METHODE, PROCEDE, ET KIT DE DIAGNOSTIC, PRONOSTIC DU CANCER COLORECTAL

La présente invention concerne une méthode, un procédé et un kit de diagnostic/pronostic permettant la mise en évidence d'un cancer colorectal, en vue de son diagnostic, son pronostic ou lors de son suivi thérapeutique.

Plus particulièrement, la présente invention se rapporte aux amorces d'amplification et aux sondes d'hybridation qui peuvent être mises en œuvre dans ce procédé, ainsi qu'un kit de diagnostic/pronostic du cancer colorectal.

On entend par « diagnostic », la détermination d'une affection d'une personne atteinte par une pathologie donnée ; par « pronostic », le degré de gravité et l'évolution ultérieure d'une pathologie et par «thérapeutique », un traitement à visée curative proposée au patient.

Le cancer colorectal représente le troisième cancer chez l'homme, la deuxième cause de décès en France et son incidence ne cesse d'augmenter d'année en année.

Son coût pour la société dépend du stade du diagnostic et du pronostic de la maladie. Aux stades très précoces ou immédiatement précancéreux, cette maladie est curable à un coup peu élevé et sa mortalité est nulle. Aux stades plus avancés, son coût économique et son taux de mortalité sont très élevés.

Les facteurs de risque sont en partie dus à notre mode de vie et notre alimentation mais également à notre patrimoine génétique. Généralement les cancers colorectaux héréditaires sont caractérisés soit par une

anomalie du gène APC soit par le syndrome de Lynch qui se traduit par des anomalies de gènes codant pour les protéines de réparation de l'ADN. Dans les deux cas, il s'agit soit d'une ou plusieurs mutations géniques soit d'une ou plusieurs anomalies de méthylation de ces gènes ou des gènes régulateurs de ceux-ci.

Au plan histologique, la muqueuse tapissant le colon et le rectum se transforme en crypte aberrante et polype adénomateux jusqu'à devenir une tumeur invasive. Un saignement occulte, détectable dans les selles, peut être le témoin de la tumeur dès lors le polype adénomateux devient visible et aux stades plus avancés. Ces saignements sont intermittents.

Toutefois, au plan génique, il est connu que l'élément initiateur de la carcinogénèse colorectale est, dès le stade de crypte aberrante, l'inactivation du gène APC, dont la protéine joue un rôle relatif au contrôle de la prolifération, de l'apoptose et de la migration des cellules épithéliales intestinales. Cette inactivation provoque l'activation de certaines voies de signalisation, telles que celle de la WNT/Béta-caténine et la formation d'adénomes précoces. Les étapes suivantes de la carcinogénèse colorectale nécessitent le cumul d'autres anomalies géniques telles que les mutations du gène K-RAS, l'inactivation du gène p53 ou encore l'inactivation de gènes impliqués dans le processus de mésappariements de l'ADN (gène MMR).

La réduction de la mortalité due à ce cancer nécessite un diagnostic de la maladie aux stades très précoces. Un dépistage des sujets asymptomatiques âgés de plus de 50 ans est la meilleure action de santé publique dans ce domaine. Actuellement, le dépistage se réalise par un test biologique de recherche de sang occulte dans les selles de type biochimique («Gaïac», «Magstream» ou «Hemoccult») ou immunologique

«Magstream» ; «Eiken») suivi d'une coloscopie systématique si ceux-ci sont positifs, afin de détecter les tumeurs et/ou les retirer.

La limite de ces tests est leurs faibles sensibilités ou spécificités. En effet, le test Hemocult est positif dans 13% à 50% des cas avec tumeur colique ou rectale, en même temps près de 50% des individus ayant un test

Hemcoult positif auront une coloscopie normale. Le test immunologique a amélioré le taux de sensibilité du fait de son caractère quantitatif dans la recherche de sang fécal mais la spécificité du test risque de diminuer si le seuil de positivité du test est fixé très bas générant ainsi des coloscopies inutiles avec un impact non négligeable sur le ratio coût/efficacité.

Ainsi des tests alternatifs sont nécessaires. Des cellules épithéliales coliques incluent des cellules d'origine tumorale exfoliées quotidiennement dans les selles. Malgré la faible quantité d'ADN humain fécal, les anomalies géniques d'origine tumorale deviennent potentiellement des marqueurs d'intérêt dans un test diagnostic.

Un test commercialisé basé sur la détection de mutation ponctuelle de l'ADN fécal est disponible. Il présente une sensibilité supérieure aux autres tests biologiques (recherche de sang occulte dans les selles) mais se révèle être très onéreux.

Dans la demande de brevet internationale n° WO2005/112988, il est explicité des compositions, des procédés et des kits pour diagnostiquer et traiter des cancers, dans lesquels, le facteur inhibiteur de Wnt ((Wnt

Inhibitory Factori - WIF1 ) est sous-exprimé. Il est prévu des compositions pour inhiber la prolifération de cellules cancéreuses, pour induire l'apoptose dans une cellule cancéreuse, par inhibition de la signalisation Wnt dans une cellule cancéreuse et pour le traitement d'une maladie associée à la sous expression de WIF1.

Les tests actuels permettent de détecter avec plus ou moins de sensibilité et de spécificité des mutations d'ADN ou des conséquences des mutations (sous expression d'une protéine) ou la présence de sang dans les selles.

Aujourd'hui, le problème est de créer un test de dépistage et/ou de pronostic permettant la découverte et/ou le diagnostic de cancer en phase précoce ayant une bonne spécificité et sensibilité tout en restant abordable en termes de prix.

La présente invention pallie les inconvénients de l'art antérieur en proposant une nouvelle méthode, un procédé et un kit de diagnostic/pronostic permettant la mise en évidence d'un cancer colorectal, en vue du diagnostic, du pronostic ou du suivi thérapeutique.

Le procédé selon l'invention permet notamment de déterminer la présence ou non d'un cancer colorectal, d'évaluer sa gravité, de déterminer le traitement le plus adapté ainsi que de suivi des patients traités.

La présente invention a pour but de remédier aux inconvénients précédemment évoqués et consiste pour cela en un procédé ou méthode pour le diagnostic/pronostic et/ou le suivi du cancer colorectal, comprenant les étapes suivantes : a. l'extraction d'un matériel nucléique d'un échantillon biologique ; b. l'utilisation d'au moins une paire d'amorces d'amplification en vue d'obtenir des amplicons d'au moins une séquence cible ; c. l'utilisation d'au moins une sonde de détection pour détecter la présence desdits amplicons ; caractérisé en ce qu'il comprend une étape de modification entre les étapes a) et b).

Avantageusement, les étapes b) et c) sont réalisées en même temps et l'étape b) est une PCR conventionnelle ou quantitative.

La sonde de détection selon l'invention peut comporter un marqueur.

De préférence, ladite séquence cible est comprise dans le gène WIF1.

Plus particulièrement, ladite paire d'amorces comprend au moins une amorce d'amplification comprenant au moins 15 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique choisie parmi les SEQ ID n° 1 à 10 et/ou ladite sonde de détection comprend au moins 15 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID n° 1 à 10.

Plus précisément, la présente invention concerne également une amorce d'amplification pour le diagnostic/pronostic et/ou le suivi du cancer colorectal comprenant au moins 15 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique choisie parmi les SEQ ID n°1 à 10.

De même, la présente invention se rapporte aussi à une sonde de détection pour le diagnostic/pronostic et/ou le suivi du cancer colorectal comprenant au moins 15 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID n° 1 à 10.

De manière avantageuse, la présente invention concerne l'utilisation de ladite amorce d'amplification et/ou de ladite sonde de détection pour le diagnostic/pronostic et le suivi du cancer colorectal.

Avantageusement, la présente invention concerne également un kit pour le diagnostic/pronostic et le suivi du cancer colorectal comprenant ladite amorce et/ou ladite sonde de détection.

L'invention sera bien comprise à la lumière de la description qui suit, se rapportant à des exemples illustratifs, et en aucun cas exhaustifs, de la présente invention, en référence aux dessins, ci-joints, dans lesquels :

- la figure 1 est une représentation d'un gel d'agarose des séquences isolées à partir de l'ADN tissulaire de deux patients (n°

5 cancer colique, n° 31 cancer rectal d'une collection biologique);

- la figure 2 est une représentation chromatographique de séquençage de l'amplicon du gène WIF1 qui met également en évidence les sites de méthylation CG ; - les figures 3 et 4 sont des représentations graphiques illustrant le niveau de méthylation retrouvées dans les urines et le sérum des individus (normaux ou avec tumeur colorectale).

L'inactivation du gène APC engendre l'activation des voies de signalisation des protéines telles que la Wnt et la formation d'adénomes précoces. Il est connu que la voie WIF 1 est l'un des gènes impliqués dans l'inhibition de la voie de signalisation Wnt.

La présente invention propose une méthode, un procédé, un test et un kit de diagnostic/pronostic simplifiés, permettant la mise en évidence d'un cancer colorectal, en vue du diagnostic, du pronostic ou du suivi thérapeutique, basés sur la mise en évidence d'anomalies fonctionnelles de l'ADN, telle que les méthylations.

On sait que l'ADN altéré résulte toujours d'une origine tumorale et qu'il est libéré dans la lumière colique, la circulation sanguine ou les voies urinaires. La recherche d'anomalie, comme par exemple l'ADN méthylé permet de détecter un plus grand nombre de tumeurs, dont celles colorectales.

De plus, il a été démontré que certains phénotypes d'anomalies épigéniques présentant des îlots CpG méthylés (zones où les paires de nucléotides C et G sont très fréquentes) étaient présents dans certains cancers colorectaux. En effet, il a été décrit que l'expression silencieuse de WIF1 est due à un promoteur hyperméthylé.

Préalablement, une récolte d'un « échantillon biologique » est opérée chez un individu susceptible d'être atteint par un cancer ou en quête de dépistage/diagnostic/suivi. Cet échantillon, contenant des cellules circulantes et du matériel nucléique, peut être son sang, ses selles, sa salive, son urine, sa bile, son sérum, son plasma etc.

Le « matériel nucléique », composé de séquences d'acides désoxyribonucléiques (ADN) ou ribonucléiques (ARN), ainsi prélevé chez ledit individu via ledit échantillon biologique comprend une séquence cible.

Une « séquence cible », est une séquence nucléotidique spécifique d'un gène cible qu'il soit simple ou double brin, tel que le WIF1.

Par exemple, voici la séquence du gène WIF1 : aaagtgcagggattacaggcgtgagccatcgcgcccggccgaattcagcaacttttaaaa aatatc agcaaacgtgaagatatccacgatgttagaggagccctaccccggagggtcaggtacagc ttcgtc cagggcccagggcactcttccgggcactgccgggttatcagggagacagacgggaatccc caaat gctgggtgtcgggcaagtaccagctggacgccctgcgcctcgagccaaggccagcgctgc catcg gcaccatcggacagtcgagcctcgagttttaactgcttgggagcgcgcaaagtgccagcc tatcgc agaacggagcgcatagggttggcggagagaggaatcctactggctgaaagggagacgaag gca atttgcgccttcagtgagcgccggaggaggaacaggagtcatcacctcatcatcatcatc atcatcatc atcaccatcaccatcaccatcatcagcactcagtcaagcccagcgttgtctgcttcccca tttccctcccc cgaagcctcccttggcccgaggaggtggcgagtgatgtcccaggggtctctgagtgccct tctccgg gtccgccagccctacacgcccacttcgcgggcgctccactggggcaccgcactgtgaatg cagcct cgggggtccctcgcggccccgcccccgggggggccccacagcgcccccaagtggcggccg cc

caggcctcgcgggccccactcctcgctcgcacctcgctcgcgcagcccttcccgctc ttctgttctcg ctctatttgccccgctgactgctggcctcgccagctttgccagtcttacgtctctgccgc ccccactcccg cccg cg ccccatcttcttg cg cg actcg cg ccg ctggtccccccctcctcctcccgcg tcctg cctg c cccctcctcctgctctcgcaggctccttggcacccaggccgggaggcgacgcgcccagcc GTCT AAACGGGAACAGCCCTGGCTGAGGGGCTGCAGCGCAGCAGAGTATC TGACGGCGCCAGGTTGCGTAGGTGCGGCACGAGGAGTTTTCCCGGC AGCGAGGAGGTCCTGAGCAGCATGGCCCGGAGGAGCGCCTTCCCT GCCGCCGCGCTCTGGTCTGGAGCATCCTCCTGTGCCTGCTGGCACT GCGGGCGGAGGCCGGGCCGCCGCAGGAGGAGAGCCTGTACCTATG GATCGATGCTCACCAGGCAAGAGTACTCATAGgtaaggcccccgcctccaggc cttcccctgcct

Une fois modifié par du bisulfite de sodium, la séquence d'intérêt ou cible du gène WIF1 complètement méthylé est : gtttagCGttgtttgttttttttatttttttttttCGaagttttttttggttCGaggagg tggCGagtgatgttttag gggtttttgagtgttttttttCGggttCGttagttttataCGtttatttCGCGggCGttt tattgggCGtat CGtattgtgaatgtagtttCGggggtttttCGCGgtttCGttttCGggggggttttatag CGtttttaag tggCGgtCGtttaggtttCGCGggttttatttttCGttCGtatttCGttCGCGttagttt ttttCGttttttt gttttCGttttatttgtttCGttgattgttggtttCGttagttttgttagttttaCGttt ttgtCGtttttattttCGttC G C Gttttatttttttg C G C GattC G C GttC GttggtttttttttttttttttC G C Gttttgtttg ttttttttttttgtttt CGtaggttttttggtatttaggtCGggaggCGaCGCGtttagtCGTTTAAACGGGAATA

GTTTTGGTTGAGGGAGTTGTAGCGTAGTAGAGTATTTGACGGCGTTA GGTTGCGTAGGTGCGGTACGAGGAGTTTTTTCGGTAGCGAGGAGGT TTTGAGTAGTATGGTTCGGAGGAGCGTTTTTTTTGTCGTCGCGTTTTG GTTTTGGAGTATTTTTTTGTGTTTGTTGGTATTGCGGGCGGAGGTCGG GTCGTCGTAGGAGGAGAGTTTGTATTTATGGATCGATGTTTATTAGGT

AAGAGTATTTATAGgtaaggttttCGtttttagCGtttttttttgttt

Une « séquence nucléotidique » est un enchaînement de motifs nucléotidiques, c'est-à-dire une séquence d'acides nucléiques ou de polynucléotides ou de fragments de ces derniers.

On entend par « motif nucléotidique » un nucléotide naturel d'acide nucléique ou un nucléotide modifié (base, phosphate, sucre).

Les structures et les modifications de ces enchaînements sont soit naturelles, soit résultantes d'une recombinaison génétique ou d'une synthèse chimique.

Le procédé selon l'invention se rapporte à de nouvelles séquences nucléotidiques d'une séquence cible, telle celle du WIF1 , qui peuvent être utilisées en tant qu'amorces d'amplification ou de sondes d'hybridation afin de détecter et/ou pronostiquer et/ou suivre un individu atteint d'un cancer colorectal.

Plus particulièrement, les inventeurs ont découvert que lesdites séquences nucléotidiques cibles présentaient des anomalies fonctionnelles telles que les méthylations.

Ainsi la présente propose une nouvelle méthode, un procédé et un kit de diagnostic/pronostic permettant la mise en évidence d'un cancer colorectal, en vue du diagnostic et/ou du pronostic et/ou du suivi thérapeutique, en recherchant une hyperméthylation du gène de WIF1 ou de son promoteur et en quantifiant cette anomalie.

De manière plus précise, ladite séquence nucléotidique selon l'invention comprenant au moins 15 motifs nucléotidiques d'une séquence choisie parmi les SEQ ID n°1 à n°10 est très pertinente :

- en tant qu'amorce d'amplification pour amplifier les séquences cibles, tel que le gène WIF1 ,

- en tant que sonde d'hybridation pour une hybridation spécifique sur des séquences cibles, tels que le gène WIF1.

L'étape a) consiste en une extraction du matériel nucléique d'un échantillon biologique.

La mise en évidence de la présence d'ADN tumoral à partir d'effluent ou d'échantillon biologique nécessite l'extraction de l'ADN total. Cette extraction est réalisée par tout protocole d'extraction d'acides nucléiques d'échantillon biologique de type connu en soi.

Par exemple, cette extraction peut être effectuée par une méthode de lyse des cellules issues de l'échantillon biologique, telle que par exemple chimique, physique, thermique, etc.

Avantageusement, cette étape peut être suivie d'une purification (centrifugation ou toute autre méthode de purification de type connu en soi) consistant à séparer et à concentrer les acides nucléiques des autres constituants.

Les cellules qui échappent à l'apoptose, comme les cellules tumorales, possèdent des fragments d'ADN plus long que ceux de cellules normales. L'ADN long peut donc servir de premier marqueur de tumeur colorectale.

Par exemple, l'échantillon biologique peut être des selles (5 à 10g) disposées dans une solution tampon favorisant l'extraction des acides nucléiques (ADN, ARN), par l'intermédiaire du kit « EXACT » ou « QIAGEN » ou tout autre procédé. Les acides nucléiques obtenus peuvent être suspendus dans un tampon Tris enrichie en EDTA.

Bien entendu, l'homme de l'art sait adapter l'extraction, la purification et la conservation des acides nucléiques en fonction des échantillons biologiques dont ils sont issus.

L'étape a bis) est la modification de l'ADN extrait.

En vue de procéder à la détection des anomalies fonctionnelles de la séquence cible, il est nécessaire de modifier l'ADN recueilli par tout type de méthode de modification de type connu en soi.

La méthylation d'un gène ou de son promoteur influence son expression et peut entraîner son inactivation fonctionnelle, par exemple.

Les présents inventeurs ont recherché parmi les marqueurs principaux méthylés, le seuil de normalité, puisque le nombre de gènes méthylés et leur niveau de méthylation augmentent avec l'âge.

A titre illustratif, l'ADN recueilli peut être purifié à partir de lymphocytes T, en utilisant le kit « Qiagen » et être artificiellement méthylé par de la méthyltransférase ou toute autre méthode. Ensuite l'ADN ainsi méthylé est modifié, par du bisulfite de sodium avant sa purification.

Le bisulfite de sodium transforme la cytosine non méthylée en uracile alors que la cytosine méthylée reste intacte.

Après cette étape on peut amplifier et quantifier la forme méthylée du gène WIF1.

Les étapes b) et c) sont : l'utilisation d'amorces d'amplification afin de générer des amplicons d'au moins une séquence cible du matériel nucléique.

Selon la présente invention, une « amorce d'amplification » est une séquence nucléique comprenant 10 à 100 motifs nucléotidiques,

préférentiellement de 40 à 80 paires de bases d'au moins une séquence cible de matériel génétique.

Préférentiellement, ladite amorce comprend au moins 15 motifs nucléotidiques d'une séquence choisie parmi :

- une séquence de SEQ ID n°1 à 10 ;

- une séquence homologue de SEQ ID n°1 à 10 complémentaire ou suffisamment complémentaire ; ou présentant une homologie suffisante pour s'hybrider à SEQ ID n°1 à 10 ou à leurs séquences complémentaires ;

- une séquence comprenant une séquence de SEQ ID n°1 à 10, qui aurait la même fonction que l'amorce d'amplification.

Une séquence trop petite améliore le rendement mais se révèle moins spécifique et, à contrario, une séquence trop importante diminue le rendement tout en augmentant la spécificité de la séquence cible.

Plus précisément l'utilisation d'une paire d'amorces permet de réaliser un processus d'amplification par une polymérisation enzymatique (technique de réplication ciblée in vitro dite « PCR », Polymerase Chain Reaction), permettant d'obtenir à partir d'un échantillon d'importantes quantités d'un fragment d'ADN spécifique et de longueur définie.

Ces techniques sont bien connues de l'homme de l'art.

On entend par « hybridation », un processus par lequel deux séquences nucléiques, comme par exemple, une amorce et une séquence cible se lient dans des conditions spécifiques et bien connues de l'homme du métier. Les séquences d'amorces utilisées peuvent être :

- WIF1 sens : TATACGTTTATTTCGCGGGC (SEQ ID N°4)

- WIF1 anti sens : ACGACGACCCGACCTCCGCCC (SEQ ID N°5) ou encore :

- WIF1 sens CGTATTTCGTTCGCGTTAGTTTTTTTC (SEQ ID N°6)

- WIF anti sens CTCTCCTCCTACGACGACCCG (SEQ ID N°7)

De manière alternative, les séquences d'amorces et/ou des sondes comprenant comprennent au moins 15 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique choisie parmi :

(SEQ ID N ⁰ I ) gtttagCGttgtttgttttttttatttttttttttCGaagttttttttggttCGaggagg tggCGagtgatgttttag gggtttttgagtgttttttttCGggttCGttagttttataCGtttatttCGCGggCGttt tattgggCGtat CGtattgtgaatgtagtttCGggggtttttCGCGgtttCGttttCGggggggttttatag CGtttttaag tggCGgtCGtttaggtttCGCGggttttatttttCGttCGtatttCGttCGCGttagttt ttttCGttttttt gttttCGttttatttgtttCGttgattgttggtttCGttagttttgttagttttaCGttt ttgtCGtttttattttCGttC G C G ttttatttttttg CGCG attC G C G ttC Gttg gtttttttttttttttttCG C Gttttg tttg ttttttttttttgtttt CGtaggttttttggtattitaggtCGggaggCGaCGCGtttagtCGTTTAAACGGGAATA

GTTTTGGTTGAGGGAGTTGTAGCGTAGTAGAGTATTTGACGGCGTTA GGTTGCGTAGGTGCGGTACGAGGAGTTTTTTCGGTAGCGAGGAGGT TTTGAGTAGTATGGTTCGGAGGAGCGTTTTTTTTGTCGTCGCGTTTTG GTTTTGGAGTATTTTTTTGTGTTTGTTGGTATTGCGGGCGGAGGTCGG GTCGTCGTAGGAGGAGAGTTTGTATTTATGGATCGATGTTTATTAGGT

AAGAGTATTTATAGgtaaggttttCGtttttagCGtttttttttgttt

(SEQ ID N°2)

CGTTTAAACGGGAATAGTTTTGGTTGAGGGAGTTGTAGCGTAGTAGA GTATTTGACGGCGTTAGGTTGCGTAGGTGCGGTACGAGGAGTTTTTT CGGTAGCGAGGAGGTTTTGAGTAGTATGGTTCGGAGGAGCGTTTTTT TTGTCGTCGCGTTTTGGTTTTGGAGTATTTTTTTGTGTTTGTTGGTATT GCGGGCGGAGGTCGGGTCGTCGTAGGAGGAGAGTTTGTATTTATGG ATCGATGTTTATTAGGTAAGAGTATTTATAG

(SEQ ID N° 3)

TTTGACGGCGTTAGGTTGCGTAGGTGCGGTACGAGGAGTTTTTTCGG TAGCGAGGAGGTTTTGAGTAGT

Préférentiellement, les séquences des amorces et des sondes utilisées sont :

- WIF1 sens : TTTGACGGCGTTAGGTTGC (SEQ ID N°8)

- WIF1 anti sens ACTACTCAAAACCTCCTCGCTACC (SEQ ID N°9)

- la sonde WIF1 : CGGTACGAGGAGTTTT (SEQ ID N°10)

Par exemple, les amorces de méthylation suscitées sont amplifiées par PCR classique ou quantitative sur la matrice lymphocytaire artificiellement méthylée par l'enzyme S-méthyltransférase.

La figure 1 est une représentation d'un gel d'agarose des séquences isolées à partir de l'ADN tissulaire de deux patients (n° 5 cancer colique, n° 31 cancer rectal d'une collection biologique).

Comme illustré à la figure 1 , les amplicons peuvent être ensuite analysés sur gel d'agarose pour une électrophorèse afin de vérifier que leurs tailles correspondent bien à la taille attendue des amorces WIF1.

Ainsi on peut visualiser les amplicons issus de la PCR dans la fourchette de poids attendue et correspondant aux 69 paires de bases pour WIF1 comme indiqué sur la figure 1 pour un malade atteint d'une tumeur colique (n°T5) et un autre malade atteint d'une tumeur rectale (n° T31 ).

Lors de l'étape de la détection des acides nucléiques cibles, il peut être prévu d'utiliser une sonde de détection spécifique.

Bien entendu, cette étape de détection directe ou indirecte, peut être réalisée par tout autre mode de détection de type connu en soi.

Une « sonde d'hybridation » est une séquence nucléique de 10 à 100 motifs nucléotidiques ayant une spécificité d'hybridation dans des conditions spécifiques et déterminées afin qu'elle cette s'hybride avec la séquence nucléique cible.

De manière avantageuse, la sonde d'hybridation est une sonde de détection. En effet, la sonde d'hybridation peut comprendre un marqueur permettant sa détection. Ledit « marqueur » est un traceur capable de repérer, marquer ou distinguer ce qui est reconnaissable du fait de sa propriété physique ou chimique (radioactivité, fluorescence, masse, couleur, luminescence et autres... via des détections optique, électrique, etc.) en très faible quantité.

Les amorces fonctionnelles sont analysées avec un fluorochrome ou un autre fluorescent ou « quencher » qui se lie au produit d'amplification (ADN double brin).

Ainsi on peut détecter une réaction d'hybridation entre une sonde de détection et la séquence cible.

De manière alternative, il peut être prévu que la sonde de détection soit une sonde de détection « molecular beacon ».

La sonde d'hybridation peut également être une sonde de capture, où ladite sonde est immobilisée sur un support solide par tout moyen approprié (de type connu en soi). On détectera ensuite la réaction d'hybridation entre la sonde de capture et la séquence cible.

Pour la détection de la réaction d'hybridation, on peut également utiliser des séquences cibles marquées, directement ou indirectement de la séquence cible.

De manière alternative, l'étape d'hybridation peut être une étape de marquage et/ou de clivage de la séquence cible.

Afin de s'affranchir des dimères d'amorces qui se constituent spontanément, il peut être prévu de lier aux amorces sens et antisens une sonde taqman spécifique construite à l'aide de logiciels bien connus.

Les inventeurs de la présente invention, en vue de corriger toute variabilité d'efficacité enzymatique possible, ont normalisé l'expression du gène cible par la détermination d'un gène de ménage dont l'expression est obligatoire et courante chez tous les individus, par l'intermédiaire d'un ratio.

De manière alternative, l'amplification est réalisée en même temps que l'étape de la détection.

Alternativement, l'amplification est une PCR quantitative permettant de quantifier directement les séquences cibles souhaitées.

La figure 2 est une représentation chromatographique de séquençage de l'amplicon du gène WIF1 qui met également en évidence les sites de méthylation CG (flèche en haut de la figure) de deux tumeurs de deux patients différents après traitement au bisulfite de sodium.

Les flèches indiquent les cytosines méthylées reconnues par les séquences dinucléotidiques CpG, couvertes par les amorces WIF1.

Les figures 3 et 4 sont des représentations graphiques illustrant les niveaux de méthylation retrouvées dans les urines et le sérum des individus normaux et atteints de cancer colorectal.

Le niveau de méthylation est indiqué par la hauteur des barres et les étoiles indiquent une méthylation anormale mais non quantifiable par ce procédé ou tout autre procédé similaire.

Les résultats explicités ci-après sont illustratifs d'expériences de comparaison réalisées et en aucun cas limitatifs.

Tableau 1 : Comparaison des échantillons prélevés chez des individus normaux et atteints de tumeurs plus ou moins développées ^*

^* seion ^§ es fichiers de la cotonoscopîe et pathologiques

Tableau 2: Caractéristiques des marqueurs après l'extraction de l'ADN du tissu ou des effluents biologiques

Tableau 3: Comparaison des méthylation dans le sérum et les urine de WIF1 , ALX4 and Vimentine chez les mêmes individus.

Comme illustrés sur les tableaux 1 à 3, les échantillons biologiques ont été prélevés sur 272 individus. L'ADN a été extrait à partir de tissus (10 normaux et 10 tumoraux), et les urines, le sérum, les selles et soumis à l'extraction d'ADN, la modification et PCR de méthylation pour identifier le gène cible WIF1 , ALx4 et Vimentine. Deux mutations Kras ont été détectées dans les selles comme un contrôle fécal de dosage.

Le marqueur de méthylation de WIF1 a été le plus sensible dans l'urine et le sérum avec une sensibilité de 52,08% et 29,16% respectivement.

La combinaison de ces deux milieux (urine et de sérum) a amélioré la sensibilité de l'épreuve pour tous les gènes marqueurs de dépistage: WIF1 60,41 %, ALX4 35,41 % et Vimentine 10,41 % sans perte de spécificité.

La sensibilité et la spécificité des épreuves combinées (mutations Kras et sur la méthylation) étaient de 23% et 97% respectivement dans les selles.

Les valeurs ont varié comme suit pour la sensibilité et la spécificité des gènes évaluées: Krasi [9,61 % (10/104), 97,16% (3 / 106)], Kras2 [6,73% (7 / 104) et 99,05% (1 / 106) ], [Wif1 9,61 % (10/104), 99,05% (1 / 106)], [ALX4 8,65% (9 / 104) et 99,05% (1 / 106)] et [Vim 0,96% (1 / 104); 100% 17 (0 / 106)]. Comme seul test de méthylation, la spécificité et de WIF1 est de 97% pour la détection des tumeurs colorectales. Bien que combiné avec d'autres marqueurs moléculaires, sa sensibilité est améliorée. Une analyse systématique de la méthylation WIF1 comme seul marqueur dans le sérum et/ou l'urine (voire des selles) de la même personne pourrait offrir une méthode non-invasive pour le dépistage du cancer colorectal.

Les résultats obtenus en comparaison avec d'autres marqueurs démontrent que la sensibilité et la spécificité de cette méthode sont considérablement supérieures. En effet, la sensibilité globale du test de méthylation WIF1 a été évaluée à 58% et sa spécificité à 100%.

Bien entendu, la méthode et le test selon l'invention peuvent être combinés avec, ou inclure, d'autres marqueurs moléculaires en vue d'augmenter encore sa sensibilité.

La présente invention permet d'améliorer la stratégie de dépistage ainsi que les traitements des formes précoces de cancer ou précancéreuses.