La présente invention concerne un procédé de quantification de bactéries vivantes dans un milieu aqueux susceptible d'en contenir. La présente invention concerne plus particulièrement une méthode de quantification de bactéries vivantes dans un échantillon aqueux susceptible de contenir un mélange de cellules mortes et vivantes.

Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé de quantification de bactéries vivantes du genre entérocoques et Escherichia coli, contenues dans un échantillon d'eau de baignade et, plus particulièrement, d'eau de mer.

La méthode selon l'invention est utile car il existe des normes sanitaires réglementaires de concentration desdites bactéries E. coli et entérocoques vivantes à ne pas dépasser dans lesdites eaux de baignades, à savoir, notamment, pas plus de 10 bactéries E. Coli/ml et 370 entérocoques/100 ml

On entend ici par bactéries E. coli, toutes les sous-espèces pathogènes et non pathogènes de l'espèce Escherichia coli. Les méthodes de référence pour réaliser ces quantifications de bactéries E. coli et entérocoques dans les échantillons d'eau de baignade comprennent des cultures cellulaires desdites bactéries dans ledit échantillon et la quantification par mesure de l'activité enzymatique (Méthodes normalisées références NF T 90-432 (pour la recherche des entérocoques) et NF T 90-433 (pour la recherche de E. Coli). Dans cette méthode de référence, on ne réalise pas l'extraction desdites bactéries, ni la quantification d'ADN.

Les inconvénients de ce type de méthodes sont une durée et donc un délai de rendu des résultats important, à savoir requérant une incubation de 48h environ), ainsi qu'une spécificité quant aux bactéries détectées insuffisantes et un manque de précision des résultats notamment pour les faibles valeurs.

On connaît également une méthode, dans laquelle on extrait les bactéries de l'échantillon par filtration sur membranes, puis on extrait l'ARN desdites bactéries par lyse cellulaires et on quantifie l'ADN chromosomique par une méthode de RT PCR dans laquelle on transforme l'ARN en ADN.

L'avantage de cette méthode est que l'ARN des bactéries mortes se dégrade de sorte que, lors de l'étape de quantification par amplification, on quantifie uniquement l'ADN des bactéries vivantes.

Toutefois, cette méthode présente les inconvénients suivants. La fragilité des ARN rend la technique très délicate et impose des conditions de manipulation drastiques, notamment des conditions drastiques de décontamination des matériels et réactifs. D'autre part, la quantification est précédée d'une étape de transcription inverse pour transformer les ARN en ADNc. Cette étape peut introduire un biais dans la quantification, et montre qu'on ne quantifie pas directement la cible. En outre, la production d'enzyme ARNase et donc la quantité d'ARN dans une cellule bactérienne peut varier selon son état physiologique. Ainsi, en état de carence nutritionnelle comme dans les eaux de baignade, la bactérie produit des RNase qui vont dégrader ses ARN ribosomaux

Le but de la présente invention est de fournir une méthode d'extraction et quantification de bactéries vivantes dans des eaux de baignade, soit à la fois, plus performante en termes de sensibilité d'extraction, de détection et de quantification, et simple et moins coûteuse à industrialiser.

Pour ce faire, la présente invention fournit un procédé de quantification de bactéries vivantes dans un milieu liquide, de préférence un milieu aqueux, susceptible d'en contenir, caractérisé en ce qu'on réalise les étapes successives suivantes dans lesquelles : a/ on ajoute des levures dans le dit échantillon et on réalise un mélange sous agitation, et b/ on sépare un résidu solide constitué d'un précipité contenant toutes les levures et bactéries contenues dans le dit échantillon, cl on re-suspend le dit résidu solide dans une solution tamponnée à pH de 7 à 8, de préférence un tampon Tris 40mM à pH 7,6 et on y ajoute un composé intercalant photo-activable ou tout autre composé chimique ou biologique apte, dans des conditions de concentration et/ou de traitement, à provoquer la liaison dudit composé spécifiquement à l'ADN des bactéries mortes sans provoquer la lyse ou dégradation des parois des bactéries vivantes ni la liaison à l'ADN des bactéries vivantes, ledit composé dénommé composé inhibiteur étant apte à empêcher ainsi l'amplification par PCR de l'ADN qui lui est lié, et d/ on sépare une fraction contenant un résidu solide contenant toutes les levures et bactéries, et e) on chauffe ledit résidu solide, de préférence au bain marie, à une température de pas plus de 100°C, de préférence à 95°C pendant 5 à 10 minutes, de manière à lyser toutes les bactéries sans provoquer la lyse des levures, et f/ on sépare une fraction contenant toutes les levures et débris de bactéries lysées et on récupère une fraction contenant l'ADN bactérien, et g/ on met en œuvre une quantification par amplification par PCR, de préférence par PCR en temps réel, de l'ADN provenant desdites bactéries initialement vivantes dans l'échantillon de départ. A l'étape a/, les levures ont semble-t-il un effet de "trapping" et/ou effet entraînant sur les bactéries. Cette étape a/ permet d'éviter d'avoir à mettre en œuvre à l'étape b) une étape de séparation des bactéries par filtration au cours de laquelle il y a nécessairement des pertes lors du décrochage des bactéries sur les filtres d'une part, et d'autre part permet d'éviter de mettre en œuvre des agents précipitants chimiques actuellement dans le commerce, lesquels sont relativement plus onéreux.

A l'étape c), ledit composé inhibiteur est mis en œuvre dans les conditions de concentration et de traitement aptes à provoquer ladite liaison dudit composé à l'ADN des bactéries mortes.

Un premier aspect de l'invention est donc d'avoir découvert cet effet technique des levures, à savoir cette utilisation nouvelle des levures à titre d'agent précipitant dans l'extraction de bactéries, à savoir que :

- à l'étape a/, les levures entraînent ou retiennent la totalité des bactéries mortes et vivantes de l'échantillon liquide testé, et

- à l'étape d/, on élimine ainsi ledit composé inhibiteur et d'autres molécules éventuelles présentes dans l'échantillon initial pouvant affecter le étapes ultérieures, et

- à l'étape e/, les levures résistent jusqu'à 15 minutes à une température de 95 à 100°C, de sorte que, en pratique, pour réaliser le claquage des parois bactériennes des bactéries mortes et des bactéries vivantes, un chauffage de 5 mn est suffisant, sans affecter la paroi des levures.

L'étape e/ permet donc de récupérer ultérieurement (à l'étape f/) l'ADN bactérien à savoir l'ADN provenant des bactéries mortes liées au composé inhibiteur et l'ADN non lié au composé inhibiteur provenant des bactéries initialement vivantes, et non pas l'ADN des levures, ce qui serait dommageable à la sensibilité de la PCR de l'étape g/, compte tenu de la relativement grande quantité de levures mises en œuvre initialement.

Cette étape e/ permet d'éviter la mise en œuvre d'une lyse chimique suivie d'une purification sur colonne pour réduire les coûts. Le chauffage présente aussi l'intérêt d'éviter la mise en œuvre de détergent onéreux et de colonne spécifique de purification, étant entendu en outre que lesdits détergents peuvent avoir un effet inhibiteur sur le rendement de la PCR ultérieur.

Les essais réalisés démontrent qu'à l'étape d/, on récupère au moins 99% des bactéries initialement contenues dans l'échantillon.

L'intérêt de l'invention résulte essentiellement du double effet technique avantageux de la mise en œuvre de levures en tant qu'agent précipitant favorisant donc l'extraction des bactéries sans gêner l'extraction sélective de l'ADN bactérien dans le cas d'une étape d'extraction d'ADN par chauffage, l'ADN des levures n'étant pas récupéré d'une part, et d'autre part, l'ADN bactérien n'étant pas dégradé.

C'est la combinaison de la mise en œuvre de levures à titre d'agent précipitant de bactéries d'une part, et un procédé d'extraction d'ADN simple et peu onéreux par mise en température à 95-100°C d'une solution du culot bactérien et de levures, qui sont à l'origine des résultats avantageux de l'invention.

A l'étape f/, l'ADN bactérien comprend l'ADN non dégradé des bactéries initialement vivantes et l'ADN lié au dit composé inhibiteur provenant de la lyse des bactéries initialement mortes.

Le procédé selon l'invention consiste donc essentiellement, dans un premier temps, à récupérer la totalité des cellules présentes dans l'échantillon aqueux, puis d'éliminer l'ADN des cellules mortes, avant d'extraire et de purifier l'ADN des bactéries vivantes. Finalement, l'ADN obtenu est suffisamment pur pour être quantifié par PCR en temps réel. Le procédé selon la présente invention peut être mis en œuvre en moins de 4 heures et s'avère plus précis que la méthode de référence comparative.

Plus particulièrement, à l'étape g/, on réalise la quantification des bactéries vivantes du genre entérocoques et Escherichia Coli contenues dans un échantillon d'eau de baignade.

Selon une autre caractéristique particulière avantageuse, à l'étape b/, on réalise la centrifugation de l'échantillon à au moins 5000 g dans un récipient pendant au moins 10 minutes et on récupère le culot par élimination du surnageant.

Cette vitesse minimale de 5000 g permet d'obtenir un rendement de récupération cellulaire de plus de 99%. Aux vitesses inférieures à 5 000 g, il faut augmenter considérablement le temps de centrifugation pour obtenir un rendement de récupération cellulaire de plus de 99%. Des vitesses de centrifugations supérieures à 5000 g conviennent mais ne permettent pas de diminuer les temps de centrifugation.

Plus particulièrement encore, à l'étape a), on utilise de la levure boulangère de Saccharomyces cerevisiae, la concentration en levures étant ajustée à une valeur de 200 à 400 pg/ml, de préférence environ 300 Mg/ml.

A cette concentration de 200 pg/ml, les levures forment un tamis cellulaire qui entraine dans sa précipitation toutes les cellules bactériennes, de préférence sous l'action de la force centrifuge lorsque la séparation est effectuée par centrifugation. Aux concentrations supérieures à 400 pg/ml, le culot devient trop important et ne reste pas fixé au fond du récipient.

Avantageusement encore, à l'étape a/, on ajoute en outre dans l'échantillon une protéine coagulante telle que le sérum albumine bovine (BSA) à une concentration de 2 à 20 mg/ml dans l'échantillon pour favoriser l'adhérence du culot sur la paroi du récipient de centrifugation à l'étape b/.

A des concentrations trop élevées de protéines coagulantes, il devient difficile de réhydrater et re-suspendre le résidu solide à l'étape cl, d'une part, et, d'autre part, l'efficacité de l'étape e/ de chauffage peut se trouver affectée du fait de la coagulation de ladite protéine.

Dans un mode préféré de réalisation, à l'étape c/, ledit composé inhibiteur est un agent intercalant photo-activable et on soumet la suspension à un traitement d'irradiation lumineuse d'activation de la liaison dudit agent intercalant avec l'ADN des bactéries mortes, ledit agent intercalant inhibant l'amplification par PCR dudit ADN auquel il est lié.

Il est connu de l'homme du métier, notamment dans WO 01/77379 et WO 2007/100762, que certains agents photoactivables intercalant peuvent se lier spécifiquement avec l'ADN des bactéries mortes, dont la paroi membranaire est dégradée ou lysée, puis se lier par intercalation avec l'ADN des bactéries mortes, sans pouvoir pénétrer à l'intérieur des bactéries vivantes et, donc, sans se lier à l'ADN des bactéries vivantes. Les bactéries mortes ont leur paroi fragilisée, rendue perméable, voire déchirée, ce qui permet à un agent intercalant de traverser la paroi et de pénétrer dans la cellule pour atteindre son ADN car les bactéries sont des organismes ne possédant pas de noyau et leur ADN n'est donc pas protégé par une membrane à l'intérieur de la bactérie. Cette intercalation inhibe l'amplification par PCR de l'ADN. L'ADN des cellules mortes ainsi que les brins d'Adn libres liés à l'agent intercalant dans l'échantillon ne sont alors plus quantifiable en PCR ce qui rend la méthode spécifique des cellules vivantes car l'agent intercalant reste bloqué au niveau de la paroi des bactéries vivantes, et permet donc à l'étape g/ de quantifier spécifiquement uniquement l'ADN des bactéries vivantes par amplification par PCR, puisque l'agent intercalant photoactivable ne lui est pas lié.

Plus particulièrement, selon la présente invention, ledit agent intercalant est un azoture d'éthidium, de préférence l'EMA, à une concentration de 2 à 5 pg/ml et on soumet la suspension à une irradiation lumineuse, en maintenant une température de suspension à la température ambiante, de préférence en trempant le récipient la contenant dans la glace. En présence de lumière et grâce à sa fonction chimique particulière notamment l'azoture s'agissant de l'EMA, l'agent intercalant peut se coupler à l'ADN de façon covalente.

Plus particulièrement, on réalise une irradiation lumineuse en plaçant la suspension sous une lampe halogène de 150 Watt à 20 cm pendant au moins 10 minutes.

Le composé EMA est tout particulièrement intéressant, du fait de son faible coût et de ce que l'utilisation de l'EMA contrairement au PMA nécessite des concentrations très faibles pour le traitement de l'ADN des bactéries mortes (2 à 5 pg/ml pour l'EMA au lieu de 100 pg/ml pour le PMA) le risque pour l'utilisateur est donc beaucoup moins important du fait du caractère cancérigène de ces molécules mutagènes.

Selon une autre caractéristique avantageuse, à l'étape d/, on réalise la dite séparation par centrifugation de la suspension obtenue après le traitement de l'étape c/, à au moins 5 000 g pendant au moins 10 minutes et élimination de la plus grand part du surnageant pour récupérer le culot contenant ledit résidu solide contenant toutes les levures et bactéries dans une petite fraction d'au moins 500 μΙ de la dite suspension, et on la chauffe à l'étape e).

Là encore, aux vitesses inférieures à 5 000 g, il faut augmenter considérablement le temps de centrifugation pour obtenir un rendement de récupération cellulaire de plus de 99%. Des vitesses de centrifugations supérieures conviennent mais ne permettent pas de diminuer les temps de centrifugation.

Plus particulièrement encore, à l'étape f/, on réalise la dite séparation par centrifugation de la suspension obtenu après le traitement de l'étape c/, à au moins 5000 g pendant au moins 5 minutes et élimination du culot contenant les levures intactes et les débris de bactéries lysées, pour récupérer le surnageant contenant ledit ADN bactérien.

Là encore, aux vitesses inférieures à 5 000 g, il faut augmenter considérablement le temps de centrifugation pour culoter l'ensemble des levures et débris cellulaires, des vitesses de centrifugation supérieures conviennent.

Plus particulièrement encore, à l'étape g/ on réalise une étape préalable purification de l'ADN bactérien, de préférence sur colonne de silice ou une colonne de filtration membranaire de seuil de 30 KDa.

Le seuil de 30 KDa est choisi parce que les chromosomes bactériens ont au minimum 3.10 ⁶ bases. De façon connue, ces colonnes de filtration présentent une membrane hydrophile qui va retenir l'ADN bactérien, sans le fixer. Toutes les autres molécules et sels résiduels seront éliminés dans le filtrat. L'ADN retenu dans un faible volume de TE sera récupéré en retournant la colonne au dessus d'un tube propre.

Cette étape de purification permet d'éliminer des protéines et des ARNs relargués par les bactéries ou encore des traces résiduelles de composé inhibiteur tel que l'EMA ou d'autres molécules éventuellement présentes dans l'échantillon initial, ceci afin que la quantification ultérieure par PCR soit la plus fiable possible en éliminant toutes impuretés de l'échantillon pouvant affecter la fiabilité et spécificité de l'amplification par PCR notamment pouvant affecter l'action d'une enzyme polymérase entre autres. Plus particulièrement encore, à l'étape g/ on amplifie les bactéries E. Coli et entérocoques avec les couple d'amorces suivantes

- pour les bactéries E. coli : une séquence spécifique de E. coli tirée du gène 16S, et

- pour les bactéries du genre entérocoques : une séquence spécifique du genre Enterococcus tirées du gène tuf.

Les 2 séquences spécifiques ci-dessus ont été choisies car elles permettent de réaliser des cycles d'amplification et une quantification dans les mêmes conditions et selon un même protocole pour les 2 séquences.

On peut réaliser une PCR classique avec le Sybr Green comme fluorochrome, l'amplification pouvant être réalisé simultanément sur une même plaque car les protocoles de PCR sont identiques, la quantification de chaque espèce nécessitant toutefois des puits séparés pour chaque analyse.

Avantageusement encore, pour la quantification, on réalise l'amplification d'une gamme d'étalons d'ADN chromosomiques desdites bactéries vivantes et/ ou une gamme d'étalonnage d'ADN synthétique non bactérien dénommé ADN alien à différentes concentrations connues. Dans ce dernier cas à l'étape g/ on ajoute dans l'échantillon d'Adn à quantifier, une concentration connue de dite ADN alien à titre de contrôle interne. on utilise les oligonucléotides suivants choisis parmi : - SEQ. ID. n°l et 2 pour les amorces 5' et 3' pour l'amplification de la séquence tirée du gène 16S de la bactérie E. Coli, et

- SEQ. ID. n°3 et 4 pour les amorces 5' et 3' pour l'amplification de la séquence tirée du gène tuf des bactéries entérocoques, et - SEQ. ID. N°5 pour la séquence de contrôle interne d'ADN alien, et

- SEQ. ID. n°6 et 7 pour les amorces 5' et 3' de la séquence SEQ. ID. n°5. Les séquences d'ADN SEQ. ID. n°l à 7 sont décrites dans le listage de séquence annexé à la description.

Les étapes d'extraction et de quantification du procédé selon l'invention sont suffisamment sensibles pour permettre de détecter des concentrations de 2 à 10 ⁸ bactéries vivantes/ml d'échantillons. Le seuil maximum de 10 ⁸ bactéries est lié à un problème de sensibilité de la PCR alors que le seuil minimal de 2 bactéries/ml est lié à la fois aux performances d'extraction et de sensibilité de la PCR.

D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lumières des exemples détaillés de réalisation ci- après.

L'exemple 2 se réfère aux figures 1 à 3 suivantes dans lesquelles :

- la figure 1 représente les effets de la concentration en azoture d'éthidium sur des échantillons constitués uniquement de bactéries vivantes ou uniquement de bactéries mortes ou encore sur des échantillons mixtes contenant des bactéries vivantes et des bactéries mortes, avec une durée d'illumination de 20 mn, les 3 concentrations en EMA suivantes ayant été testées : 3 pg/ml, 6 pg/ml et 12 pg/ml.

Dans la figure 1, les symboles suivants ont les significations suivantes :

: échantillon avec bactéries vivantes uniquement

■ : échantillon avec bactéries mortes uniq ¹ uement : échantillon avec bactéries vivantes et mortes

ES

- la figure 2 représente les effets du traitement de l'azoture d'éthidium à 3 pg/ml avec des durées d'élimination variables (10 mn et 20 mn) sur des échantillons constitués de bactéries vivantes, ou des échantillons constitués de bactéries mortes ou des échantillons mixtes contenant des bactéries mortes et des bactéries vivantes.

Dans la figure 2, les symboles suivants ont les significations suivantes :

E¾ : échantillon avec bactéries vivantes uniquement H : échantillon avec bactéries mortes uniquement

: échantillon avec bactéries vivantes et mortes 0 : sans EMA

- la figure 3 représente le rendement (%) de l'étape d'extraction d'ADN par chauffage en fonction de la durée (t) d'incubation à 95°C (de 0 à 15 minutes).

Exemple 1 : Quantification de E. coli et Enterococcus présents dans un échantillon de milieu aqueux

On a réalisé les cinq étapes successives suivantes de :

1/- récupération et concentration de l'ensemble des cellules par centrifugation avec utilisation d'un précipitant spécifique et novateur (cette étape 1 correspond aux étapes a/ et b/) définies ci-dessus);

2/- déstructuration de l'ADN des bactéries mortes et de l'ADN libre dans l'échantillon par un traitement à l'EMA (cette étape 2 correspond à l'étape c/ définie ci-dessus);

3/-récupération et lyse totale des cellules par un chauffage de l'échantillon et séparation de l'ADN du reste de l'échantillon (cette étape 3 correspond aux étapes d/ à f/ définies ci-dessus); 4/-pu rification de l'ADN sur colonne de silice ou par filtration sur membrane (cette étape est inclue dans l'étape f/ définie ci-dessus);

5/- quantification de l'ADN par PCR quantitative (cette étape est inclue dans l'étape g/ définie ci-dessus). 1/- Etape de récupération de l'ensemble des bactéries

La centrifugation permet de concentrer l'échantillon et de séparer les culots cellulaires des surnageants. La difficulté majeure avec la centrifugation réside dans le fait qu'à des concentrations cellulaires inférieures à 10 ⁷ bactéries par ml, même avec des vitesses allant jusqu'à 17 000 x g pendant des durées relativement longues (20 mn), le rendement de récupération cellulaire est rarement supérieur à 60% et, même pour des échantillons dont la concentration bactérienne est supérieure à 10 ⁷ /ml une centrifugation de 15 mn à 17.000 x g/ ne permet de récupérer que 95% des bactéries dans le culot. C'est pourquoi selon la présente invention, on ajoute un précipitant jusque-là encore jamais utilisé pour cet usage : Saccharomyces cerevisiae dite levure de boulangerie. Les levures sont des microorganismes, champignons unicellulaires de 5 à 6 μιτι, capables de sporuler et donc faciles à conserver. Très résistantes, leurs parois leur permettent de survivre à la déshydratation et aux températures élevées. Ainsi, la levure de boulanger Saccharomyces cerevisiae, commercialisée sous forme déshydratée, s'est révélée être un excellent candidat pour assurer la sédimentation des bactéries. En effet, il s'agit d'un organisme unicellulaire qui sédimente rapidement. Une centrifugation de 10 min à 5 000 x g suffit pour former un culot de levure stable au fond du tube et assure la récupération des cellules bactériennes. Des quantifications réalisées sur gel d'agar avant et après cette centrifugation ont montré que quelque soit la quantité initiale de bactéries, l'ajout de levures déshydratées (préalablement resuspendues dans une solution de Tris stérile) dans l'échantillon assure une récupération de 100 % des bactéries. De plus, en ajoutant de la BSA en solution dans un échantillon, on peut observer un culot encore plus solide. D'autre part, l'utilisation de cette solution de BSA est un atout pour les premiers rinçages car elle est réputée pour capter les sels présents dans un échantillon et faciliter la PCR ultérieure même en présence d'inhibiteurs (King CE., Debruyne R., Kuch M., Schwarz C, and Poinar H.N. (2009): A quantitative approach to detect and overcome PCR inhibition in ancient DNA extracts. BioTechniques, Vol. 47, p. 941-949).

Plus précisément, 200 mg de levure déshydratée sont transférés dans un tube de 2 ml, puis on ajuste le volume à 2 ml avec une solution tampon Tris (40 mM et pH 7,6) puis on mélange sous agitation avec un dispositif Vortex pendant 2 minutes. On obtient ainsi une suspension de levure avec une concentration de 100 mg/ml. Parallèlement, on prépare une solution de BSA de 60 mg/ml dans de l'eau stérile. Ensuite, on transfert 50ml_ d'échantillon d'eau de mer à tester dans un flacon de 50 ml. Puis on y ajoute 150 μΙ de suspension de levure ci-dessus et 2 ml de solution de BSA ci-dessus et on homogénéise.

La suspension de levure ainsi ajoutée à la concentration de 300 pg/ml dans l'échantillon forme un tamis cellulaire et, au cours d'une centrifugation à la vitesse minimale de 5000 x g pendant 10 minutes, entraine l'ensemble des bactéries présentes dans le culot. D'autre part, la BSA à la concentration de 3 mg/ml dans l'échantillon permet de rendre ce culot solide et d'éviter son écoulement lors de l'élimination du surnageant. La suspension de levure peut être préparée soit à partir de levures fraîches soit à partir de levures déshydratées resupendues dans du tampon Tris 40mM pH 7,6 afin d'éviter un choc osmotique. La BSA est réhydratée dans de l'eau stérile. D'autre part, les levures n'inhibent pas la PCR quantitative ultérieure. En effet, si l'on poursuit le protocole jusqu'à l'extraction de l'ADN, et qu'on quantifie cet ADN par PCR quantitative en temps réel, on obtient un rendement (Quantité ADN mesurée / Quantité initiale de bactéries) proche de 1.

2/- Traitement à l'azoture d'éthidium Le surnageant éliminé après la première centrifugation de 10 minutes à 5 000 g à la température de 25°C, il reste dans le culot les levures et toutes les bactéries vivantes et mortes initialement présentes dans l'échantillon. Ce culot est repris dans 15 ml d'un tampon Tris 40 mM pH 7,6 et 45 μΙ d'une solution d'azoture d'éthidium (EMA) dans du TMAO (triméthyl aminé oxyde) sont ajoutés, l'EMA se trouvant ainsi ajouté à la concentration de 3 pg/ml dans l'échantillon. Une première courte incubation de 30 secondes à 5 minutes, à température ambiante et à l'obscurité, permet à l'EMA de traverser les parois perforées des cellules mortes. Puis une phase de photoactivation permet de lier l'éthidium de façon covalente à l'ADN. Ces liaisons entraînent des modifications structurales de l'ADN qui ne pourra alors plus être quantifié par PCR quantitative (pas de déshybridation, pas de fixation de la polymérase). Cette photoactivation est réalisée en plaçant les échantillons dans un bac à glace afin d'éviter son échauffement. Placé sur une table d'agitation, l'échantillon est homogénéisé tout au long de son illumination. Pour la photo activation, une lampe halogène de 150 Watt est positionnée 20 cm au dessus de la surface de l'échantillon. L'illumination dure ainsi 10 minutes. Dans ces conditions, l'ADN des bactéries vivantes, protégé par la paroi imperméable, conserve sa structure et ses propriétés. L'EMA une fois activé par la lumière ne pourra plus agir ultérieurement. On peut alors compléter le volume de l'échantillon à 50 ml avec le tampon Tris et centrifuger de nouveau l'échantillon dans les mêmes conditions que précédemment, à savoir 10 minutes à 5 000g et à la température de 25°C.

3/- Etape de lyse des cellules par chauffage et récupération de l'ADN de l'échantillon

La centrifugation ci-dessus permet de reformer un culot constitué des levures et des cellules vivantes et mortes. Le surnageant peut être éliminé grossièrement de façon à ne laisser qu'une fraction de 500 pL environ contenant le résidu solide. Pour cela il suffit simplement de retourner et de vider le tube. Un court vortexage permet de resuspendre le culot dans le surnageant résiduel. Sous l'action d'un choc thermique (5 minutes à 95 °C puis 5 minutes dans la glace), les cellules lysent et libèrent leur ADN. Une rapide centrifugation de 5 minutes à 25°C et à 5 000 x g suffit alors pour séparer le culot de levure et les débris cellulaires du surnageant dans lequel est dissout l'ADN.

4/- Etape de purification de l'ADN

Le surnageant contient donc l'ADN à quantifier. Cependant, il est susceptible d'être contaminé par des protéines et des ARNs relargués par les bactéries ou encore des traces résiduelles d'EMA ou autres molécules éventuellement présentes dans l'échantillon initial. La quantification par PCR quantitative exige une certaine pureté de l'échantillon. En effet, basée sur l'action d'une polymérase, l'efficacité de la technique peut être diminuée en présence d'inhibiteurs. Le surnageant est donc purifié et concentré soit : a) par filtration sur membrane. Tout le surnageant est prélevé et déposé sur une colonne Vivacon 500 (Sartorius stedim, membrane hydrosart) avec un seuil de rétention de 30 000 Da préalablement rincée avec du TE (Tris lOmM, EDTA ImM, pH 8). L'échantillon est alors rincé deux fois avec le TE. Les filtrations sont permises grâce à des centrifugations successives à 7 000 x g pendant 10 minutes. Les rinçages effectués, toutes les molécules ayant un poids moléculaire inférieur à 30 kDa ont été éliminées et l'ADN peut donc être récupéré dans le volume de TE retenu au dessus de la membrane en retournant la colonne au dessus d'un tube propre.

b) par fixation-élution sur colonne de silice. Tout le surnageant est mélangé avec des solutions de rinçage puis passé sur une colonne QIAamp MinElute (Kit QIA amp DNA Micro, QIAGEN). L'ADN contenu dans l'échantillon va se fixer sur les billes de silice contenu dans la colonne. Après un rinçage, l'ADN est éluer dans 50 pL de TE. Le passage des solutions sur la colonne est effectué grâce à des centrifugations de 1 à 3 minutes à 20000 x g.

L'ADN obtenu est alors suffisamment pur pour être quantifié par PCR quantitative. 5/- Etape de quantification par PCR quantitative

On a utilisé un appareil MX 3500 P de la société STRATAGENE et le kit WIZARD GENOMIC PURIFICATION de la société PROMEGA pour extraire l'ADN en ajoutant une étape de digestion de protéine avec la protéinase K. Un contrôle interne préférable pour vérifier l'absence d'inhibition de la PCR dans chaque échantillon. Ce contrôle est réalisé en ajoutant une quantité connue d'ADN synthétique, ci-après SEQ. ID. n°5 vu absent de toutes banques chromosomiques, dans l'échantillon final. La quantité de cet ADN est mesurée par PCR quantitative avec les amorces SED. ID. n°6 et 7 ce qui permet de déterminer s'il existe une inhibition, et si tel est le cas de calculer la dérive qu'elle entraine. En supposant que l'inhibition influence autant l'amplification de l'ADN synthétique que celle de l'ADN bactérien, on déduit la quantité réelle d'ADN bactérien dans l'échantillon. Une gamme étalon est nécessaire pour chaque gène ciblé par la

PCR quantitative. En effet, l'appareil de PCR quantitative détermine le cycle seuil (« cycle threshold » dit et), cycle à partir duquel la fluorescence est suffisamment importante pour être mesurée. Plus la concentration initiale en ADN cible est importante plus la fluorescence sera quantifiable tôt. Pour traduire ce cycle seuil en quantité d'ADN, une gamme étalon de 5 points minimum est donc nécessaire. Cette gamme est effectuée avec de l'ADN génomique extrait de la bactérie ciblée, purifié et quantifié en nombre de copies par microlitre ou avec la séquence cible synthétique quantifiée en nombre de copies par microlitre. Les séquences d'ADN synthétique ainsi que les oligonucléotides permettant l'amplification de ce dernier ont été construits spécifiquement pour cette technique. Les oligonucléotides ciblant des gènes spécifiques des Escherichia coli et des entérocoques ont été récupérés de la littérature. La sensibilité de la PCR quantitative dépend de la spécificité des amorces utilisées. Trois couples d'amorces ont été testés pour E. coli :

• un couple d'amorces ciblant une séquence du gène uidA, spécifique de E. coli et codant pour la β-glucuronidase (protéine dosée par la méthode enzymatique).

• un couple ciblant le gène 16S qui est également spécifique de E. coli, et qui, étant présent en plusieurs copies dans le génome (5 à 7 copies) permet une détection plus sensible, et donc un seuil plus bas.

• un couple ciblant le gène LacZ, mais ces amorces non spécifiques de E. coli ont été éliminées.

Les amorces du gène 16S ont été privilégiées pour l'étude car, pour des échantillons à faible concentration chromosomique, les amorces du gène uidA faisaient apparaître des concatémères d'oligonucléotides empêchant la mesure exacte du nombre de copies du gène. Des concentrations différentes (homo-concentrations et hétéro- concentrations) en amorces dans le volume réactionnel ont été testées, des modifications de la durée et/ou de la température lors de la phase d'élongation ont également fait l'objet d'une étude, mais aucune des conditions testées n'a permis d'éliminer la formation de ces dimères et/ou concatémères.

Deux couples d'amorces ont été testés pour Entérocoques.

• Des amorces ciblant gène 23S, spécifique des entérocoques,

• Un couple ciblant une séquence du gène codant pour la protéine Tuf tout autant spécifique des Entérocoques. Ce second couple a été privilégié pour la quantification des entérocoques car l'amplification et la quantification de la séquence ciblée peuvent être réalisées avec le même protocole de PCR quantitative que celui de la quantification des E. coli. Le couple d'oligonucléotides utilisé pour quantifier le nombre de chromosomes des E. coli proposé par Malinen et al (2003) (Comparison of real-time PCR with SYBR Green I or 59-nuclease assays and dot-blot hybridization with rDNA-targeted oligonucleotide probes in quantification of selected faecal bacteria. Microbiology, Vol. 149, p. 269-277) ciblant le gène 16S des E. coli uniquement, présente les séquences suivantes :

Ecolil6s Fw : SEQ. ID. n° 1 = 5' - GTTAATACCTTTGCTCATTGA -

3

Ecolil6s Rv : SEQ. ID. n° 2 = 5' - ACCAGGGTATCTAATCCTGTT - 3'

Le couple d'amorces utilisé pour quantifier le nombre de chromosomes des entérocoques établi par Morrison et al (2008) : (Quantification of enterococci and bifidobacteria in Georgia estuaries using conventional and molecular methods. Water Research, Vol 42, p. 4001-4009) ciblant le gène de la protéine Tuf des entérocoques, présente les séquences suivantes :

EnteroTuf Fw : SEQ. ID. n° 3 = 5' - TACTGACAAACCATTCATGATG

- 3'

EnteroTuf Rv : SEQ. ID. n° 4 = 5' - AACTTCGTCACCAACGCGAAC - 3'.

Chaque analyse est indépendante et a été optimisée avec des Kit de SYBR Green mais l'amplification et la quantification des séquences cibles d'E. coli et des entérocoques peuvent être réalisées simultanément au cours d'un même programme PCR. Avec les couples d'amorce utilisées à la concentration de 0,4 μΜ, chaque cycle d'amplification contient seulement deux étapes : une étape de déshybridation à 95°C pendant 5 secondes suivie d'une étape de fixation de la TaqPolymérase et de polymérisation à 60 °C pendant 25 secondes. Le niveau de fluorescence dans chaque puits est mesuré à la fin de chaque cycle. Une courbe de fusion de l'ADN amplifié est réalisée à la fin des cycles d'amplification, elle permet de vérifier l'amplification d'une séquence unique et spécifique. L'appareil de PCR quantitative estime alors le nombre de copies initial de séquence cible dans la prise d'essai de chaque échantillon. En tenant compte du volume final de l'échantillon et de la dérive due à l'inhibition, la concentration initiale en bactéries dans l'échantillon peut être déterminée.

La séquence de contrôle interne d'ADN synthétique dite séquence alien et ses amorces d'amplification étaient les séquences suivantes :

Séquence alien =

SEQ. ID. N° 5 = 5' - CCCATTCATCTGCCAGCTAGCAGACGGGCACAACGGGTCAACATATTGCTGCTT GGACTTAAGTTACGCTAGAGGTTTCTATGGGCCAGGTGCATAAGGATGCTCTC CCA - 3'

Ali Fw : SEQ. ID. n° 6 = 5'- GGGTAAGTAGACGGTCGATC - 3'

Ali Rv : SEQ. ID. n° 7 = 5' - ACGTATTCCTACGAGAGGGT - 3'

Exemple 2 : Influence de la concentration en EMA et du traitement d'illumination. 2.1/- Influence de la concentration en EMA sur la liaison à l'ADN des cellules vivantes et mortes.

Des essais de quantification d'ADN sur des échantillons préalablement traités avec des concentrations variables en azoture d'éthidium de 3, 6 et 12 pg/ml ont été réalisés. Trois types d'échantillons ont été testés, des échantillons composés uniquement de bactéries vivantes ou mortes (non lysées) et des échantillons mixtes contenant 10 fois plus de cellules mortes non lysées que cellules vivantes dans 50 ml d'eau de mer filtrée. La figure 1 présente les détails et résultats de l'expérience.

Le rendement en ordonnée (%) correspond au rapport du nombre de chromosomes mesuré par rapport à la quantité initiale en bactéries dans l'échantillon.

Suite à une exposition de 20 minutes sous une lampe halogène (150 W), seule la concentration de 3 pg/ml d'EMA d'échantillon semble adaptée. En effet, après un traitement à l'azoture d'éthidium aux concentrations 6 pg/ml et 12 pg/ml, aucun chromosome n'est quantifié dans les échantillons contenant des bactéries vivantes uniquement. En revanche, après un traitement à l'azoture d'éthidium à la concentration de 3 pg/ml, dans un échantillon mixte, la PCR quantitative permet de quantifier 96% des chromosomes des bactéries vivantes. L'EMA semble donc agir prioritairement sur les cellules mortes. D'autre part, cette concentration apparaît suffisante pour traiter tout l'ADN des cellules mortes. En effet dans un échantillon constitué uniquement de cellules mortes, après un tel traitement, la PCR quantitative ne quantifie rien. Cependant, le traitement s'avère être trop puissant car dans un échantillon constitué de cellules vivantes uniquement, la PCR quantitative ne quantifie que 53 % des chromosomes. Dans ces conditions, l'EMA déstructure une partie de l'ADN des cellules vivantes en absence de cellule morte.

2.2/- Influence du traitement d'illumination sur la liaison à l'ADN des cellules

Des essais de quantification d'ADN sur des échantillons traités à l'azoture d'éthidium 3 pg/ml pendant des durées d'illumination variables (10 et 20 minutes) ont été réalisés. Trois types d'échantillons sont testés, des échantillons composés uniquement de bactéries vivantes ou mortes (non lysées) et des échantillons mixtes contenant 10 fois plus de cellules mortes non lysées que cellules vivantes dans 50 ml d'eau de mer filtrée. La figure 2 présente les détails et résultats de l'expérience. Le rendement en ordonnées (%) correspond au rapport du nombre de chromosomes mesurés par rapport à la quantité initiale en bactéries dans l'échantillon.

Alors que l'EMA à 3 pg/ml agit aussi sur l'ADN des cellules vivantes lorsque la phase d'illumination est de 20 minutes, 10 minutes d'illumination suffisent pour ponter la totalité de l'ADN des cellules mortes et de l'ADN libre, tout en évitant l'action de l'EMA sur les cellules vivantes dans un échantillon dépourvu de bactéries mortes.

D'autre part, il est important de noter qu'un dénombrement sur milieux gélosés après le traitement à l'EMA ne permet pas de mesurer le nombre de cellules vivantes dans l'échantillon. En effet, même s'il n'endommage pas l'ADN des bactéries vivantes, l'azoture d'éthidium semble léser les cellules vivantes et perturber leur développement.

Exemple 3 : Condition de mise en œuvre de l'étape d'extraction de l'ADN par chauffage en fonction de la durée d'incubation à 95°C A l'étape 3 d'extraction de l'ADN bactérien, tout l'ADN libre ainsi que celui des bactéries mortes est ponté par l'EMA. L'ADN des bactéries vivantes doit maintenant être libéré dans le milieu afin d'être récupéré puis dosé en PCR quantitative. Une incubation dans un bain- marie porté à 95°C suivie d'une incubation dans la glace permet de lyser les bactéries. Cependant, une incubation à 95°C trop longue altère l'ADN libéré par les cellules après leur lyse.

La figure 3 présente les résultats du test qui a permis de déterminer la durée optimale de ce temps d'incubation de l'échantillon. On peut remarquer que la quantité de chromosomes estimée par la PCR quantitative diminue en fonction du temps d'incubation à 95°C. 5 minutes sont nécessaires pour assurer la lyse de toutes les cellules, quelle que soit la concentration initiale en bactérie. Au-delà de 5 minutes, on remarque que le nombre de chromosomes mesuré par PCR quantitative décroit. Une durée d'incubation de 5 minutes est suffisante et évite certains dommages de l'ADN bactérien après la lyse des cellules.