kollagenhaltigen Material

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reduzierung des Endotoxingehalts in einem kollagenhaltigen Material.

Kollagenhaltige Materialien, die als tierische Rohstoffe aus Knochen oder Bindegewebe gewonnen werden, sind mehr oder weniger stark mit Endotoxinen belastet. Bei Endotoxinen handelt es sich in erster Linie um Lipopolysaccharide aus der äußeren Zellmembran von gramnegativen Bakterien oder Blaualgen, die von diesen Mikroorganismen kontinuierlich abgegeben, vor allem aber bei deren Lyse freigesetzt werden. Endotoxine zählen zu den Pyrogenen, d.h. sie können beim Kontakt mit den Schleimhäuten, vor allem aber bei einem Übertritt ins Blut, beim Menschen Fieber verursachen und unter Umständen sogar zu einem anaphylaktischen Schock oder zum Tod führen.

Aufgrund dieser Eigenschaften ist eine möglichst weitgehende Reduzierung des Endotoxingehalts von kollagenhaltigen Materialien wünschenswert, und zwar sowohl wenn diese für den Einsatz im Lebensmittel- oder Kosmetikbereich bestimmt sind, ganz besonders aber bei pharmazeutischen bzw. medizinischen Anwendungen, bei denen das kollagenhaltige Material direkt mit dem Blutkreislauf in Kontakt gelangt (z.B. kann Kollagenpulver aufgrund seiner Quellfähigkeit als Hämostatikum eingesetzt werden).

Es wurden im Stand der Technik bereits verschiedene Methoden zur Verringerung des Endotoxingehalts von Kollagen beschrieben. So wird beispielsweise in der JP 2004-300077 A und in der JP 2009-173678 A vorgeschlagen, fibril- liertes bzw. dispergiertes Kollagen mit einer basischen Lösung von Alkohol und/oder Aceton zu behandeln. Gemäß der JP 07-138809 A können Endotoxine aus der Lösung eines solubilisierten Kollagens entfernt werden, indem sie durch ein Polyolefin absorbiert werden. Derartige Verfahren haben jedoch den Nachteil, dass sie auf die Behandlung von Kollagen beschränkt sind, das in eine lösliche oder dispergierbare Form überführt wurde. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist jedoch insbesondere natives Kollagen bzw. kollagenhaltiges Material von Interesse, das als unlöslicher, partikulärer Feststoff vorliegt, da gerade für einige medizinische Anwendungen, bei denen ein niedriger Endotoxingehalt gefordert wird, bevorzugt unlösliches Kollagen eingesetzt wird. Darüber hinaus lassen sich die oben beschriebenen Verfahren kaum in einem industriellen Maßstab umsetzen, da die benötigten Mengen an organischen Lösungsmitteln bzw. Absorbermaterialien unverhältnismäßig hohe Kosten verursachen würden. Durch die Verwendung brennbarer organischer Lösungsmittel wie Alkohol würden zudem hohe Anforderungen an die Sicherheitstechnik gestellt.

Es sind auch Verfahren bekannt, um Kollagen zu Gelatine mit einem geringen Endotoxingehalt weiterzuverarbeiten . So wird in der JP 2007-211170 A vorgeschlagen, die Endotoxine in Fischkollagen durch Erhitzen bei einem pH-Wert von 5 bis 9 zu inaktivieren. Unter diesen Bedingungen erfolgt jedoch auch die zumindest partielle Denaturierung des Kollagens zu löslicher Gelatine, sodass dieses und ähnliche Verfahren zur Herstellung von unlöslichem Kollagen mit einem niedrigen Endotoxingehalt ebenfalls nicht geeignet sind. Dasselbe gilt für Verfahren wie Ultrafiltration oder Umkehrosmose.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, die Nachteile der vorstehend beschriebenen Verfahren zu überwinden.

Diese Aufgabe wird bei dem eingangs genannten Verfahren erfindungsgemäß dadurch gelöst, dass das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

Behandeln des kollagenhaltigen Materials mit Lauge;

Behandeln des kollagenhaltigen Materials mit Säure; und

Behandeln des kollagenhaltigen Materials mit einem Oxidationsmittel . Es wurde überraschend festgestellt, dass durch die Anwendung dieser Verfahrensschritte der Endotoxingehalt von kollagenhaltigem Material deutlich reduziert werden kann, insbesondere auf Werte unterhalb von ca. 10 EU/g (gemäß dem weiter unten beschriebenen LAL-Test). Das erfindungsgemäße Verfahren kann relativ einfach und kostengünstig durchgeführt werden und eignet sich somit insbesondere auch für den industriellen Maßstab, d.h. für die Verarbeitung von Chargen an kollagenhaltigem Material in der Größenordnung von ca. 30 bis 50 Tonnen.

Das kollagenhaltige Material im Sinne der vorliegenden Erfindung umfasst na- tives Kollagen, d.h. unlösliches Kollagen, welches nicht oder nur in geringem Umfang denaturiert oder hydrolysiert ist. Das Material kann unterschiedliche Anteile an Kollagen enthalten, wobei das Material in der Regel zu einem überwiegenden Anteil, d.h. zu mehr als 50 Gew.%, aus Kollagen besteht. Bevorzugt liegt der Kollagenanteil jedoch deutlich höher, z. B. bei über 90 Gew.%.

Als kollagenhaltige Materialien können insbesondere Knochen, Knorpel, Häute oder Sehnen von Säugetieren, Geflügel oder Fischen eingesetzt werden (z.B. Rinderspalt oder Schweineschwarten). Bevorzugt umfasst das kollagenhaltige Material jedoch Ossein, welches durch Entfetten und Entmineralisieren von Knochen hergestellt wird und einen besonders hohen Anteil an Kollagen enthält (typischerweise über 95 Gew.% der Trockenmasse).

Das übliche Herstellungsverfahren für Ossein umfasst eine als Mazeration bezeichnete Säurebehandlung der Knochen über einen Zeitraum von ca. 2 bis 8 Tagen bei Raumtemperatur (< 25 °C). Diese Säurebehandlung allein ist jedoch nicht geeignet, um den Endotoxingehalt von Ossein auf einen akzeptablen Wert, insbesondere für eine medizinische Anwendung des Kollagens, zu senken.

Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es günstig, wenn das kollagenhaltige Material eine relativ kleine Partikelgröße aufweist. Bei Verwendung von Ossein kann dieses z.B. Partikelgrößen im Bereich von ca. 4 bis ca. 12 mm aufweisen.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist nicht auf eine bestimmte Reihenfolge der oben genannten Verfahrensschritte beschränkt, das Behandeln des kollagen- haltigen Materials mit Lauge kann also sowohl vor als auch nach dem Behandeln mit Säure erfolgen. Besonders günstig ist es jedoch, wenn das Behandeln mit Säure nach dem Behandeln mit Lauge erfolgt, da bei dieser Reihenfolge eine besonders effektive Reduzierung des Endotoxingehalts erreicht werden kann.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens erfolgt das Behandeln mit einem Oxidationsmittel während und/oder nach dem Behandeln mit Säure. Die gleichzeitige Anwendung von Säure und Oxidationsmittel ermöglicht einen effizienten Verfahrensablauf und bietet sich insbesondere bei Oxidationsmitteln an, die in saurem Milieu stabil sind (z. B. Wasserstoffperoxid).

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Schritte unter solchen Bedingungen durchgeführt, dass das kollagenhaltige Material durch das Verfahren nicht oder nicht vollständig denaturiert oder in eine lösliche Form überführt wird. Somit eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren auch zur Herstellung von unlöslichem Kollagen mit einem niedrigen Endotoxingehalt. Hierzu ist es vorteilhaft, wenn alle Schritte des Verfahrens bei einer Temperatur von ca. 25 °C oder weniger, d.h. bei Raumtemperatur, durchgeführt werden, da eine Denaturierung des Kollagens in der Regel erst bei höheren Temperaturen erfolgt, bei Säugetierkollagen oberhalb von 30 °C.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst bevorzugt keine Behandlung des kollagenhaltigen Materials mit einem organischen Lösungsmittel . Hierdurch können die sicherheitstechnischen Anforderungen und die Kosten des Verfahrens gesenkt werden, was insbesondere bei der Verarbeitung von kollagenhaltigen Materialien im industriellen Maßstab ins Gewicht fällt. Für die Behandlung des kollagenhaltigen Materials mit Lauge wird bevorzugt eine starke Lauge eingesetzt, wie z.B. Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid. Alternativ können aber auch schwächere Laugen, z. B. Calciumhydroxid, eingesetzt werden.

Günstigerweise wird die Lauge als wässrige Lösung mit einer Konzentration von ca. 0,5 bis ca. 1,5 mol/l, insbesondere von ca. 0,7 bis ca. 1,2 mol/l, eingesetzt. Die Behandlung des kollagenhaltigen Materials mit der Lauge kann im Batch erfolgen (z. B. in einem Behälter mit einem Rührwerk) oder, insbesondere bei größeren Chargen, in einem Umlaufverfahren (z. B. in einem Behälter mit einem Siebboden, wobei die Lauge wiederholt auf das kollagenhaltige Material gegeben und unterhalb des Siebbodens abgezogen wird). Batch- und Umlaufverfahren können auch kombiniert werden.

Bevorzugt wird das kollagenhaltige Material ca. 12 bis ca. 72 Stunden mit Lauge behandelt, weiter bevorzugt ca. 24 bis ca. 48 Stunden, insbesondere bei Verwendung einer starken Lauge wie Natriumhydroxid. Bei Verwendung einer schwächeren Lauge wie Calciumhydroxid kann die Behandlung jedoch auch über einen wesentlich längeren Zeitraum, z. B. auf bis zu 55 Tage, ausgedehnt werden.

Günstig ist es, wenn das kollagenhaltige Material zwischen dem Behandeln mit Lauge und dem Behandeln mit Säure mit Wasser gewaschen wird. Dadurch wird, wenn z. B. die Laugenbehandlung als erster Schritt erfolgt, die Lauge vor der Säurezugabe weitgehend entfernt oder zumindest soweit verdünnt, dass eine unerwünschte Temperaturerhöhung durch eine exotherme Neutralisie- rungsreaktion vermieden werden kann .

Für die Behandlung des kollagenhaltigen Materials mit Säure wird bevorzugt eine starke Säure verwendet, wie z. B. Schwefelsäure, Phosphorsäure, Salzsäure oder Mischungen hiervon, wobei Schwefelsäure besonders bevorzugt ist. Dabei wird die Säure vorzugsweise als wässrige Lösung mit einer Konzentra- tion von ca. 0,1 bis ca. 0,5 mol/l, insbesondere von ca. 0,2 bis ca. 0,4 mol/l, eingesetzt.

Wie bereits im Zusammenhang mit der Laugenbehandlung beschrieben, kann die Behandlung des kollagenhaltigen Materials mit der Säure in einem Batch- Verfahren oder in einem Umlaufverfahren erfolgen, wobei insbesondere bei großen Chargen die technische Realisierung eines Umlaufverfahrens günstiger ist.

Ferner ist es günstig, wenn die Konzentration der Säure kontinuierlich erhöht wird, um eine lokale Übersäuerung des Materials und eine damit einhergehende Hydrolyse zu vermeiden. Ein schrittweises Zudosieren der Säure kann sowohl bei einem Batch- als auch bei einem Umlaufverfahren erfolgen.

Die Dauer der Säurebehandlung des kollagenhaltigen Materials beträgt vorzugsweise ca. 6 bis ca. 14 Stunden, insbesondere ca. 8 bis ca. 12 Stunden.

Die Behandlung des kollagenhaltigen Materials mit dem Oxidationsmittel kann, wie bereits oben erwähnt, günstigerweise zeitgleich mit der Säurebehandlung erfolgen, z. B. indem das Oxidationsmittel nach Abschluss der Säurezugabe hinzugefügt wird. Das Oxidationsmittel umfasst bevorzugt Wasserstoffperoxid, welches unter sauren Bedingungen relativ stabil ist.

Bevorzugt wird das Oxidationsmittel in einer wässrigen Lösung mit einer Konzentration von ca. 800 bis ca. 3.200 ppm, insbesondere von ca. 1.200 bis ca. 2.000 ppm, eingesetzt.

Nach der abschließenden Behandlung mit Säure (bzw. nach der abschließenden Laugenbehandlung, falls die Säurebehandlung als erster Schritt erfolgt) wird das kollagenhaltige Material bevorzugt mit Wasser gewaschen, um die Säure (bzw. Lauge) vor der Weiterverarbeitung und/oder Lagerung des kollagenhaltigen Materials zu entfernen. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reduzierung des Endotoxingehalts in Ossein, wobei das Verfahren die folgenden Schritte in der angegebenen Reihenfolge umfasst: a) Behandeln des Osseins mit einer wässrigen Natriumhydroxidlösung; b) Waschen des Osseins mit Wasser;

c) Behandeln des Osseins mit einer wässrigen Schwefelsäurelösung unter Zugabe von Wasserstoffperoxid; und

d) Waschen des Osseins mit Wasser.

Die Mengen an Lauge, Säure und Waschwasser, die jeweils im Verhältnis zur Menge des kollagenhaltigen Materials eingesetzt werden, können je nach Art der Verfahrensführung und der verwendeten Apparatur angepasst werden. Typischerweise werden z.B. jeweils ca. 0,5 bis ca. 0,8 Liter Flüssigkeit pro Kilogramm des kollagenhaltigen Materials eingesetzt. Bei einem Umlaufverfahren ist es günstig, wenn der Durchfluss im Bereich von ca. 0,3 bis ca. 0,4 l/h»kg liegt.

Nach der Durchführung der vorstehend beschriebenen Verfahrensschritte liegt das kollagenhaltige Material in Form einer wässrigen Aufschlämmung bzw. nach Abzug des flüssigen Mediums in einem feuchten Zustand vor. Da das Material in diesem Zustand nicht lagerfähig ist, ist es bevorzugt, wenn das erfindungsgemäße Verfahren ferner eine anschließende Trocknung des kollagenhaltigen Materials umfasst.

Die Trocknung des kollagenhaltigen Materials kann bei erhöhten Temperaturen durchgeführt werden, bevorzugt bei einer Temperatur von ca. 100 bis ca. 180 °C. Im Gegensatz zu einer Behandlung von Kollagen in einem wässrigen sauren oder alkalischen Medium führen hohe Temperaturen bei der Trocknung, die auch nur kurzzeitig sind, nicht zu einer Hydrolyse des Kollagens. Ein bevorzugtes Trocknungsverfahren im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist die Kontakthaftschichtzylindertrocknung. Es können aber auch andere Trocknungsverfahren eingesetzt werden, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, wie z. B. Konvektionstrocknung, Sprühtrocknung, Gefriertrocknung oder Vakuum bandtrocknung.

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das kollagenhaltige Material vor und/oder nach der Trocknung zerkleinert. Eine Zerkleinerung des Materials vor dem Trocknen kann erforderlich sein, um das Trocknungsverfahren effizient durchführen zu können, falls das kollagenhaltige Material nicht bereits vor der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eine ausreichend geringe Partikelgröße aufweist. So ist es z. B. vorteilhaft, vor einer Kontakthaftschichtzylindertrocknung das kollagenhaltige Material bis auf eine Partikelgröße von weniger als ca. 0,5 mm zu zerkleinern, sodass das Material ohne Zuhilfenahme von Wasser als Fördermittel auf den Zylinder aufgetragen werden kann und die Filmbildung und Trocknung auf dem Zylinder störungsfrei abläuft. Nach dem Trocknen des kollagenhaltigen Materials kann dieses gegebenenfalls weiter vermählen werden, um ein Kollagenpulver mit der gewünschten Partikelgröße zu erhalten. Solche Pulver können in der Lebensmittel-, Kosmetik- und Pharmaindustrie eingesetzt werden.

Für bestimmte Anwendungen hat es sich auch als besonders vorteilhaft erwiesen, wenn das kollagenhaltige Material bereits vor dem Trocknen bis auf die gewünschte Partikelgröße zerkleinert wird. Durch eine Hochdruckhomogenisa- tion des in Suspension befindlichen Materials, der gegebenenfalls eine Nassvermahlung vorausgehen kann, können z. B. Kollagenpartikel mit einem mittleren Durchmesser in gequollenem Zustand von weniger als ca. 100 μιη hergestellt werden. Ein entsprechendes Verfahren ist in der Offenlegungsschrift DE 10 2008 036 576 AI beschrieben. Solche Partikel können u.a. als Fettersatz in Lebensmitteln eingesetzt werden, um das cremige Mundgefühl von 01- in-Wasser-Emulsionen zu simulieren.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein kollagenhaltiges Material mit einem Endotoxingehalt von weniger als ca. 10 EU/g (Endotoxin-Units/g), welches nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt ist. Die Bestimmung des Endotoxingehalts bezieht sich dabei auf die empfindlichste derzeit verfügbare Nachweismethode für Endotoxine, den in der sechsten Ausgabe des Europäischen Arzneibuches (Ph. Eur. 6) beschriebenen LAL-Test (Limulus-Amöbozyten-Lysat-Test). Dieser beruht auf der Aktivierung der Gerinnungskaskade durch Endotoxine in einem aus Pfeilschwanzkrebsen gewonnenen Amöbozyten- Lysat.

Der Grenzwert von 10 EU/g des kollagenhaltigen Materials entspricht dabei in etwa dem niedrigsten Wert, der bei einem unlöslichen Material mit Hilfe des LAL-Tests noch reproduzierbar bestimmt werden kann. Das kollagenhaltige Material gemäß der vorliegenden Erfindung kann somit als im Wesentlichen endotoxinfrei bezeichnet werden kann. Mit anderen Worten kann der Endoto- xingehalt durch das erfindungsgemäße Verfahren soweit reduziert werden, dass ein Nachweis von Endotoxinen mit den verfügbaren Methoden praktisch nicht mehr möglich ist.

Die vorliegende Erfindung betrifft schließlich auch die Verwendung des vorstehend beschriebenen kollagenhaltigen Materials zur Herstellung von pharmazeutischen oder kosmetischen Präparaten oder zur Herstellung von Lebensmitteln. Im pharmazeutischen Bereich ist eine bevorzugte Anwendung der Einsatz von Kollagenpulver als Hämostatikum .

Schließlich kann das erfindungsgemäße kollagenhaltige Material als auch Rohstoff zur Herstellung von im Wesentlichen endotoxinfreier Gelatine verwendet werden, die ebenfalls ein breites pharmazeutisches Anwendungsspektrum aufweist. Der Einsatz von Kollagen, welches endotoxinfrei ist bzw. einen äußerst geringen Endotoxingehalt aufweist, ist dabei einer von mehreren Parametern, die neben einer entsprechenden Verfahrensführung bei der Herstellung von endotoxinfreier Gelatine berücksichtigt werden müssen.

Diese und weitere Vorteile der Erfindung werden anhand des nachfolgenden Ausführungsbeispiels näher erläutert. Beispiel

Als kollagenhaltiges Ausgangsmaterial wurden 45 kg Ossein aus Schweineknochen mit einer Partikelgröße im Bereich von 0,4 bis 12 mm eingesetzt. Dieses wurde in einem Behälter mit Siebboden, Auslassventil unter dem Siebboden und Rührwerk in 29 I Wasser aufgeschlämmt. Die Rührgeschwindigkeit betrug während des gesamten Verfahrens ca. 30 U/min.

Zu dem Ansatz wurden während eines Zeitraums von 2,5 Stunden 1,7 I einer 50 Gew.%igen wässrigen Natriumhydroxidlösung zugegeben, sodass die Endkonzentration der Natronlauge ca. 0,7 mol/l betrug. Nach 36 Stunden Rühren wurde die Natronlauge während eines Zeitraums von 2,5 Stunden durch 29 I Wasser verdrängt.

Im Anschluss an diese Laugenbehandlung wurde das Ossein weitere 2,5 Stunden mit 29 I Wasser gewaschen.

Innerhalb von 2,5 Stunden erfolgte nunmehr die Zugabe von 1,4 I einer 30 Vol .%igen wässrigen Schwefelsäurelösung, entsprechend einer Endkonzentration an Schwefelsäure von ca. 0,26 mol/l. Nach Zugabe der Schwefelsäure erfolgte der Zusatz von 116 ml einer 35 Gew.%igen Wasserstoffperoxidlösung innerhalb von 15 min (Endkonzentration ca. 1.330 ppm). Es wurde weitere 7,5 Stunden gerührt.

Nach der Behandlung des kollagenhaltigen Materials mit Säure und einem Oxi- dationsmittel wurde dieses während 4 Stunden mit einem Wasserdurchfluss von 12 l/h gewaschen.

Nach dem Ablassen des Waschwassers wurde das Ossein einem zweistufigen Zerkleinerungsprozess unterzogen, wobei zunächst eine Nassvermahlung durchgeführt wurde, um die mittlere Partikelgröße auf einen Wert von ca. 0,26 mm zu reduzieren. Die resultierende Suspension wurde mittels einer Kontakt- haftschichtzylindertrocknung bei ca. 160 °C Oberflächentemperatur getrocknet und der getrocknete Film zu einem Kollagenpulver mit einer mittleren Partikelgröße von ca. 110 μιη weiter vermählen . Die Partikelgröße wurde mittels Siebanalyse bestimmt.

Alternativ zu der Trockenvermahlung kann auch eine Zerkleinerung mittels Hochdruckhomogenisation, wie in der DE 10 2008 036 576 AI beschrieben, durchgeführt werden.

Die Bestimmung des Endotoxingehalts des auf diese Weise aus Ossein hergestellten Kollagenpulvers gemäß dem LAL-Test (Ph. Eur. 6) wurde bei einer Verdünnung von 1 : 50 (in Form einer Suspension) durchgeführt und ergab einen Endotoxingehalt von weniger als 10 EU/g. Dieser Wert entspricht in etwa der Nachweisgrenze des Tests bei dieser Verdünnung, wobei die Durchführung des Tests bei einer geringeren Verdünnung aufgrund der starken Quellfähigkeit des Kollagenpulvers nicht mehr praktikabel ist.

Im Vergleich hierzu liegt der Endotoxingehalt des eingesetzten Rohstoffs typischerweise in einem Bereich von mehreren tausend EU/g.

Dieses Beispiel zeigt, dass das erfindungsgemäße Verfahren eine drastische Reduzierung des Endotoxingehalts in kollagenhaltigen Materialien ermöglicht und somit zur Herstellung eines im Wesentlichen endotoxinfreien kollagenhaltigen Materials geeignet ist. Es kann kostengünstig und mit relativ geringem Aufwand auch im industriellen Maßstab eingesetzt werden, da es ohne den Einsatz von organischen Lösungsmitteln und/oder speziellen Absorbern auskommt.