Erfindung betrifft eine Mikrotropfenrückhalteanordnung, ein Verfahren zum Betreiben und die Verwendung dieser Anordnung gemäß der Gattung der Patentansprüche, insbesondere für mikrofluidische Systeme.

Von der WO 2010036352 Al ist ein System bekannt, das das Trennen von Probenkomponenten durch Unterteilen derselben in Tröpfchen oder andere Komponenten, das Verstärken oder anderweitiges Reagieren der Komponenten innerhalb der Tröpfchen, das Detektieren der amplifizierten Komponenten oder Eigenschaften davon und / oder das Analysieren der resultierenden Daten ermöglicht.

Hauptanwendungsgebiet des Systems ist dabei die Polymerasekettenreaktion .

Gemäß der Offenbarung der WO 2010036352 Al umfasst das System einen Tröpfchengenerator, der zum Erzeugen von Tröpfchen konfiguriert ist, die Teile einer zu analysierenden Probe enthalten, wobei die Tröpfchen in einem nicht mischbaren Fluid angeordnet sind, das eine Probenemulsion bildet, eine Heiz- und Kühlstation mit einem Fluideinlass und einem Fluidauslass, eine Detektionsstelle stromabwärts von der Heiz- und Kühlstation, einen Kanal, der einen kontinuierlichen Fluidweg vom Fluideinlass zum Fluidauslass der Heiz- und Kühlstation bildet, eine Pumpe zum Bewegen der Probenemulsion durch den Kanal, eine Steuerung, die programmiert ist, um einen Fluidtransport durch den Kanal zu betreiben, und einen Analysator, der konfiguriert ist, um Daten zu verarbeiten, die an der Erfassungs Station gesammelt werden.

Dabei kann ein Tröpfchenreservoir vorgesehen sein, wobei die erste Fluidleitung den Tröpfchengenerator mit dem Reservoir verbindet, und eine zweite Fluidleitung, die das Reservoir mit dem Fluideinlass der Heiz- und Kühlstation verbindet.

Der Controller kann so programmiert sein, dass er den Tröpfchengenerator so einstellt, dass er die Tröpfchengröße basierend auf von der Detektions Station empfangenen Daten ändert.

Eine Ausgestaltung des Systems umfasst: • mindestens einen Tröpfchengenerator, der eine Vielzahl von Emulsionen einschließlich Tröpfchen bildet, die jeweils eine Probenpartition enthalten, die als eine Reaktionsmischung zur Amplifikation eines Nukleinsäureziels vorbereitet ist,

• eine Platte, die eine Anordnung von Hohlräumen definiert, um die Emulsionen zu halten,

• eine Heiz- und Kühlvorrichtung, um die in den Hohlräumen angeordneten Emulsionen zu erhitzen, um eine Nukleinsäureamplifikation in Tröpfchen zu induzieren und

• eine Detektionsanordnung zum Detektieren von Signalen von intakten Tröpfchen der Emulsionen; und eine Steuerung, die mit der Detektionsanordnung in Verbindung steht und programmiert ist, um eine Anwesenheit des Nukleinsäuretargets in einer Probe, falls vorhanden, zu schätzen, basierend auf Signalen, die von den intakten Tröpfchen detektiert werden.

Der Nachteil dieser technischen Lösung besteht darin, dass der Tröpfchengenerator eine Kapillarspaltkammer ist, welche mit Ventilen versehen ist, die ansteuerbar sind.

Auf Grund der Initialbefüllung dieses Systems kommt es zu unerwünschten Luftblasen, welche nicht aus dem System ausgetrieben werden und die Ventile nicht in jedem Fall passieren können, so dass das System in der Praxis bereits von Hersteller als Einwegartikel Luftblasen frei vorgefüllt und daher nicht wiederverwendbar ist.

DE 101 04 323 Al offenbart ein Verfahren zum Herstellen einer Rille mit einer Engstelle in der Oberfläche eines Bauteils durch Ätzen. Um ein solches Bauteil in einfacher Weise herstellen zu können, werden durch isotropes Ätzen voneinander beabstandete Rillenabschnitte erzeugt. Anschließend wird zwischen den Rillenabschnitten durch ein weiteres Ätzen ein Rillenstück mit relativ engem Querschnitt erzeugt, das die beiden Rillenabschnitte miteinander unter Bildung einer Engstelle, s.g. Drosselstelle, verbindet.

Bei einer Verfahrensvariante wird mit einer Ätzmaske mit zwei beabstandeten Ätzöffnungen solange isotrop geätzt, bis sich die gebildeten Rillenabschnitte stimseitig unter Bildung einer Engstelle teilweise durchdringen.

Im Zusammenhang mit dieser Engstelle wird eine Fluidplatte gelehrt, die durch zwei Siliziumscheiben mit gemäß dem Verfahren hergestellten Rillen durch Bonden der beiden Bauteile hergestellt werden kann, wobei die Rillen einen inneren Kanal aufweisen, der eine Drosselstelle bildet, so dass dort - beispielsweise durch integrierte Drucksensoren - die Druckdifferenz an der Drosselstelle erfasst und damit Messgrößen zur Ermittlung des Durchflusses in einfacher Weise gewonnen werden können.

Die Engstelle, s.g. Drosselstelle, gemäß dieser technischen Lehre dient der Erzeugung einer messbaren Druckdifferenz zur Ermittlung des Durchflusses eines Fluidstromes und sie ist nicht dazu geeignet, Luftblasen aus dem Fluidstrom zu entfernen, Tropfen in einer Kammer einzulagem oder diese aus der Kammer auszutreiben.

WO 2018/186 881 Al offenbart eine Trägheitspumpe. Diese

Trägheitspumpe kann einen mikrofluidischen Kanal, ein Fluidstellglied im mikrofluidischen Kanal und ein Rückschlagventil im mikrofluidischen Kanal beinhalten. Das Rückschlagventil kann ein bewegliches Ventilelement, ein verengtes Kanalsegment, das stromaufwärts des beweglichen Ventilelements angeordnet ist, und ein Sperrelement beinhalten, das im mikrofluidischen Kanal stromabwärts des beweglichen Ventilelements ausgebildet ist. Das verengte Kanalsegment kann eine Breite kleiner als eine Breite des beweglichen Ventilelements aufweisen, so dass das bewegliche Ventilelement den Fluidstrom durch das Rückschlagventil blockieren kann, wenn das bewegliche Ventilelement im verengten Kanalsegment positioniert ist. Das Sperrelement kann so konfiguriert werden, dass das Sperrelement das bewegliche Ventilelement innerhalb des Rückschlagventils einschränkt und gleichzeitig den Fluidfluss ermöglicht, wenn das bewegliche Ventilelement gegen das Sperrelement positioniert ist. Diese technische Lösung ist nicht dazu geeignet, Luftblasen aus dem Fluidstrom zu entfernen, Tropfen in einer Kammer einzulagern oder diese aus der Kammer auszutreiben.

US 2003/0121644 Al offenbart eine Wärmemassentransportvorrichtung, die Mikrokanäle und Mikropumpen verwendet, um eine dünnere Bauform zu erreichen und damit eine höhere Wärmeleitfähigkeit zu erzielen. Die Wärmemassentransportvorrichtung weist eine Struktur auf, in der die Mikrokanäle für den Durchgang durch ein Kühlmittel und die Mikropumpen für den Transport des Kühlmittels eine einzige Einheit bilden.

So können bspw. eine Kanalschicht, in der die Mikrokanäle gebildet sind, und eine Pumpschicht, in der die Mikropumpen angeordnet sind, in eine Mehrschichtstruktur laminiert sein. Darüber hinaus ist die Wärmemassentransportvorrichtung in der Form flexibel ausgestaltet, dass die Mikrokanäle und Mikropumpen auf einem Harzsubstrat unter Verwendung von flexiblem Material ausgeführt sind. Dabei kann auch vorgesehen sein, dass die Wärmemassentransportvorrichtung einen Abschnitt des Mikrokanals aufweist, der eine Verengung in einem geschlossenen Kreislauf von Mikrokanal und Mikropumpe darstellt.

Dabei ist nicht vorgesehen, dass ein Entfernen von Luftblasen, das Einlagem von Tropfen in einer Kammer oder das Austreiben von Tropfen aus der Kammer möglich ist.

US 2016/0193605 Al offenbart das Isolieren oder Identifizieren einer Zelle in einer Zellsuspension zur Unterscheidung von Tumorzellen von Nicht-Tumorzellen basierend auf einer physikalischen Eigenschaft dieser Zellen und dem Leiten der Zellsuspension durch einen mikrofluidischen Kanal, der eine Verengung beinhaltet und das Leiten der Zellsuspension durch diese Verengung ermöglicht. Die Engstelle gemäß dieser technischen Lehre kann so bemessen sein, dass sie eine relativ größere Zelle gegenüber einer relativ kleineren Zelle bevorzugt verformt. Dazu umfasst das mikrofluidische System einen Mikrofluidikkanal, durch den eine in einem Puffer suspendierte Tumorzelle hindurchtreten kann und der im Vergleich zu einer Nicht-Tumorzelle verengt ist, wobei diese Verengung des Mikrofluidikkanals der Zellverformung dient, in dem die Engstelle so bemessen ist, dass sie eine Tumorzelle vorzugsweise mehr verformt als eine Nicht-Tumorzelle.

Der Nachteil dieser technischen Lösung besteht darin, dass sie ausschließlich der Zelltrennung dient. Ein Entfernen von Luftblasen, welche durch die Probeneingabe in das Fluid entstehen, ein Einlagem von Tropfen in einer Kammer sowie das Austreiben der Tropfen aus der Kammer wird nicht ermöglicht.

DE 20 2012 013 668 Ul offenbart ein Verfahren zum Quantifizieren einer Menge von Enzymmolekülen, welches bspw. eine Vorrichtung für die Tropfenbildung verwendet. Diese Vorrichtung weist einen Einlasskanal, einen Auslasskanal und zwei Trägerflüssigkeitskanäle auf. Die Kanäle treffen sich an einem Knotenpunkt. Der Einlasskanal leitet eine Probenflüssigkeit zu dem Knotenpunkt. Die Trägerflüssigkeitskanäle leiten eine Trägerflüssigkeit, die mit der Probenflüssigkeit unmischbar ist, zu dem Knotenpunkt. Der Einlasskanal verengt sich an seinem distalen Abschnitt, wobei er sich mit dem Knotenpunkt verbindet. Der Einlasskanal ist rechtwinklig zu den Trägerflüssigkeitskanälen orientiert. Tropfen werden gebildet, wenn die Probenflüssigkeit aus dem Einlasskanal zu dem Knotenpunkt fließt, wo die Probenflüssigkeit mit der fließenden Trägerflüssigkeit, die über die Trägerflüssigkeitskanäle dem Knotenpunkt zugeführt wird, interagiert. Der Auslasskanal nimmt die Tropfen der Probenflüssigkeit, die von der Trägerflüssigkeit umgeben sind, auf.

Der Nachteil dieser technischen Lösung besteht darin, dass lediglich eine Tropfenbildung generiert wird. Das Befreien von Luftblasen kombiniert mit der Rückhaltung sowie dem Austreiben von Tropfen wird mit dieser technischen Lösung nicht ermöglicht.

US 2010/0252118 Al offenbart mikrofluidische Strukturen und ein Verfahren zur Manipulation von Flüssigkeiten, Fluidkomponenten und Reaktionen, wobei solche Strukturen und das Verfahren die Produktion von Tröpfchen mit einem genauen Volumen ermöglichen, die in bestimmten Bereichen der Vorrichtung gespeichert können. Dabei sind die mikrofluidischen Strukturen und das Verfahren so konzipiert, dass sie Komponenten (bspw. biologische Zellen) in einer Anordnung aufnehmen und positionieren können, um diese zu manipuliert und dabei zu beobachten.

Gemäß der technischen Lehre von US 2010/0252118 Al strömt der Tropfen in einem Strömungspfad in eine Richtung, indem er von einem Trägerfluid getragen wird, das in die gleiche Richtung strömt. Beim Passieren der Verbindung zwischen zwei Strömungspfaden am stromaufwärts gelegenen Abschnitt strömt das Tröpfchen aufgrund seines geringeren Strömungswiderstands in diesem Strömungspfad relativ zu dem anderen Strömungspfad mit einen Fluidbeschränkungsbereich, bspw. einem schmalen Fluidpfadabschnitt und/oder einen Bereich mit einer kleineren Querschnittsfläche als der Fluidwegabschnitt beinhaltet, so dass der Tropfen nicht weiter durch das mikrofluidische Netzwerk fließen kann. Dementsprechend ist das Tröpfchen in einem Bereich, z.B. einem "Mikrotopf" oder einer "Kammer" des mikrofluidischen Netzwerks positioniert.

Es besteht dabei auch die Möglichkeit, dass der Tropfen in einem Bereich festgehalten wird, obwohl das Trägerfluid weiterhin im mikrofluidischen Netzwerk fließt. Dabei wird allgemein festgestellt, dass jeder geeignete Fluidweg als Fluideinschränkungsbereich verwendet werden kann, der einen höheren hydrodynamischen Widerstand und/oder eine kleinere Querschnittsfläche für die Fluidströmung aufweist.

Als Beispiel wird ein Fluideinschränkungsbereich in Form eines schmalen Fluidpfades oder eines Kanals mit den gleichen Abmessungen wie der Strömungspfad genannt, wobei in diesem ein Hindernis in Form eines Ventils, angeordnet ist.

In einem anderen Beispiel ist der Fluideinschränkungsbereich eine poröse Membran, einen semipermeablen Stopfen (z.B. ein Gel), ein Ventil oder eine andere Struktur.

Dabei kann ein Mikrofluidiknetz vorgesehen sein, dass einen Flüssigkeitsrestriktionsbereich in Form einer engen Öffnung aufweist, durch welchen das Tröpfchen aufgrund eines hohen hydrodynamischen Widerstands nicht hindurchfließen kann. Infolgedessen umgeht das Tröpfchen den Flüssigkeitsrestriktionsbereich und fließt in einen andern Fluidweg. Durch diese Umkehrung des Durchflusses im Mikrofluidiknetz können die Tröpfchen nacheinander aus diesem Bereich des Mikrofluidiknetzes entfernt werden, in denen sie sich zuvor befanden. Der Nachteil dieser technischen Lösung besteht darin, dass unterschiedliche fluidische Komponenten zur Realisierung der einzelnen Funktionalitäten, wie bspw. die Entfernung von Blasen, das Zurückhalten von Tropfen und das Austreiben von Tropfen aus dem Speicherelement vorgesehen sind

US 2018/0003611 Al offenbart eine Vorrichtung (einen biologischen Testchip) mit einer auf einem Substrat ausgebildeten mikrofluidischen Kanalstruktur, wobei sich im Kanal ein Fluidaktuator befindet, der im Fluidstrom biologische Zielpartikel zum Zählen in einem Detektionsbereich vereinzelt, wobei der Chip konkret folgende Komponenten umfasst:

• ein Substrat;

• eine mikrofluidische Kanalstruktur, die auf dem Substrat gebildet ist und einen ersten Kanal beinhaltet;

· ein Fluid-Stellglied innerhalb der mikrofluidischen Kanalstruktur.

• ein Sensorbereich innerhalb des ersten Kanals, um einen Fluidstrom biologischer Partikel auf einer einmaligen Basis durch den Betrieb des Fluidaktuators zu empfangen, wobei der Sensorbereich ein Volumen in der gleichen Größenordnung wie ein Volumen eines einzelnen der biologischen Partikel aufweist,

Dabei sind folgende Ausgestaltungen dieser Komponenten vorgesehen:

- mindestens ein Impedanzsensor, der im Sensorbereich angeordnet ist, um biologische Partikel zu zählen, die durch den Sensorbereich geführt werden,

- eine Ausschlussstruktur stromaufwärts von dem Sensorbereich, um biologische Partikel auszuschließen, die größer sind als das Volumen des Sensorbereichs sind, und

- eine Einlassstruktur mit einer sich allmählich verengende

Querschnittsfläche in der stromabwärts gerichteten Ausrichtung beinhaltet. wobei der Kanal eine Verengung aufweist, die wesentlich kleiner als die sonstige Querschnittsfläche ist und die biologischen Partikel Blutzellen sind.

Der Nachteil dieser technischen Lösung besteht darin, dass nur eine Verengung zum Vereinzeln der Blutzellen in einem Flüssigkeitsstrom vorgesehen ist, welche keine Entfernung von Luftblasen der Probeeingabe, das Zurückhalten von Tropfen sowie das Austreiben von Tropfen aus einem Rückhalteelement ermöglicht.

US 2011/0275143 Al offenbart eine Plattform für die Analyse einzelner Zellen oder Moleküle in einer Flüssigkeit, welche folgende Komponenten umfasst:

• einen Generator, zum Erzeugen von Tröpfchen oder Blasen zu erzeugen, die einzelne Zellen oder einzelne Moleküle enthalten,

• einen Sortierer, zum Entfernen unerwünschter bzw. leerer Tröpfchen oder Blasen, die vom Generator erzeugt wurden,

• eine Detektions- oder Messvorrichtung, die zum Detektieren oder Messen einer Eigenschaft der Zelle oder des Moleküls, welche in dem Tropfen oder der Blase enthalten ist,

• eine fluidische Blasenlogik-Screeningvorrichtung zum Screenen der im Tröpfchen oder der Blase enthaltenen Zelle oder des Moleküls gemäß der erfassten oder gemessenen Eigenschaft, um mindestens eine ausgewählte Zelle oder ein ausgewähltes Molekül zu identifizieren,

• mindestens ein logisches Speicherelement für Fluidblasen zum Speichern der ausgewählten Zelle oder des ausgewählten Moleküls, das in dem Tropfen oder der Blase enthalten ist, und

• eine fluidische Blasenlogik-Leitweglenkungsschaltung zum Leiten der ausgewählten Zelle oder des ausgewählten Moleküls, das in dem Tröpfchen oder der Blase enthalten ist, von einer Siebvorrichtung zu einem Speicherelement.

Der Nachteil dieser sehr komplexen technischen Lösung besteht in der Vielzahl unterschiedlicher fluidischer Komponenten zur Realisierung der einzelnen Funktionalitäten, wie bspw. die Entfernung von Blasen, das Zurückhalten von Tropfen und das Austreiben von Tropfen aus dem Speicherelement.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Mikrotropfenrückhalteanordnung und ein Verfahren zum Betreiben dieser in einem mikrofluidischen System anzugeben, welche die zuvor stehend genannten Nachteile des Standes der Technik vermeiden und insbesondere ein Zurückhalten von Probetropfen bei geringen Volumenströmen, ein mittiges Austreiben von Probetropfen bei mittleren Volumenströmen und gleichzeitig den Durchtritt von Luftblasen ermöglicht.

Darüber hinaus sollen verschiedene Anwendungen dieser Anordnung des Verfahrens zum Betreiben dieser Anordnung angegeben werden.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die Merkmale des 1. Patentanspruchs gelöst. Weitere günstige Ausgestaltungsmöglichkeiten der Erfindung sind in den nachgeordneten Patentansprüchen angegeben.

Das Wesen der Erfindung besteht darin, dass in einer monolithisch hergestellten integrierten mikrofluidischen Anordnung auf Chip-Basis, welche bspw. der technischen Lehre von WO 2010/036352 Al entspricht, an Stelle der bekannten Ventile mindestens eine Mikrotropfenrückhalte-anordnung mit einer speziellen Geometrie in einem mikrofluidischen Kanal angeordnet ist.

Diese Mikrotropfenrückhalteanordnung ist als multifunktionale mikrofluidische Funktions Struktur (= „Rückhaltestruktur“) für das Zurückhalten von Tropfen eines Probefluids (= "Probetropfen") in einer als Kapillarspalt ausgestalteten Speicherkammer für Probetropfen einer vorgegebenen Größe ausgeführt. Dabei wird die Speicherkammer Einlass- und Auslassseitig durch als dreidimensionale geometrische Anordnungen realisierte Rückhaltestrukturen begrenzt.

Einlassseitig bezeichnet die Seite der Rückhaltestruktur, auf welcher kleine Tropfen zurückgehalten werden. Auslassseitig bezeichnet die Seite der Rückhaltestruktur, aus welcher Luftblasen und Tropfen die Struktur bei höheren Flussraten verlassen.

Die Mikrotropfenrückhalteanordnung ist in Form einer Barriere als Engstelle des Kanals mit einem mittig angeordneten Durchlass für Flüssigkeiten (= Strömungsverengung / Furt) in einem Mikrokanal vor und / oder nach der als Kapillarspalt ausgestalteten Speicherkammer für Probetropfen ausgebildet, so dass die Die Rückhaltestruktur zwei Teilbereiche, eine Barrierestruktur und einen Durchlass, umfasst

Dazu sind die in die verengte Stelle des Mikrokanals einlaufende Wand und die aus der verengten Stelle des Mikrokanals auslaufende Wand jeweils in einer konkaven (d.h. nach innen gewölbter) Form des Mikrokanals ausgeführt, wobei die Konkavität gleich oder unterschiedlich sein kann.

Der Verlauf der Wand des Mikrokanals an seiner Verengung entspricht dabei annähernd oder genau einer konkaven oder streng konkaven Funktion.

Eine Funktion ist konkav, wenn ihr Graph oberhalb jeder Verbindungsstrecke zweier seiner Punkte liegt. Dies ist gleichbedeutend dazu, dass der Hypograph der Funktion, also die Menge der Punkte unterhalb des Graphen, eine konvexe Menge ist.

Eine reellwertige Funktion f: C— >R, die auf einer konkaven Teilmenge C eines reellen Vektorraums definiert ist, heißt konkav, wenn für alle x, y aus C und für alle t e [0,1] gilt, dass

f (tx + (1 - t) y) > tf (x) + (1 - t) f (y), so wird die Funktion konkav genannt.

Eine Funktion heißt streng konkav oder strikt konkav, wenn die obige Ungleichung im strengen Sinn gilt; das heißt für zwei Elemente x y aus C und alle t e [0,1] gilt, dass

f (tx + (1 - t) y) > tf (x) + (1 - t) f (y). [Harro Heuser: Lehrbuch der Analysis (Teil 1), 10. Auflage, B. G. Teubner, Stuttgart 1993, ISBN 3-519-32231-5. (49.2)] Beim annähernd konkaven Verlauf der Wand des Mikrokanals an seiner Verengung zum Durchlass hin und vom Durchlass weg kann die Wand mäanderförmig gleichmäßig oder ungleichmäßig in langen flachen oder kurzen starken Wellenformen oder aber auch stufenförmig ausgestaltet sein

Beim konkaven oder streng konkaven Verlauf der Wand des Mikrokanals an seiner Verengung zum Durchlass hin und vom Durchlass weg ist die Wand mit einem durchgehend gleichmäßigem Verlauf verengend bzw. erweiternd ausgeführt.

Die ausgebildete Verengung des Mikrokanals am Durchlass ist so ausgestaltet, dass die Länge des Durchlasses in Flussrichtung des Kanals sehr kurz bis nahezu punktförmig ist.

Gleichzeitig ist der Rand der Verengung am Durchlass verrundet, d.h. er darf nicht eckig ausgeführt sein.

Durch diese Ausgestaltung (Länge und Verrundung) des Durchlasses in Kombination mit dem Verlauf der Wand des Mikrokanals (in Flussrichtung) zum Durchlass hin und von Durchlass weg, ist die bestimmungsgemäße Funktionsweise der Rückhaltestruktur gewährleistet.

Diese Rückhaltestrukturen dienen der geordneten Einlagerung von Tropfen in einer Speicherkammer und der Vermeidung eines unerwünschten Austritts von Tropfen aus der Speicherkammer sowie der Handhabung von unerwünschten Luftblasen.

Bei der Initialbefüllung passieren große Luftblasen die Rückhaltestruktur vollständig, so dass eine zuverlässige, Luftblasen-freie Initialbefüllung sowie das Austreiben von unerwünschten, im mikrofluidischen System befindlichen Luftblasen für eine bestimmungsgemäße Nutzung der Speicherkammer erfolgt.

Für die Befüllung der Speicherkammer mit Probetropfen ermöglicht die Rückhaltestruktur die Einlagerung von Tropfen in die Speicherkammer, in dem diese zurückgehalten werden.

Für die Entleerung der in der Speicherkammer gespeicherten Probetropfen ermöglicht die Rückhaltestruktur, dass diese die Speicherkammer als eine lineare Folge gleichmäßig beabstandeter Tropfen in der Kanalmitte des als Auslass dienenden Mikrokanals verlassen.

Die Steuerung dieser drei einzelnen Funktionen der Rückhaltestruktur erfolgt über die zur Anwendung kommenden Flussraten (V olumenströme) .

Für das Einlagem der Tropfen in der Speicherkammer kommen geringe Volumenströme zur Anwendung.

Für das Austreiben von Luftblasen mit hoher Grenzflächenspannung und geringer Viskosität kommen hohe Volumenströme zur Anwendung.

Für das Austreiben der Probetropfen als mittig geführte, gleichförmig beabstandete Folge von Tropfen kommen mittlere Volumenströme zur Anwendung.

Die Rückhaltestruktur weist für das Zurückhalten und das Vereinzeln von Tropfen einen Nenndurchmesser DT auf, wobei die Rückhaltestruktur in einem Kapillarspaltkanal mit der Höhe HC = DT und der Weite WC integriert ist.

Die Höhe HR der Rückhaltestruktur beträgt ca. HR 2/3 * HC.

Die Rückhaltestruktur wird durch zwei bezüglich der vertikalen Hauptebene des Kanals in Flussrichtung spiegelsymmetrische und zueinander beabstandeten Teilstrukturen gebildet. Der kleinste Abstand AT MIN zwischen den Teilstrukturen beträgt AT MIN— HC/3.

Die der Kanalmitte zugewandten Teilstrukturen sind mit einem Radius RI von 121— HR verrundet.

Die Länge der Rückhaltestruktur in Flussrichtung nimmt zu den begrenzenden Seitenwänden zu. Dieser Teil der Geometrie kann durch einen Kreisbogen mit einem Radius R2 mit E2 N 0.6 * WC beschrieben werden.

Alle genannten Linienzüge können durch Polygone, Splines oder unter Verwendung geeigneter mathematische Funktionen, wie zum Beispiel Polynome beliebiger Ordnung, Reihenentwicklungen (z.B. Tailor- Reihe) oder andere geeignete mathematische Ausdrücke approximiert werden.

Die so ausgestaltete Rückhaltestruktur kann vollständig unter Verwendung eines zweistufigen Ätzprozesses (Fotolithografie + Plasmaätzen in Silizium) hergestellt werden und nachfolgend mittels galvanischer Abformung in ein Spritzgusswerkzeug für die kostengünstige Massenfertigung, bspw. monolithisch hergestellter integrierter mikrofluidische Bauelemente und Systeme mit Rückhaltestruktur(en), überführt werden.

Die gemäß den zuvor stehend ausgeführten geometrischen Vorgaben ausgestaltete Rückhaltestruktur verfügt über drei Funktionalitäten, welche durch die Stärke der Volumenströmen des flüssigen Mediums im Mikrokanal schaltbar sind:

· Durchtritt von Luftblasen durch die Rückhaltestruktur

Für den Durchtritt von Luftblasen durch die Rückhaltestruktur kommen hohe Volumenströme zur Anwendung. Im Gegensatz zu Probentropfen zeichnen sich Luftblasen durch eine hohe Grenzflächenspannung, ein hohes Volumen und eine geringe Viskosität aus. Durch die hydrodynamischen Kräfte wird die Luftblase formschlüssig in die Rückhaltestruktur gepresst. Im Bereich der zentralen Apertur kann sie diese überwinden. Beim nachfolgenden Durchtritt bildet sich im Bereich der zentrale Öffnung eine Engstelle der Luftblase aus. Diese Engstelle muss als bevorzugte Position für eine Fragmentierung der Luftblase interpretiert werden.

Die Wahrscheinlichkeit der Fragmentierung steigt mit der Länge dieser Struktur in Flussrichtung. Für die Vermeidung der Fragmentierung muss dieser Bereich in seiner Längenausdehnung minimiert werden. Dies gelingt durch die Verrundung der Struktur mit dem vorgegeben Radius RI.

Wird diese Struktur alternativ durch einen von der Rückhaltestruktur abweichenden Kapillarkanal gemäß dem Stand der Technik definiert, so erzeugt die Fragmentierung kleine Luftblasen, welche die Struktur nicht mehr passieren können und der angestrebten Funktionalität für das Zurückhalten kleiner Probetropfen oder deren kontrollierter Passage (dem Austreiben) wird nicht ausgebildet.

• Zurückhalten von Probetropfen bei geringen Volumenströmen

Geringe Volumenströme kommen für die Erzeugung und Einlagerung von Probetropfen in der Speicherkammer zur Anwendung. Unter diesen Prozessbedingungen können Probetropfen die Rückhaltestruktur nicht passieren, da die durch die Rückhaltestruktur erzeugten Rückhaltekräfte durch die hydrodynamischen Kräfte des strömenden Trägerfluids nicht überkompensiert werden können.

Der erste eintreffende Probetropfen wird durch die entstehenden hydrodynamischen Kräfte zur Kanalmitte transportiert und verschließt die dort angeordnete Öffnung aufgrund der von seinen Grenzflächen erzeugten Grenzflächenkräfte.

• Mittiges Austreiben von Probetropfen bei mittleren Volumenströmen

Bei mittleren Volumenströmen übersteigen die durch das strömenden Trägerfluid gebildeten die hydrodynamischen Kräfte die für den Durchtritt eines Tropfens durch den zentralen Bereich der Rückhaltestruktur erforderlichen Kräfte. Im Ergebnis können Tropfen die im mittleren Bereich angeordnete Öffnung passieren und werden zugleich durch das die Rückhaltestruktur überströmende Fluid in der Kanalmitte geführt. Die durch die Grenzflächenspannung des Probetropfens erzeugten Grenzflächenkräfte werden durch die hydrodynamischen Kräfte des strömenden Trägerfluids überkompensiert.

Zu den zuvor stehenden drei Funktionalitäten wird eine an sich bekannte Kapillarspaltkammer ein- oder beidseitig durch die Rückhaltestrukturen begrenzt.

Das Verfahren zum Betreiben des Systems mit dieser Kapillarspaltkammer und die Anwendung der Kapillarspaltkammer sind an sich aus der WO 2010/036352 Al bekannt, wobei die Ventile der vorbekannten technischen Lösung durch die Rückhaltestrukturen ersetzt und die Abmessungen sowie die Volumenströme an diese Rückhaltestrukturen angepasst sind, so dass die bestehenden Nachteile der technischen Lösung gemäß der Offenbarung der WO 2010/036352 Al überwunden werden.

Auf Grund der Geometrie der Rückhaltestruktur und deren Verwendung ergeben sich jedoch auch weitere, neue verfahrenstechnische Anwendungsmöglichkeiten (neben der PCT), wie z.B. das Sortieren der Tropfen unmittelbar nach Verlassen der Kapillarspaltkammer.

Die geometrisch ausgestalteten Rückhaltestrukturen für Tropfen nutzen dabei immer das Wechselspiel hydrodynamischer Kräfte mit den durch Grenzflächen erzeugten Kräften. Eine mathematische Beschreibung dieser Phänomene ist durch die dem Fachmann bekannte Navier-Stokes- Bilanzgleichung für "Body Forces“ im Kontext mit den konstruktiven Randbedingungen der Rückhaltestruktur gegeben. Das vermittels der an ihrem Ein- und Ausgang mit mindestens einer Mikrotropfenrückhalteanordnung versehenen Kapillarspaltkammer durchführbare Verfahren dient der Populationsanalyse einer Population von Probetropfen mit unterschiedlicher stofflicher Zusammensetzung. Ziel ist die Identifizierung und optionale Separation von Tropfen, deren stoffliche Zusammensetzung die vom Anwender vorgegebenen Kriterien erfüllen. Als Kriterium kommt die Bildung eines mit optischen Verfahren auslesbaren Markers im Volumen des Probetropfens zur Anwendung. Der Fachwelt sind diese Verfahren als digitale tropfenbasierte Assays bekannt.

Im ersten Schritt wird eine Suspension von Probetropfen mit unterschiedlicher stofflicher Zusammensetzung unter Verwendung eines Tropfengenerators als Suspension des Probefluids in einem mit diesem nicht mischbaren Trägerfluid erzeugt.

Diese Suspension von Probetropfen wird in die durch die Rückhaltestrukturen begrenzte Kapillarspaltkammer (Speicherkammer) eingelagert.

Nach Inkubation werden die den Zieleigenschaften entsprechenden Tropfen mit optisch spektroskopischen oder bildgebenden Verfahren identifiziert und deren Anzahl bestimmt.

Deren Anzahl in Relation zur Gesamtanzahl der Tropfen ist das angestrebte Ergebnis intitialen Populationsanalyse.

Nachfolgend werden die Probetropfen aus der Kapillarspaltkammer (Speicherkammer) einer Sortierstruktur für die Separation und Gewinnung der den Zielkriterien entsprechenden Probetropfen zugeführt. Hierfür ist deren Transport in der Mitte des Auslasskanals zwingend erforderlich.

Im Ergebnis des Sortierprozesses werden die den Zielkriterien entsprechenden Tropfen für eine nachfolgende Rückgewinnung und analytische Bewertung des Inhaltes gewonnen.

Das System mit der Tropfenrückhalteanordnung ermöglicht das Trennen von Probenkomponenten durch Unterteilen derselben in Tröpfchen, das Verstärken oder anderweitiges Reagieren der Komponenten innerhalb der Tröpfchen, das Detektieren der amplifizierten Komponenten oder Eigenschaften davon in den Tröpfchen und / oder das Analysieren der resultierenden Daten.

Der Vorteil der vorliegenden technischen Lösung gegenüber der in WO 2010/036352 Al offenbarten Lösung besteht darin, dass bei der Tropfenrückhalteanordnung durch die Stärke der Volumenströmung des flüssigen Mediums im Mikrokanal drei Funktionalitäten schaltbar sind und auf die vorbekannten Ventile verzichtet werden kann.

Dabei wird durch die Tropfenrückhalteanordnung ein Zurückhalten von Probetröpfchen bei geringen Volumenströmen, ein mittiges Austreiben von Probetröpfchen bei mittleren Volumenströmen und gleichzeitig der Durchtritt von Luftblasen bei starken Volumenströmen ermöglicht.

Durch diese technische Lösung erfolgt die Verbesserung der Zuverlässigkeit und Handhabbarkeit von monolithisch integrierten Chipsystemen für die Durchführung digitaler, tropfenbasierter mikrofluidischer Assays.

Für die Durchführung dieser Assays werden Probetropfen als Suspension in einem mit der Probenflüssigkeit unmischbaren Trägerfluid erzeugt, in eine Kapillarspaltkammer eingelagert und inkubiert. Nach Abschluss oder während der Inkubation werden die Tropfen unter Verwendung optisch-spektroskopischer oder bildgebender Verfahren einer

Populationsanalyse unterzogen. Dieser Ablauf entspricht an sich den klassischen, durch den vorbekannten Stand der Technik offenbarten Workflow für die Durchführung digitaler tropfen- basierter Assays.

Anwendungsbeispiele für den Einsatz der

Mikrotropfenrückhalteanordnung in integrierten mikrofluidischen Chipsystemen sind die Durchfluss-Analyse in monolithisch integrierten oder modularen Anordnungen, die stationäre Einlagerung und Inkubation von Tropfen in Form monolithisch integrierter oder modularer Anordnungen.

Die Mikrotropfenrückhalteanordnung begrenzt dabei die Kapillarspaltkammer in den integrierten Chipsystemen für die Inkubation der Probetropfen sowohl Einlass- als auch auslassseitig und verhindert ein Austreten der Probetropfen während der Befüllung und Inkubation.

Die Erweiterung um ein Sortierverfahren für die Gewinnung von Probentropfen ist dabei möglich. Hierfür können auslassseitig der Kapillarspaltkammer mikrofluidische Sortierstrukturen integriert werden. Für derartige mikrofluidische Sortierstrukturen sind bereits Beispiele aus dem Stand der Technik bekannt. Voraussetzung für die Anwendbarkeit dieser Strukturen ist die Zufuhr der Tropfen in die Sortierstruktur als gleichförmig beabstandete Folge von Tropfen in der Mitte des Einlasskanals der Sortierstruktur. Auch diese Aufgabenstellung wird durch die Mikrotropfenrückhalteanordnung abgedeckt.

Somit erfolgt durch die Mikrotropfenrückhalteanordnung eine Erweiterung des Funktionsumfanges an sich bekannter integrierter mikrofluidische Chipsysteme für die Durchführung digitaler, tropfenbasierter Assays.

Für die Herstellung eines integrierten Chipsystems als mikrofluidisches Netzwerk mit einem oder mehreren

Mikrotropfenrückhalteanordnung(en) werden nur zwei unterschiedliche Kanalhöhen benötigt. Damit ist das Gesamtsystem unter Verwendung etablierter, zweistufiger Strukturierungsverfahren herstellbar. Für die Massenfertigung mittels Spritzguss muss nur ein strukturiertes Formteil hergestellt werden, welches justagefrei mit einem nicht strukturierten Decksubstrat verbondet werden kann.

Die Erfindung wird nachstehend an Hand der schematischen

Zeichnungen und der Ausführungsbeispiele näher erläutert, ohne auf diese beschränkt zu sein. Dabei zeigen:

Fig. la: eine schematische, seitlich geneigte Aufsicht einer

Ausführungsform der erfindungsgemäßen Mikrotropfenrückhalteanordnung,

Fig. lb: eine schematische Schnittdarstellung der Mikrotropfenrück halteanordnung gemäß Fig. la entlang des Kanals in der Aufsicht mit den Ebenen A, B und C,

Fig. 2a: eine schematische Schnittdarstellung entlang der Ebene A der

Mikrotropfenrückhalteanordnung gemäß Fig. lb,

Fig. 2b: eine schematische Schnittdarstellung entlang der Ebene B der

Mikrotropfenrückhalteanordnung gemäß Fig. lb,

Fig. 2c: eine schematische Schnittdarstellung entlang der Ebene A der

Mikrotropfenrückhalteanordnung gemäß Fig. lb, Fig. 3a-d: eine schematische Darstellung von vier Varianten der Geometrie der Rückhaltestruktur der der Mikrotropfenrückhalteanordnung gemäß Fig. lb,

Fig. 4: die schematische Darstellung eines Mikrotropfenrückhalte- anordnungen gemäß Fig. lb in einem mikrofluidischen

Bauelement und

Fig. 5: einen detaillierten, vergrößerten Querschnitt eines Ausschnitts aus Fig. 4. Ausführungsbeipiel 1:

Aufbau der Mikrotropfenrückhalteanordnung

Die in Fig.la und Fig. lb sowie den Fig. 2a bis c dargestellte Mikrotropfenrückhalteanordnung (1) ist in Form einer Furt in einem Mikrokanal (3) als Verengung des Mikrokanals (3) mit einem Durchlass (4) für Flüssigkeiten als Strömungsverengung ausgebildet.

Dazu sind die in die verengte Stelle des Mikrokanals einlaufende Wand (ew) und die aus der verengten Stelle des Mikrokanals (3) auslaufende Wand (aw) jeweils in einer konkaven (d.h. nach innen gewölbter) Form des Mikrokanals (3) ausgeführt, wobei die Konkavität gleich oder unterschiedlich sein kann.

Beim konkaven oder streng konkaven Verlauf der Wand (w) des Mikrokanals (3) ist dieser an seiner Verengung zum Durchlass (4) hin und vom Durchlass (4) weg mit einem durchgehend gleichmäßigem Verlauf ausgeführt [verengend einlaufende Wand (ew) und erweiternd auslaufende Wand (aw)].

Beim annähernd konkaven Verlauf der Wand (w) des Mikrokanals (3) an seiner Verengung zum Durchlass (4) hin und vom Durchlass (4) weg kann die Wand (w) mäanderförmig gleichmäßig oder ungleichmäßig in langen flachen oder kurzen starken Wellenformen oder aber auch stufenförmig ausgestaltet sein (in der Fig. 1 nicht dargestellt). Die ausgebildete Verengung des Mikrokanals (3) am Durchlass (4) ist so ausgestaltet, dass die Länge des Durchlasses (4) in Flussrichtung des Mikrokanals (3) sehr kurz bis nahezu punktförmig ist.

Gleichzeitig ist der Rand der Verengung am Durchlass (4) verrundet, d.h. er darf nicht eckig ausgeführt sein.

Durch diese Ausgestaltung (Länge und Verrundung) des Durchlasses (4) in Kombination mit dem Verlauf der Wand (w) des Mikrokanals (4) in Flussrichtung zum Durchlass hin und von Durchlass weg, ist die bestimmungsgemäße Funktionsweise der

Mikrotropfenrückhalteanordnung (1) gewährleistet.

Form der Wand (w) des Mikrokanals (3) der Rückhaltestruktur (111): Die Gesamthöhe der in den Kanal integrierten Rückhaltestruktur (111) ist geringer als die Höhe des in die Rückhaltestruktur (111) einmündenden / auslaufenden Kanalabschnittes.

Der Höhenübergang ist zweckmäßigerweise als Stufe mit einem Flanken winkel zwischen 30 und 120° ausgeführt.

In Kanalmitte ist die Rückhaltestruktur (111) mit einem Durchlass (4) ausgestattet. Zweckmäßigerweise hat dieser Durchlass (4) die gleiche Kanalhöhe wie der in die Rückhaltestruktur (4) einmündende / auslaufende Kanalabschnitt.

Der durch die Barriere bewirkte hydrodynamische Widerstand besitzt einen Maximalwert am Übergang zu den Seitenwänden des Mikrokanals (3) und nimmt zur Kanalmitte hin ab.

Dies wird durch:

a) eine zur Kanal-Seitenwand hin zunehmende Länge der

Barrierenstruktur in Flussrichtung oder

b) eine zur Kanal-Seitenwand hin zunehmende Höhe der

Barrierenstruktur oder

c) eine Kombination beider Merkmale

realisiert. Die einlassseitige Form der Barriere ist der Geometrie der Vorderseite einer den Mikrokanal (3) vollständig ausfüllenden Luftblase - im Allgemeinen ein Kreis- oder Ellipsenbogen angenähert.

Für bidirektionalen Betrieb ist eine bezüglich der Schnittebene C spiegelsymmetrische Form vorteilhaft.

Für unidirektionalen Betrieb kann die auslassseitige Geometrie unter Berücksichtigung der Punkte:

• Die Gesamthöhe der in den Mikrokanal (3) integrierten Rückhaltestruktur (111) ist geringer als die Höhe des in die Rückhaltestruktur (111) einmündenden / auslaufenden Kanal abschnittes.

· Der Höhenübergang ist zweckmäßigerweise als Stufe mit einem

Flanken winkel zwischen 30 und 120° ausgeführt.

• In Kanalmitte ist die Rückhaltestruktur (111) mit einem

Durchlass (4) ausgestattet. Zweckmäßigerweise hat dieser Durchlass (4) die gleiche Kanalhöhe wie der in die Rückhaltestruktur (111) einmündende/auslaufende Kanalabschnitt frei gestaltet sein.

Beispiele für die geometrische Gestaltung der Rückhaltestruktur (111) sind in der Fig. 3 gezeigt.

Für die Gestaltung des Durchlasses (4) ist es vorteilhaft, wenn dessen minimale Weite an nur an einem Punkt erreicht wird und die Annäherung an diesen Punkt durch eine von Kreis- oder Parabel-Bögen abgeleitete Linienführung erreicht wird.

Für die Gestaltung der Geometrie ist eine stetige Linienführung vorteilhaft. Bei Bedarf kann diese durch Polygon Linien approximiert werden. Dies trifft besonders für die Fertigung mittels Fotolithografie zu, bei der die Geometrien auf den genutzten Foto-Lithografie- Masken üblicherweise durch die Verknüpfung/Aneinanderreihung von Polygonen erzeugt werden. Dimensionierung der Rückhaltestruktur (111):

Die Breite des in die Rückhaltestruktur (111) einlaufenden Kanals liegt im Bereich von 120 bis 1200 gm.

Die Höhe des in die Rückhaltestruktur (111) einlaufenden Kanals liegt im Bereich von 10 bis 400 gm. Die Breite des aus der Rückhaltestruktur (111) auslaufenden

Mikrokanals (3) liegt im Bereich von 20 bis 1200 gm und entspricht vorzugsweise der Breite des in die Rückhaltestruktur (111) einlaufenden Mikrokanals (3). Die Höhe des aus der Rückhaltestruktur (111) auslaufenden

Mikrokanals (3) liegt im Bereich von 10 bis 400 gm und entspricht vorzugsweise der Höhe des in die Rückhaltestruktur (111) einlaufenden Mikrokanals (3). Die Höhe der Barrierenstruktur beträgt mindestens 0.1 * Höhe des in die Rückhaltestruktur (111) einlaufenden Mikrokanals (3) und maximal 0.9 * Höhe des in die Rückhaltestruktur (111) einlaufenden

Mikrokanals (111). Die minimale Weite des Durchlasses (4) beträgt mindestens 0.5 * Höhe der Barrierenstruktur und maximal 2.0 * Höhe des in die Rückhaltestruktur (111) einlaufenden Kanals.

Zu den zur Anwendung kommenden Volumenströmen Q:

Der Volumenstrom Q sind an den Kanalquerschnitt A gekoppelt. Dabei gilt: Q = u * A.

Hohe Volumenströme, bei denen große Luftblasen die Struktur passieren, betragen 100 - 500 mm/s Flussgeschwindigkeit gemessen im einlas seitig in die Rückhaltestruktur (111) einmündenden Mikrokanal (3).

Mittlere Volumenströme, bei denen kleine Tropfen die Rückhalte struktur (111) im Durchlass (4) passieren, betragen 10 - 100 mm/s mittlere Geschwindigkeit gemessen im einlasseitig in die Rückhaltestruktur (111) einmündenden Mikrokanal (3).

Geringe Volumenströme, bei denen kleine Tropfen durch die Rückhaltestruktur (111) zurückgehalten werden und den Durchlass (4) nicht passieren, betragen 0.1 - 10 mm/s mittlere Geschwindigkeit gemessen im einlasseitig in die Rückhaltestruktur (111) einmündenden Mikrokanal (3).

Auswahl möglicher Anwendungsfälle und hierfür genutzte Tropfengrößen.

Ein Tropfendurchmesser von 3 - 50 pm mit einer Erzeugungsrate von 5 kHz -100 kHz wird bspw. zur digitalen PCR, isotherrnale DNA Amplifikations-Assays, Assays für Einzelmolekül Nachweis, Single-Cell Assays, Single Bacteria Assays, Single Phage Assays (Digital Phage Display) eingesetzt.

Ein Tropfendurchmesser von 20-100 pm mit einer Erzeugungsrate von 1 kHz - 50 kHz wird bspw. für mikrobielle und zellbasierte Reporter Assays mit Vorkultivierung, Digitale PCR in Anwesenheit von DNA- Capture Beads für Next Generation Sequencing eingesetzt.

Ein Tropfendurchmesser 50-200 pm mit einer Erzeugungsrate von 0.5 kHz -15 kHz wird bspw. für Untersuchung an Säuger-Zellkulturen und Stammzellen, Mikrofermentation-Experimente, Spherid-Erzeugung, Hybridoma-Zellkulturen für Stammoptimierung/Stammplege in der Antikörper Produktion und zur Untersuchung mikrobieller Konsortien eingesetzt. Ausführungsbeispiel 2:

Mikrotropfenrückhalteanordnung in einem integriertem mikrofluidischen Bauelement Wie in Fig. 4 dargestellt, kann die Mikrotropfenrückhalteanordnung (1) in einem integriertem mikrofluidischen Bauelement realisiert werden, in dem eine Mikrotropfenrückhalteanordnung (1) einlas sseitig (e) in einem Mikrokanal (3) angeordnet ist, welcher in eine als Kapillarspalt ausgestalteten Speicherkammer (2) für Probetröpfchen einer vorgegebenen Größe einmündet und eine zweite Mikrotropfen rückhalteanordnung (1) auslassseitig (a) in einem Mikrokanal (3) angeordnet ist, welcher aus der Speicherkammer (2) entspringt, so dass die Speicherkammer (4) einlassseitig (e) und auslassseitig (a) durch die Mikrotropfenrückhalteanordnung (1) begrenzt wird, so dass das Trennen von Probenkomponenten durch Unterteilen derselben in Tröpfchen oder andere Komponenten, das Verstärken oder anderweitiges Reagieren der Komponenten innerhalb der Tröpfchen, das Detektieren der amplifizierten Komponenten oder Eigenschaften davon und / oder das Analysieren der resultierenden Daten ermöglicht wird.

Dabei wird die Funktionalität der Mikrotropfenrückhalteanordnung (1) durch die Flüssigkeitsvolumenströme, welche im Bauelement steuerbar sind, eingestellt, in dem zum Durchtritt von Luftblasen durch die Mikrotropfenrückhalteanordnung (1) geringe Volumenströme im Bereich von 0,1 bis 10 mm/s zum Zurückhalten von Probetropfen durch die Mikrotropfenrückhalteanordnung (1), mittlere Volumenströme im Bereich von 10 bis 100 mm/s zum mittigen Austreiben von Probetropfen durch die Mikrotropfenrückhalteanordnung (1) und hohe Volumenströme im Bereich von 100 bis 500 mm/s zum Austreiben von Luftblasen im mikrofluidischen Bauelement gemäß dem vorbekannten Stand der Technik eingestellt werden.

Ausführungsbeispiel 3:

Mikrotropfenrückhalteanordnung in einem integriertem mikrofluidischen Bauelement zur Bestimmung der Anzahl der gegen beta-Lactam- Antibiotika (Penicilline) resistenten Erreger in einer Probe und die Gewinnung der Erreger für eine nachfolgende mikrobiologische / molekularbiologische Analyse. Erreger mit einer Resistenz gegen beta-lactam-Antibiotika sezernieren das Enzym beta-Lactamase als ExoEnzym. Dieses bewirkt die Spaltung des beta-Lactam Ringes des Antibiotikums und damit eine Deaktivierung der antibakteriellen Wirkung dieses Wirkstoffes. Für die Durchführung der Bestimmung der der Anzahl der gegen beta- Lactam-Antibiotika resistenten Erreger in einer Probe und die Gewinnung der Erreger für eine nachfolgende mikrobiologische und/ oder molekularbiologische Analyse wird ein mikrofluidisches Bauelement gemäß Fig. 1 in einer integrierten Fluidanordnung verwendet.

Dabei wird eine Probe, enthaltend die zu untersuchenden Mikroorganismen, mit einem chromogenen beta-Lactamase Substrat (sigma Product ID: MAK221) versetzt und in eine Tropfensuspension überführt.

Bei Anwesenheit des Enzymes beta-Lactamase wird dieses Substrat gespalten und setzt einen Farbstoff frei. Die Tropfensuspension wird in der durch die Mikrotropfenrückhalteanordnung (1) begrenzten Kapillarspaltkammer (Speicherkammer) eingelagert, inkubiert und nach der Inkubation durch eine Mikrotropfenrückhalteanordnung (1) gemäß

Fig. 5 hindurchgeführt. Nach dem Hindurchtreten der einzelnen Tropfen werden diese optisch gemäß dem Stand der Technik untersucht / analysiert. Anhand der Bildung einer farbigen Spezies werden Tropfen, in denen sich Penicillin-resistente Mikroorganismen befinden anhand der Bildung des Farbstoffes identifiziert. Die ermittelte Anzahl positiver Tropfen (gefärbte Tropfen) dient als primärer diagnostischer Befund. Durch nachfolgendes Austreiben der Tropfen aus der Inkubationskammer und Sortieren werden die Tropfen mit positiver Färbung gewonnen und einer nachfolgenden mikrobiologischen oder molekularbiologischen Analyse zugeführt.

Ausführungsbeispiel 4

Mikrotropfenrückhalteanordnung in einem integriertem mikrofluidischen

Bauelement zur Durchführung einer Polymerasekettenreaktion (PCR)

Das System zur Polymerasekettenreaktion (PCR), welches mindestens zwei Mikrotropfenrückhalteanordnungen (1) enthält, dient dem Trennen von Probenkomponenten durch Unterteilen derselben in Tröpfchen, dem Verstärken oder anderweitiges Reagieren der Komponenten innerhalb der Tröpfchen, dem Detektieren der amplifizierten Komponenten oder Eigenschaften davon und / oder dem Analysieren der resultierenden Daten.

Das System umfasst einen Tröpfchengenerator, der zum Erzeugen von Tröpfchen konfiguriert ist, die Teile einer zu analysierenden Probe enthalten, wobei die Tröpfchen in einem nicht mischbaren Fluid (11) angeordnet sind, das eine Probenemulsion bildet, eine Heiz- und Kühlstation mit einem Fluideinlass und einem Fluidauslass , eine Detektionsstelle stromabwärts von der Heiz- und Kühlstation, einen Kanal, der einen kontinuierlichen Fluidweg vom Fluideinlass zum Fluidauslass der Heiz- und Kühlstation bildet, eine Pumpe zum Bewegen der Probenemulsion durch den Kanal, eine Steuerung, die programmiert ist, um einen Fluidtransport durch den Kanal zu betreiben, und einen Analysator, der konfiguriert ist, um Daten zu verarbeiten, die an der Erfassungsstation gesammelt werden.

Dabei kann ein Tröpfchenreservoir vorgesehen sein, wobei eine erste Fluidleitung den Tröpfchengenerator mit dem Tröpfchen reservoir verbindet, und eine zweite Fluidleitung, die das Tröpfchenreservoir mit dem Fluideinlass der Heiz- und Kühlstation verbindet. Ein Controller kann so programmiert sein, dass er den Tröpfchengenerator so einstellt, dass er die Tröpfchengröße und die Tröpfchenerzeugungsfrequenz basierend auf den an der Detektions stelle empfangenen Daten ändert.

Der mindestens eine Tröpfchengenerator, bildet eine Vielzahl von Emulsionen einschließlich Tröpfchen, die jeweils eine Probenpartition enthalten, die als eine Reaktionsmischung zur Amplifikation eines Nukleinsäureziels vorbereitet ist.

Das planare System zur Polymerasekettenreaktion ist durch seine Hohlräumen definiert, und hält /führt / leitet die Emulsionen.

Die Heiz- und Kühlvorrichtung dient dazu, die in den Hohlräumen angeordneten Emulsionen zu erhitzen / zu kühlen (meist zeitlich sequentiell), um eine Nukleinsäureamplifikation in den Tröpfchen zu induzieren.

Vermittels einer Detektionsanordnung, welche an der Detektions stelle positionierbar ist, dient dem Detektieren von Signalen aus den intakten Tröpfchen der Emulsionen, wobei eine Steuerung, die mit der Detektionsanordnung in Verbindung steht und programmiert ist, vorgesehen ist, um die Anwesenheit des Nukleinsäuretargets in einer Probe (falls vorhanden) basierend auf Signalen, die bei den intakten Tröpfchen detektiert werden, zu detektieren und zu analysieren.

Für eine Vielzahl der hier aufgezeigten Anwendungsbeispiele ist ein dem Assay nachgeschaltetes Sortieren für die Gewinnung von Tropfen und Tropfeninhalten mit selektierbaren Eigenschaften von höchster Bedeutung.

Für die Implementierung vollständiger Hochdurchsatz-Screening Verfahren ist die Gewinnung der identifizierten Hits für eine nachgeschaltete detaillierte Analyse und Verwertung fester Bestandteil des Workflows.

Die erfindungsgemäße multifunktionale Rückhaltestruktur eröffnet nunmehr die Möglichkeit, digital tropfenbasierte Assays auf nur einem Chip mit Sortierverfahren zu kombinieren und damit komplette Hochdursatz-Screening-Verfahren auf einen einzigen integrierten Lab- on-a-Chip-Bauelement zu implementieren.

Alle in der Beschreibung, den Ausführungsbeispielen und den nachfolgenden Ansprüchen dargestellten Merkmale können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination miteinander erfindungswesentlich sein.

Bezugszeichenliste

1 Mikrotropfenrückhalteanordnung

111 Rückhaltestruktur

10 zu analysierenden Probe

11 nicht mischbaren Fluid

15 Detektions stelle

16 Kanal

2 Speicherkammer

3 Mikrokanal

4 Durchlass a Fluidauslass

e Fluideinlass

aw auslaufende Wand

ew einlaufende Wand

w Wand

A erste Schnittebene

B zweite Schnittebene

C dritte Schnittebene x, y, z Raumkoordinaten

Transportrichtung (Flussrichtung)