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Title:
METHOD FOR PRODUCING COLLAGEN PEPTIDES FROM BONES, AND PRODUCED COLLAGEN PEPTIDES
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2021/089243
Kind Code:
A1
Abstract:
The present invention relates to a method for producing collagen peptides from bones, comprising the following steps: a) providing bones from vertebrates; b) mechanically comminuting the bones to a particle size of less than 1. 000 pm, preferably less than 500 pm, more preferably less than 300 pm, at a temperature of less than 70°C during comminution; c) heating the comminuted bones in an aqueous suspension to a temperature above 100°C, preferably above 120°C, more preferably above 130°C, for a period of 1 to 30 min, preferably 2 to 10 min, more preferably 4 to 8 min; d) adding one or more proteases to the suspension to obtain an aqueous solution of collagen peptides; and e) separating the aqueous solution of collagen peptides from the comminuted bones. The method does not comprise maceration of the bones with an acid or liming of the bones with a base, and bones provided in step a) have not been subjected to maceration and liming. The invention further relates to collagen peptides produced by this method.

Inventors:
PÖRSCHKE RALF (DE)
Application Number:
PCT/EP2020/077092
Publication Date:
May 14, 2021
Filing Date:
September 28, 2020
Export Citation:
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Assignee:
GELITA AG (DE)
International Classes:
A23J1/10; A23J3/06; A23J3/34; A23L33/17; A23L33/18; A61K38/01; C07K14/46; C07K14/78; C12P21/06
Domestic Patent References:
WO2006121361A12006-11-16
Foreign References:
CN101787078A2010-07-28
CN103937859A2014-07-23
US4176199A1979-11-27
DE102012110612A12014-05-08
Attorney, Agent or Firm:
HOEGER, STELLRECHT & PARTNER PATENTANWÄLTE MBB (DE)
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Claims:
P a t e n t a n s p r ü c h e

1. Verfahren zur Herstellung von Kollagenpeptiden aus Knochen, umfassend die folgenden Schritte: a) Bereitstellen von Knochen von Wirbeltieren; b) mechanisches Zerkleinern der Knochen bis zu einer Partikelgröße von weniger als 1.000 pm, bevorzugt weniger als 500 pm, weiter bevorzugt weniger als 300 pm, bei einer Temperatur von weniger als 70 °C während der Zerkleinerung; c) Erhitzen der zerkleinerten Knochen in einer wässrigen Suspension auf eine Temperatur von über 100 °C, bevorzugt über 120 °C, weiter bevorzugt über 130 °C, für einen Zeitraum von 1 bis 30 min, bevorzugt 2 bis 10 min, weiter bevorzugt 4 bis 8 min; d) Zugabe einer oder mehrerer Proteasen zu der Suspension, um eine wässrige Lösung von Kollagenpeptide zu erhalten; und e) Abtrennen der wässrigen Lösung von Kollagenpeptiden von den zerkleinerten Knochen, wobei das Verfahren weder eine Mazeration der Knochen mit einer Säure noch ein Äschern der Knochen mit einer Base umfasst, und wobei die in Schritt a) bereitgestellten Kochen keiner Mazeration und keinem Äschern unterzogen wurden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Knochen von Säugetieren stammen, insbesondere von Rindern.

3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Knochen vor dem Zerkleinern gereinigt werden, insbesondere entfettet werden.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Reinigung der Knochen eine Behandlung mit einem oder mehreren Enzymen umfasst, bevorzugt mit Proteasen und/oder Lipasen. 5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Knochen vor dem Zerkleinern einen Fettgehalt von weniger als 4 Gew.% aufweisen, bevorzugt von weniger als 1 Gew%, weiter bevorzugt von weniger als 0,5 Gew.%.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Knochen vor dem Zerkleinern einen Gehalt an Kollagen im Verhältnis zum Gesamtproteingehalt von mindestens 55% aufweisen, bevorzugt von 70 bis 90%, wobei der Kollagengehalt bestimmt wird über den Hydroxyprolingehalt multipliziert mit dem Faktor 7,3 und der Gesamt proteingehalt bestimmt wird über den Kjeldahl-Stickstoffgehalt multipli ziert mit dem Faktor 6,25.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das mechanische Zerkleinern eine Trockenvermahlung oder eine Nassver mahlung der Knochen umfasst, bevorzugt eine Nassvermahlung in einer wässrigen Suspension.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Erhit zen in einer wässrigen Suspension mit einem Gewichtsanteil an zerklei nerten Kochen von 0,05 bis 0,5 kg/l durchgeführt wird, bevorzugt von 0,1 bis 0,3 kg/l, weiter bevorzugt von 0,15 bis 0,2 kg/l.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei vor dem Erhitzen der pH-Wert der wässrigen Suspension auf einen Bereich von 5 bis 7 eingestellt wird, bevorzugt von 6 bis 7, um Kollagenpeptide mit einem isoelektrischen Punkt von über 5,6 zu erhalten, oder wobei vor dem Erhitzen der pH-Wert der wässrigen Suspension auf einen Bereich von 7 bis 9 eingestellt wird, bevorzugt von 7,9 bis 8,6, um Kollagen peptide mit einem isoelektrischen Punkt von unter 5,6 zu erhalten. 10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die wäss rige Suspension vor der Zugabe der einen oder mehreren Proteasen auf eine Temperatur im Bereich von 40 bis 60 °C abgekühlt wird.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die eine oder mehreren Proteasen, die nach dem Erhitzen der wässrigen Suspen sion zugegeben werden, ausgewählt sind aus mikrobiellen Endopro- teasen, bevorzugt Serinproteasen, insbesondere aus Bacillus subtilis.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die eine oder mehreren Proteasen in einer Menge von 0,01 bis 0,5 Gew%, bezo gen auf die Trockenmasse der zerkleinerten Knochen, zugegeben werden, bevorzugt von 0,02 bis 0,2 Gew%, weiter bevorzugt von 0,03 bis 0,1 Gew.%.

13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die enzymatische Reaktion nach der Zugabe der einen oder mehreren Proteasen für einen Zeitraum von 0,5 bis 4 Stunden durchgeführt wird, bevorzugt von 1 bis 3 Stunden.

14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die zerkleinerten Knochen nach dem Abtrennen der wässrigen Lösung von Kollagenpeptiden ein weiteres Mal den Schritten c) bis e) unterzogen werden.

15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Abtrennen der wässrigen Lösung von Kollagenpeptiden eine Filtration umfasst, insbesondere eine Membranfiltration.

16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, ferner umfassend ein Trocknen der wässrigen Lösung von Kollagenpeptiden, um ein Pulver von Kollagenpeptiden zu erhalten, insbesondere mittels Sprühtrocknung. 17. Kollagenpeptide, hergestellt gemäß dem Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche.

18. Kollagenpeptide nach Anspruch 17 mit einem gewichtsmittleren Molekulargewicht von weniger als 25.000 Da aufweisen, bevorzugt von weniger als 10.000 Da, weiter bevorzugt von weniger als 5.000 Da.

19. Kollagenpeptide nach Anspruch 18 mit einem gewichtsmittleren Molekulargewicht von 500 bis 5.000 Da, insbesondere von 2.000 bis 4.000 Da.

20. Kollagenpeptide nach einem der Ansprüche 17 bis 19 mit einem isoelektrischen Punkt von über 5,6, insbesondere von über 6,0.

21. Kollagenpeptide nach Anspruch 17 oder 18 mit einem isoelektrischen Punkt von unter 5,6, insbesondere von 5,2 bis 5,6.

* * *

Description:
Verfahren zur Herstellung von Kollagenpeptiden aus Knochen, und hergestellte Kollagenpeptide

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Kollagen peptiden aus Knochen.

Die Erfindung betrifft ferner Kollagenpeptide, die gemäß diesem Verfahren hergestellt sind.

Kollagenpeptide entstehen bei der Hydrolyse des tierischen Strukturproteins Kollagen, insbesondere durch enzymatische Hydrolyse. Alternative Bezeich nungen sind daher Kollagenhydrolysat oder hydrolysiertes Kollagen. Im Fall von tierischen Knochen als Ausgangsmaterial handelt es sich insbesondere um Kollagen vom Typ I.

Kollagenpeptide werden insbesondere in der Lebensmittelindustrie vielfältig eingesetzt, zum einen wegen ihrer physiologischen Wirkung in Nahrungser gänzungsmitteln oder sogenanntem "Functional Food", aber auch unter lebensmitteltechnischen Gesichtspunkten wie z.B. als Emulgator, Stabilisator, Bindemittel usw. Eine charakteristische Eigenschaft von Kollagenpeptiden ist ihre Löslichkeit auch in kaltem Wasser und ihre mangelnde Fähigkeit, ein Gel auszubilden. Dadurch lassen sich Kollagenpeptide von Gelatine abgrenzen, bei der es sich um denaturiertes und nur geringfügig hydrolysiertes Kollagen han delt. Kollagenpeptide weisen ein Molekulargewicht von weniger als 25.000 Da auf, meistens sogar von weniger als 10.000 Da, während die Molekularge wichte von Gelatine deutlich höher liegen.

Kollagenpeptide werden normalerweise aus Gelatine als Zwischenprodukt her gestellt (siehe z.B. R. Schrieber und H. Gareis: Gelatin Handbook, 2007, Ka pitel 2.2.11). Die Herstellung von Gelatine aus Knochen erfolgt gemäß dem Stand der Technik wiederum in einem mehrstufigen Prozess, der als wesentli che Schritte eine Entmineralisierung der Knochen in einem stark sauren Milieu (Mazeration) und eine anschließende Behandlung in einem stark alkalischen Milieu (Äschern) umfasst, um dann die Gelatine bei erhöhter Temperatur (typi scherweise zwischen 50 und 100 °C) in mehreren Stufen extrahieren zu kön nen (siehe Gelatin Handbook, Kapitel 2.2.5).

Bei der Mazeration werden die geschroteten Knochen über einen Zeitraum von ca. einer Woche in einem Gegenstromverfahren mit verdünnter Salzsäure be handelt, um die mineralischen Bestandteile (Calciumcarbonat und Calcium phosphat) aus dem Knochengewebe herauszulösen (siehe Gelatin Handbook, Kapitel 2.2.1.1). Das mit diesem Verfahren erhaltene Produkt wird als Ossein bezeichnet. Ein relevanter Kostenfaktor bei der Mazeration ist, neben den Chemikalien, die erforderliche Kühlung wegen der exothermen Reaktion der Salzsäure mit den Calciummineralen. Nachteilig ist ferner die hohe Chlorid fracht im Abwasser.

Das anschließende Äschern des Osseins ist notwendig, um eine effektive Ex traktion der Gelatine zu ermöglichen. Das typische Äscherverfahren umfasst eine Behandlung mit einer Calciumhydroxidsuspension (pH-Wert von über 12) über einen Zeitraum von mehreren Monaten (siehe Gelatin Handbook, Kapitel 2.2.4.1). Durch die Verwendung von stärkeren Laugen kann die Behandlungs zeit zwar verkürzt werden (z.B. auf einige Tage bei Verwendung von Natrium hydroxid), dies führt jedoch zu Ausbeuteverlusten.

Das vorstehend beschriebene Verfahren führt zu Knochengelatine vom Typ B, die sich durch einen isoelektrischen Punkt (IEP) von unter 5,6 auszeichnet, typischerweise im Bereich von 4,8 bis 5,5. Der IEP entspricht demjenigen pH- Wert, bei dem die Polypeptidketten der Gelatine (oder die daraus hergestellten Kollagenpeptide) eine neutrale Gesamtladung aufweisen. Der relativ niedrige IEP von Gelatine vom Typ B ergibt sich dadurch, dass beim Äschern die Ami nosäuren Asparagin und Glutamin fast vollständig zu Asparaginsäure bzw. Glutaminsäure umgewandelt werden. Gelatine vom Typ B weist bei gleicher Gelstärke eine deutlich höhere Viskosität auf als Gelatine vom Typ A und ist deshalb für die meisten Anwendungsfelder bevorzugt. Die Herstellung von Knochengelatine vom Typ A, bei der das Osse in ohne Äschern im sauren Milieu extrahiert wird, spielt daher nur eine unter geordnete Rolle. Gelatinen vom Typ A weisen einen IEP von über 6 auf, im Fall von Typ-A-Knochengelatine typischerweise im Bereich zwischen 6 und 8 (bei Schweineschwartengelatine im Bereich von 8 bis 9).

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein alternatives Verfahren für die Herstellung von Kollagenpeptiden vorzuschlagen, bei dem die Nachteile des oben beschriebenen Verfahrens über Knochengelatine vom Typ B als Zwi schenprodukt ganz oder teilweise vermieden werden können.

Diese Aufgabe wird bei dem Verfahren der eingangs genannten Art erfin dungsgemäß dadurch gelöst, dass es die folgenden Schritte umfasst: a) Bereitstellen von Knochen von Wirbeltieren; b) mechanisches Zerkleinern der Knochen bis zu einer Partikelgröße von weniger als 1.000 pm, bevorzugt weniger als 500 pm, weiter bevorzugt weniger als 300 pm, bei einer Temperatur von weniger als 70 °C wäh rend der Zerkleinerung; c) Erhitzen der zerkleinerten Knochen in einer wässrigen Suspension auf eine Temperatur von über 100 °C, bevorzugt über 120 °C, weiter bevor zugt über 130 °C, für einen Zeitraum von 1 bis 30 min, bevorzugt 2 bis 10 min, weiter bevorzugt 4 bis 8 min; d) Zugabe einer oder mehrerer Proteasen zu der Suspension, um eine wässrige Lösung von Kollagenpeptide zu erhalten; und e) Abtrennen der wässrigen Lösung von Kollagenpeptiden von den zerklei nerten Knochen, wobei das Verfahren weder eine Mazeration der Knochen mit einer Säure noch ein Äschern der Knochen mit einer Base umfasst, und wobei die in Schritt a) bereitgestellten Kochen keiner Mazeration und keinem Äschern unterzogen wurden. Es wurde im Rahmen der Erfindung überraschenderweise festgestellt, dass sich Kollagenpeptide durch eine unmittelbare enzymatische Behandlung des Knochenmaterials mittels Proteasen hersteilen lassen, ohne den Umweg über die Herstellung von Knochengelatine. Das erfindungsgemäße Verfahren ver zichtet daher explizit auf eine Mazeration und/oder ein Äschern der Knochen, wodurch die gesamte Verfahrensdauer bis zur Gewinnung der Kollagenpeptide drastisch verkürzt wird: Während die Mazeration und das Äschern im Extrem fall mehrere Monate beanspruchen, mindestens aber mehrere Tage, kann das erfindungsgemäße Verfahren innerhalb von wenigen Stunden durchgeführt werden. Auch der Energiebedarf und die Abwasserbelastung sind bei dem er findungsgemäßen Verfahren gegenüber dem Stand der Technik deutlich ver ringert.

Unter dem Begriff "Mazeration" wird im Rahmen der vorliegenden Beschrei bung eine Behandlung mit einer Säure bei einem pH-Wert von unter 1 ver standen, und unter dem Begriff "Äschern" wird eine Behandlung mit einer Base bei einem pH-Wert von über 12 verstanden.

Als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren können prinzipiell Knochen von jeglichen Wirbeltieren eingesetzt werden, also z.B. auch von Vö geln oder Fischen. Bevorzugt wird das Verfahren aber mit Knochen von Säu getieren durchgeführt, insbesondere mit Knochen von Rindern.

Günstig ist es, wenn die Knochen vor dem Zerkleinern gereinigt werden, ins besondere entfettet werden. Die Reinigung des Ausgangsmaterials begünstigt den effizienten Ablauf der enzymatischen Hydrolyse und ermöglicht die Her stellung von qualitativ hochwertigen Kollagenpeptiden.

Die Reinigung der Knochen umfasst vorzugsweise eine Behandlung mit einem oder mehreren Enzymen, bevorzugt mit Proteasen und/oder Lipasen. Während die Lipasen der Entfettung dienen, können mittels Proteasen nicht-kollagene Proteine abgebaut und entfernt werden. Eine Hydrolyse des Kollagens durch die Proteasen erfolgt vor dem entsprechenden Zerkleinern der Knochen nicht in nennenswertem Ausmaß.

Die Knochen weisen vor dem Zerkleinern günstigerweise einen Fettgehalt von weniger als 4 Gew.% auf, bevorzugt von weniger als 1 Gew.%, weiter bevor zugt von weniger als 0,5 Gew.%.

Im Hinblick auf die Entfernung von nicht-kollagenen Proteinen ist es vorteil haft, wenn die Knochen vor dem Zerkleinern einen Gehalt an Kollagen im Ver hältnis zum Gesamtproteingehalt von mindestens 55% aufweisen, bevorzugt von 70 bis 90%. Dabei wird der Kollagengehalt über den Hydroxyprolingehalt multipliziert mit dem Faktor 7,3 bestimmt, und der Gesamtproteingehalt wird über den Kjeldahl-Stickstoffgehalt multipliziert mit dem Faktor 6,25 bestimmt. Durch die genannten Faktoren wird der Anteil an Hydroxyprolin und Stickstoff in Kollagen berücksichtigt, der sich von den entsprechenden Anteilen im Gesamtprotein unterscheidet.

Die mechanische Zerkleinerung der vorzugsweise gereinigten Knochen bis zu einer Partikelgröße von weniger als 1.000 pm ist ein wesentliches Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens. Aufgrund der geringen Partikelgröße wird eine direkte enzymatische Hydrolyse des Kollagens in dem Knochenmaterial er möglicht, ohne dass die aus dem Stand der Technik bekannten Vorbehand lungen wie Mazeration oder Äschern erforderlich sind. Das mechanische Zer kleinern kann eine Trockenvermahlung oder eine Nassvermahlung der Kno chen umfassen, wobei eine Nassvermahlung in einer wässrigen Suspension bevorzugt ist. Während der Zerkleinerung wird die Temperatur bei unter 70 °C gehalten, um lokale Überhitzungen des Materials zu vermeiden.

Zur Vorbereitung auf die enzymatische Hydrolyse werden die zerkleinerten Knochen in einer wässrigen Suspension auf eine Temperatur von über 100 °C erhitzt, wobei für diese thermische Vorbehandlung ein Zeitraum von maximal 30 min ausreichend ist. Dabei wird das Kollagen denaturiert und der enzymati schen Hydrolyse zugänglich gemacht. Der Gewichtsanteil an zerkleinerten Knochen in der wässrigen Suspension beträgt dabei vorzugsweise von 0,05 bis 0,5 kg/l, bevorzugt von 0,1 bis 0,3 kg/l, weiter bevorzugt von 0,15 bis 0,2 kg/l.

Optional kann die thermische Vorbehandlung der zerkleinerten Knochen weiter beschleunigt und/oder intensiviert werden durch einen zusätzlichen Energie eintrag mittels Kavitation, z.B. durch Ultraschall oder einen Hochdruckhomo genisator. Eine weitere Möglichkeit ist die Beaufschlagung der Suspension mit elektrischen Wechselfeldern.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass der isoelektrische Punkt der hergestellten Kollagenpeptide auf einfache Weise be einflusst werden kann, indem während des Erhitzens der zerkleinerten Kno chen in der wässrigen Suspension ein entsprechender pH-Wert eingestellt wird. Je nach Anwendungsfeld können Kollagenpeptide mit einem hohen oder niedrigen IEP bevorzugt sein, wobei die Unterschiede in den Eigenschaften hier weniger gravierend sind als bei Gelatine vom Typ A bzw. Typ B.

Um Kollagenpeptide mit einem hohen IEP von über 5,6 zu erhalten, wird der pH-Wert der wässrigen Suspension vor dem Erhitzen auf einen Bereich von 5 bis 7 eingestellt, bevorzugt von 6 bis 7. Ein hoher IEP ergibt sich in der Regel auch, wenn keine Einstellung des pH-Wertes vorgenommen wird.

Um Kollagenpeptide mit einem niedrigen IEP von unter 5,6 zu erhalten, wird der pH-Wert der wässrigen Suspension vor dem Erhitzen auf einen Bereich von 7 bis 9 eingestellt, bevorzugt von 7,9 bis 8,6.

Nach der thermischen Vorbehandlung wird die wässrige Suspension auf eine Temperatur im Bereich von 40 bis 60 °C abgekühlt, bevor die eine oder meh reren Proteasen zugegeben werden. In diesem Temperaturbereich liegen die Aktivitätsoptima der Proteasen, die für die enzymatische Hydrolyse des Kolla- gens typischerweise zum Einsatz kommen. Günstigerweise sind die eine oder mehreren Proteasen, die nach dem Erhitzen der wässrigen Suspension zugegeben werden, ausgewählt aus mikrobiellen Endoproteasen, bevorzugt Serinproteasen, insbesondere aus Bacillus subtilis. Die Verwendung solcher Enzyme zur Hydrolyse von Kollagen ist aus dem Stand der Technik bekannt. Eine häufig eingesetzte Protease ist z.B. Subtilisin.

Typischerweise werden die eine oder mehreren Proteasen in einer Menge von 0,01 bis 0,5 Gew.%, bezogen auf die Trockenmasse der zerkleinerten Kno chen, zugegeben, bevorzugt von 0,02 bis 0,2 Gew.%, weiter bevorzugt von 0,03 bis 0,1 Gew.%.

Die enzymatische Reaktion wird nach der Zugabe der einen oder mehreren Proteasen bevorzugt für einen Zeitraum vom 0,5 bis 4 Stunden durchgeführt, weiter bevorzugt von 1 bis 3 Stunden.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die zerkleiner ten Knochen nach dem Abtrennen der wässrigen Lösung von Kollagenpeptiden ein weiteres Mal den Schritten c) bis e) unterzogen. Durch dieses zweimalige Erhitzen und Behandeln mit Protease der zerkleinerten Knochen kann die Aus beute an Kollagenpeptiden erhöht werden.

Das Abtrennen der wässrigen Lösung von Kollagenpeptiden von den zerklei nerten Knochen umfasst bevorzugt eine Filtration, insbesondere eine Mem branfiltration. Dadurch können auch kleinste Partikel der zerkleinerten Kno chen und andere Feststoffe entfernt werden.

Nach einer Filtration kann die wässrige Lösung von Kollagenpeptiden bevor zugt einem Ionenaustausch unterzogen werden, insbesondere einer Entsal zung.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren ferner ein Trocknen der wässrigen Lösung von Kollagenpeptiden, um ein Pulver von Kollagenpeptiden zu erhalten, insbesondere mittels Sprühtrocknung. Zuvor kann die wässrige Lösung mit Hilfe von Verdampfern aufkonzentriert werden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Kollagenpeptide, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt sind.

Die erfindungsgemäßen Kollagenpeptide weisen typischerweise ein gewichts mittleres Molekulargewicht von weniger als 25.000 Da auf, bevorzugt von we niger als 10.000 Da, weiter bevorzugt von weniger als 5.000 Da. Besonders günstig ist ein gewichtsmittleres Molekulargewicht von 500 bis 5.000 Da, ins besondere von 2.000 bis 4.000 Da.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weisen die Kollagen peptide einen hohen isoelektrischen Punkt von über 5,6 auf, insbesondere von über 6,0.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung weisen die Kollagen peptide einen niedrigen isoelektrischen Punkt von unter 5,6 auf, insbesondere von 5,2 bis 5,6.

Diese und weitere Vorteile der Erfindung ergeben sich aus den nachfolgend beschriebenen Beispielen.

Es zeigt:

Fig. 1: Ladungsverteilungen von Kollagenpeptiden gemäß dem Stand der

Technik und gemäß der Erfindung mittels isoelektrischer Fokussierung. Beispiel 1: Herstellung von Kollaaenpeptiden aus Knochen im Labormaßstab

Rinderknochen werden mittels Heißwasser und durch Proteasen unterstützte Entfleischung und Entfettung vorgereinigt und anschließend zu einem Kno chenpulver mit einer Partikelgrößenverteilung von d50 < 350 pm und d90 < 700 pm gemahlen. Das Knochenpulver wird dann mit gleicher Masse Wasser vermischt und im Mikrowellenherd unter Rühren für ca. 1 min auf 120 bis 130 °C erhitzt. Nach Abkühlung (ca. 20 min) auf unter 100 °C werden 0,1 Gew.% (bezogen auf die Knochenpulvermasse) der Protease Subtilisin zugegeben und die Suspension bei 60 °C gerührt. Aufgrund der enzymatischen Reaktion unter Bildung von löslichen Kollagenpeptiden steigt die Konzentration der wässrigen Phase mit der Zeit an, wie in der Tabelle 1 angegeben. Die Konzentration wird mit einem Refraktometer gemessen, das auf die Einheit °Brix zur Messung von Saccharose kalibriert ist.

Tabelle 1

Nach Sedimentation des Knochenpulvers wird der Uberstand filtriert und ent salzt. Die Kollagenpeptide werden aufkonzentriert und getrocknet. Der IEP der Kollagenpeptide liegt bei 6,23.

Die Verteilung der molekularen Ladungen dieser erfindungsgemäßen Kollagen peptide kann mittels isoelektrischer Fokussierung bestimmt werden. Ein ent sprechendes Chromatogramm ist in der Figur 1 dargestellt, wobei links der pH-Wert im Gel angegeben ist und die drei Spuren wie folgt belegt sind:

Spur Nr. 1: Markerpeptide

Spur Nr. 2: Kollagenpeptide aus Knochengelatine vom Typ B gemäß dem Stand der Technik (mit Mazeration und Äschern)

Spur Nr. 3: erfindungsgemäßen Kollagenpeptide gemäß dem obigen Beispiel Die Ladungen der Moleküle sind prinzipiell bei beiden Proben ähnlich, wobei die erfindungsgemäßen Kollagenpeptide in diesem Fall auch Banden von nega tiven, d.h. alkalischen Molekülen zeigen. Der pH-Wert bei der Denaturierung bestimmt die Lage der Banden und damit den isoelektrischen Punkt der Kolla genpeptide.

Beispiel 2: Herstellung von Kollaaenpeptiden aus Knochen im Pilotmaßstab

In einem Rührbehälter wird eine 15 Gew.%ige wässrige Suspension von gerei nigtem Knochenpulver (d90 < 700 pm) aus Rinderknochen vorgelegt, wobei die Knochen zuvor wie im Beispiel 1 gereinigt wurden. Das Verhältnis von Gesamtprotein zu Kollagen beträgt 1,7 (normiert auf Trockenmasse minus Fettgehalt). Der pH-Wert der Suspension wird auf 6,5 eingestellt.

Die Suspension wird mit einer Pumpe durch einen Wärmetauscher gepumpt und dadurch auf 130 °C erhitzt. Diese Temperatur wird ca. 6 min gehalten. Anschließend wird die Suspension durch einen Wärmetauscher auf ca. 60 °C abgekühlt und in einem Rührbehälter gesammelt. Es werden 0,05 Gew.% (bezogen auf die trockene Knochenmasse) der Protease Subtilisin zugegeben. Nach 2 Stunden Reaktionszeit wird die enzymatische Hydrolyse durch Erhitzen der Suspension auf 85 °C für 5 min abgebrochen.

Die wässrige Phase wird mit einer Dekantierzentrifuge abgetrennt und in ei nem Behälter gesammelt. Die feste Phase wird noch einmal in derselben Weise behandelt wir oben für das Knochenpulver beschrieben (Herstellen einer Sus pension, thermische Vorbehandlung, Abkühlung, enzymatische Hydrolyse und Abtrennen der wässrigen Phase durch Dekantieren).

Die wässrigen Phasen (Kollagenpeptidlösungen) aus beiden Durchgängen wer den vereinigt und zur weiteren Aufreinigung mit geeigneten Verfahren filtriert, entsalzt, aufkonzentriert und getrocknet. Die Ausbeute dieses Verfahrens liegt bei ca. 16 bis 19 Gew.% Kollagenpepti- den, bezogen auf die eingesetzte Knochenmasse.

Die Qualität der Kollagenpeptide kann z. B. anhand von hohen Transmissions werten von wässrigen Lösungen mit einer Konzentration von 20 Gew.% bei den Wellenlängen 450 nm und 620 nm bewertet werden. Die gemessenen Werte und der jeweilige Qualitätsstandard sind in der Tabelle 2 angegeben:

Tabelle 2

Das gewichtsmittlere Molekulargewicht der Kollagenpeptide gemäß dem Bei spiel 2 liegt im Bereich von 3.000±500 Da. Durch die Wahl des Enzyms, die Enzymmenge und die Reaktionszeit kann die Molekulargewichtsverteilung der erfindungsgemäßen Kollagenpeptide beeinflusst werden.