[0001] 本发明涉及分子生物学与生物技术领域， 特别涉及一种利用生物催化技术制备 烟酰胺单核苷酸的方法。

背景技术

[0002] 烟酰胺单核苷酸 （Nicotinamide mononucleotide, 缩写成 NMN) 是生物细胞内 存在的一种生化物质， 它在被烟酰胺核苷酸腺苷转移酶腺苷化后即转 化成生物 细胞所赖以生存的重要物质烟酰胺腺嘌呤二核 苷酸 （NAD， 又称辅酶 I) ， 并且 同吋直接参与体内腺苷转移， 其在生物细胞内的水平直接影响到 NAD的浓度， 在生物细胞能量生成中扮演着重要角色， 并且对人体无危害。

[0003] 截至目前， 人们已经发现烟酰胺单核苷酸具有诸如延缓衰 老、 治疗帕金森等老 年病、 调节胰岛素分泌、 影响 mRNA的表达等诸多医疗保健用途， 更多的用途还 在不断研发出来。 随着人们对烟酰胺单核苷酸药用及保健效果认 知的增加， 以 及作为一种反应底物在化工方面的广泛应用， 市场上对烟酰胺单核苷酸的需求 量与日俱增。

[0004] 目前， NMN的制备方法主要包括以下三种： 1、 酵母菌发酵法； 2、 化学合成 法； 3、 生物催化法。 其中， 化学合成法具有成本较高且产生手性化合物的 缺点 ； 而酵母菌发酵法生产的 NMN含一定有机溶剂残留； 生物催化法因不含机溶剂 残留， 也不存在手性问题且制备的 NMN与机体内的同型而成为目前最绿色环保 无公害的 NMN的制备方法。 现有的制备 NMN的生物催化法一般是以烟酰胺和 5'- 磷酸核糖基 -1'-焦磷酸 （PRPP) 为底物， 在烟酰胺磷酸核糖转移酶 （Nicotinamid e phosphoribosyltransferase, 缩写成 Nampt) 的催化下制备 NMN。 但是， 因 PRPP 的市场价格较高且来源受限， 导致该生物催化法的生产成本较高， 严重制约了 其应用和发展。

[0005] 因此， 有必要幵发一种无需使用 PRPP作为底物的利用生物催化技术制备 NMN 的新方法。 技术问题

[0006] 针对上述背景技术中提到的现有的烟酰胺单核 苷酸的制备方法存在的诸多问题 ， 本发明的目的在于提供一种利用生物催化技术 制备 NMN的新方法， 该方法可 避幵使用价格较高且来源受限的 PRPP作为底物， 具有价格低廉、 绿色环保无公 害、 适宜大规模工业化生产等优点。

问题的解决方案

技术解决方案

[0007] 为实验上述目的， 发明人经过长期大量的实验摸索， 终于幵发出一种制备烟酰 胺单核苷酸的方法， 其特征在于： 以烟酰胺、 ATP和核糖为原料， 在烟酰胺磷酸 核糖转移酶、 核糖磷酸焦磷酸激酶以及核糖激酶的催化作用 下发生反应， 制得 烟酰胺单核苷酸。

[0008] 根据酶的国际系统命名法， 上述方法中所使用的酶的 EC编号分别为： 烟酰胺 磷酸核糖转移酶 EC 2.4.2.12， 核糖磷酸焦磷酸激酶 EC 2.7.6.1， 核糖激酶 EC 2.7.1.15。

[0009] 上述方法中所使用的各种酶的具体存在形式包 括酶液、 酶冻干粉、 含酶细胞以 及各种固定化酶和固定化含酶细胞， 可以是未经纯化的粗酶形式， 也可以是经 部分纯化或完全纯化的形式。

[0010] 为提高所使用酶的稳定性和重复利用率， 以更好地完成上述催化反应并更进一 步降低成本， 上述方法中优选使用固定化酶。 该固定化酶的制备方法大致为： 用洗酶缓冲液 （0.02M Tris-HCl/0.001M EDTA， pH7.0溶液） 将酶稀释至蛋白含 量为 5-10mg/ml， 再将酶稀释液与 PB溶液 （2.0mol/L磷酸二氢钾， pH7.5) 等体积 混合， 然后加入酶固定化载体 （50毫克酶 /克载体） ， 于摇床 （转速 150rpm) 中 2 5°C反应 20小吋。 反应完成后用滤袋过滤， 用洗酶缓冲液清洗 5-6次， 即得固定化 酶。 其中的酶固定化载体可以选用环氧型 LX-3000、 二氧化硅、 活性炭、 玻璃珠 以及大孔型聚 N-氨乙基丙烯酰胺 -聚乙烯等。

[0011] 优选地， 所述反应在温度为 30-50°C， pH值为 6.5-8.5的条件下进行。

[0012] 更优选地， 所述反应在温度为 35-45°C， pH值为 7.0-8.0的条件下进行吋转化率 最高。 [0013] 优选地， 所述反应在 Mg 2+和 K +存在的条件下进行。

[0014] 优选地， 所述反应在 Tris-HCl缓冲液中进行。

[0015] 优选地， 所述烟酰胺的浓度为 l-150mM， 所述 ATP的浓度为 l-50mM， 所述核 糖的浓度为 l-100mM。

[0016] 优选地， 所述原料中烟酰胺、 ATP、 核糖的摩尔比为 1-4:1:1-4。 按照此种配比 投放原料可使 ATP得到充分反应， 其转化率为 80<¾-100<¾。 因为在三种原料中， 以 ATP的售价为最高， 故而此种配比可较大程度地降低生产成本。 更优选地， 所 述原料中烟酰胺、 ATP、 核糖的摩尔比为 1.5:1:1.5， 反应以底物 ATP计算的转化 率为 100%， 且成本最低。

[0017] 反应完成后得到的烟酰胺单核苷酸粗产品溶液 可采用本领域已知的常规技术手 段进行过滤、 纯化和干燥处理， 即得烟酰胺单核苷酸成品。

[0018] 优选地， 上述方法中所使用的烟酰胺磷酸核糖转移酶为 如下 （a) 或 （b) 的蛋 白质：

[0019] (a) 其氨基酸序列如 SEQ ID NO: 3所示的蛋白质，

[0020] (b) 在 （a) 限定的氨基酸序列中经过取代、 缺失或添加一个或几个氨基酸并 且以烟酰胺和 PRPP为底物具有比氨基酸序列如 SEQ ID NO: 2所示的亲本高的烟 酰胺磷酸核糖转移酶催化活性的由 ) 衍生的蛋白质。

[0021] 上述烟酰胺磷酸核糖转移酶是发明人对来自 Meiothermus ruber DSM 1279的核 苷酸序列如 SEQ ID NO: 1所示的亲本烟酰胺磷酸核糖转移酶的基因进� �定点突 变， PCR扩增后插入适当的载体， 随后在 LB+卡那霉素培养基上筛选而获得的一 系列具有高催化活性的烟酰胺磷酸核糖转移酶 突变体， 这些突变体的高催化活 性可极大地降低工业上应用生物催化技术生产 烟酰胺单核苷酸的成本， 具有较 高的工业应用价值。

[0022] 优选地， 所述烟酰胺磷酸核糖转移酶与如 SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列相 比在选自至少一个下述位点处具有至少一个突 变： 第 180位、 第 182位、 第 231位 、 第 298位、 第 338位以及第 377位。

[0023] 更优选地， 所述烟酰胺磷酸核糖转移酶具有至少一个下述 突变： F180A、 F180 W、 A182Y、 E231A、 E231Q、 D298A、 D298N、 D298E、 D338N、 D338E、 D37 7A、 D377N以及 D377E。

发明的有益效果

有益效果

[0024] 1、 与现有的烟酰胺单核苷酸的制备方法相比， 本发明提供的方法既克服了化 学合成法和酵母菌发酵法的缺陷， 又成功避免了价格昂贵且来源受限的 PRPP的 使用， 该方法以底物 ATP计算的转化率高达 100%， 属于现今烟酰胺单核苷酸的 制备方法中最为绿色环保无公害、 适宜大规模工业化生产且价格低廉的一种。

[0025] 2、 本发明提供的方法中使用的烟酰胺磷酸核糖转 移酶是一种经人工诱导定点 突变获得的突变体， 与现有的野生型相比， 该突变体的酶活力大大提高， 经酶 活测定， 以烟酰胺和 PRPP为底物， 该突变体的酶催化活性是亲本的 1.2-6.9倍， 如此高的催化活性使其可以未经纯化以粗酶形 式使用， 或者只须部分纯化， 这 就使得应用本发明提供的烟酰胺磷酸核糖转移 酶突变体催化生产 NMN的成本大 大降低， 具有较高的市场竞争力， 能够满足将 NMN的生物催化方法应用于大规 模工业化生产的需求。

本发明的实施方式

[0026] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细 说明， 以下实施例是对本发明的 解释， 本发明并不局限于以下实施例， 实施例中未注明具体条件者， 按常规条 件或制造商建议的条件进行。

[0027] 本发明提供的烟酰胺单核苷酸的制备方法可以 是将所有原料及酶一并加入的一 步投料方式也可以是分步投料方式， 一步投料方式具有操作简单、 反应吋间短 的优点， 分步投料方式具有反应彻底、 转化率高的优点， 其具体实施过程如下

[0028] 一步投料方式：

[0029] 将各原料溶解于水中配制底物溶液， 该底物溶液的组成为 l-150mM的烟酰胺、 l-50mM的 ATP、 1-lOOmM的核糖、 l-30mM的 MgCl ₂

、 l-20mM的 KC1以及 50-100mM的 Tris-HCl缓冲液， 调 pH至 6.5-8.5。 然后向底物 溶液中加入催化用的各种酶， 各种酶的加入量分别为： 烟酰胺磷酸核糖转移酶 1- lOOg/L底物溶液， 核糖磷酸焦磷酸激酶 1- 100g/L底物溶液， 核糖激酶 1- 100g/L底 物溶液。 搅拌均匀后进行反应， 反应过程中持续搅拌 （搅拌速度 50rpm) ， 控制 反应温度为 30-50°C， 维持 pH值为 6.5-8.5。 反应 l-8h后即得烟酰胺单核苷酸粗产 品溶液， 再经过滤、 纯化、 干燥后即得烟酰胺单核苷酸成品。

[0030] 分步投料方式：

[0031] 将各原料溶解于水中配制底物溶液， 该底物溶液的组成为 l-50mM的 ATP、 1-10 OmM的核糖、 l-30mM的 MgCl ₂ 、 l-20mM的 KC1以及 50-100mM的 Tris-HCl缓冲液 ， 调 pH至 6.5-8.5。 然后向底物溶液中加入以下催化用酶： 核糖磷酸焦磷酸激酶 1- 100g/L底物溶液， 核糖激酶 l-100g/L底物溶液。 搅拌均匀后进行反应， 反应过程 中持续搅拌 （搅拌速度 50rpm) ， 控制反应温度为 30-50°C， 维持 pH值为 6.5-8.5。

[0032] 待上述反应进行 l-8h后， 分离出反应液， 再向反应液中加入 1-lOOmM的烟酰胺 、 l-30mM的 MgCl ₂

、 50- lOOmM的 Tris-HCl缓冲液以及烟酰胺磷酸核糖转移酶 1- 100g/L底物溶液， 搅 拌均匀后继续反应， 反应过程中持续搅拌 （搅拌速度 50rpm) ， 控制反应温度为 30-50°C, 维持 pH值为 6.5-8.5， 再反应 l-8h后即得烟酰胺单核苷酸粗产品溶液， 再经过滤、 纯化、 干燥后即得烟酰胺单核苷酸成品。

[0033] 以下实施例中所使用的酶， 除烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体是从来自 Meiother mus ruber DSM 1279的核苷酸序列如 SEQ ID NO: 1所示的亲本烟酰胺磷酸核糖 转移酶经人工诱导定点突变获得的之外， 其余烟酰胺磷酸核糖转移酶、 核糖磷 酸焦磷酸激酶以及核糖激酶均是从市场上直接 购入的酶冻干粉。

[0034] 实施例 1

[0035] 烟酰胺单核苷酸的制备

[0036] 向反应釜中加入底物溶液， 含 ImM的烟酰胺、 ImM的 ATP、 ImM的核糖、 lm M的 MgCl ₂ 、 ImM的 KC1以及 50mM的 Tris-HCl缓冲液， 调 pH至 6.5-7.0。 然后向底 物溶液中加入催化用的各种酶， 各种酶的加入量分别为： 烟酰胺磷酸核糖转移 酶 lg/L底物溶液， 核糖磷酸焦磷酸激酶 lg/L底物溶液， 核糖激酶 lg/L底物溶液。 搅拌均匀后进行反应， 反应过程中持续搅拌 （搅拌速度 50rpm) ， 控制反应温度 为 30°C， 维持 pH值为 6.5-7.0。 反应 lh后即得烟酰胺单核苷酸粗产品溶液 （含 NM N0.5mM) ， 再经过滤、 纯化、 干燥后即得烟酰胺单核苷酸成品。

[0037] 实施例 2

[0038] 烟酰胺单核苷酸的制备

[0039] 向反应釜中加入底物溶液， 含 15mM的 ATP、 lOOmM的核糖、 10mM的 MgCl ₂ 、 10mM的 KC1以及 70mM的 Tris-HCl缓冲液， 调 pH至 7.0-7.5。 然后向底物溶液中 加入以下催化用酶： 核糖磷酸焦磷酸激酶 20g/L底物溶液， 核糖激酶 20g/L底物溶 液。 搅拌均匀后进行反应， 反应过程中持续搅拌 （搅拌速度 50rpm) ， 控制反应 温度为 35°C， 维持 pH值为 7.0-7.5。

[0040] 待上述反应进行 3h后， 分离出反应液， 并将反应液送入另一反应釜中， 再向反 应液中加入 60mM的烟酰胺、 10mM的 MgCl ₂ 、 70mM的 Tris-HCl缓冲液以及烟酰 胺磷酸核糖转移酶 20g/L底物溶液， 搅拌均匀后继续反应， 反应过程中持续搅拌 (搅拌速度 50rpm) ， 控制反应温度为 35°C， 维持 pH值为 7.5-8.0， 再反应 3h后即 得烟酰胺单核苷酸粗产品溶液 （含 NMN7.3mM) ， 再经过滤、 纯化、 干燥后即 得烟酰胺单核苷酸成品。

[0041] 实施例 3

[0042] 烟酰胺单核苷酸的制备

[0043] 向反应釜中加入底物溶液， 含 35mM的 ATP、 70mM的核糖、 20mM的 MgCl ₂ 、 15mM的 KC1以及 lOOmM的 Tris-HCl缓冲液， 调 pH至 7.5-8.0。 然后向底物溶液 中加入以下催化用酶： 核糖磷酸焦磷酸激酶 50g/L底物溶液， 核糖激酶 50g/L底物 溶液。 搅拌均匀后进行反应， 反应过程中持续搅拌 （搅拌速度 50rpm) ， 控制反 应温度为 40°C， 维持 pH值为 7.5-8.0。

[0044] 待上述反应进行 5h后， 分离出反应液， 并将反应液送入另一反应釜中， 再向反 应液中加入 60mM的烟酰胺、 20mM的 MgCl ₂ 、 lOOmM的 Tris-HCl缓冲液以及烟 酰胺磷酸核糖转移酶 50g/L底物溶液， 搅拌均匀后继续反应， 反应过程中持续搅 拌 （搅拌速度 50rpm) ， 控制反应温度为 40°C， 维持 pH值为 7.5-8.0， 再反应 5h后 即得烟酰胺单核苷酸粗产品溶液 （含 NMN17.2mM) ， 再经过滤、 纯化、 干燥后 即得烟酰胺单核苷酸成品。

[0045] 实施例 4 [0046] 烟酰胺单核苷酸的制备

[0047] 向反应釜中加入底物溶液， 含 150mM的烟酰胺、 50mM的 ATP、 lOOmM的核糖 、 30mM的 MgCl ₂ 、 20mM的 KC1以及 lOOmM的 Tris-HCl缓冲液， 调 pH至 8.0-8.5。 然后向底物溶液中加入催化用的各种酶， 各种酶的加入量分别为： 烟酰胺磷酸 核糖转移酶 100g/L底物溶液， 核糖磷酸焦磷酸激酶 100g/L底物溶液， 核糖激酶 10 Og/L底物溶液。 搅拌均匀后进行反应， 反应过程中持续搅拌 （搅拌速度 50rpm) ， 控制反应温度为 50°C， 维持 pH值为 8.0-8.5。 反应 8h后即得烟酰胺单核苷酸粗 产品溶液 （含 NMN24.9mM) ， 再经过滤、 纯化、 干燥后即得烟酰胺单核苷酸成 p

[0048] 实施例 5

[0049] 烟酰胺单核苷酸的制备

[0050] 制备固定化酶： 用洗酶缓冲液 （0.02M Tris-HCl/0.001M EDTA， pH7.0溶液） 分别将烟酰胺磷酸核糖转移酶、 核糖磷酸焦磷酸激酶以及核糖激酶稀释至蛋白 含量为 5-10mg/ml， 再将酶稀释液与 PB溶液 （2.0mol/L磷酸二氢钾， pH7.5) 等体 积混合， 然后加入酶固定化载体环氧型 LX-3000 (50毫克酶 /克载体） ， 于摇床 ( 转速 150rpm) 中 25°C反应 20小吋。 反应完成后用滤袋过滤， 用洗酶缓冲液清洗 5- 6次， 即分别得到固定化烟酰胺磷酸核糖转移酶、 固定化核糖磷酸焦磷酸激酶以 及固定化核糖激酶。

[0051] 向反应釜中加入底物溶液， 含 30mM的烟酰胺、 20mM的 ATP、 30mM的核糖、 15mM的 MgCl ₂ 、 15mM的 KC1以及 lOOmM的 Tris-HCl缓冲液， 调 pH至 7.0-7.5。 然 后向底物溶液中加入催化用的各种酶， 各种酶的加入量分别为： 固定化烟酰胺 磷酸核糖转移酶 10g/L底物溶液， 固定化核糖磷酸焦磷酸激酶 10g/L底物溶液， 固 定化核糖激酶 10g/L底物溶液。 搅拌均匀后进行反应， 反应过程中持续搅拌 （搅 拌速度 50rpm) ， 控制反应温度为 37°C， 维持 pH值为 7.0-7.5。 反应 4h后即得烟酰 胺单核苷酸粗产品溶液 （含 NMNlOmM) ， 再经过滤、 纯化、 干燥后即得烟酰 胺单核苷酸成品。

[0052] 实施例 6

[0053] 烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的制备 [0054] 本发明提供的方法中用到的人工诱导定点突变 的烟酰胺磷酸核糖转移酶的制备 过程大致为： 首先构建含有亲本烟酰胺磷酸核糖转移酶基因 的载体质粒， 然后 设定定点突变的位点以及突变后的氨基酸种类 ， 再合成适当的引物， 以含亲本 烟酰胺磷酸核糖转移酶基因的载体质粒为模板 ， PCR扩增 DNA片段、 装配所扩 增的 DNA片段以及 PCR扩增全长突变基因。 然后将该全长突变基因克隆到适当 的载体上并转化适当的宿主细胞， 经培养筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活 性的阳性克隆。 最后从阳性克隆中提取质粒 DNA， 进行 DNA序列测定分析， 以 确定引入的突变， 在确定目的片段插入到载体上后， 通过 LB+卡那霉素培养基筛 选， 从而获得一系列具有高催化活性的烟酰胺磷酸 核糖转移酶突变体。

[0055] 在上述制备方法中， 可采用任何适用的载体， 例如： 可以为原核表达载体， 如 pRSET和 pES21等； 可以为克隆载体， 如 pUC18/19和 pBluscript-SK等。 本发明 优先选用 pRSET-A为载体， 载体的宿主细胞可以是包括大肠杆菌在内的原 核细 胞， 也可以是包括酿酒酵母和毕赤巴斯德酵母在内 的真核细胞。

[0056] 一、 含有亲本烟酰胺磷酸核糖转移酶基因的载体质 粒的构建

[0057] 对基因库公布的来自 Meiothermus ruber DSM 1279的亲本烟酰胺磷酸核糖转移 酶的基因序列 （GenBank登录号： CP001743.1) 进行全序列人工合成 （由商业合 成公司完成） 。 合成的的产物经限制性内切酶 Ndel和 BamHI酶切后与经同样限制 性内切酶 Ndel和 BamHI酶切的载体 pRSET-A (源自 Invitrogen, USA) 连接， 得质 粒 pRSET- _n ampt。 经 DNA测序， 确定该被克隆的亲本烟酰胺磷酸核糖转移酶的 核 苷酸序列如 SEQ ID NO: 1所示， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO: 2所示。

[0058] 二、 烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的制备

[0059] PCR扩增反应体系为： 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), lO mM KCl, 10 mM (NH ₄ ) ₂ SO ₄ ， 2 mM MgS0 ₄ ， 0.1% Triton X-100, 50 mM dATP， 50 mM dTTP， 50 mM dCTP， 50 mM dGTP， 1.5 U Pfu DNA聚合酶（Promega, USA) , 20 ng DNA模板 ， 以及 400 nM上游引物和 400 nM下游引物， 用无菌水调反应体积至 50微升。

[0060] PCR扩增反应条件为： 95°C 3分钟， 35圈循环： 95°C 50秒、 52°C 30秒和 72°C 3 分钟， 最后 72°C 5分钟。

[0061] 1、 F180A突变体的制备 [0062] 用如下引物对 F180A-F: 5'

GTTCAAACTGCACGACGCGGGTGCTCGTGGTGTTTC 3'和 F180A-R: 5'

GAAACACCACGAGCACCCGCGTCGTGCAGTTTGAAC 3'， 以实施例 6第一部 分构建的质粒 pRSET-nampt为模板， 利用上述 PCR扩增反应体系和 PCR扩增反应 条件进行高保真 PCR扩增 F180A突变体基因， 经 1%琼脂糖胶电泳分离并用商业 试剂盒回收扩增产物， 再将扩增产物用载体 pRSET-A连接 （具体参考实施例 6第 一部分） ， 得到质粒 pRSET-F180A。 将质粒 pRSET-F180A转化感受态细菌细胞 E. coli BL21 , 在 Luria broth (LB) 平板 （含 50 mg/L卡那霉素） 上筛选出具有烟酰 胺磷酸核糖转移酶活性的克隆， 从克隆中提取质粒 pRSET-F180A的 DNA， 经 DN A测序确定引入的点突变无误。 与如 SEQ ID NO: 2所示的亲本氨基酸序列相比 ， F180A突变体的氨基酸序列在第 180位点由 Phe (F) 突变为 Ala (A) ， 其氨基 酸序列如 SEQ ID NO: 3所示。

[0063] 2、 F180W突变体的制备

[0064] 用如下引物对 F180W-F: 5'

GTTCAAACTGCACGACTGGGGTGCTCGTGGTGTTTC 3'和 F180W-R: 5' GAAACACCACGAGCACCCCAGTCGTGCAGTTTGAAC 3'， 以实施例 6第一部 分构建的质粒 pRSET-nampt为模板， 利用上述 PCR扩增反应体系和 PCR扩增反应 条件进行高保真 PCR扩增 F180W突变体基因， 经 1%琼脂糖胶电泳分离并用商业 试剂盒回收扩增产物， 再将扩增产物用载体 pRSET-A连接 （具体参考实施例 6第 一部分） ， 得到质粒 pRSET-F180W。 将质粒 pRSET-F180W转化感受态细菌细胞 E. coli BL21 , 在 Luria broth (LB) 平板 （含 50 mg/L卡那霉素） 上筛选出具有烟 酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆， 从克隆中提取质粒 pRSET-F180W的 DNA， 经 DNA测序确定引入的点突变无误。 与如 SEQ ID NO: 2所示的亲本氨基酸序列相 比， F180W突变体的氨基酸序列在第 180位点由 Phe (F) 突变为 Trp (w) 。

[0065] 3、 A182Y突变体的制备

[0066] 用如下引物对 A182Y-F: 5' 第一部分构建的质粒 pRSET-nampt为模板， 利用上述 PCR扩增反应体系和 PCR扩 增反应条件进行高保真 PCR扩增 A182Y突变体基因， 经 1%琼脂糖胶电泳分离并 用商业试剂盒回收扩增产物， 再将扩增产物用载体 pRSET-A连接 （具体参考实 施例 6第一部分） ， 得到质粒 pRSET-A182Y。 将质粒 pRSET-A182Y转化感受态细 菌细胞 E. coli BL21， 在 Luria broth (LB) 平板 （含 50 mg/L卡那霉素） 上筛选出 具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆， 从克隆中提取质粒 pRSET-A182Y的 DN A， 经 DNA测序确定引入的点突变无误。 与如 SEQ ID NO: 2所示的亲本氨基酸 序列相比， A182Y突变体的氨基酸序列在第 182位点由 Ala (A) 突变为 Tyr (Y)

[0067] 4、 E231A突变体的制备

[0068] 用如下弓 I物对 Ε231 A-F: 5' CTATCCCGGCTATGGCGCACTCTACCGTTAC

3'和 Ε231 A-R: 5' GTAACGGTAGAGTGCGCCATAGCCGGGATAG 3'， 以实施例 6 第一部分构建的质粒 pRSET-nampt为模板， 利用上述 PCR扩增反应体系和 PCR扩 增反应条件进行高保真 PCR扩增 E231A突变体基因， 经 1%琼脂糖胶电泳分离并 用商业试剂盒回收扩增产物， 再将扩增产物用载体 pRSET-A连接 （具体参考实 施例 6第一部分） ， 得到质粒 pRSET-E231A。 将质粒 pRSET-E231A转化感受态细 菌细胞 E. coli BL21， 在 Luria broth (LB) 平板 （含 50 mg/L卡那霉素） 上筛选出 具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆， 从克隆中提取质粒 pRSET-E231A的 DN A， 经 DNA测序确定引入的点突变无误。 与如 SEQ ID NO: 2所示的亲本氨基酸 序列相比， E231A突变体的氨基酸序列在第 231位点由 Glu (E) 突变为 Ala (A)

[0069] 5、 E231Q突变体的制备

[0070] 用如下弓 I物对 E231Q-F: 5' CTCTATCCCGGCTATGCAGCACTCTACCGTTACC 3'和 E231Q-R: 5' GGTAACGGTAGAGTGCTGCATAGCCGGGATAGAG 3'， 以实 施例 6第一部分构建的质粒 pRSET-nampt为模板， 利用上述 PCR扩增反应体系和 P CR扩增反应条件进行高保真 PCR扩增 E231Q突变体基因， 经 1%琼脂糖胶电泳分 离并用商业试剂盒回收扩增产物， 再将扩增产物用载体 pRSET-A连接 （具体参 考实施例 6第一部分） ， 得到质粒 pRSET-E231Q。 将质粒 pRSET-E231Q转化感受 态细菌细胞 E. coli BL21， 在 Luria broth (LB) 平板 （含 50 mg/L卡那霉素） 上筛 选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆， 从克隆中提取质粒 pRSET-E231Q 的 DNA， 经 DNA测序确定引入的点突变无误。 与如 SEQ ID NO: 2所示的亲本氨 基酸序列相比， E231Q突变体的氨基酸序列在第 231位点由 Glu (E) 突变为 Gin (

Q) 。

[0071] 6、 D298A突变体的制备

[0072] 用如下弓 I物对 D298A-F: 5' TATCCGTCCGGCGTCTGGTGACCC 3'和 D298A-R:

5' GGGTCACCAGACGCCGGACGGATA

3'， 以实施例 6第一部分构建的质粒 pRSET-nampt为模板， 利用上述 PCR扩增反应 体系和 PCR扩增反应条件进行高保真 PCR扩增 D298A突变体基因， 经 1%琼脂糖 胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物， 再将扩增产物用载体 pRSET-A连接

(具体参考实施例 6第一部分） ， 得到质粒 pRSET-D298A。 将质粒 pRSET-D298A 转化感受态细菌细胞 E. coli BL21， 在 Luria broth (LB) 平板 （含 50 mg/L卡那霉 素） 上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克 隆， 从克隆中提取质粒 pRSET -D298A的 DNA， 经 DNA测序确定引入的点突变无误。 与如 SEQ ID NO: 2所示 的亲本氨基酸序列相比， D298A突变体的氨基酸序列在第 298位点由 Asp (D) 突 变为 Ala (A) 。

[0073] 7、 D298N突变体的制备

[0074] 用如下弓 I物对 D298N-F: 5' GTTGTTATCCGTCCGAATTCTGGTGACCCGCCG 3'和 D298N-R: 5' CGGCGGGTCACCAGAATTCGGACGGATAACAAC 3'， 以实施 例 6第一部分构建的质粒 pRSET-nampt为模板， 利用上述 PCR扩增反应体系和 PC R扩增反应条件进行高保真 PCR扩增 D298N突变体基因， 经 1%琼脂糖胶电泳分离 并用商业试剂盒回收扩增产物， 再将扩增产物用载体 pRSET-A连接 （具体参考 实施例 6第一部分） ， 得到质粒 pRSET-D298N。 将质粒 pRSET-D298N转化感受态 细菌细胞 E. coli BL21， 在 Luria broth (LB) 平板 （含 50 mg/L卡那霉素） 上筛选 出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆， 从克隆中提取质粒 pRSET-D298N的 D NA， 经 DNA测序确定引入的点突变无误。 与如 SEQ ID NO: 2所示的亲本氨基 酸序列相比， D298N突变体的氨基酸序列在第 298位点由 Asp (D) 突变为 Asn ( N) 。

[0075] 8、 D298E突变体的制备

[0076] 用如下引物对 D298E-F: 5'

GTTGTTATCCGTCCGGAATCTGGTGACCCGCCGTTC 3'和 D298E-R: 5' GAACGGCGGGTCACCAGATTCCGGACGGATAACAAC 3'， 以实施例 6第一咅 分构建的质粒 pRSET-nampt为模板， 利用上述 PCR扩增反应体系和 PCR扩增反应 条件进行高保真 PCR扩增 D298E突变体基因， 经 1%琼脂糖胶电泳分离并用商业 试剂盒回收扩增产物， 再将扩增产物用载体 pRSET-A连接 （具体参考实施例 6第 一部分） ， 得到质粒 pRSET-D298E。 将质粒 pRSET-D298E转化感受态细菌细胞 E . coli BL21 , 在 Luria broth (LB) 平板 （含 50 mg/L卡那霉素） 上筛选出具有烟酰 胺磷酸核糖转移酶活性的克隆， 从克隆中提取质粒 pRSET-D298E的 DNA， 经 DN A测序确定引入的点突变无误。 与如 SEQ ID NO: 2所示的亲本氨基酸序列相比 ， D298E突变体的氨基酸序列在第 298位点由 Asp (D) 突变为 Glu (E) 。

[0077] 9、 D338N突变体的制备

[0078] 用如下引物对 D338N-F: 5'

GAGTCAGCGTTAACACCATTACCCTGGATAACACGAAC 3'， 以实施例 6第一 部分构建的质粒 pRSET-nampt为模板， 利用上述 PCR扩增反应体系和 PCR扩增反 应条件进行高保真 PCR扩增 D338N突变体基因， 经 1%琼脂糖胶电泳分离并用商 业试剂盒回收扩增产物， 再将扩增产物用载体 pRSET-A连接 （具体参考实施例 6 第一部分） ， 得到质粒 pRSET-D338N。 将质粒 pRSET-D338N转化感受态细菌细 胞 E. coli BL21， 在 Luria broth (LB) 平板 （含 50 mg/L卡那霉素） 上筛选出具有 烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆， 从克隆中提取质粒 pRSET-D338N的 DNA， 经 DNA测序确定引入的点突变无误。 与如 SEQ ID N0: 2所示的亲本氨基酸序列 相比， D338N突变体的氨基酸序列在第 338位点由 Asp (D) 突变为 Asn (N) 。

[0079] 10、 D338E突变体的制备

[0080] 用如下弓 I物对 D338E-F: 5' GTTATCCAGGGTGAAGGTGTTAACGCTGAC

3'和 D338E-R: 5' GTCAGCGTTAACACCTTCACCCTGGATAAC 3'， 以实施例 6第 一部分构建的质粒 pRSET-nampt为模板， 利用上述 PCR扩增反应体系和 PCR扩增 反应条件进行高保真 PCR扩增 D338E突变体基因， 经 1%琼脂糖胶电泳分离并用 商业试剂盒回收扩增产物， 再将扩增产物用载体 pRSET-A连接 （具体参考实施 例 6第一部分） ， 得到质粒 pRSET-D338E。 将质粒 pRSET-D338E转化感受态细菌 细胞 E. coli BL21， 在 Luria broth (LB) 平板 （含 50 mg/L卡那霉素） 上筛选出具 有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆， 从克隆中提取质粒 pRSET-D338E的 DNA ， 经 DNA测序确定引入的点突变无误。 与如 SEQ ID NO: 2所示的亲本氨基酸序 列相比， D338E突变体的氨基酸序列在第 338位点由 Asp (D) 突变为 Glu (E) 。

[0081] 11、 D377A突变体的制备

[0082] 用如下弓 I物对 D377A-F: 5' CACCCGCACCGTGCGACCCAGAAATTC

3'和 D377A-R: 5' GAATTTCTGGGTCGCACGGTGCGGGTG 3'， 以实施例 6第一咅 分构建的质粒 pRSET-nampt为模板， 利用上述 PCR扩增反应体系和 PCR扩增反应 条件进行高保真 PCR扩增 D377A突变体基因， 经 1%琼脂糖胶电泳分离并用商业 试剂盒回收扩增产物， 再将扩增产物用载体 pRSET-A连接 （具体参考实施例 6第 一部分） ， 得到质粒 pRSET-D377A。 将质粒 pRSET-D377A转化感受态细菌细胞 E. coli BL21 , 在 Luria broth (LB) 平板 （含 50 mg/L卡那霉素） 上筛选出具有烟 酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆， 从克隆中提取质粒 pRSET-D377A的 DNA， 经 DNA测序确定引入的点突变无误。 与如 SEQ ID NO: 2所示的亲本氨基酸序列相 比， D377A突变体的氨基酸序列在第 377位点由 Asp (D) 突变为 Ala (A) 。

[0083] 12、 D377N突变体的制备

[0084] 用如下引物对 D377N-F: 5'

GAGCGAATTTCTGGGTATTACGGTGCGGGTGTTGC 3'， 以实施例 6第一咅吩 构建的质粒 pRSET-nampt为模板， 利用上述 PCR扩增反应体系和 PCR扩增反应条 件进行高保真 PCR扩增 D377N突变体基因， 经 1%琼脂糖胶电泳分离并用商业试 剂盒回收扩增产物， 再将扩增产物用载体 pRSET-A连接 （具体参考实施例 6第一 部分） ， 得到质粒 pRSET-D377N。 将质粒 pRSET-D377N转化感受态细菌细胞 E. coli BL21 , 在 Luria broth (LB) 平板 （含 50 mg/L卡那霉素） 上筛选出具有烟酰 胺磷酸核糖转移酶活性的克隆， 从克隆中提取质粒 pRSET-D377N的 DNA， 经 DN A测序确定引入的点突变无误。 与如 SEQ ID NO: 2所示的亲本氨基酸序列相比 ， D377N突变体的氨基酸序列在第 377位点由 Asp (D) 突变为 Asn (N) 。

[0085] 13、 D377E突变体的制备

[0086] 用如下弓 I物对 D377E-F: 5' CCCGCACCGTGAAACCCAGAAATTCG

3'和 D377E-R: 5' CGAATTTCTGGGTTTCACGGTGCGGG 3'， 以实施例 6第一部 分构建的质粒 pRSET-nampt为模板， 利用上述 PCR扩增反应体系和 PCR扩增反应 条件进行高保真 PCR扩增 D377E突变体基因， 经 1%琼脂糖胶电泳分离并用商业 试剂盒回收扩增产物， 再将扩增产物用载体 pRSET-A连接 （具体参考实施例 6第 一部分） ， 得到质粒 pRSET-D377E。 将质粒 pRSET-D377E转化感受态细菌细胞 E . coli BL21 , 在 Luria broth (LB) 平板 （含 50 mg/L卡那霉素） 上筛选出具有烟酰 胺磷酸核糖转移酶活性的克隆， 从克隆中提取质粒 pRSET-D377E的 DNA， 经 DN A测序确定引入的点突变无误。 与如 SEQ ID NO: 2所示的亲本氨基酸序列相比 ， D377E突变体的氨基酸序列在第 377位点由 Asp (D) 突变为 Glu (E) 。

[0087] 14、 E231Q/D338E突变体的制备

[0088] 用如下引物对 D338E-F: 5' GTTATCCAGGGTGAAGGTGTTAACGCTGAC

3'和 D338E-R: 5' GTCAGCGTTAACACCTTCACCCTGGATAAC 3', 以实施例 6 第二部分的第 5小节构建的质粒 pRSET-E231Q为模板， 利用上述 PCR扩增反应体 系和 PCR扩增反应条件进行高保真 PCR扩增 E231Q/D338E突变体基因， 经 1%琼 脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物 ， 再将扩增产物用载体 pRSET-A 连接 （具体参考实施例 6第一部分） ， 得到质粒 pRSET-21。 将质粒 pRSET-21转 化感受态细菌细胞 E. coli BL21， 在 Luria broth (LB) 平板 （含 50 mg/L卡那霉素 ) 上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克 隆， 从克隆中提取质粒 pRSET-2 1的 DNA， 经 DNA测序确定引入的点突变无误。 与如 SEQ ID NO: 2所示的亲本 氨基酸序列相比， E231Q/D338E突变体的氨基酸序列在第 231位点由 Glu (E) 突 变为 Gin (Q) 、 在第 338位点由 Asp (D) 突变为 Glu (E) 。

[0089] 15、 E231Q/D377E突变体的制备

[0090] 用如下引物对 D377E-F: 5' CCCGCACCGTGAAACCCAGAAATTCG 3'和 D377E-R: 5' CGAATTTCTGGGTTTCACGGTGCGGG 3', 以实施例 6第二部 分的第 5小节构建的质粒 pRSET-E231Q为模板， 利用上述 PCR扩增反应体系和 PC R扩增反应条件进行高保真 PCR扩增 E231Q/D377E突变体基因， 经 1%琼脂糖胶电 泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物， 再将扩增产物用载体 pRSET-A连接 （具 体参考实施例 6第一部分） ， 得到质粒 pRSET-22。 将质粒 pRSET-22转化感受态 细菌细胞 E. coli BL21， 在 Luria broth (LB) 平板 （含 50 mg/L卡那霉素） 上筛选 出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆， 从克隆中提取质粒 pRSET-22的 DNA ， 经 DNA测序确定引入的点突变无误。 与如 SEQ ID NO: 2所示的亲本氨基酸序 列相比， E231Q/D377E突变体的氨基酸序列在第 231位点由 Glu (E) 突变为 Gin (Q) 、 在第 377位点由 Asp (D) 突变为 Glu (E) 。

[0091] 16、 D338E/D377E突变体的制备

[0092] 用如下引物对 D377E-F: 5' CCCGCACCGTGAAACCCAGAAATTCG

3'和 D377E-R: 5' CGAATTTCTGGGTTTCACGGTGCGGG 3', 以实施例 6第二部 分的第 10小节构建的质粒 pRSET-D338E为模板， 利用上述 PCR扩增反应体系和 P CR扩增反应条件进行高保真 PCR扩增 D338E/D377E突变体基因， 经 1%琼脂糖胶 电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物， 再将扩增产物用载体 pRSET-A连接 （ 具体参考实施例 6第一部分） ， 得到质粒 pRSET-23。 将质粒 pRSET-23转化感受 态细菌细胞 E. coli BL21， 在 Luria broth (LB) 平板 （含 50 mg/L卡那霉素） 上筛 选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆， 从克隆中提取质粒 pRSET-23的 DN A， 经 DNA测序确定引入的点突变无误。 与如 SEQ ID NO: 2所示的亲本氨基酸 序列相比， D338E/D377E突变体的氨基酸序列在第 338位点由 Asp (D) 突变为 G1 u (E) 、 在第 377位点由 Asp (D) 突变为 Glu (E) 。

[0093] 17、 E231Q/D338E/D377E突变体的制备

[0094] 用如下引物对 D377E-F: 5' CCCGCACCGTGAAACCCAGAAATTCG

3'和 D377E-R: 5' CGAATTTCTGGGTTTCACGGTGCGGG 3', 以实施例 6第二部 分的第 14小节构建的质粒 pRSET-21为模板， 禾 上述 PCR扩增反应体系和 PCR 扩增反应条件进行高保真 PCR扩增 E231Q/D338E/D377E突变体基因， 经 1%琼脂 糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物， 再将扩增产物用载体 pRSET-A连 接 （具体参考实施例 6第一部分） ， 得到质粒 pRSET-31。 将质粒 pRSET-31转化 感受态细菌细胞 E. coli BL21， 在 Luria broth (LB) 平板 （含 50 mg/L卡那霉素） 上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克 隆， 从克隆中提取质粒 pRSET-31 的 DNA， 经 DNA测序确定引入的点突变无误。 与如 SEQ ID NO: 2所示的亲本氨 基酸序列相比， E231Q/D338E/D377E突变体的氨基酸序列在第 231位点由 Glu (E ) 突变为 Gin (Q) 、 在第 338位点由 Asp (D) 突变为 Glu (E) 、 在第 377位点由 Asp (D) 突变为 Glu (E) 。

[0095] 18、 E231Q/D298A/D338E/D377E突变体的制备

[0096] 用如下引物对 D298A-F: 5' TATCCGTCCGGCGTCTGGTGACCC 3'和 D298A-R ： 5' GGGTCACCAGACGCCGGACGGATA 3', 以实施例 6第二部分的第 17小节 构建的质粒 pRSET-31为模板， 利用上述 PCR扩增反应体系和 PCR扩增反应条件 进行高保真 PCR扩增 E231Q/D298A/D338E/D377E突变体基因， 经 1%琼脂糖胶电 泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物， 再将扩增产物用载体 pRSET-A连接 （具 体参考实施例 6第一部分） ， 得到质粒 pRSET-41。 将质粒 pRSET-41转化感受态 细菌细胞 E. coli BL21， 在 Luria broth (LB) 平板 （含 50 mg/L卡那霉素） 上筛选 出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆， 从克隆中提取质粒 pRSET-41的 DNA ， 经 DNA测序确定引入的点突变无误。 与如 SEQ ID NO: 2所示的亲本氨基酸序 列相比， E231Q/D298A/D338E/D377E突变体的氨基酸序列在第 231位点由 Glu (E ) 突变为 Gin (Q) 、 在第 298位点由 Asp (D) 突变为 Ala (A) 、 在第 338位点由 Asp (D) 突变为 Glu (E) 、 在第 377位点由 Asp (D) 突变为 Glu (E) 。

[0097] 三、 酶的提取

[0098] 将含亲本烟酰胺磷酸核糖转移酶基因的质粒 pRSET-nampt以及含烟酰胺磷酸核 糖转移酶突变体基因的质粒 pRSET-F180A、 pRSET-F180W、 pRSET-A182Y、 pR SET-E231A、 pRSET-E231Q^ pRSET-D298A、 pRSET-D298N、 pRSET-D298E、 pRSET-D338N、 pRSET-D338E、 pRSET-D377A、 pRSET-D377N、 pRSET-D377E 、 pRSET-21、 pRSET-22、 pRSET-23、 pRSET-31以及 pRSET-41分别转化感受态 细菌细胞 E. coli BL21， 在 Luria broth (LB) 平板 （含 50 mg/L卡那霉素） 上 37°C 培养 24小吋。 接种单个克隆于 50毫升 LB液体培养基 （含 50 mg/L卡那霉素） 中于 30°C培养 16-20小吋。 离心收集菌体， 称量等同量菌体按照 1 :4比例悬浮破菌液 （pH

7.5) 中。 然后用超声波裂解细菌细胞。 离心 （4-10°C， 12000rpm, 10分钟） 并 收集上清液， 即分别得到亲本烟酰胺磷酸核糖转移酶以及一 系列烟酰胺磷酸核 糖转移酶突变体的上清蛋白溶液， 可用于酶活性的测定以及烟酰胺单核苷酸的 的生物催化制备。

[0099] 四、 酶活性的测定

[0100] 配制底物溶液： 含 60mM的烟酰胺、 25mM的 PRPP、 18mM的 MgCl ₂

、 15mM的 KC1和 lOOmM的 Tris buffer缓冲液， 调 pH至 7.5。 分别取底物溶液 900微 升各 19份， 然后分别加入 100微升等浓度的实施例 6第三部分得到的亲本烟酰胺 磷酸核糖转移酶以及各烟酰胺磷酸核糖转移酶 突变体的上清蛋白溶液， 于 37°C进 行 10分钟反应， 加入 10(VL25<¾三氯乙酸终止反应。 通过高效液相色谱仪 （HPL C) 测定反应液中烟酰胺单核苷酸 （NMN) 的含量， 并计算每种酶的比酶活， 以亲本烟酰胺磷酸核糖转移酶的比酶活为参比 100， 亲本及各突变体的相对比活 性如表 1所示。

[0101] 表 1烟酰胺磷酸核糖转移酶的酶活

[表 1]

[0102] 五、 烟酰胺单核苷酸的制备

[0103] 向反应釜中加入底物溶液， 含 30mM的烟酰胺、 20mM的 ATP、 30mM的核糖、 15mM的 MgCl ₂ 、 15mM的 KC1以及 lOOmM的 Tris-HCl缓冲液， 调 pH至 7.0-7.5。 然 后向底物溶液中加入催化用的各种酶， 各种酶的加入量分别为： 实施例 6第三部 分得到的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体 （F180A) 的上清蛋白溶液 10ml /L底物 溶液， 核糖磷酸焦磷酸激酶 20g/L底物溶液， 核糖激酶 20g/L底物溶液。 搅拌均匀 后进行反应， 反应过程中持续搅拌 （搅拌速度 50rpm) ， 控制反应温度为 37°C， 维持 pH值为 7.0-7.5。 反应 4h后即得烟酰胺单核苷酸粗产品溶液 （含 NMNlOmM ) ， 再经过滤、 纯化、 干燥后即得烟酰胺单核苷酸成品。