opératoires adéquates. De préférence, l'étape d'addition D est une estérification.

Selon un mode de réalisation particulier, l'estérification est conduite à température ambiante, par exemple entre 20°C et 25°C. De préférence, l'estérification est conduite en présence d'un solvant, et par exemple dans du dichlorométhane. Selon un mode de réalisation particulier, la réaction d'estérification est conduite en présence de 4- diméthylaminopyridine et/ou de Ν,Ν'-dicyclohexylcarbodiimide. Selon un mode de réalisation, le produit de la réaction de formule (laD) est purifié à pression réduite, par exemple entre 5 mmHg et 15 mmHg, par exemple 10 mmHg. Selon un mode de réalisation particulier, le procédé selon l'invention est un procédé de préparation d'un composé de formule (laD) telle que définie ci-dessous, ledit procédé comprenant une étape d'addition D d'un composé de formule (la) :

dans laquelle les radicaux R- _\ à R ₆ , Ra à Re et n sont tels que définis selon l'invention et dans laquelle l'un au moins des radicaux Ra à Re est un groupement OH, de préférence un radical Rd ;

avec un composé de formule (le) suivante : Rx-L-Rz (le) dans laquelle,

Rx est un groupe réactif permettant de réagir avec une fonction OH, de préférence un groupe C(0)OH ou OH ;

L est un groupe d'atomes dit «groupe espaceur » ; et

Rz est un (C ₃ -C ₂₀ )hétérocycle éventuellement substitué ; ladite étape d'addition D résultant en la formation d'un composé de formule (laD) suivante :

dans laquelle les radicaux R- _\ à R ₆ et n sont tels que définis selon l'invention et dans laquelle les radicaux Ra1 à Re1 ont les mêmes définitions que les radicaux Ra à Re définis pour la formule (la) respectivement,

parmi lesquels l'un au moins des radicaux Ra1 à Re1 , de préférence Rd1 , représente le groupe résultant de la réaction entre le groupe OH et Rx, lié de façon covalente à L-Rz. Selon un mode de réalisation, Rx est un groupement C(0)OH.

Selon un mode de réalisation, le groupe espaceur L est un (CrCio)alkylène pouvant être substitué et/ou comprendre un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi O, N et S, et/ou une ou plusieurs fonctions ester, éther, carbonate et carbamate.

Selon un mode de réalisation, le groupe espaceur L est un (CrCio)alkylène pouvant être substitué et/ou comprendre au moins une fonction choisie parmi le groupe constitué des aminés secondaires, des aminés tertiaires, des esters, des étheroxydes, des carbonates et des carbamates, de préférence les esters. Selon un mode de réalisation particulier, le groupement espaceur L est un polyéthylene glycol.

Selon un mode de réalisation particulier, le groupe espaceur L lié au groupe résultant de la réaction entre le groupe OH et Rx est sélectionné parmi le groupe constitué de :

-0-C(0)-(Ci-Cio)alkylène-, -O-CH ₂ -(C ₁ -C ₁₀ )alkylène-, -O-C(O)-O(C ₁ -C ₁₀ )alkylène- et -O-

C(O)-NH-(CrC ₁₀ )alkyl0ne, dans lesquels les (CrC ₁₀ )alkylènes peuvent être substitués et/ou comprendre un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi O, N et S, et/ou une ou plusieurs fonctions ester, éther, carbonate et carbamate.

Selon un mode de réalisation, le ou les éventuel(s) substituant(s) envisagé(s) pour les groupes (CrCio)alkylènes ci-dessus sont choisis parmi le groupe constitué de OH, halogène, C(0)OH, =0, (C Cio)alkyle, 0(C Cio)alkyle, OC(O)(CrCi ₀ )alkyle, (C ₂ - Cio)alcényle, C(O)O(CrCi ₀ )alkyle, NH ₂ , NH(C Cio)alkyle et N[(Ci-Ci ₀ )alkyle] _2.

Selon un mode de réalisation particulier, le groupe espaceur L lié au groupe résultant de la réaction entre le groupe OH et Rx représente un groupe -0-C(0)-(d-

C ₅ )alkylène-C(0)0-.

Selon un mode de réalisation, Rz est un hétérocycle multicyclique fusionné éventuellement substitué, de préférence un quadricycle fusionné éventuellement substitué. Selon un mode de réalisation particulier, Rz est un hétérocycle de formule suivante, éventuellement substitué:

De préférence, Rz est l'artemisinine, de formule :

où représente la liaison au groupe espaceur L.

Selon un mode de réalisation, Rz est un (C ₃ -C ₂₀ )hétérocycle éventuellement substitué par au moins un substituant choisi parmi le groupe constitué de OH, halogène, C(0)OH, =0, (Ci-Cio)alkyle, O(CrC ₁₀ )alkyle, OC(O)(CrC ₁₀ )alkyle, (C ₂ -C ₁₀ )alcényle, C(0)0(CrCio)alkyle, NH ₂ , NH(C Cio)alkyle et N[(Ci-Ci ₀ )alkyle] _2, de préférence par au moins substituant choisi parmi =0 et les (CrCi ₀ )alkyles tels que le méthyle.

Selon un mode de réalisation particulier, l'étape d'addition D est une étape d'estérification de la marmycine A :

avec l'artesunate de formule suiva

pour former le composé de formule (laD) suivante

Selon un mode particulier de réalisation, le procédé de préparation des composés de formule (laD) selon l'invention comprend les étapes suivantes :

i) étape de couplage A selon l'invention,

ii) étape de couplage B selon l'invention,

iii) étape de cyclisation Ca selon l'invention, et

iv) étape d'addition D selon l'invention.

Composés de formules (la), (Ib), (laD), (II), (III), (ΙΙΙ'), (IV), (V) et (VI)

Les modes de réalisation particuliers ci-dessous s'appliquent aux composés de formules (la), (Ib), (laD), (II), (III), (ΙΙΙ'), (IV), (V) et (VI) selon l'invention.

Selon une variante, lorsqu'au moins un des radicaux Ra est choisi parmi les groupements réactifs permettant de former une liaison C-C glycosidique, les radicaux Rd sont indépendamment choisis les uns des autres parmi le groupe constitué de : H, OH, halogène, C(0)OH, =0, (CrC ₁₀ )alkyle, O(CrC ₁₀ )alkyle, OC(O)(CrC ₁₀ )alkyle, (C ₂ - C ₁₀ )alcényle, C(O)O(CrC ₁₀ )alkyle, NH ₂ , NH(CrC ₁₀ )alkyle, N[(CrC ₁₀ )alkyle] ₂ , (C C ₁₀ )alkyle-COO ^" et le méthoxyméthyloxygène, dans lesquels lesdits alkyles peuvent être substitués.

Selon une seconde variante, lorsqu'au moins un des radicaux Rd est choisi parmi les groupements réactifs permettant de former une liaison O-C tel que AcO, les radicaux Ra sont indépendamment choisis les uns des autres parmi le groupe constitué de : H, OH, halogène, C(0)OH, =0, (CrC ₁₀ )alkyle, O(CrC ₁₀ )alkyle, OC(O)(CrC ₁₀ )alkyle, (C C ₁₀ )alkenyle, C(O)O(CrC ₁₀ )alkyle, NH ₂ , NH(CrC ₁₀ )alkyle et N[(CrC ₁₀ )alkyle] _2, dans lesquels lesdits alkyles peuvent être substitués. Selon un mode de réalisation particulier, les groupements réactifs permettant de former une liaison C-C glycosidique sont choisis parmi OH et les groupements 0(C Cio)alkyle, de préférence OH et OMe.

Les modes de réalisation ci-dessous s'entendent pour les groupements Ra à Re des composés de formules (la), (Ib), (II) et (IV), et Ra1 à Re1 lorsque ces derniers sont présents, c'est-à-dire lorsqu'il s'agit des composés de formule (laD).

Selon un mode de réalisation, Ra et Ra1 sont OH ou 0(CrC ₄ )alkyle, par exemple méthoxy.

Selon un mode de réalisation, Rb et Rb1 sont H.

Selon un mode de réalisation, Rc et Rc1 sont un (CrC ₁₀ )alkyle, de préférence un

(CrC ₄ )alkyle. Selon un mode de réalisation, Rc et Rc1 sont un méthyle.

Selon un mode de réalisation, Rd et Rd1 sont OH ou un méthoxyméthyloxygène. Selon un mode de réalisation, Rd et Rd1 ne sont pas un groupement AcO. Selon un mode de réalisation, Rd et Rd1 ne sont pas un groupement OH.

Selon un mode de réalisation, Rb et Rb1 sont H et Rc et Rc1 sont un méthyle.

Selon un mode de réalisation, Rb est H, Rc est un méthyle et Re est un méthyle.

Selon un mode de réalisation, Rb1 est H, Rc1 est un méthyle et Re1 est un méthyle.

Selon un mode de réalisation, R _{1 ;} R ₂ , R ₅ et R ₆ sont H. Selon un mode de réalisation, R _{1 ;} R ₅ et R ₆ sont H et R ₂ est un halogène, de préférence Cl, ou H.

Selon un mode de réalisation, R ₃ et R ₄ forment avec les atomes de carbone auxquels ils se rattachent un groupement (C ₆ -Ci ₀ )aryle, de préférence un phényle, éventuellement substitué;

Selon un mode réalisation, R ₃ et R ₄ forment avec les atomes de carbone auxquels ils se rattachent un phényle ou un cyclohexyle substitué par au moins substituant choisi parmi le groupe constitué de OH, méthyle, =0.

De préférence, ledit phényle ou cyclohexyle est substitué par un, deux ou trois substituants indépendamment choisis les uns des autres parmi OH, CH ₃ et =0.

Selon un mode de réalisation, lorsque R ₃ et R ₄ forment ensemble un phényle, ledit phényle n'est pas substitué par un méthyle.

Selon un mode de réalisation, les oses, les cycloalkyles et les aryles des radicaux

Ri à R ₆ peuvent être substitués au moins une fois par un substituant choisi parmi le groupe constitué de OH, halogène, C(0)OH, =0, (CrC ₁₀ )alkyle, O(CrC ₁₀ )alkyle, OC(O)(CrC ₁₀ )alkyle, (C ₂ -C ₁₀ )alcényle, C(O)O(CrC ₁₀ )alkyle, NH ₂ , NH(CrC ₁₀ )alkyle, N[(CrC ₁₀ )alkyle] ₂ , et

les alkyles compris dans les radicaux Ra, Rb, Rc, Rd et Re et Ra1 , Rb1 , Rc1 , Rd1 et Re1 sont substitués par au moins un substituant choisi parmi le groupe constitué de OH, halogène, C(0)OH, =0, O(Ci-Ci ₀ )alkyle, OC(O)(Ci-Ci ₀ )alkyle, (C ₂ -Ci ₀ )alcényle, C(0)0(Ci-Cio)alkyle, NH ₂ , NH(Ci-Ci ₀ )alkyle, N[(Ci-Ci ₀ )alkyle] ₂ .

Selon un mode de réalisation, les oses, les cycloalkyles et les aryles des radicaux Ri à R ₆ peuvent être substitués au moins une fois par un substituant choisi parmi le groupe constitué de CH ₃ , OH, =0, COOH, COMe et NMe _2, de préférence par Me, et les alkyles compris dans les radicaux Ra, Rb, Rc, Rd et Re et Ra1 , Rb1 , Rc1 , Rd1 et Re1 sont substitués par un au moins un substituant choisi parmi le groupe constitué de OH, =0, COOH, COMe, NMe _2.

La présente invention concerne également un composé de formule (II), susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention.

La présente invention concerne également un composé de formule (la) susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention.

La présente invention concerne également un composé de formule (Ib) susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention.

La présente invention concerne également un composé de formule (laD) susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention.

La présente invention concerne un composé de formule (II) suivante :

dans laquelle, les radicaux Ri à R ₆ , Ra à Re et n sont tels que définis selon l'invention.

Selon un mode de réalisation, Rc est un (CrCi ₀ )alkyle, de préférence un méthyle.

Selon un mode de réalisation, l'invention concerne un composé de formule (II) telle que définie ci-dessus, à l'exception des composés pour lesquels R ₃ et R ₄ forment avec les atomes de carbone auxquels ils se rattachent un groupement phényle. La présente invention concerne un composé de formule (la) suivante :

dans laquelle, les radicaux R- _\ à R ₆ , Ra à Re et n sont tels que définis selon l'invention, à l'exception des composés pour lesquels R ₃ et R ₄ forment avec les atomes de carbone auxquels ils se rattachent un groupement phényle, et

à l'exception des composés suivants :

La présente invention concerne un composé de formule (Ib) suivante :

dans laquelle, les radicaux Ri à R ₆ , Ra à Re et n sont tels que définis selon l'invention.

Selon un mode de réalisation, les composés de formules (la) et/ou (Ib) sont de configuration suivante :

La présente invention concerne également les composés spécifiques suivants :

Selon un mode de réalisation, lesdits composés sont de formules suivantes :

La présente invention concerne un composé de formule (laD) suivante :

dans laquelle les radicaux Ri à R _6, Ra1 à Re1 et n sont tels que définis selon l'invention.

La présente invention concerne un composé de formule (laD) de formule suivante :

Selon un aspect particulier, l'invention concerne les composés synthétiques non naturels de formule (la), (Ib) ou (laD). Selon un autre aspect, l'invention concerne les composés de formules (la) et (Ib) sous forme cristalline, et plus particulièrement la marmycine A sous la forme cristalline référencée sous le numéro CCDC1015494 (Cambridge Cristallography Data Center).

La présente invention concerne également le composé synthétique non naturel spécifique suivant :

Marmycine A

Utilisations des composés de formule (la), (Ib), (laD) et (II)

La présente invention concerne également un composé de formule (la), (Ib), (laD) ou (II) pour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'un cancer, d'une infection bactérienne et/ou du paludisme. La marmycine A est notamment connue comme ayant des propriétés cytotoxiques sur des lignées cancéreuses humaines du sein, de la prostate, du poumon, du colon, des ovaires et des leucémies (W. Fenical, J. Nat. Prod. 2007, 70, 1406-1409). La marmycine A et ses analogues s'accumulent dans les organites tels que les lysosomes et produisent des espèces réactives de l'oxygène (également appelées ROS - Reactive Oxygen Species) dans ces derniers. Ces espèces réactives de l'oxygène induiraient la perméabilisation de la membrane des organites. Cette perméabilisation induirait alors l'apoptose des cellules (cf. Oncogene (2008) 27, 6434-6451 ). Or, la perméabilisation de la membrane lysosomale en particulier est un processus perturbé dans les cellules cancéreuses. Les composés selon l'invention sont donc utiles notamment dans le traitement des cancers.

On entend par « cancers », des tumeurs malignes solides ou "liquides" (également appelés cancers hématologiques) et/ou leurs métastases. Par "métastase" on entend les tumeurs malignes secondaires formées par la migration de cellules cancéreuses à une autre localisation que celle de la tumeur maligne de départ. Les cancers hématologiques comprennent notamment les myélomes, les lymphomes et les leucémies.

Plus particulièrement, les composés de formule (la), (Ib), (laD) ou (II) selon l'invention sont utiles dans le traitement et/ou la prévention d'un cancer choisi parmi les leucémies, un cancer du colon, des ovaires, du sein, de la prostate, de l'utérus (notamment col de l'utérus), du poumon, de la vessie, du cerveau, de l'estomac, du pancréas, du foie, de l'intestin, de la tête et du cou et de la peau, de préférence un cancer du sein, de la prostate, du poumon, du colon, des ovaires et des leucémies.

Avantageusement, un ou plusieurs composés de formule (la), (Ib), (laD) ou (II) selon l'invention sont utilisés dans une méthode de traitement et/ou la prévention d'un cancer résistant, et en particulier d'un cancer présentant des cellules souches cancéreuses. Par « cancers résistants » on entend notamment les cancers résistants aux thérapies conventionnelles (comme par exemple au taxol). Il s'agit par exemple d'un traitement du cancer du sein résistant aux thérapies conventionnelles. Selon une variante, l'invention concerne un traitement d'un cancer du sein à cellules souches cancéreuses résistantes exprimant les marqueurs CD44 et sous-exprimant CD24 (CD44 ^hi9h /CD24 ^l0W )- Selon une variante, l'invention concerne un traitement d'un cancer à cellules cancéreuses résistantes exprimant par exemple la « Human telomerase reverse transcriptase » (hTERT). Selon une variante, l'invention concerne un traitement d'un cancer à cellules souches cancéreuses résistantes exprimant les marqueurs CD133 et/ou ALGH (CD133 ⁺ et/ou ALGH ⁺ ) (par exemple un glioblastome multiforme ; « Glioblastoma multiforme (GBM)). Selon une variante, les composés (la), (Ib), (laD) ou (II) selon l'invention sont utilisés en traitement thérapeutique d'un cancer en seconde ligne de traitement (second- line treatment »). Avantageusement, un ou plusieurs composés de formule (la), (Ib), (laD) ou (II) selon l'invention sont utilisés dans une méthode de traitement et/ou la prévention d'un cancer présentant des cellules souches cancéreuses.

Le tableau suivant illustre des types de tumeurs malignes solides et de façon non exhaustive, des marqueurs de surface cellulaire de leurs cellules souches cancéreuses (Laurie E Ailles and Irving L Weissman, Cancer stem cells in solid tumors. Current Opinion in Biotechnology 2007, 18:460-466 ; Tirino V, Desiderio V, Paino F, De Rosa A, Papaccio F, La Noce M, Laino L, De Francesco F, Papaccio G. Cancer stem cells in solid tumors: an overview and new approaches for their isolation and characterization. FASEB J. 2013 Jan;27(1): 13-24) :

Type de tumeur Phénotype de surface CSC

Cancer du sein/

CD44 ⁺ CD24- ^|0W

Breast cancer

Glioblastome/

CD133 ⁺

Glioblastoma

Mélanome/

CD20 ⁺

Melanoma

Cancer de la prostate/

CD447a ₂ 3 ₁ ^hi /CD133 ⁺

Prostate cancer

Cancer ovarien/

CD44 ⁺

Ovarian cancer

Cancer gastrique/

CD44 ⁺

Gastric cancer

Pancreatic cancer/

CD44 ⁺ EpCAIVT CD24 ⁺

Cancer du pancréas

Cancer du poumon/

CD133 ⁺ '

Lung cancer

CD133 ⁺

Cancer du colon

CD44 ⁺ EpCAIVT CD166 ⁺

Cancer colorectal héréditaire

sans polypose/ CD44 ⁺

HNSCC Osteosarcome/

CD133 ⁺ , CD1 17 ⁺ , Stro-1 ⁺

Osteosarcoma

Chondrosarcome/

CD133 ⁺

Chondrosarcoma

Sarcome Synovial /

CD133 ⁺

Synovial sarcoma

Sarcome d'Ewing/

CD133 ⁺

Ewing's sarcoma

Rhabdomyosarcome/

CD133 ⁺

Rhabdomyosarcoma

Myélome multiple/

CD138 ^"

Multiple myeloma

Selon une variante, l'invention concerne un traitement d'une tumeur du système hématopoïétique présentant des cellules souches cancéreuses exprimant les marqueurs CD34 et sous-exprimant CD38 (CD347CD38 ).

On entend par « infections bactériennes » les pathologies dues à la contamination de l'organisme par des bactéries.

On entend par « paludisme » ou malaria, la maladie infectieuse potentiellement mortelle due à un parasite du genre Plasmodium tels que Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, et Plasmodium malariae, propagée par la piqûre de certaines espèces de moustiques anophèles.

De préférence, les composés de formule (Ib) et (laD) sont utiles dans le traitement et/ou la prévention des cancers, d'infections bactériennes et/ou du paludisme.

De préférence, les composés de formule (la) et (laD) sont utiles dans le traitement et/ou la prévention du paludisme.

La présente invention vise également un composé de formule (la), (Ib), (laD) ou

(II) telle que définie selon l'invention pour son utilisation en tant que médicament, de préférence un composé de formule (Ib) pour son utilisation en tant que médicament.

La présente invention concerne également l'utilisation d'un composé de formule (la), (Ib), (laD) ou (II) pour la préparation d'un médicament pour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'un cancer, d'une infection bactérienne et/ou du paludisme.

La présente invention concerne également une méthode de traitement et/ou prévention des cancers, d'infections bactériennes et/ou du paludisme comprenant l'administration à un patient d'un moins un composé de formule (la), (Ib), (laD) et/ou (II). La présente invention vise également des compositions, de préférence pharmaceutiques, comprenant au moins un composé de formule (la), (Ib), (laD) et/ou (II).

La présente invention concerne donc des compositions pharmaceutiques comprenant, en tant que principe actif, au moins un composé de formule (la), (Ib) et/ou (II) selon l'invention. Ces compositions pharmaceutiques contiennent une dose efficace d'au moins un composé de formule (la), (Ib), (laD) et/ou (II) selon l'invention, ou un sel pharmaceutiquement acceptable, ainsi qu'au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. Lesdits excipients sont choisis selon la forme pharmaceutique et le mode d'administration souhaité, parmi les excipients habituels qui sont connus de l'homme du métier. Les compositions pharmaceutiques peuvent contenir d'autres composés actifs.

Dans les compositions pharmaceutiques de la présente invention pour l'administration orale, sublinguale, sous-cutanée, intramusculaire, intra-veineuse, topique, locale, intratrachéale, intranasale, transdermique ou rectale, le principe actif de formule (la), (Ib), (laD) et/ou (II) tel que défini selon l'invention, ou un sel de celui-ci, peut être administré sous forme unitaire d'administration, en mélange avec des excipients pharmaceutiques classiques, aux animaux et aux êtres humains pour le traitement et/ou la prévention des maladies mentionnées ci-dessus.

Les formes unitaires d'administration appropriées comprennent les formes par voie orale telles que les comprimés, les gélules molles ou dures, les poudres, les granules et les solutions ou suspensions orales, les formes d'administration sublinguale, buccale, intratrachéale, intraoculaire, intranasale, par inhalation, les formes d'administration topique, transdermique, sous-cutanée, intramusculaire ou intraveineuse, les formes d'administration rectale et les implants. Pour l'application topique, on peut utiliser les composés selon l'invention dans des solutions, émulsions, crèmes, gels, pommades ou lotions, sans limitation particulière à cet égard.

La présente invention concerne également l'utilisation d'un composé de formule (la), (Ib), (laD) ou (II) pour le marquage d'un organite, de préférence le lysosome.

La présente invention concerne également l'utilisation d'un composé de formule (la), (Ib), (laD) ou (II) en tant que marqueur ou biomarqueur, par exemple d'au moins un organite, de préférence le lysosome.

La présente invention concerne également un procédé de détection d'au moins un lysosome comprenant la mise en contact d'au moins une cellule, de préférence de type eucaryote, avec un composé de formule (la), (Ib), (laD) ou (II).

La présente invention concerne également un procédé de marquage d'au moins un lysosome comprenant la mise en contact d'au moins une cellule de préférence de type eucaryote, avec un composé de formule (la), (Ib), (laD) ou (II). Selon un mode de réalisation particulier, ledit procédé de détection comprend en outre les étapes suivantes :

- mise en contact de cellules vivantes avec au moins un composé de formule (la), (Ib), (laD) ou (II) ;

- détection de la présence éventuelle des composés de l'invention dans le cytosol, et plus particulièrement dans les lysosomes.

Selon une variante, le procédé de détection comprend la détection de la présence éventuelle des composés de l'invention par des moyens d'enregistrement de la fluorescence.

Selon une variante, le procédé de détection comprend la détection de la présence éventuelle des composés de l'invention par immunodétection.

Selon une variante, le procédé de détection comprend la détection des lysosomes et des composés de l'invention.

Avantageusement, l'invention concerne une méthode d'évaluation de la prolifération cellulaire mettant en œuvre un procédé de détection selon l'invention.

L'invention concerne également un kit de marquage biologique comprenant au moins un composé de formule (la), (Ib), (laD) ou (I I). Avantageusement ce kit comprend également au moins un composé détectable par imagerie, comme par exemple un composé fluorophore ou au moins un anticorps.

Description des figures

Les figures 1 , 2 et 3 montrent l'activité cytotoxique de la marmycine A et de la doxorubicine (agent intercalant utilisé dans le traitement du cancer).

La figure 1 montre le pourcentage de viabilité cellulaire en fonction de la concentration en μΜ de la marmycine A (trait plein) ou de la doxorubicine (trait en pointillés) des cellules U20S (lignée cancéreuse ostéosarcome).

La figure 2 montre le pourcentage de viabilité cellulaire en fonction de la concentration en μΜ de la marmycine A (trait plein) ou de la doxorubicine (trait en pointillés) des cellules A2780 (lignée cancéreuse ovarienne). Les IC ₅₀ obtenus sont de 9,8 μΜ pour la marmycine A et 0,06 μΜ pour la doxorubicine.

La figure 3 montre le pourcentage de viabilité cellulaire en fonction de la concentration en μΜ du composé 33 (trait plein épais), de la doxorubicine (trait en pointillés) ou d'étoposide (trait plein fin) des cellules HT1080 (lignée de fibrosarcome).

La figure 4 représente des photographies obtenues par la fluorescence dans lesquelles : « DAPI » représente le marquage au niveau du noyau cellulaire par le DAPI (4',6'-diamidino-2-phénylindole) ; «Doxorubicin » représente le marquage de la doxorubicine au niveau du noyau cellulaire; «DAPI/Marmycin A » représente le marquage au niveau cellulaire par le DAPI et le marquage de la Marmycine A au niveau des lysosomes.

La figure 5 représente des photographies obtenues par fluorescence dans lesquelles : « Marmycin A » représente le marquage et la localisation de la Marmycine A,

« DND-22 » représente le marquage et la localisation des lysosomes ; « Merge » représente la colocalisation de la Marmycine A et des lysosomes ; « ZOOM » représente une photographie avec un grossissement sur une zone particulière de la photographie

« Merge » montrant la colocalisation de la Marmycine A et des lysosomes.

La figure 6 représente des photographies obtenues par fluorescence dans lesquelles : « DAPI » représente le marquage au niveau du noyau cellulaire par le DAPI ;

« GFP-Lamp1 » représente le marquage des lysosomes par l'anticorps anti-LAMP1 ;

« Marmycin A » représente le marquage et la localisation de la Marmycine A ;

« MERGE » représente la colocalisation de la Marmycine A et des protéines lysosomales GFP-Lamp1 au niveau des lysosomes, et de DAPI au niveau du noyau cellulaire.

La figure 7 représente une analyse par Western Blot dans laquelle « 4 ! » représente la Doxorubicine et « 1 ! » la Marmycine A.

La figure 8 représente des photographies obtenues par fluorescence dans lesquelles : « DAPI » représente le marquage au niveau du noyau cellulaire par le DAPI ; « GFP-Lamp1 » représente le marquage des lysosomes par l'anticorps anti-LAMP1 ;

« Artesumycine» représente le marquage et la localisation de l'artesumycine ;

« MERGE » représente la colocalisation de l'artesumycine et des protéines lysosomales

GFP-Lamp1 au niveau des lysosomes, et de DAPI au niveau du noyau cellulaire (échelle

10 μπι).

La figure 9 représente le pourcentage de cellules MDA-MB-231 viables après 72h de traitement avec la doxorubicine (DXR) (ronds, en pointillés fins), la marmycine A (carrés, en points), l'artesunate (ronds, en pointillés épais), l'artesumycine (ronds, trait plein) et une combinaison de marmycine A et d'artesunate (ronds, en points et tirets).

La figure 10 montre une activité cytotoxique de l'artésumycine (TC5) sur une lignée cellulaire souche cancéreuse HMLER CD24-.

La figure 1 1 montre une activité cytotoxique de l'artésumycine (TC5) sur une lignée cellulaire cancéreuse HMLER ID2. EXEMPLES

Exemple 1 : Synthèse des composés de formules (V) et (VI) selon l'invention La synthèse du diénophile 5 (composé de formule (V)) est réalisée selon le schéma 1 . Le composé 8 (fournisseur AIdrich) est protégé dans des conditions classiques sous forme de naphthalène diacétylé 9 qui est ensuite bromé en milieu acide (voir Kitani, Y.; Morita, A.; Kumamoto, T.; Ishikawa, T. Helvetica Chimica Acta 2002, 85, 1 186 Carreno, M.C. et al Chem. Eur. J. 2000, 6, 906 Shis, C; Swenton, J.S. J. Org. Chem. 1982, 47, 2825).

Schéma 1 : Préparation d'un composé de formule (V)

Le diène 15 (composé de formule (VI)) est préparé à partir du composé 10 commercialement disponible (fournisseur AIdrich) selon le schéma 2. Une première étape de bromation est d'abord réalisée. Le composé 11 est protégé en acétale 12 en présence d'éthylène glycol et d'une quantité catalytique d'acide. La réaction est réalisée à une concentration de 0,4 M en moins de 2 heures au reflux du benzène. Le composé 12 est transformé en 13 par une étape de couplage pallado-catalysée afin d'y greffer la chaîne vinylique.

La déprotection de 13 en 14 se fait en milieu acide doux pour éviter l'isomérisation de la double liaison et la formation d'une cétone α-β insaturée. L'action de bromure de méthylmagnésium en présence de chlorure de cérium à froid permet la formation du diène désiré 15 de manière racémique. Schéma 2 : Préparation d'un composé de formule (VI) :

Exemple 2 : Etape de couplage A et préparation d'un composé de formule (III) selon l'invention

Le composé 16 (composé de formule ( I II')) est préparé selon le schéma 3 suivant :

Schéma 3 : Etape de couplage A et préparation d'un composé de formule (III)

Les composés 5 et 15 sont portés au reflux du toluène pendant 16 heures, le milieu subit ensuite une évaporation lente d'environ 1 heure à l'évaporateur rotatif dans un bain à 60 °C. Le milieu est repris dans le MeOH et reste sous agitation dans le noir pendant 4 heures. 3 équivalents de carbonate de potassium sont ensuite ajoutés afin d'obtenir après traitement le produit désiré 16.

Une étape d'activation de l'alcool 16 par l'anydride triflique en présence de triéthylamine dans le dichlorométhane à basse température permet d'obtenir le composé 3 (composé de formule (III)). Exemple 3 : Synthèse de l'aminopyranose

Suivant la procédure décrite dans la littérature, (cf. Raymond N. Russell, Theresa M. Weigel, Oksoo Han, Hung-wen Liu. Carbohydrate Research, Volume 201, Issue 1, 15 June 1990, Pages 95- 114 (b)Brimacombe, J. S.; Hanna, R.; Saeed, M. S.; Tucker, L. C. N. J. Chem. Soc, Perkin Trans. 1 1982, 2583-2587.) le composé 4 est préparé à partir du L-rhamnopyranose 7 (fournisseur Alfa Aeser).

Après la protection dans des conditions standard par le benzylidène en position 2 et 3, le composé 17 subit une nouvelle protection par action du MOMCI (ou méthyle chlorométhyle éther) en position 4. L'utilisation d'une base forte sur le composé 18 permet une déprotection sélective pour former la cétone 19 en position 3. Le composé 19 réagit avec l'O-benzylhydroxylamine en présence d'acétate de sodium pour former l'intermédiaire 20. En présence de chlorure de cérium et de méthyllithium le composé 20 est sélectivement méthylé en 21 qui subit une hydrogénolyse pour obtenir le produit désiré 4, selon le schéma 4 ci-dessous.

Schéma 4 : Synthèse de l'aminopyranose

Exemple 4 : Etape de couplage B, préparation des composés de formule (II) selon l'invention

Exemple 4.1 :

Le couplage B selon l'invention a été réalisé une première fois selon le schéma 5 suivant :

Schéma 5 : Etape de couplage B

Le couplage B est réalisé en présence de K ₂ C0 ₃ dans le toluène à reflux avec 20 mol% Cu-I, 2 éq. de K ₂ C0 ₃ , 3 éq. de 4 dans le toluène à 160 °C pendant 72 heures. Un rendement de 33% est obtenu.

Des conditions opératoires différentes ont également été testées, comme le montre le tableau 1 ci-dessous.

Tableau 1

Exemple 4.2 :

Le couplage B selon l'invention a été réalisé également selon le schéma 6 suivant.

Schéma 6 : Etape de couplage B

Un rendement de 33% est également obtenu.

Dans un tube sec avec septum ont été mélangés sous argon, le triflate 3 (34.00 mg, 0.081 mmol), le catalyseur Cul (3.08 mg, 0.016 mmol, 20% mol), et K ₂ C0 ₃ (22.3 mg, 0.162 mmol, 2 equiv.), puis l'aminé 4 a été ajoutée (88.64 mg, 0.405 mmol, 5 equiv.) dissoute dans 4 mL de toluène sec. Puis le septum a été replacé sur le bouchon sous argon et la reaction s'est faite à 160 ⁵ C pendant 72 h. Ensuite, le milieu a été refroidi, lavé avec une solution saturée de NaHC0 ₃ (5 ml_), et extrait avec du DCM (3x5 ml_). Les couches organiques ont été séchées sur du Na ₂ S0 ₄ et le solvant a été éliminé sous vide. Une purification par flash- chromatographie sur gel de silice (heptane/AcOEt, 8 :2) a été ensuite effectuée.

13.05 mg du composé 27 (33%, 8-(((2S,3fî,4fî,6fî)-6-methoxy-3- (methoxymethoxy)-2,4-dimethyltetrahydro-2/- -pyran-4-yl)amino)-3-methyltetraphene-7,12- dione) ont été obtenus sous forme de solide violet.

¹ H RMN (300 MHz, CDCI ₃ ) δ 10.56 (s, 1 H), 8.35 (d, J = 7.5 Hz, 1 H), 8.29 - 8.17 (m, 1 H), 7.81 - 7.62 (m, 2H), 7.57 (d, J = 7.1 Hz, 1 H), 7.46 (t, J = 8.0 Hz, 1 H), 7.35 (d, J = 8.6 Hz, 1 H), 4.89 (q, J = 6.8 Hz, 2H), 4.63 (d, J = 3.2 Hz, 1 H), 4.31 (dq, J = 9.4, 6.2 Hz, 1 H), 3.48 (s, 3H), 3.28 (d, J = 9.4 Hz, 1 H), 3.14 (s, 3H), 2.77 (d, J = 14.7 Hz, 1 H), 1 .82 (dd, J = 14.8, 4.2 Hz, 1 H), 1 .65 (s, 3H), 1 .39 (d, J = 6.3 Hz, 3H). ¹³ C NMR (126 MHz, CDCI ₃ ) δ 187.33, 185.15, 151 .03, 138.46, 137.16, 136.42, 135.50, 134.22, 134.20, 131 .96, 128.82, 128.58, 128.45, 127.74, 123.06, 120.54, 1 15.62, 1 13.84, 99.09, 97.56, 87.49, 64.48, 56.81 , 55.75, 54.90, 38.38, 26.54, 21 .73, 18.70. HRMS (ESI-TOF) calculé pour C ₂₉ H ₃₂ N0 ₆ [M+H] ⁺ 490.2224, trouvé : 490,2225.

Exemple 5 : Etape de cyclisation Ca, préparation des composés de formule (la) selon l'invention

Exemple 5.1 :

Les composés 30 et 31 sont mis en présence d'1 .5 éq de HBF ₄ (50% w/w en solution aqueuse) au reflux de CH ₃ CN. Le produit de cyclisation 1 est obtenu avec un rendement de 17%.

Ainsi, en une seule étape, la cyclisation mais également la déprotection du MOM sont réalisées, afin d'obtenir le produit naturel (schéma 7).

Schéma 7 : Etape de cyclisation Ca

Plusieurs essais ont été réalisés, comme le montre le tableau 2 ci-dessous.

Tableau 2:

En particulier, avec 60% en mol de HBF ₄ au reflux de l'acétonitrile, le produit 1 est obtenu avec un rendement de 13%.

Exemple 5.2 :

Une solution du composé 27 (21 .00 mg, 0.0429 mmol) et de HBF ₄ (5 μΙ_, 0.0429 mmol, 1 equiv.) dans 2 mL de CH ₃ CN a été mise sous reflux pendant 8h.

Le mélange a été ensuite refroidi, dilué dans du dichlorométhane (5 mL) et lavé avec une solution saturée de NaHC0 ₃ (3x5 mL). La phase organique a été séchée sur Na ₂ S0 ₄ et le solvant a été évaporé sous vide. Une chromatographie préparative sur couche mince utilisant de l'heptane/AcOEt (1 :1 ) en tant qu'éluant a permis d'obtenir 2.3 mg de Marmycine A avec un rendement de 13%

La recristallisation par évaporation d'un mélange CH ₂ CI ₂ :Heptane a permis d'obtenir des aiguilles de cristal rouges.

¹ H RMN (950 MHz, CDCI ₃ ) δ 9.59 (s, 1 H), 9.55 (d, J = 8.8 Hz, 1 H), 8.31 (d, J = 8.5 Hz, 1 H), 8.08 (d, J = 8.5 Hz, 1 H), 7.67 (s, 1 H), 7.60 (d, J = 7.3 Hz, 1 H), 7.57 (dd, J = 8.8, 1 .7 Hz, 1 H), 7.53 (d, J = 7.4 Hz, 1 H), 4.85 - 4.80 (m, 1 H), 3.22 (t, J = 9.4 Hz, 1 H), 3.17 (dq, J = 9.2, 6.0 Hz, 1 H), 2.56 (s, 1 H), 2.19 (ddd, J = 13.2, 3.2, 1 .2 Hz, 1 H), 1 .87 (dd, J = 13.2, 1 .8 Hz, 1 H), 1 .55 (s, 1 H), 1 .27 (d, J = 6.0 Hz, 1 H). ¹³ C NMR (239 MHz, CDCI ₃ ) δ 186.53, 185.77, 148.75, 138.81 , 136.56, 136.47, 136.15, 134.72, 134.65, 132.21 , 128.82, 128.54, 128.31 , 127.80, 127.42, 122.34, 1 16.13, 1 1 1 .35, 79.16, 69.36, 69.33, 51 .76, 35.05, 25.03, 21 .73, 18.43. HRMS (ESI-TOF) calculé pour C ₂₆ H ₂₄ N0 ₄ [M+H] ⁺ 414.1700, trouvé 414.1703. Exemple 6 : Etape de cyclisation Cb, préparation des composés de formule (Ib) selon l'invention

Des composés de formule (Ib) ont également été obtenus à partir des composés 28 et 32. En milieu basique fort, les produits 33 (oxamarmycine) et 34 sont obtenus, avec des rendements respectifs de 52% et 65%, comme montré par le schéma 8 ci- dessous.

Schéma 8 : Etape de cyclisation Cb

Une solution du composé 28 (5.00 mg, 0.01 12 mmol) dans 2ml_ de DMF sec a été refroidie à 0 ⁵ C et a été ajoutée à NaH (2.70 mg, 0.1 123 mmol, 10 equiv.):

après 2h à cette température, la réaction a été stoppée avec MeOH. Le solvant a été évaporé sous vide et une chromatographie préparative sur couche mince utilisant de éther de pétrole/AcOEt (8:2) en tant qu'éluant a permis d'obteni 2.54 mg d'O-Marmycine avec un rendement de 52 % (solide violet). 1 H NMR (300 MHz, CDCI ₃ ) δ 9.65 (d, J = 8.9 Hz, 1 H), 9.40 (s, 1 H), 8.37 (d, J = 8.6 Hz, 1 H), 8.07 (d, J = 8.7 Hz, 1 H), 7.66 (s, 1 H), 7.58 (m, 2H), 7.06 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 4.72 (d, J = 4.3 Hz, 1 H), 3.94 (dq, J = 12.1 , 6.1 Hz, 1 H), 3.81 (dd, J = 9.8, 1 .3 Hz, 1 H), 3.28 (s, 3H), 2.55 (s, 3H), 2.28 (d, J = 14.8 Hz, 1 H), 2.06 (dd, J = 14.6, 4.7 Hz, 1 H), 1 .38 (s, 3H), 1 .31 (d, J = 6.2 Hz, 3H). ¹³ C NMR (126 MHz, CDCI ₃ ) δ 186.01 , 185.61 , 145.39, 138.58, 136.73, 136.58, 135.08, 134.08, 131 .92, 129.62, 129.38, 128.90, 128.72, 127.77, 122.59, 1 19.66, 1 17.69, 1 12.88, 97.52, 79.61 , 62.13, 55.58, 48.38, 41 .89, 28.49, 21 .72, 17.45. HRMS (ESI-TOF) calculé pour C^H^NOs [M+H] ⁺ 444.1805, trouvé 444.1826.

Exemple comparatif 7 : Couplage effectué selon la réaction de Buchwald-Hartwig Exemple 7.1 :

Le composé 22 est obtenu dans les conditions décrites dans le schéma 3 à partir de l'alcool commercialement disponible, et l'aminé 23 est également commerciale (fournisseur AIdrich). La réaction est effectuée selon le schéma suivant : Schéma 9 : Couplage effectué selon la réaction de Buchwald-Hartwig.

Différents catalyseurs, ligands et solvants ainsi que différentes bases et températures ont été testés (cf. Tableau 3). Dans le meilleur des cas, seulement 13% du produit 24 a été observé. Le reste est du produit d'hydrolyse 25 et du réactif 22 qui n'a pas réagi.

Tableau 3

a) 5% Pd, 5% L, 1.4 eq base, 1.2 eq LiCI ;

b) 10%Pd, 15% L, 2 eq. Base, 2 eq. LiCI ;

c) 5%Pd, 10%L, 2 eq. Base, 2 eq. LiCI ;

d) 5% Pd, 10% L, 1 eq base, 1 eq LiCI ;

e) 15%Pd, 15% L, 1.2 eq base ;

f) 15%Pd, 15% L, 1.2 eq base, 1.4 eq LiCI.

Exemple 7.2 :

Le couplage a également été réalisé entre le triflate 22 et l'aminopyranose 4. Le rendement a chuté à 3% et beaucoup de produit d'hydrolyse 25 a été observé (schéma 10). Schéma 10 : Couplage effectué selon la réaction de Buchwald-Hartwig.

Par conséquent, le couplage B selon l'invention permet d'obtenir un rendement d'au moins 30 % en composé de formule (II), nettement supérieur au rendement obtenu avec un couplage de type Buchwald-Hartwig.

Exemple comparatif 8 : Essai de cyclisation effectué en présence d'un acide La voie de la C-glycosylation intramoléculaire favorisée par un acide de Lewis ou de Bronsted a été testée. Une large étude a été menée en faisant varier l'acide (BF ₃ Et ₂ 0, TMSOTf, ScOTf, InOTf, PPTS, APTS, Cp ₂ HfCI ₂ /AgCI0 ₄ ) sans résultats probants. Seules la déprotection du composé 27 en 28, et la formation de l'amino- anthraquinone 29 ont été été observés.

Schéma 11 : Cyclisation en présence d'un acide

Contrairement aux conditions opératoires de cyclisation Ca et Cb selon l'invention, la cyclisation en présence d'un acide n'a pas permis d'obtenir les composés souhaités.

Exemple 9 : Activité cytotoxique des composés selon l'invention Des essais de prolifération cellulaire ont été réalisés de la manière suivante pour démontrer l'activité cytotoxique des composés de l'invention : Des cellules U20S et A2780 achetées auprès de l'ATCC, ont été maintenues dans des milieux de McCoy's 5A ou RPMI 1640, respectivement, supplémentés avec 10% de sérum bovin (« fetal bovine sérum » (FBS)), et de 1 X Antibiotic-Antimycotic (tous de Gibco®) à 37 °C avec 5% de C0 ₂ . La mesure de viabilité cellulaire a été mise en œuvre en étalant 2000 cellules par puits dans une plaque de 96 puits. La N-Acétyl Cystéine (NAC, A9165 Sigma) ou l'inhibiteur de Pan-caspase zVAD-FMK (550377 de BD pharmingen) ont été prétraités pendant 1 heure ou 30 minutes avant le traitement avec la Marmycine A, respectivement. Le réactif « CelITiter-Blue® Reagent» (20 l/puits) a été ajouté après 24, 48, ou 72 heures de traitement, et les cellules ont été incubées pendant une heure avant la détection par fluorescence (560(20)Ex/590(10)Em) en utilisant un dispositif « Perkin Elmer Wallac 1420 Victor2 Microplate Reader ».

Le même protocole est utilisé pour évaluer la viabilité cellulaire des cellules HT1080 en présence du composé 33 de l'exemple 6 (dénommé Oxaméthoxymarmycine ou « Oxamethoxymarmycin » en anglais), de la doxorubicine, ou d'étoposide.

Les résultats sont représentés sur les figures 1 à 3.

Sur la figure 1 , les IC ₅₀ (« IC ₅₀ » représentant la concentration inhibitrice médiane des cellules par le composé évalué) obtenues sont de 10,3 μΜ pour la marmycine A et 0,1 μΜ pour la doxorubicine, à 72 heures.

Sur la figure 2, les IC ₅ o obtenues sont de 9,8 μΜ pour la marmycine A et 0,06 μΜ pour la doxorubicine, à 72 heures.

Sur la figure 3, les IC ₅₀ obtenues sont de 75 μΜ pour l'Oxaméthoxymarmycine, de 0,035 μΜ pour la doxorubicine, et de 0.5 μΜ pour l'étoposide, à 72 heures.

Exemple 10 : Localisation cellulaire des composés selon l'invention

Des cellules U20S cultivées avec moins de 40% de confluence ont été traitées pendant 24 heures avec 10 μΜ de composé sauf indication contraire. Le marqueur LysoTracker® Blue DND-22 (L7525, Molecular Probes®) a été ajouté 30 minutes avant fixation. GFP-Lamp1 a été transfecté de manière transitoire selon les instructions commerciales. Pour résumer, 5 mL of CelILighl® Lysosomes-GFP BacMam 2.0 (C10596, Life Technologies) ont été mélangés avec 200 μΜ de milieu de culture U20S et ajoutés à chaque puits d'une plaque de 24 puits. Après incubation toute la nuit (16 heures), les cellules ont été lavées et traitées avec la Marmycine A comme indiqué à l'exemple 9. Pour l'analyse par immunofluorescence, les cellules ont été fixées 12 minutes dans 2% de formaldehyde/PBS, perméabilisées 10 min avec 0.1 % Triton X/PBS et fixées pendant 1 h avec 5% BSA, 0.2% Tween-20/PBS (tampon fixateur ou « blocking buffer »). Des lamelles couvre-objet ont été incubées avec des anticorps anti-LAMP1 , p62, dilués à 1/100 dans le tampon fixateur toute la nuit à 4 °C. Les cellules ont été ensuite lavées 3 fois avec 0.2% Tween-20/PBS, et incubées comme décrit ci-dessus avec un anticorps secondaire conjugué Alexa 488 anti-souris « anti-mouse Alexa 488-conjugated secondary antibody » (A1 1029, Invitrogen) dilué à 1/500 dans le tampon fixateur. Les lamelles couvre-objet ont été lavées comme décrit ci-dessus et montées avec un milieu de montage VectaShield® pour analyse par fluorescence avec ou sans DAPI (Vector Laboratories Ltd). Les images obtenues ont été prises avec un microscope Leica (Zeiss) et analysées avec le logiciel ImageJ.

La figure 4 à 6 représente des photographies obtenues par fluorescence. La figure

4 illustre par la comparaison des différentes photographies que la Marmycine A n'est pas localisée au niveau du noyau cellulaire, mais à l'emplacement des lysosomes.

La figure 5 illustre la colocalisation de la Marmycine A avec les lysosomes. La Marmycine A est donc présente et s'accumule dans les lysosomes.

La figure 6 illustre également que la Marmycine A s'accumule dans les lysosomes.

Exemple 11 : Western blot

Les cellules avec le traitement indiqué selon l'exemple 10 ont été lavées deux fois dans du PBS et lysées avec un tampon Laemmli 2X. Les extraits cellulaires ont été portés à ébullition pendant cinq minutes à 100 °C et quantifiés avec le dispositif Nanodrop 2000 (Thermal Scientific). 100 μg de lysat de protéines ont été séparés avec un gel 4-20% Mini- PROTEAN ^® TGX Stain-Free™ (BioRad) et transférés sur membrane nitrocellulose (Amersham). Les tâches ont été détectées avec différents anticorps, tels que anti-3-actin (ab8226, Abcam), anti-p62 (610833, BD Transduction Laboratories™), anti-H2AX (PA1 - 14198, Thermal Scientific), anti-gH2AX (Ser139) (#2577, Cell Signaling), anti-p21 , anti- p53 (1 C12) (#2524, Cell Signaling), anti-p-p53, anti-LC3B (#2775, Cell Signaling), anti- BID dilués à 1/1000 dans 5% BSA, 0.1 % Tween-20/TBS. L'analyse par western Blot montre précisément que la Marmycine A (« 1 ! ») induit une réponse n'endommageant que légèrement l'ADN qui est dépendante de la caspase, ce qui est en accord avec l'absence de marquage direct du génome, alors que la Doxorubicine (« 4 ! ») engendre une réponse endommageant l'ADN (phosphorylation de H2AX sur la ser139, phosphorylation de P53, induction de P21 ). Exemple 12 : Préparation des composés de formule (laD), étape d'addition D selon l'invention

A un mélange de marmycine A (2.3 mg, 0.0055 mmol), d'artesunate (2.1 mg, 0.0056 mmol) et de 4-diméthylaminopyridine (DMAP) (0.7 mg, 0.0006 mmol, 10 mol%) dans du dichlorométhane sec (0.3 mL) est ajoutée une solution de Ν,Ν'- dicyclohexylcarbodiimide (1.1 mg, 0.0055 mmol) dans du dichlorométhane (0.2 mL) à 0° C. La solution en résultant est mélangée toute la nuit à température ambiante et ensuite concentrée jusqu'à obtenir un résidu sec.

Le produit brut est purifié par chromatographie à couches minces (heptane/AcOEt,

1 :1) pour obtenir un solide rouge dénommée artesumycine (1.8 mg, 42%).

¹ H NMR (500 MHz, CDCI ₃ ) δ 9.65 (s, 1H), 9.59 (d, J= 9.0 Hz, 1H), 8.39 (d, J= 8.5 Hz, 1 H), 8.11 (d, J=9.0 Hz, 1 H), 7.69 (s, 1 H), 7.63-7.56 (m, 2H), 7.50 (d, J=7.5 Hz, 1H), 5.80 (d, J= 9.5 Hz, 1H), 5.41 (s, 1H), 4.83 (s, 1H), 4.79 (d, J= 9.5 Hz, 1H), 3.44 (dq, J = 12.0, 6.0 Hz, 1H), 2.79-2.74 (m, 4H), 2.58-2.54 (m, 4H), 2.36 (td, J= 14.0, 4.0 Hz, 1H), 2.25 (dd, J= 13.0, 2.0 Hz, 1H), 2.02 (ddd, J= 7.5, 4.0, 3.0 Hz, 1H), 1.89-1.86 (m, 2H), 1.75 (dd, J= 13.5, 4.0 Hz, 2H), 1.67 (dd, J= 13.0, 3.0 Hz, 1H), 1.62-1.58 (m, 2H), 1.44- 1.41 (m, 4H), 1.42 (s, 3H), 1.35 (dd, J= 13.0, 3.0 Hz, 1H), 1.09 (d, J= 6.0 Hz, 3H), 1.95- 1.02 (m, 1H), 0.93 (d, J= 6.0 Hz, 3H), 0.86 (d, J= 7.0 Hz, 3H). ¹³ C NMR (151 MHz, CDCI ₃ ) δ 186.6, 185.6, 172.1, 171.2, 148.6, 138.7, 136.5, 135.9, 134.9, 134.6, 132.2, 128.8, 128.6, 128.3, 127.8, 126.7, 122.5, 115.9, 111.0, 104.6, 92.3, 91.5, 80.2, 79.6, 69.3, 66.4, 51.5, 51.1, 45.2, 37.3, 36.2, 35.0, 34.1, 31.9, 29.8, 29.1, 28.9, 26.1 , 25.1 , 24.6, 22.1, 21.7, 20.3, 18.0, 12.2. HRMS (ESI-TOF) calculé pour [M+Na] ⁺ 802.3198, trouvé à 802.3204. W +253 (c 0.015, tetrahydrofurane).

Exemple 13 : Localisation cellulaire des composés de formule (laD) selon l'invention

Des cellules U20S cultivées avec moins de 40% de confluence ont été traitées pendant 24 heures avec 10 μΜ d'artesumycine. Le marqueur LysoTracker® Blue DND-22 (L7525, Molecular Probes®) a été ajouté 30 minutes avant fixation. GFP-Lamp1 a été transfecté de manière transitoire selon les instructions commerciales. Pour résumer, 5 mL of CelILight® Lysosomes-GFP BacMam 2.0 (C10596, Life Technologies) ont été mélangés avec 200 μΜ de milieu de culture U20S et ajoutés à chaque puits d'une plaque de 24 puits. Après incubation toute la nuit (16 heures), les cellules ont été lavées et traitées avec de l'artesiimycine comme indiqué à l'exemple 9. L'analyse par immunofluorescence a été réalisée de la même façon qu'à l'exemple 10.

La figure 8 représente des photographies obtenues par fluorescence et illustre la colocalisation de l'artesumycine avec les lysosomes. L'artesumycine est donc présente et s'accumule dans les lysosomes.

Exemple 14 : Activité cytotoxique des composés de formule (laD) selon l'invention Des essais de prolifération cellulaire ont été réalisés de la même manière que présenté à l'exemple 9 pour démontrer l'activité cytotoxique des composés de formule (laD) selon l'invention.

Des cellules MDA-MB-231 (cellules cancéreuses humaines provenant du sein) achetées auprès de l'ATCC, ont été maintenues dans un milieu de McCoy's 5A, supplémenté avec 10% de sérum bovin (« fetal bovine sérum » (FBS)), et de 1 X Antibiotic-Antimycotic (tous de Gibco®) à 37 °C avec 5% de C0 ₂ .

La mesure de viabilité cellulaire a été mise en œuvre en étalant 2000 cellules par puits dans une plaque de 96 puits. La N-Acétyl Cystéine (NAC, A9165 Sigma) ou l'inhibiteur de Pan-caspase zVAD-FMK (550377 de BD pharmingen) ont été prétraités pendant 1 heure ou 30 minutes avant le traitement avec les composés testés, respectivement. Le réactif « CelITiter-Blue® Reagent» (20Ml/puits) a été ajouté après 24, 48, ou 72 heures de traitement, et les cellules ont été incubées pendant une heure avant la détection par fluorescence (560(20)Ex/590(10)Em) en utilisant un dispositif « Perkin Elmer Wallac 1420 Victor2 Microplate Reader ».

Les composés testés sont la doxorubicine, la marmycine A, l'artesunate, l'artesumycine et une combinaison de la marmycine A et de l'artesunate (cf. Figure 9).

La figure 9 montre une activité cytotoxique sur une lignée cellulaire cancéreuse de la marmycine A et de l'artesumycine. L'artesumycine à une concentration de 0,9 μηι permet d'obtenir une viabilité cellulaire inférieure à 50 %. L'activité cytotoxique de l'artesumycine est supérieure à celle de la marmycine A et également supérieure à celle de la combinaison de la marmycine A avec l'artesunate. L'IC50 de l'artesumycine est de 0,9 μΜ. L'IC50 de la combinaison artesunate avec la marmycine A est de 10 μΜ.

On observe donc un effet synergique obtenu avec l'artesumycine comparé à l'activité de la combinaison marmycine A et artesunate. Exemple 15 : Activité cytotoxique des composés de formule (laD) selon l'invention

Viabilité cellulaire: la viabilité cellulaire a été évaluée par le protocole suivant:

Etalement sur une plaque de 96 puits de 1000 cellules/puits. Les céllules ont été traitées pendant 72 heures. Après 72 heures de traitement en a ajouté le réactif CelITiter- Blue® Reagent (G8081 , Promega) et les cellules ont été incubées pendant une heure avant enregistrement des intensités de fluorescence (Excitation, 560/20 nm; Emission, 590/10 nm) en utilisant un appareillage Perkin Elmer Wallac 1420 Victor2 Microplate Reader.

Les résultats sont présentés sur les figures 10 et 1 1 avec différentes cultures cellulaires.

Culture cellulaire : le matériel suivant a été utilisé : tampon salin « Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline » (14190-094, 500 mL, Gibco), DMEM/F12 (31331 -028, 500 mL, Gibco), DMEM haut glucose avec UltraGlutamine (BE12- 604F/U1 , BioWhittaker, Lonza), milieu McCoy's 5A (Modifié) (26600-023, Gibco), RPMI 1640 avec L-glutamine (BE12-702F/U1 , BioWhittaker, Lonza), sérum bovin (« Fetal Bovine Sérum » FBS, 10270- 106, Gibco), Hydrocortisone (H0888, Sigma), Insuline (10516, Sigma or I9278, Sigma), facteur de croissance « BD Epidermal growth factor human recombinant » (hEGF, 354052, BD Biosciences), PEN-STREP (DE17-602E, BioWhittaker, Lonza), dihydrochlorure de Puromycin (A1 1 138-02, 460 Life Technologies).

La lignée cellulaire épithéliale mammaire humaine « human mammary epithelial cell line" a été infectée avec un rétrovirus portant hTERT, SV40 et l'allele oncogénétique HrasV12, dénommé cellules HMLER CD44high/CD24low, n'exprimant pas E-cadherin et Vimentin (référence HMLER CD24low ou HMLER CD44+/CD24-), offerte généreusement par A. Puisieux (INSERM).

La lignée référencée HMLER ID2 est une lignée transformée hTert, SV40, HRasV12 isogénique mais non souche.

Les cellules HMLER CD44 ^/1i9/1 /CD24 ^,olv (cellules souches cancéreuses ; « Cancer stem cell » ; CSCs), HMLER CD44 ^/ ^ ^/ 7CD24 ^/1 '^ (non-CSCs) ont été cultivées dans un milieu DMEM/F12 supplémenté avec 10% de FBS, 10 μg/mL d'insuline, 0.5 μg/mL d'hydrocortisone, 10 ng/mL hEGF, et 0.5 μg/mL de puromycine.

Un test de mycoplasme a été réalisé en utilisant un kit PCR de détection de mycoplasme (G238, 470 Applied Biological Materials) confirmant l'absence de contamination des cellules. Les composés testés sont la doxorubicine, l'artésunate, et l'artésumycine (TC5) (cf. Figures 10 et 1 1 ).

La figure 10 montre une activité cytotoxique de l'artésumycine sur une lignée cellulaire souche cancéreuse HMLER CD24-. L'artésumycine à une concentration de 1 μηι permet d'obtenir une viabilité cellulaire bien inférieure à 50 % (environ 18%). L'activité cytotoxique de l'artésumycine est supérieure à celle de l'artésunate. L'IC50 de l'artésumycine est de 10OnM.

La figure 1 1 montre une activité cytotoxique de l'artésumycine sur une lignée cellulaire cancéreuse HMLER ID2. L'artésumycine à une concentration de 0,1 μηι permet d'obtenir une viabilité cellulaire bien inférieure à 50 % (environ 44%). L'activité cytotoxique de l'artésumycine est supérieure à celle de l'artésunate. L'IC50 de l'artésumycine est de 98nM.

Ces résultats illustrent l'efficacité de l'artésumycine sur des lignées cellulaires malignes humaines résistantes aux thérapies conventionnelles comme le taxol, tant souches que non souches.