Enzymatische Synthese von Sphingolipiden

Gebiet der Erfindung

Gegenstand der Erfindung ist die enzymatische Synthese von Sphingolipiden und Zusammensetzungen enthaltend Sphingoli- pide aus Lysosphingolipiden und Carbonsäureestern, sowie kosmetische, dermatologische oder pharmazeutische Formulierungen, die diese Sphingolipide oder Zusammensetzungen enthalten .

Stand der Technik

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biokatalytischen Herstellung von Sphingolipiden der allgemeinen Formel I

Formel I

durch Umsetzung eines Lysosphingolipids der allgemeinen Formel II

Formel II

mit einem Carbonsäureester der allgemeinen Formel III,

RV ^O

Y

R ³ Formel I I I

wobei R ¹ , R ² , R ³ und X wie unten definiert.

Die Sphingolipide finden Anwendung als kosmetisch und/oder dermatologisch aktive Komponenten.

Sphingolipide der allgemeinen Formel I mit R ² = H werden Ceramide genannt und sind natürlich in der Haut (Stratum corneum) vorkommende polare Lipide. In den äußeren Hornzel- len (Corneocyten) stellen Ceramide einen Hauptbestandteil

(40-65% des Lipidanteils) der Zellmembranen dar und spielen somit eine zentrale Rolle in deren Schutzfunktion indem sie beispielsweise die Wasserpermeabilität regulieren. Mit zu- nehmendem Alter büßen die Keratinozyten einen Großteil ihrer Ceramidsynthese-aktivität ein wodurch die Haut einen Teil ihrer Schutzwirkung verliert und beispielsweise den epidermalen Wasserverlust nicht mehr vollständig unterbinden kann. Dies kann durch topische Applikation von Cerami- den wenigstens teilweise kompensiert werden (z.B.: Farwick, M. et al., Int. J. Cosm. Sei., 2007, 29(4), 319-329 oder Klee, S. K. et al . Basic Clinic. Dermatol. , 2007, 40, 155- 165) .

Darüber hinaus wurden positive Effekte von Ceramiden bei der Behandlung atopischer Dermatitis berichtet (Kerscher, M. et al., Eur. J. Dermatol., 1991, 1, 39-43; Imokawa, G. et al., J. Soc. Cosmet. Chem. 1989, 40, 500-507) .

In Anbetracht der demographischen Entwicklung in vielen Industrieländern, insbesondere in Deutschland, ist mit einem weiter wachsenden Bedarf an Ceramiden zu rechnen.

Nach dem Stand der Technik werden Ceramide durch Schotten-Baumann-analoge N-Acylierung von Lysosphingolipiden der allgemeinen Formel II mit R ² = H wie z.B. Phytosphingosin (allgemeine Formel II mit R ² = H und X = CH ₂ -HCOH) mittels aktivierter Carbonsäurederivate hergestellt.

Typischerweise ist das Phytosphingosin fermentativen Ursprungs .

Bei der aktivierten Carbonsäure handelt es sich typischerweise um das Carbonsäurechlorid welches entweder als solches eingesetzt wird oder in situ aus der Carbonsäure hergestellt wird. In US6420604 (Cosmoferm, NL) wird die Synthese einiger Ceramide durch Reaktion der Sphingosinbase mit entsprechenden Carbonsäurehalogeniden beschrieben. Besonders nachteilig bei dieser Methode ist einerseits die Notwendigkeit des Einsatzes von toxischen Organochlorver- bindungen sowie das Anfallen einer hohen Salzfracht im Endprodukt. Außerdem ist dem Fachmann offensichtlich, dass bei der Verwendung hochreaktiver Carbonsäurehalogenide mit der Bildung signifikante Mengen unerwünschter Nebenprodukte zu rechnen ist.

Alternative Syntheserouten verlaufen über Anhydride. So lehrt beispielsweise WO93/20038 (Gist-Brocades, NL) die basenkatalysierte Synthese gemischter Anhydride aus Carbonsäure und Alkyl-phenylsulfonylchlorid um reaktive Carbonsäurederivate für die N-Acylierung von Phytosphingosin zu erhalten .

Allen diesen Routen ist gemein, dass sie auf der Verwendung reaktiver Carbonsäurederivate beruhen. Nachteilig ist hierbei sowohl die hohe Korrosivität dieser Substanzen als auch

ihre Gesundheitsschädlichkeit was spezielle Reaktorsysteme und Vorkehrungen notwendig macht und somit den präparativen Aufwand erhöht. Darüber hinaus muss für die topische Anwendbarkeit der Produkte sichergestellt sein dass sie von den reaktiven und toxischen Edukten und Nebenprodukten befreit sind. Des Weiteren ist mit hohen Salzfrachten zu rechnen sowie mit dem damit verbundenen zusätzlichen Aufwand bei der Produktaufreinigung und Entsorgung. Ein weiterer Nachteil der Verfahren des Standes der Technik ist, dass nur geringe Edukt- und Produktkonzentrationen erhalten werden; so sind in WO93/20038 (Gist-Brocades, NL) maximal 15% (w/v) -Eduktlösungen im toxischen Lösungsmittel Methylenchlorid bei gleichzeitiger Verwendung von reaktiven und toxischen Coreagentien p-Toluolsulfonsäurechlorid und Triethylamin beschrieben. Darüber hinaus ist sind entweder Reinheit der Produkte oder Ausbeuten (jeweils im Bereich um 80%) nicht zufriedenstellend.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war deshalb die Bereit- Stellung eines alternativen, schonenden und industriell anwendbaren Zugangs zu Ceramiden bei dem wenigstens einer der Nachteile des Standes der Technik überwunden werden kann.

Amidierungsreaktionen sind auch biokatalytisch, d.h. unter Verwendung eines Enzyms als Katalysator, zugänglich. übersichten über industrielle Anwendungen von Enzymen finden sich beispielsweise bei Liese et al (Industrial Biotransformations; Second, Completely Revised Edition, Wiley-VCH, Weinheim, 2006) . Bevorzugte Biokatalysatoren für die Syn- these von Carbonsäurederivaten sind Hydrolasen (E. C. 3.1.x.x) insbesondere Lipasen (Triacylglyceridesterhydrola- sen, E. C. 3.1.1.3) und Esterasen (E. C. 3.1.1.1) .

Entsprechend ihrer natürlichen Funktion im Metabolismus einer Zelle katalysieren Lipasen bevorzugt hydrolytische Spaltung von Estern. Aber auch die kondesative Bildung von Estern ist vielfach literaturbeschrieben. Repräsentative Beispiele hierfür finden sich bei Drauz und Waldmann (Enzyme Catalysis in Organic Synthesis, A Comprehensive Handbook; Second, Completely Revised and Enlaged Edition, Vol. II, Wiley-VCH, Weinheim, 2002), bei Aehle (Enzymes in In- dustry, Production and Applications; Second, Completely Re- vised Edition, Wiley-VCH, Weinheim, 2004) oder bei Bornscheuer (Enzymes in Lipid Modification, Wiley-VCH, Weinheim, 2000) .

Auch für die Verwendung von Aminen als Nucleophile in Li- pase-katalysierten Kondensationsreaktionen finden sich Literaturbeispiele .

Y. -M. Xia et al, J MoI Catal B, 2004, 31,111-115 beschreibt beispielsweise die Synthese von N-Lauroyl-ß-aminoproprio- nitril durch Amidierung von Laurinsäuremethylester mit einem reaktiven, primären Amin katalysiert durch eine Lipase aus Candida antarctica (CALB) . Nachteilig bei dem beschriebenen Verfahren ist neben der Beschränkung auf verdünnte Substratlösungen (unter 50 mM) der vergleichweise geringe Umsatz von lediglich bis zu 94,3% Umsatz. Darüber hinaus ist bei der gezeigten Reaktion keinerlei Regio- oder Chemo- selektivität notwendig.

Solche Selektivitäten können allerdings bei der erfindungs- gemäßen Umsetzung zwingend notwendig, da sich in einem Eduktmolekül wie beispielsweise dem Phytosphingosin mehrere reaktive Funktionalitäten befinden können. Die Problematik dieser Selektivität zeigt sich beispielsweise bei P.

Tufvesson et al . : Biotechnol .Bioeng. , 2007, 97(3), 447-453: Bei der CALB-katalysierten Umsetzung von Ethanolamin mit Carbonsäuren war keine einfache selektive Amidierung unter Umgehung der enzymkatalysierten Veresterung möglich. Ledig- lieh unter mehrfachem Zudosieren eines Eduktes und destil- lativer Entfernung des Reaktionswassers konnte eine Anreicherung des gewünschten Amids erreicht werden.

In einem weiteren Beispiel für die enzymatische Amidierung beschreiben M. Nechab et al . : JOC, 2007, 72, 6918-6923 die stereoselektive Umsetzung von (R) -konfigurierten sekundären Aminen mittels CALB. Die hohe optische Reinheit (>99% ee) der beobachteten Produkte legt eine starke Präferenz der CALB für (R) -konfigurierte Amine nahe, wodurch die Umset- zung von beispielsweise Phytosphingosin aufgrund seiner S- Konfiguration am Amin-Kohlenstoffatom mit diesem Katalysator fraglich ist. Des Weiteren wurden wiederum stark verdünnte Subs t rat lösungen (100 mM) bei gleichzeitig hohen Biokatalysatorkonzentrationen (27% w (CALB) /w (Substrate) ) eingesetzt was die industrielle Attraktivität des beschriebenen Verfahrens signifikant einschränkt.

In WO94/26919 (Gis t-Brocades, NL) ist die enzymatische N-Acylierung von Phytosphingosin mittels Carbonsäureestern und unter Verwendung bakterieller Lipasen oder Säugetierli- pasen beschrieben. In dem beschriebenen Verfahren werden bevorzugt bakterielle Lipasen und Säugetierlipasen eingesetzt; insbesondere eine Lipase aus Pseudomonas alcalige- nes . Nachteilig bei diesem Verfahren ist insbesondere die Notwendigkeit hoher Biokatalysatormengen (30—95% w/w) zur Erreichung von nur mäßigen Umsätzen (bis zu 78%) . Darüber hinaus wurden signifikante Mengen an unerwünschten N,O-Di- acylierungsprodukten (bis zu 17%) gefunden. Zusätzlich wur-

den lediglich verdünnte Lösungen der Substrate eingesetzt (59 bis 93 mM) was geringe Raum-Zeit-Ausbeuten zur Folge hatte. Ein weiterer Nachteil ist die Beschränkung auf Phy- tosphingosin-Base als Substrat was im Vergleich zur Verwen- düng von Säureadditionsprodukten des Phythosphingosins , beispielsweise Phytosphingosin-Sulfat , eine drastische Erhöhung der Substratkosten mit sich bringt. Ausdrücklich wird außerdem darauf hingewiesen, dass Lipasen aus Hefen und Pilzen als Katalysatoren nicht geeignet sind. Somit scheidet das in WO94/26919 beschriebene Verfahren als ökonomisch sinnvolle Alternative zu den bestehenden chemischen Verfahren aus .

Es besteht daher weiterhin Bedarf an Methoden der enzymati- sehen Amidierung von Lysosphingolipiden welche die Nachteile des Standes der Technik überwinden, um bisher nicht realisierbare biokatalytische Spingolipidsynthese ausgehend von Carbonsäurealkylestern zu ermöglichen.

Beschreibung der Erfindung

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war daher die Bereitstellung eines Verfahrens, das einen oder mehrere Nachteile der Verfahren des Standes der Technik nicht aufweist. Insbesondere sollte ein Verfahren entwickelt werden, mit dem gut verfügbare Lysosphingolipide als Edukte und darüber hinaus in hohen Konzentrationen eingesetzt werden können.

Weitere nicht explizit genannte Aufgaben ergeben sich aus dem Kontext der nachfolgenden Beschreibung, der Beispiele sowie der Ansprüche.

überaschenderweise wurde gefunden, dass entgegen dem Stand der Technik mittels Pilzlipasen die selektive Umsetzung von Carbonsäureestern mit Lysosphingolipiden zu Sphingolipiden hoher Reinheit möglich ist. Darüber hinaus wurde gefunden, dass diese Umsetzung ökonomisch sinnvoll durchführbar ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren bzw. der erfindungsgemäß verwendete Biokatalysator hat den Vorteil, dass Amidie- rungsreaktion ökonomisch sinnvoll durchgeführt werden kön- nen, da entweder relativ niedrige Enzymkonzentrationen eingesetzt werden müssen, beispielsweise unter 10 Gewichts-% bezogen auf die eingesetzten Edukte, und/oder der Biokatalysator mehrfach, zum Beispiel mindestens 10-fach, wieder verwendet werden kann. Ein weiterer Vorteil des erfindungs- gemäßen Verfahrens besteht darin, dass ohne aufwändige Aufarbeitungsreaktionen, wie Chromatographie oder fraltio- nierte Kristallisation Produkte hoher Reinheit, beispielsweise mit einem Aktivgehalt von > 90% und einem Anteil von N, O-Diacetylierungsprodukten von unter 5% darstellbar sind. Ein besondere Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass als Carbonsäurekomponenten einfach zugängliche Carbonsäurealkyles ter , beispielsweise Methylester, eingesetzt werden, die keine unerwünschten Nebenreaktionen verursachen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur biokatalytischen Herstellung von Sphingolipiden der allgemeinen Formel I

Formel I

durch Umsetzung eines Lysosphingolipids der allgemeinen Formel II

Forme l I I

mit einem Carbonsäureester der allgemeinen Formel III,

Formel III

wobei R ¹ eine lineare oder verzweigte, gegebenenfalls eine oder mehrere Mehrfachbindungen und/oder aromatische oder heteroaromatische Ringe enthaltende, gegebenenfalls durch Sauerstoffatome oder Ester- oder Amidfunktionalitäten un- terbrochene, gegebenenfalls durch mindestens eine weitere Gruppe ausgewählt aus Alkyl- Hydroxy-, Keto- oder Amingrup- pen substituierte Alkylkette mit 2 bis 55 Kohlenstoffatomen, bevorzugt -CH ₂ -Y-CH ₃ mit Y = eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung oder eine lineare oder verzweigte, gegebenen- falls eine oder mehrere Mehrfachbindungen und/oder aromatische oder heteroaromatische Ringe enthaltende, gegebenenfalls durch Sauerstoffatome oder Ester- oder Amidfunktiona- litäten unterbrochene, gegebenenfalls durch mindestens eine weitere Gruppe ausgewählt aus Alkyl- Hydroxy-, Keto- oder Amingruppen substituierte Alkylenkette mit 1 bis 53 Kohlenstoffatomen, darstellt,

R ² H, Phosphocholin, Serin, Ethanolamin oder einen Zucker bevorzugt Zucker oder H , besonders bevorzugt H darstellt,

X CH=CH, CH ₂ -CH ₂ oder CH ₂ -HCOH , bevorzugt CH ₂ -HCOH darstellt,

R ³ einen verzweigten oder unverzweigten Alkylrest mit 1 bis 12 C-Atomen, der mit mindestens einem Rest -OR ⁴ substituiert sein kann, darstellt,

wobei R ⁴ unabhängig voneinander gleiche oder ungleiche Reste ausgewählt aus der Gruppe umfassend

H und ein Rest -C (O)R ¹

ist,

dadurch gekennzeichnet, dass ein Biokatalysator eingesetzt wird, der mindestens eine Carboxylester-Hydrolase der Enzymklasse E. C. 3.1.1 ausgewählt aus der Gruppe umfassend

Carboxylester-Hydrolasen der Enzymklasse E. C. 3.1.1, die sich aus einem Organismus des Reiches der Pilze isolieren lassen und Carboxylester-Hydrolasen der Enzymklasse E. C. 3.1.1, die auf Aminosäureebene mindestens 60 %, vorzugsweise mindestens 80 % bevorzugt mindestens 90 %, besonders bevorzugt mindestens 95%, 98% bzw. 99 % homolog zu den sich aus einem Organismus des Reiches der Pilze isolieren lassenden sind,

aufweist .

Mit „Homologie auf Aminosäureebene" im Sinne der vorliegenden Erfindung ist nun und sei auch im Folgenden die „Aminosäure-Identität" verstanden, welche mit Hilfe bekannter Verfahren bestimmt werden kann. Generell werden besondere Computerprogramme mit Algorithmen unter Berücksichtigung spezieller Erfordernisse verwendet. Bevorzugte Verfahren zur Bestimmung der Identität erzeugen zunächst die größte übereinstimmung zwischen den zu vergleichenden Sequenzen. Computer-Programme zur Bestimmung der Identität umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, das GCG- Programmpaket, einschließlich

GAP (Deveroy, J. et al . , Nucleic Acid Research 12 (1984), Seite 387, Genetics Computer Group University of Wisconsin, Medicine (Wi), und - BLASTP, BLASTN und FASTA (Altschul, S. et al . , Journal of Molecular Biology 215 (1990), Seiten 403-410. Das BLAST- Programm kann erhalten werden vom National Center For Bio- technology Information (NCBI) und aus weiteren Quellen (BLAST Handbuch, Altschul S. et al . , NCBI NLM NIH Bethesda ND 22894; Altschul S. et al . , vorstehend) .

Der Fachmann ist sich bewusst, dass verschiedene Computerprogramme für die Kalkulation der ähnlichkeit bzw. Identität zwischen zwei Nukleotid- oder Aminosäure-Sequenzen zur Verfügung stehen. So kann die prozentuale Identität zwischen zwei Aminosäure-Sequenzen z.B. durch den Needleman und Wunsch (J. Mol. Biol. (48) : 444-453 (1970)) Algorithmus bestimmt werden, der in das GAP Programm im GCG Software- Paket (erhältlich über http://www.gcg.com) integriert wurde, berechnet werden und zwar entweder unter Verwendung einer Blossom 62-Matrix oder einer PAM250-Matrix, einer gap weight von 16, 14, 12, 10, 8, 6, oder 4 und einer length weight von 1, 2, 3, 4, 5, oder 6. Der Fachmann wird aner-

kennen, dass die Verwendung unterschiedlicher Parameter zu leicht unterschiedlichen Ergebnissen führen wird, dass aber die prozentuale Identität zwischen zwei Aminosäure-Sequenzen insgesamt nicht signifikant unterschiedlich sein wird. üblicherweise wird die Blossom 62-Matrix unter Anwendung der Voreinstellungen (gap weight: 12, length weight: 1) genutzt .

Eine Identität von 60 % gemäß dem vorstehenden Algorithmus bedeutet im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung 60 % Homologie. Das gleiche gilt für höhere Identitäten.

Besonders bevorzugt ist in dem erfindungsgemäßen Verfahren der Carbonsäureester der allgemeinen Formel III der Ester einer Carbonsäure mit einem Rest -R ³ des Alkohols R ³ OH, bei dem die Carbonsäure ausgewählt ist aus der Gruppe der natürlich vorkommenden Fettsäure auf Basis natürlicher pflanzlicher oder tierischer öle mit 6-30 Kohlenstoffato- men, insbesondere mit 8-22 Kohlenstoffatomen . Natürliche Fettsäuren sind unverzweigt und bestehen aus einer geraden Anzahl Kohlenstoffatomen . Eventuelle Doppelbindungen besitzen cis-Konfiguration . Beispiele sind: Capronsäure, Capryl- säure, Caprinsäure, Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitin- säure, Palmitoleinsäure, Isostearinsäure, Stearinsäure, 12-Hydroxystearinsäure, Dihydroxys tearinsäure, ölsäure, Linolsäure, Linolensäure, Petrolesinsäure, Elaidinsäure, Arachinsäure, Behensäure, Erucasäure, Gadoleinsäure, Linolensäure, Eicosapentaensäure, Docosahexaensäure, Arachidon- säure, dessen Esterprodukte ganz besonders bevorzugt sind.

Des Weiteren ist in dem erfindungsgemäßen Verfahren der Carbonsäureester der allgemeinen Formel III bevorzugt der Ester einer Carbonsäure mit einem Rest -R ³ des Alkohols

R ³ OH, bei dem die Carbonsäure ausgewählt ist aus der Gruppe der hydroxylierten Derivaten einer mehrfach ungesättigten Fettsäure. Solche Fettsäure sind beispielsweise 9- oder 13- Hydroxyoctadecadiensäure, 15-Hydroxyeicosatetraensäure und die Reihe der sogenannten alpha-Hydroxysäuren . Ebenfalls ist in diesem Zusammenhang die Carbonsäure besonders bevorzugt ein Polykondensationsprodukt von hydroxyfunktionali- sierten Säuren, beispielsweise Poly-12-hydroxystearinsäure oder Polyricinolsäure .

Ebenfalls ist in diesem Zusammenhang die Carbonsäure besonders bevorzugt eine synthetische oder natürlich vorkommende Carbonsäure, die aromatische Substituenten enthält, wie z.B. Benzoesäure, Zimmtsäure, Ferulasäure, Protocatechur- säure, Gallussäure, Vanillinsäure, Syringasäure, Isoferula- säure, Sinapinsäure, Kaffesäure, Genitinsäure, Salicyl- säure, Salicylursäure oder Nikotinsäure.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren ist R ³ bevorzugt ein un- substituierter Alkylrest mit 1 bis 4 C-Atomen, bevorzugt ist R ³ ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Methyl-,

Ethyl-, Vinyl-, Propyl-, Isopropyl-, n-Butyl, sek-Butyl- und tert-Butyl-Reste .

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens stellt der Carbonsäureester der allgemeinen Formel III einen Voll- oder Partialestern von Polyolen mit mindestens einer Säure R ¹ COOH dar. Bevorzugt werden als Voll- oder Partialester von Polyolen Glycol-, Glyceryl-, 1, 2-pentandiyl- 1, 3-pentandiyl-, 1 , 2-Butadiyl-, 1 , 3-Buta- diyl-, 1 , 4-Butadiylester, sowie deren Isomere und ungesättigte Analoga eingesetzt.

Die durch die Veresterung von R ¹ COOH den Rest R ³ bestimmenden oben genannten Edukte können als Reinsubstanz oder im Gemisch vorliegen, so dass folglich durch die Struktur der allgemeinen Formel III gegebenenfalls ein Gemisch beschrie- ben werden kann.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren können Mischungen von Sphingolipiden der allgemeinen Formel I biokatalytisch hergestellt werden, indem Mischungen der allgemeinen Formel III mit unterschiedlichem R ¹ eingesetzt werden.

Ebenso können in dem erfindungsgemäßen Verfahren Mischungen von Carbonsäureestern der allgemeinen Formel III mit unterschiedlichem R ³ eingesetzt werden.

Erfindungsgemäß können auch die Säureadditionsprodukte, auch Säureadditionsalze genannt, der Lysosphingolipide eingesetzt werden, wie sie beispielsweise im Falle des bereits genannten Phytosphingosins bei den etablierten fermentati- ven Verfahren anfallen, wie beispielsweise beschrieben bei P. Lersch, U. Schick, Spec . Chem. Mag., 2003, 23(6), 30-31. Als Säureadditionsprodukt des Lysosphingolipids wird bevorzugt das Carbonsäurecarboxylat , Sulfat, Phosphat, Nitrat, Carbonat, Hydroxid oder Halogenid, besonderd bevorzugt das Chlorid und Sulfat des Lysosphingolipids eingesetzt.

Bei Verwendung des Säureadditionsproduktes des Lysosphingolipids in erfindungsgemäßem Verfahren ist es bevorzugt, dass das Lysosphingolipid durch Deprotonierung des Säureadditionsprodukts des Lysosphingolipids vor der enzymatischen Umsetzung hergestellt wird.

Das so erhaltene Lysosphingolipid wird im Folgenden auch als Lysosphingolipid-Base bezeichnet.

Die deprotonierende Behandlung kann in Lösungen oder Suspensionen des Säureadditionsproduktes des Lysosphingolipids in üblichen organischen Lösungsmitteln stattfinden. Als Lösungsmittel können beispielsweise eingesetzt werden: Paraf- fine, ein- oder mehrwertige Alkohole (z.B.: Methanol, Etha- nol, Isopropanol, Propanol, Butanol, Pentanol, Hexanol, Cyclohexanol, Methylcyclohexanol, 2-Butyl-l-octanol sowie deren Isomere, Ethylenglycol, Glycerol, Diacetonalkohol, Isobutanol, etc.), Ether (Diethylether, tert . -Butylmethyl- ether, Tetrahydrofuran, Dioxan, Polyethoylate, Polypropoxy- late sowie Mischpolymere etc.), Ketone (Azeton, Methyliso- butylketon, Methylethylketon, etc.), Ester (Triethylcitrat, Tributylcitrat . Isobutylisobutyrat , Isobutylacetat . Isono- nylisononanoat, (2-Ethylhexyl ) Acetat , Cyclohexylacetat , 4- tert . -Butylcyclohexylacetat) . Bevorzugt sind toxikologisch unbedenkliche Lösungsmittel wie Methylisobutylketon oder 2- Methyl-2-butanol .

Der Deprotonierungsschritt kann bei Reaktionstemperaturen durchgeführt werden, bei denen das Lösungsmittel sich im flüssigen Zustand befindet. Vorzugsweise bei Reaktionstemperaturen zwischen -8O ⁰ C und +15O ⁰ C, besonders bevorzugt zwischen O ⁰ C und 12O ⁰ C, ganz besonders bevorzugt zwischen +25 ⁰ C und 100 ⁰ C.

Die so erhaltene Lösung von Lysosphingolipid-Base kann als solche für die enzymatische Umsetzung eingesetzt werden oder vorher filtriert werden.

In einer weiteren Ausführung der vorliegenden Erfindung kann das Lösungsmittel des Deprotonierungsschritts nach einer dem Fachmann geläufigen Methode (z.B. destillative Entfernung oder Präzipitation/Kristallisation der Lysosphingo-

lipid-Base mit anschließender Filtration) entfernt werden. Optional kann die Lysosphingolipid-Base vor der enzymati- schen Umsetzung beispielsweise durch Präzipitation oder Kristallisation oder durch destillative Entfernung des Lo- sungsmittels isoliert werden. Bevorzugt ist, dass zwischen der Depro tonierung des Säureadditionsprodukts des Ly- sosphingolipids und biokatalytischer Herstellung ein Filtrationsschritt erfolgt, in dem die bei der deprotonierenden Behandlung anfallenden Salze entfernt werden.

Alternativ kann die Lysosphingolipid-Base durch Deprotonie- rung des Säureadditionsprodukts des Lysosphingolipids während der Biokatalyse hergestellt werden.

Die mit einer Aktivierung einhergehende Deprotonierung kann durch Einsatz einer Base erfolgen, bevorzugt mittels einer organischen oder anorganischen Base. Bevorzugt werden als anorganische Basen anorganische Hydroxide, Carbonate, Metallhydride (wie z.B. : Lithiumaluminiumhydrid, Calzium- hydrid, Natriumhydrid und ähnliche), Ionenaustauschermaterialien (wie z.B. KationeN- oder Anionentauscher) sowie als organische Basen Metallorganyle (wie beispielsweise Butyl- lithium) Alkoholate, Amine sowie deren Metallsalze wie beispielsweise Lithiumdiisopropylamin eingesetzt.

überraschenderweise wurde gefunden, dass insbesondere solche Basen, bei deren Reaktion mit den Säureadditionssalzen formal kein Wasser entsteht, qualitative besonders hochwertige Lysoshingolipid-Base liefen, welche sich in der enzy- matischen Reaktion besonders leicht umsetzen lässt. Besonders bevorzugt sind daher solche Basen, bei denen kein Reaktionswasser frei wird. Dies sind solche, die nach Proto- nierung kein Wasser frei setzen. Bevorzugt eingesetzt wird

als Base ein Alkalimetallalkoholat . Dieses kann beispielsweise in alkoholische Lösung vorliegen. Besonders bevorzugt sind Natrium- und Kaliummethanolat . Diese können ebenfalls als Lösungen in organischen Lösungsmitteln eingesetzt wer- den .

Eine weitere Alternative, Reaktionswasser zu vermeiden, und somit ebenso bevorzugt in erfindungsgemäßem Verfahren ist der Einsatz von wasserbindenden, bevorzugt wasserbindenden anorganische Salzen, wie beispielsweise Na2SO4 zur Bindung von entstehendem Reaktionswasser bei Einsatz von Alkali- und/oder Erdalkalihydroxiden als Base. Bevorzugt wird Na2SO ₄ eingesetzt.

Erfindungsgemäß liegt in dem Verfahren das molare Verhältnis zwischen Säureadditionsprodukts des Lysosphingolipids und Base im Bereich zwischen 10 zu 1 bis 0,05 zu 1, bevorzugt zwischen 3 zu 1 bis 0,2 zu 1, besonders bevorzugt zwischen 1,4 zu 1 und 0,6 zu 1 und ganz besonders bevorzugt ist das molare Verhältnis zwischen Säureadditionsprodukt des Lysosphingolipids und Base äquimolar.

In einer besonderen Ausführung der vorliegenden Erfindung wird eventuell vorhandenes Wasser aus dem Deprotonierung- sansatz zur Herstellung der Lysosphingolipid-Base entfernt. Beispielsweise werden hierzu Wasserentfernungsverfahren wie physikalischer Methoden (z.B. Destillation, Membranverfahren, Extraktion oder Adsorption (beispielweise an Molekularsieb) ) oder auch chemische Methoden (z.B.: Reaktion mit Metallhydriden und -Oxiden oder anderen Reaktanden wie Anhydriden, Estern) eingesetzt.

Wie bereits eingangs erwähnt, ist es vor dem Stand der Technik, wie er in WO94/26919 (Gist-Brocades) beschrieben ist, völlig überraschend, dass Pilzlipasen in erfindungsgemäßem Verfahren als effizienter Biokatalysator eingesetzt werden können.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren werden als Biokatalysator insbesondere Carboxylester-Hydrolasen der Enzymklasse E. C. 3.1.1, die sich aus einem Organismus des Reiches der Pilze isolieren lassen und/oder die auf Aminosäureebene mindestens 60 %, vorzugsweise mindestens 80 % bevorzugt mindestens 90 %, besonders bevorzugt mindestens 95%, 98% bzw. 99 % homolog zu den sich aus einem Organismus des Reiches der Pilze isolieren lassenden sind, bei denen der Or- ganismus ausgewählt ist aus der Gruppe der Gattungen Aspergillus, Bipolaris , Candida, Fusarium, Geotrichum, Humicola , Microsporum, Mucor, Pichia, Thermomyces , Penicilium, Pi- chia, Rhizopus , Rhizomucor, Microsporum, Mucor, Nocardia , Saccharomyces , Streptomyces , Thermomyces, Trichosporon, Zy- gosaccharomyces .

Beispielhafte Vertreter sind z.B.: Aspergillus caesiellus, A. candidus , A. carbonarius , A. carneus , A. chevalieri , A. clavatus , A. costaricaensis , A. cretensis , A. deflectus , A. flaviceps , A. flavus, A. flocculatosus , A. fumigatus , A. glaucus, A. ibericus , A. lacticoffeatus, A. lentulus , A. neobridgeri, A. nidulans , A. niger, A. niveus, A. ochra- ceus , A. oryzae, A. parasiticus , A. penicilloides , A. pipe- ris, A. pseudoelegans , A. pseudofisheri , A. restrictus , A. roseoglobulus , A. sclerotioniger, A. sojae, A. steynii, A. sydowi, A. terreus, A. udagawae, A. ustus , A. versicolor,

A. westerdijkiae, Bipolaris australiensis , B .hawaiiensis ,

B. picifera, Candida antarctica, C. cylindracea, C. lipoly-

tica, C. rugosa, C. utilis , C. robusta, C. kefyr, C. albicans, C. glabrata, C. krusei , C. lusitaniae, C. parapsilo- sis, C. tropicalis , Fusarium chlamydosporum, F. coeruleum, F. dimerum, F. incarnatum, F. moniliforme F. oxysporum, F. proliferatum, F. sacchari , F. semitectum, F. solani, F. sporotrichoides , F. sub glutinans , F. tabacinum, F. verti- cillioides , Geotrichum candidum, G.klebahnii , Humicola fus- coatra var . Fuscoatra, H.a grisea var. Grisea, H. grisea var . Thermoidea , H. insolens , Microsporum amazonicum, M. audouinii , M. audouinii var. Langeronii , M. audouinii var. Rivalierii , M. boullardii , M. canis , M. canis var. distor- tum, M. cookei, M. equinum, M. ferrugineum, M. fulvum, M. gallinae, M. gypseum, M. nanum, M. persicolor, M. praecox, M. racemosum, M. vanbreuseghemii Mucor javanicus , M. pusil- lus , M. plumbeus , M. racemosus , M. hiemalis , Nocardia aste- roides, N. brasiliensis , N. otitidiscaviarum, Penicillium aurantiogriseum, P. brevicompactum, P. chrysogenum, P. ca- memberti , P. digitatum, P. citrinum, P. commune, P. cory- lophilum, P. crustosum, P. cyclopium, P. expansum, P. funi- culosum, P. glabrum, P. glaucum, P. griseofulvum, P. itali- cum, P. marneffei, P. nalgiovense, P. nordicum, P. notatum, P. palitans , P. purpurrescens , P. purpurogenum, P. olsonii, P. oryzae, P. roqueforti , P. variabile, P. viridicatum, P. verrucosum, Pichia acaciae, P. amylophilia, P. ciferrii, P. pastoris , P. alni, P. americana , P. amethionina , P. an- gophorae, P. angusta, P. anomala, P. antillensis , P. bar- keri , P. besseyi, P. bimundalis , P. bispora, P. bovis , P. cactophila, P. canadensis , P. capsulata, P. caribaea, P. castillae, P. chambardii , P. delftensis, P. deserticola, P. dryadoides , P. euphorbiae, P. euphorbiiphila , P. fabianii , P. faecalis , P. farinosa , P. fermentans , P. finlandica , P. fluxuum, P. galaeiformis , P. glucozyma, P. guilliermondii , P. hampshirensis , P. haplophila , P. heedii, P. heimii, P.

henricii , P. holstii, P. inositovora, P. jadinii, P. japo- nica, P. kluyveri , P. kodamae, P. lynferdii , P. maganishii , P. media, P. membranifaciens , P. methanolica , P. methylivo- ria, P. mexicana , P. meyerae, P. minuta , P. mississippien- sis, P. nakasei, P. nakazawae, P. norvegensis , P. oezlemii , P. ofunaensis , P. ohmeri, P. onychis , P. opuntiae, P. pe- tersonii , P. philodendri , P. philogaea , P. pijperi , P. pini, P. populi, P. pseudocactophila , P. quercuum, P. ra- baulensis , P. rhodanensis , P. salicaria , P. scolyti, P. se- gobiensis , P. silvicola, P. spartinae, P. stipitis , P. strasburgensis , P. subpelliculosa , P. sydowiorum, P. tanni- cola, P. thermotolerans , P. toletana, P. trehalophila, P. triangularis , P. veronae, P. wickerhamii , P. xylosa, Ther- momyces lanuginosa , Rhizopus arrhizus , R. delemar, R. ni- veus , R. oryzae, R. azygosporus , R. microsporus , R. schip- perae, R. stolonifer, Rhizomucor miehei, Saccharomyces barnettii , S. bayanus , S. castellii , S. cerevisiae, S. daire- nensis, S. exiguus , S. paradoxus , S. pastorianus , S. rosi- nii, S. servazii , S. spencoerorum, S. transvaalensis , S. unisporus , S. bailii, Streptomyces spp . , Trichosporon asa- hii, T. asteroides , T. beigelii , T. coremiiforme, T. cuta- neum, T. faecale, T. gracile, T. inkin, T. mucoides , T. ovoides, T. pullulans , Zygosaccharomyces bisporus , Z. cidri, Z. fermantati , Z. florentinus , Z. mellis, Z. micro- ellipsoides , Z. mrakii, Z. rouxii.

Besonders bevorzugt eingesetzte Carboxylester-Hydrolasen in erfindungsgemäßem Verfahren sind Enzyme ausgewählt aus der Gruppe der Lipase aus Thermomyces lanuginosus (accession- number 059952), die Lipasen A und B (accessionnumber P41365) aus Candida antarctica und, die Lipase aus Mucor miehei (accessionnumber P19515) , die Lipase aus Rhizomucor javanicus (accessionnumber S32492), die Lipase aus Rhizopus

oryzae (accessionnumber P61872), die Lipasen aus Candida rugosa (accessionnumber P20261, P32946, P32947, P3294 und P32949), die Lipase aus Rhizopus niveus (accessionnumber P61871), die Lipase aus Penicillium camberti faccessionnum- ber ?2 ^γ J2V.) , die Lipasen aus Aspergillus niger (ABG73613, ABG73614 und ABG37906) und die Lipase aus Penicillium cyc- lopium (accessionnumber P61869), so wie jeweils deren auf Ammosaureebene mindestens 60 %, vorzugsweise mindestens 80 % bevorzugt mindestens 90 %, besonders bevorzugt mindestens 95%, 98% bzw. 99 % homologen. Bezüglich Homologie sei auf oben genannte Definition verwiesen.

Kommerzielle Beispiele und ebenfalls bevorzugt eingesetzte Carboxylester-Hydrolasen in er f mdungsgemaßem Verfahren sind die Handelsprodukte Lipozyme TL IM, Novozym 435, Lipo- zyme IM 20, Lipase SP382, Lipase SP525, Lipase SP523, (alles Handelsprodukte der Firma Novozymes A/S, Bagsvaerd, Danemark), Chirazyme L2, Chirazyme L5, Chirazyme L8, Chira- zyme L9 (alles Handelprodukte der Firma Roche Molecular Bi- ochemicals, Mannheim, Deutschland), sowie Lipase M „Amano", Lipase F-AP 15 „Amano", Lipase AY „Amano" , Lipase N „Amano", Lipase R „Amano", Lipase A „Amano", Lipase D „Amano", Lipase G „Amano" (alles Handelsprodukte der Firma Amano, Japan) .

Der Biokatalysator wird vorzugsweise in wasserfreier, bzw. teilhydratisierter Form eingesetzt. Er kann immobilisiert oder als Lyophilisat eingesetzt werden. Als Trager zur Immobilisierung können inerte organische oder anorganische Trager verwendet werden. Vorzugsweise werden als inerte Trager solche partikularen Trager verwendet bzw. sind im Enzymimmobilisat vorhanden, die eine Teilchengroßenvertei- lung aufweisen, bei der mindestens 90% der Teilchen eine

Teilchengröße von 10 bis 5000 μm, bevorzugt von 50 μm bis 2000 μm aufweisen. Als organische Träger können insbesondere solche eingesetzt werden, die Polyacrylat, Polymeth- acrylat, Polyvinylstyrol, Styrol-Divinylbenzolcopolymeren, Polypropylen, Polyethylen, Polyethylenperepthalat, PTFE und/oder andere Polymere aufweisen oder aus diesen bestehen. Als Trägermaterial können, in Abhängigkeit von dem zu immobilisierenden Enzym, insbesondere saure oder basische Ionenaustauscherharze eingesetzt werden, beispielsweise Du- olite A568, Duolite XAD 761, Duolite XAD 1180, Duolite XAD 7HP, Amberlite IR 120, Amberlite IR 400, Amberlite CG 50, Amberlyst 15 (alles Produkte der Fa. Rohm und Haas) oder Lewatit CNP 105 und Lewatit VP OC 1600 (Produkte der Fa. Lanxess, Leverkusen, Deutschland) . Als anorganische Träger können aus dem Stand der Technik bekannte, oxidische und/oder keramische Träger eingesetzt werden. Insbesondere können als anorganische Träger beispielsweise Celite, Zeo- liten, Silica, Controlled-Pore Glas (CPG) oder andere Träger, wie sie zum Beispiel in L. Cao, „Carrier-bound Immobi- lized Enzymes: Principles, Application and Design", Wiley- VCH: 2005, Weinheim, Deutschland, beschrieben sind, eingesetzt werden. Besonders bevorzugt bestehen die im Enzymim- mobilisat vorhandenen inerten Träger bzw. die zur Herstellung der Enzymimmobilisate verwendeten inerten Träger aus Polyvinylstyrol, Polymethacrylat oder Polyacrylat.

Die Immobilisierung auf den Partikeln kann erfindungsgemäß kovalent oder nichtkovalent, bevorzugt nichtkovalent erfolgen. Für die nichtkovalente Immobilisierung kann der Träger z. B. mit einer wässrigen Enzymlösung, die gegebenenfalls weitere Bestandteile, wie z. B. anorganische Salze oder De- tergenzien, enthalten kann, inkubiert bzw. imprägniert werden. Diese Inkubation/Imprägnierung kann z. B. bei Tempera-

turen zwischen 0 ⁰ C und 50 ⁰ C, bevorzugt zwischen 0 ⁰ C und 40 °C durchgeführt werden. Vorzugsweise erfolgt die Inkubation/Imprägnierung über einen Zeitraum von wenigen Minuten bis zu einigen Stunden. Der Fortschritt der Inkubation kann durch Bestimmung der Konzentration des Enzyms in der Lösung mit den gängigen Verfahren zur Proteinbestimmung erfolgen. Nach Erreichen des gewünschten Immobilisierungsgrads kann der Träger vorzugsweise mit Wasser gewaschen und, wenn gewünscht, getrocknet werden.

Möglich ist auch die Verwendung ganzer Zellen, die einen geeigneten Biokatalysator enthalten, entweder als resting cells oder in getrockneter Form, vorzugsweise nach einer Methode des Standes der Technik permeabilisiert .

Erfindungsgemäß kann der Biokatalysator in einem Mengenverhältnis zu den eingesetzten Substraten von 0,01% (w/w) bis 300% (w/w) verwendet werden. Das bevorzugte Massenverhältnis folgt aus der spezifischen Aktivität des Biokatalysators unter den jeweiligen Reaktionsbedingungen (insbesondere in Abhängigkeit der Substrate, deren Konzentration, des Lösungsmittels und der Reaktionstemperatur) . In Abhängigkeit dieser Parameter wird eine Biokatalysatormenge bevorzugt, die einen Vollumsatz der Reaktanden innerhalb eines Zeit- raumes von 1 bis 96 Stunden, vorzugsweise von 8 bis 24 Stunden ermöglicht. Bevorzugt wird die Biokatalysatormenge bezogen auf die Gesamtmasse an Edukten in einem Bereich zwischen 1% (w/w) und 100% (w/w) und ganz besonders bevorzugt zwischen 1% (w/w) und 50% (w/w) insbesondere zwischen 1% (w/w) und 20% (w/w) eingesetzt.

In einer besonderen Ausführungsform wird der Biokatalysator zurückgewonnen .

Erfindungsgemäß können die Reaktanden zu Beginn der enzyma- tischen Umsetzung in einem molaren Verhältnis von Ly- sosphingolipid zu Carbonsäureester von 1:10 bis 10:1 vorliegen. Der Term „molare Verhältnis" bezieht sich hierbei auf das molare Verhältnis von Lysosphingolipid-Aminen zu Acyldonorcarboxylatgruppen . Bevorzugt werden Mengenverhältnisse zwischen 1:3 und 3:1 eingesetzt. Besonders bevorzugt werden Mengenverhältnisse zwischen 1:1,4 und 1,4:1 eingesetzt, insbesondere äquimolare Mengenverhältnisse.

Die Reaktanden können entweder im geschmolzenen Zustand ohne weitere Lösungsvermittler vorliegen oder in einem organischen Lösungsmittel gelöst oder suspendiert sein. Bevorzugt wird die Reaktion im organischen Lösungsmittel durchgeführt. Als Lösungsmittel eignen sich besonders diese die die Reaktanden bei Temperaturen im Bereich 2O ⁰ C bis 13O ⁰ C in hohen Konzentrationen zu lösen vermögen. Als besonders geeignet erwiesen sich beispielsweise, ohne eine Beschränkung auf diese Lösungsmittel, Ketone wie beispiels- weise Methylisobutylketon oder Cylclohexanon, sterisch gehinderte sekundäre Alkohole wie 2-Butyl-l-Oktanol, Methyl- cyclohexanole, l-Methoxy-2-propanol, 2 , 3-Butandiol 2-Okta- nol, Diacetonalkohol, 2-Methyl-2-butanol, sterisch gehinderte Ester wie 4-tert-Butylcyclohexylacetat, (2-Ethylhe- xyl) acetat, Cyclohexylace tat und Ether wie 1,4-Dioxan, Tetrahydrofuran und Varonic APM (Evonik Goldschmidt GmbH, Essen, Deutschland) . Als ungeeignet erwiesen sich solche Lösungsmittel, insbesondere Ester, die mit signifikanter Aktivität vom Biokatalysator umgesetzt werden. Bei der Re- aktion mit Phytosphingosin als Edukt und Verwendung von Buttersäureethylester konnten beispielsweise neben dem gewünschten Produkt signifikante Mengen an N-Butyrolyphytosphingosin und Umesterungsprodukt mit dem

eingesetzten Acyldonor (z.B. Methylstearat ) nachgewiesen werden. Dasselbe gilt für die Verwendung von Essigsäurebu- tylester (Bildung von N-Acetylphytosphingosin und Acyldo- norbutylester) .

Bevorzugt wird die Reaktion unter wasserfreien Bedingungen, definiert als Wassergehalt von maximal 0,100 M, bevorzugt maximal 0,010 M und besonders bevorzugt unter maximal 0,005 M, nachgewiesen nach Karl Fischer, durchgeführt.

Hohe Substratkonzentrationen sind besonders vorteilhaft für die Reaktionsgeschwindigkeit. Bei hohen Umsätzen resultieren daraus hohe Produktkonzentrationen die sich überraschenderweise aber nicht negativ auf die Enzymaktivität bei hohen Umsätzen auswirken. Dies ist für den Fachmann insofern überraschend als dass Produktinhibition bei enzymati- schen Reaktionen üblicherweise beobachtet wird. Darüber hinaus wurde überraschenderweise gefunden, dass die Entfernung eines der Reaktionsprodukte (Ceramid oder Alkohol) aus der Reaktionsmischung nicht zwingend zur Erreichung sehr hoher bis quantitativer Umsätze notwendig ist. Nach dem, dem Fachmann geläufigen, Prinzip von Le Chatelier wäre dies bei der vorliegenden Gleichgewichtsreaktion zu erwarten gewesen. Darüber ließen die Reaktionsumsätze des Standes der Technik (WO94/26919, Gist-Brocades ) von lediglich 67% bis 78% diese Notwendigkeit erwarten. Erfindungsgemäß können allerdings auch niedrige Substratkonzentrationen effizient umgesetzt werden.

Bevorzugt im Sinne der Erfindung ist eine Reaktandenkon- zentration zu Beginn der Reaktion im Bereich zwischen 0,01 M und 3 M, insbesondere im Bereich zwischen 0,2 M und 2 M

und besonders bevorzugt im Bereich zwischen 0,5 M und 1,5 M je Reaktand liegt.

Bezüglich der Reaktionstemperatur wurde gefunden, dass ins- besondere solche Temperaturen geeignet sind bei denen die Substrate homogen im Lösungsmittel löslich sind. Vorteilhaft erwiesen sich dabei Reaktionstemperaturen im Bereich zwischen 2O ⁰ C und 13O ⁰ C. Insbesondere bei hohen Temperaturen ist aufgrund von Farbveränderungen auf eine sorgfältige Entgasung der Reaktionsmischung zu achten. überaschender- weise wurde allerdings gefunden, dass Vorkehrungen solcherart bei Reaktionstemperaturen von 100 ⁰ C und darunter nicht notwendig sind. Bevorzugt sind daher Reaktionstemperaturen im Bereich von 40 ⁰ C bis 9O ⁰ C und ganz besonders bevorzugt der Bereich zwischen 70 ⁰ C und 85 ⁰ C.

Die Reaktion wird bevorzugt unter einem Druck von kleiner 1 bar, bevorzugt kleiner 0,5 bar und besonders bevorzugt kleiner 0,05 bar durchgeführt.

Die Reaktionsführung kann im batch-Verfahren (Rührkessel) oder im Festbettreaktor kontinuierlich oder semi-kontinu- ierlich durchgeführt werden. Insbesondere beim batch-Ver- fahren war von einer hohen Inaktivierungsrate des Biokata- lysators auszugehen. Zu Nennen ist hier die mechanische Zerstörung des Biokatalysators aufgrund des auftretenden mechanischen Stresses durch Rühren, sowie thermische Inak- tivierung des Biokatalysators gepaart mit inaktivierenden Effekten hervorgerufen durch Reaktanden und Lösungsmittel. Solche Effekte sind dem Fachmann bekannt und adäquate Abhilfen sind literaturbekannt. So kann beispielsweise bei auftretender mechanischer Abnutzung des Biokatalysators im Rührverfahren diese durch Einsatz eines Festbetts umgangen

werden. Weitere Reaktortypen wie sie dem Fachmann bekannt sind eignen sich ebenfalls zur Verhinderung von mechanischer Enzyminaktivierung.

Weiterhin ist bei der Verwendung von Säureestern als Acyl- donoren mit chemischer Inaktivierung des Biokatalysators durch die freiwerdenden Alkohole zu rechnen (z.B.: Y. Yoshida et al . , J. Biosci. Bioeng., 2006, 102(1), 66-68) . Methoden zur Umgehung solcher Inaktivierungen sind dem Fachmann bekannt und umfassen beispielsweise die destilla- tive Abtrennung des Alkohols aus dem Reaktionsgemisch oder die Anwendung von Membranverfahren. überraschenderweise wurde allerdings gefunden, dass auch ohne Anwendung der oben beschriebenen Verfahren der Biokatalysator mehrfach und ohne signifikanten Aktivitätsverlust wiederverwendet werden kann.

Allen im Stand der Technik beschriebenen Verfahren ist gemein, dass die erhaltenen Produkte Zusammensetzungen aus Sphingolipid und hohen Anteilen (bis zu 19% des Gesamtproduktes) des korrespondierenden N, O-Diacylierungsproduktes sind. Diese Zusammensetzungen sind allesamt in beispielsweise kosmetischen Komposititionen nicht einsetzbar, da der Anteil an N, O-Diacylierungsprodukt nicht kleiner 5 % ist. überaschenderweise wurde weiterhin gefunden, dass in dem erfindungsgemäßen Verfahren die Amidierung der sekundären Aminfunktion gegenüber der Veresterung einer der Alkoholfunktionen deutlich bevorzugt ist. Ein gegenteiliges Verhalten insbesondere eine Bevorzugung der primären, also sterisch leicht zugänglichen Alkoholfunktion wäre zu erwarten gewesen. ähnliches ist im Stand der Technik (WO94/26919, Gist-Brocades ) beschrieben; die dort erhaltenen Reaktionsprodukte enthielten bei Verwendung einer bak-

teriellen Lipase und bereits bei einem molaren überschuss von 60% des Acyldonors über Phytosphingosin, signifikante Anteile an N, O-Diacylierungsprodukt (Mono- zu Diacylie- rungsprodukt > 1:5) .

In dem erfindungsgemäßen Verfahren konnte hingegen gezeigt werden, dass sogar bei einem 3, 6-fachen überschuss an Acyl- donor über Lysosphingolipid keine signifikante Diacylierung eintritt solange noch Lysosphingolipid im Reaktionsansatz vorhanden ist. Erst ab vollständigem Umsatz von Lysosphingolipid zum Sphingolipid konnte langsame Veresterungsaktivität nachgewiesen werden. Bei stöchiometrischer Verwendung von Lysosphingolipid und Acyldonor wurde die oben beschriebene unerwünschte Nebenreaktion kaum beobachtet.

Somit ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren mit dem besonders reine N-Acylphytosphingosine bereits als Rohprodukte aus der enzymatischen Umsetzung erhalten werden. Vorzugsweise liegt der Umsatz in Bezug auf die Zielverbindung gemäß Formel I bei über 80 %, besonders bevorzugt bei über 85% und ganz besonders bevorzugt bei mehr als 90%% des theoretisch zu erwartenden Umsatzes.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich weiterhin zur Herstellung einer Zusammensetzung enthaltend Formel I und von 0,001 bis 19 Massen-%, bevorzugt 0,005 bis 19 Massen-% besonders bevorzugt 0,01 bis 5 Massen-% des korrespondierenden N, O-Diacetlyierungsproduktes .

Somit sind Zusammensetzungen enthaltend Formel I und von 0,001 bis 19 Massen-%, bevorzugt 0,005 bis 19 Massen-% besonders bevorzugt 0,01 bis 5 Massen-% des korrespondierenden N, O-Diacetlyierungsproduktes, hergestellt mit erfin-

dungsgemäßem Verfahren, ebenfalls Bestandteil der Erfindung.

Das Sphingolipid, hergestellt mit dem erfindungsgemäßen Verfahren, ist ebenfalls Bestandteil der Erfindung.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Methode zur Isolierung des Sphingolipids aus der Reaktionsmischung. Aufgrund seiner vorteilhaften physikalischen Ei- genschaften kann das Sphingolipid leicht durch Kristallisation / Präzipitation aus der Reaktionslösung entfernt werden und somit die bereits hohe Reinheit des Rohproduktes auf einfache Weise noch gesteigert werden.

Erfindungsgemäße Sphingolipide und Zusammensetzungen sind besonders geeignet für die Herstellung von kosmetischen und pharmazeutischen Formulierungen. Daher sind kosmetische oder pharmazeutische Formulierungen enthaltend mindestens ein erfindungsgemäßes Sphingolipid und/oder eine erfin- dungsgemäße Zusammensetzung ebenfalls Bestandteil der Erfindung.

In den nachfolgend aufgeführten Beispielen wird die vorliegende Erfindung beispielhaft beschrieben, ohne dass die Er- findung, deren Anwendungsbreite sich aus der gesamten Beschreibung und den Ansprüchen ergibt, auf die in den Beispielen genannten Ausführungsformen beschränkt sein soll.

Folgende Abbildungen sind Bestandteil der Beispiele:

Abbildung 1: Reaktionsverlauf einer enzymatischen Umsetzung von Phytosphingosi mit einem 3,4-fachen überschuss an Acyl- donor .

Abbildung 2: Vergleich der Reaktionsverläufe der enzymati- schen Umsetzung von Phytosphingosine mit Methyls tearat . Dreiecke: mit zusätzlichem N-Stearoylphytosphingosin, Quadrate: ohne zusätzliches N-Stearoylphytosphingosin.

Abbildung 3: Recycling des Biokatakysators : widergegeben sind in schwarz die Anfangsaktivitäten der betreffenden Cyclen und in schraffiert die Ausbeuten nach 24h.

Abbildung 4: Zeit-Umsatz-Kurven der enzymatischen Umsetzung von Phytosphingosin mit Methylstearat in verschiedenen Lösungsmitteln .

Abbildung 5: Verlauf einer enzymatischen Ceramidl II-Syn- these unter Verwendung von Tristearin als Acyldonor.

Beispiele :

Beispiel 1: Deprotonierung von PS-Sulfat

100 g Phytosphingosin-Sulfat (Cosmoferm, Delft, NL) werden in 600 g Methanol bei 55 ⁰ C suspendiert, mit 46 g Natrium- methanolat versetzt und 150 Minuten bei 55 ⁰ C gerührt. Anschließend wird die Suspension heiß filtriert und das FiI- trat eingeengt. Der hell-beige Feststoff (78g) wird für weitere Versuche eingesetzt.

Beispiel 2: Screening kommerzieller Lipasen auf Amidie- rungsreaktivität

In einer äquimolaren Lösung von Phytosphingosin (aus Beispiel 1) und Methylstearat (jeweils IM) in Dioxan (11 mL) werden je 0,35 g (5% w/w) der in Tabelle 1 aufgeführten

Pilzlipasen suspendiert und 72h bei 8O ⁰ C Lipase geschüttelt. Anschließend wird der Biokatalysator heiß abfiltriert und das Filtrat gaschromatographisch analysiert.

Tabelle 1: Untersuchung verschiedener Hefe- oder Pilzlipasen bezüglich ihrer Eignung als N-Acylierungskatalysator für Phytosphingosin .

Lipase aus % Ceramid % Phytosphingosin % Methylstearat

Rhizomucor

15, 0 10, 9 6, 8 miehei

Thermomyces

7,1 17,3 12, 9 lanuginosa

Candida

3, 6 16, 8 17,7 rugosa

Candida

3,2 14, 6 15,7 cylindracea

Candida antarctica 2,9 20,2 15, 6

(Lipase A)

Candida antarctica 23, 1 5,3 4,4

(Lipase B)

Für weitere Versuche wurde die Lipase B aus Candida antarctica verwendet.

Beispiel 4: Negativkontrolle

Um eine mögliche unkatalysierte Umsetzung von Phytosphingosin mit dem Acyldonor auszuschließen wurde Phytosphingosin 0,2 M in Methylstearat bei 8O ⁰ C gelöst und 4 Stunden inku-

biert . Die anschließende gaschromatographische Analyse zeigte keinen signifikanten (quantifizierbaren) Umsatz.

Beispiel 5: Reaktionen mit Phytosphingosin-Sulf at

Zur Demonstration der Notwendigkeit der Deprotonierung von Phytosphingosin-Sulf at wurde folgendes Vergleichsexperiment durchgeführt: 8, 18g Phytosphingosin-Sulf at und 6, 72g Me- thylstearat wurden in 15 mL Dioxan bei 8O ⁰ C suspendiert und mit 0, 16g Novozym 435 versetzt. Nach 4 Stunden Inkubation unter Rühren wurde die Reaktionsmischung gaschromatogra- phi s ch anal ys iert . Es wurden ledigl ich 31, 7 mM N-Stearoylphytosphingosin gefunden. In einem Vergleichsexperiment unter identischen Bedingungen aber nach Zugabe von 2, 4 g N a t r i u m c a r b o n a t wurden 368 mM N-Stearoyl ^¬ phytosphingosin gefunden.

Beispiel 6: Regioselektivität der enzymatischen Acylierung

Um einen hohen überschuss von Acyldonor zu Phytosphingosi zu erreichen, wurden 4,43g Phytosphingosin in 15,09g Me- thylstearat bei 12O ⁰ C gelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,98g Novozym 435 (5% w/w) zugegeben und unter Normaldruck gerührt. Periodisch wurden Proben entnommen und gaschromato- graphisch analysiert.

Wie aus dem Reaktionsverlauf (Abbildung 1) erkennbar ist, erfolgt eine signifikante Akkumulation des unerwünschten N, O-Distaerylphytosphingosins erst bei vollständigem Umsatz der eingesetzten Phytosphingosin. So ist nach einer Stunde, bei einer Rest-Phytosphingosinkonzentration von 19 mM (Umsatz > 99,5%) noch kein N, O-Diacylierungsprodukt nachweisbar; erst unterhalb einer Phytosphinigosinkonzentration von

ca. 5 mM wird Bildung des N, O-Diacylierungsprodukts beobachtet. Darüber hinaus liegt die Reaktionsgeschwindigkeit der Nebenreaktion um einen Faktor von mehr als 25 unter der der erwünschten Reaktion.

Beispiel 7: Versuch zur Produktinhibition

Zum Ausschluss etwaiger Produktinhibition wurden 2 parallele Versuche durchgeführt. Dazu wurden jeweils 1,59g Phy- tosphingosin zusammen mit 7,45g Methylstearat in 25 mL Di- oxan bei 8O ⁰ C gelöst und mit je 0,49g Novozyme 435 versetzt. Zu einem der beiden Reaktionsmischungen wurde zusätzlich 1,3 g N-Stearoylphytosphingosin (Cosmoferm, Delft, NL) beigemischt. Wie der Vergleich der beiden Zeit-Umsatz- kurven zeigt (Abbildung 2) sind die Reaktionsverläufe identisch so dass eine ausgeprägte Produktinhibition ausgeschlossen werden kann.

Bespiel 8 : Wiederverwertbarkeit des Biokatalysators

Zur Evaluation der Wiederverwertbarkeit des Biokatalysators wurde eine Versuchsreihe wie folgt durchgeführt: 3,3 g Phy- tosphingosin wurden zusammen mit 14,9 g Methylstearat in 50 mL Dioxan bei 8O ⁰ C gelöst und die Reaktion durch Zugabe von 0,98 g Novo435 gestartet. Es werden periodisch Proben entnommen und gaschromatographisch analysiert und daraus Anfangsgeschwindigkeit und Umsatz errechnet. Nach 24h wird der Reaktionsansatz heiß filtriert und das zurückbleibende Enzym dreimal mit jeweils 50ml heißen (5O ⁰ C) Dioxan gewa- sehen. Anschließend wird der so recyclisierte Biokatalysator erneut unter gleichen Bedingungen wie oben beschrieben eingesetzt. Dieses Vorgehen wird insgesamt sechsmal wiederholt.

Wie aus Abbildung 3 deutlich wird, kann der Biokatalysator wenigstens siebenmal für die Reaktion eingesetzt werden ohne dass ein Aktivitätsrückgang zu beobachten ist.

Beispiel 9: Bestimmung der Kinetischen Parameter des Bioka- takysators

Die kinetischen Parameter der enzymatischen N-Acylierung wurden wie folgt bestimmt: Unter Beibehaltung der Konzent- ration des einen Reaktanden wurde die Konzentration des anderen Variiert. Die Reaktionen wurden in Dioxan bei 8O ⁰ C unter Verwendung jeweils der gleichen Enzymmenge durchgeführt. Es wurden periodisch Proben entnommen und gaschroma- tographisch analysiert; daraus wurden die jeweiligen An- fangsraten bestimmt und diese nach Lineweaver-Burk analysiert. Als Resultat wurden für Phytosphingosin ein K _M -Wert von 400 mM und für Methylstearat ein K _M -Wert von 196 mM bestimmt .

Beispiel 10: Einfluss der Temperatur auf die Reaktionsge- schwindigkeit

Es wurden enzymatische Umsetzungen bei verschiedenen Temperaturen durchgeführt. Allen gemein war dass die Substrate äquimolar eingesetzt wurden. Die eingesetzte Enzymmenge betrug jeweils 1,4% (w/w) . Die Ergebnisse der gaschromatogra- phischen Auswertung der Anfangsgeschwindigkeit sowie des Umsatzes nach 4 Stunden sind in

Tabelle 2 widergegeben.

Tabelle 2: Einfluss der Reaktionstemperatur auf die enzyma- tische Synthese von N-Stearoylphytosphingosin .

T [oC] Anfangskonzentration Aspec [Ug- Umsatz nach

[M] / Lösungsmittel 1] 4h [%]

80 0, 98 (in Dioxan) 840 49,5

100 2,8 (kein) 1182 79

120 2,8 (kein) 1224 92

Beispiel 11: Verwendung verschiedener Lösungsmittel

Phytosphingosin und Methylstearat wurden beide IM in dem jeweiligen Lösungsmittel bei 8O ⁰ C gelöst, mit 5% (w/w) Novozym 435 versetzt und gerührt. Periodisch wurden Proben entnommen und gaschromatographisch analysiert. Wie aus Abbildung 4 ersichtlich wird, sind die Umsatz-Zeit-Kurven sowie die Umsätze nach 24h der Einzelreaktionen nahezu deckungsgleich.

Beispiel 12: Enzymatische Umsetzung von Phytosphingosin mit verschiedenen Fettsäureestern

Phytosphingosin und die in

Tabelle 3 angegebenen Acyldonoren wurden jeweils IM im Lösungsmittel bei 8O ⁰ C gelöst, mit 5% (w/w) Novozym 435 versetzt und gerührt. Periodisch wurden Proben entnommen und gaschromatographisch analysiert

Tabelle 3: Ergebnisse der enzymatischen Umsetzung verschiedener Säureester mit Phytosphingosin .

Substrat Umsatz in % (Reaktionszeit,

Lösungsmittel)

Hexansäureethylester 98,2 (24h, MIBK) ölsäuremethylester 97,4 (23h, tert-Butanol)

Ricinolsäuremethylester 96,5 (24h, tert-Butanol) o-Salizylsäureethylester 36,5 (24h, MIBK)

Beispiel 13: Selektive Kristallisation des Produkts

Methylstearat (734mM) und Phytosphingosin (146 mM) wurden in 2-Methyl-2-butanol bei 8O ⁰ C gelöst, mit 5% w/w Novozym 435 versetzt und 20h bei 8O ⁰ C gerührt. Anschließend wurde das Enzym heiß abfiltriert und die klare Ausgangslösung über Nacht bei 45 ⁰ C temperiert. Der ausgefallene Feststoff wurde abfiltriert, Filtrat und Filterrückstand wurden gaschromatographisch analysiert. Wie aus Tabelle 4 ersicht- lieh wird ist durch fraktionierte Präzipitation eine selektive Anreicherung des gewünschten Produktes auch in Gegenwart von hohen Substratüberschüssen möglich.

Tabelle 4: Ergebnisse der selektiven Präzipitation des Reaktionsproduktes aus einer Reaktionsmischung (Angaben: Flächenprozent laut GC) .

Methylstearat Phytosphingosin-Base Cerlll

Ausgangslösung 69,3 0,14 30,5

Filtrat 90,1 0,1 9,8

Präzipitat 5,0 0,08 94,9

Beispiel 14: Tristearin als Acyldonor

Es wurden enzymatische Umsetzungen unter Verwendung von Triglycerid (Tristearin) als Acyldonor durchgeführt. Zu ei- ner Lösung von 5,4 g Phytosphingosin und 5g Tristearin in 17g Dioxan bei 8O ⁰ C wurden 0,5g Novozyme 435 zugegeben und bei Normaldruck gerührt. Es wurden periodisch Proben entnommen und gaschromatographisch analysiert.

Wie aus Abbildung 5 deutlich wird, ist ein vollständiger Umsatz des Acyldonors möglich. überraschenderweise ergab die gaschromatographische Analyse dass intermediär keine Partialglyceride (Glycerindistearat oder Glycerinmonostea- rat) in signifikanten Mengen beobachtbar waren.

Beispiel 15: EintopfSynthese von N-Stearoylphytosphingosin ausgehend von Phytosphingosin-Sulfat

100g Phytosphingosin-Sulfat (Cosmoferm, Delft, NL) werden in 100ml MIBK (Methylisobutylketon) bei 55 ⁰ C suspendiert, mit 46g Natriummethanolat versetzt und 180 Minuten bei 55 ⁰ C gerührt. Anschließend werden 73,3 g Methylstearat und 5g

Novo435 hinzugegeben. Die so erhaltene Suspension wird 36

Stunden bei 8O ⁰ C gerührt und heiß abfiltriert. Das klare Filtrat wird 4 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen und der ausgefallene hell-beige Feststoff (122,3g

N-Stearoylphytosphingosin, Reinheit >97%) abfiltriert.

Beispiel 16: Pilotansatz im Fetbettreaktor

207,8 g Phytosphingosin-Sulfat werden zusammen mit 108,04 g NaOCH ₃ -Lsg (25%ig in Methanol) in 500 ml MIBK bei 55 ⁰ C suspendiert und anschließend heiß über eine Filterpresse in

einen Festbettreaktor überführt und mit 149,3g Methylstea- rat versetzt. Im Festbett befinden sich 17,8g Novozyme 435. Der gesamte Reaktor ist auf 8O ⁰ C thermostatisiert . Das Festbett wird mit einer Pumprate von ca. 25 ml min ^"1 mit der Reaktionsmischung durchspült. Es wird ein Unterdruck von 0,8 bar angelegt, um überschüssiges Methanol zu entfernen. Nach 24h wird der Reaktor mit Stickstoff belüftet, entleert und die Reaktionslösung über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Der ausgefallene Feststoff wird ab- filtriert (287,1g N-Stearoylphytosphingosin, Reinheit

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