Область техники

Изобретения относятся к клинической иммунологии и фармакологии, в частности, к модифицированным липополисахаридам эндотоксичных бактерий родов Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium и их комбинациям, а также к включающим их вакцинам и фармацевтическим композициям.

Предшествующий уровень техники

Липополисахариды (LPS) являются эндотоксинами грам-отрицательных бактерий и включают полисахаридный (0-PS) и липидный компоненты. Этот липидный компонент, также называемый липидом А, и определяет эндотоксические свойства липополисахаридов (Rietschel Е.Т., Kirikae Т., Schade F.U., Ulmer A.J., Hoist О., Brade H., Schmidt G., Mamat U., Grimmecke H.D., Kusumoto S. et al. The chemical structure of bacterial endotoxin in relation to bioactivity. Immunobiology, 1993, Apr; 187(3-5):169-190).

Полисахаридный компонент LPS, представленный О-специфическим полисахаридом - O-PS, построенным из повторяющихся олигосахаридньгх звеньев, присоединяется к олигосахариду кора, который, в свою очередь, связан с липидом A. LPS, в состав которых входят все три структурные части - O-PS, кор и липид А, называют S-LPS, т. к. он характерен для «гладких» (smooth) форм колоний микроорганизмов.

У некоторых бактерий, в том числе патогенных, O-PS в составе LPS отсутствует. Эти микроорганизмы, которые зачастую образуют

«шероховатые» (rough) колонии, продуцируют низкокомолекулярные LPS, так называемые R-LPS, в которых присутствует только олигосахарид кора, присоединенный к липиду А.

В настоящее время доказано, что O-PS, в силу уникальности своего строения, определяют иммуноспецифичность S-LPS и, как следствие, всего

микроорганизма в целом, причем во многих случаях специфические антитела к S-LPS, индуцируемые в организме хозяина в ответ на их появление, играют ключевую роль в его защите от бактериальной инфекции и обладают высоким протективным потенциалом.

Однако хорошо известно, что, помимо способности к активации адаптивного иммунитета, LPS даже в минимальных дозах весьма эндотоксичны, а в ответ на появление их в ощутимых количествах в макроорганизме может

возникнуть состояние эндотоксического шока, что препятствует

использованию LPS в качестве компонентов вакцинных и терапевтических препаратов.

Эндотоксический компонент LPS - липид А представляет собой, как правило, дисахарид, построенный из двух фосфорилированных остатков глюкозамина, каждый из которых N- и О-ацилирован (в положениях 3- и 3') четырьмя остатками 3-гидроксимиристиновой кислоты (ГМК), которые называют первичными. Два других остатка негидроксилированных высших жирных кислот (чаще всего лауриловой и миристиновой) О-ацилируют два из вышеуказанных остатков ГМК, которые называют вторичными. Таким образом, так называемый «классический» липид А содержит шесть остатков (четыре первичных и два вторичных) высших жирных кислот (Knirel Yu.A., Valvano М. A. Bacterial Lipopolysaccharides. Structure, Chemical Synthesis, Biogenesis and Interaction with Host Cells. Springer Wien New York, 2011, 440 pp.).

Известно, что LPS грам-отрицательных микроорганизмов, содержащие не «классический» липид А с шестью остатками высших жирных кислот, а модифицированный тем или иным способом липид А с меньшим их

количеством, обладают сниженным уровнем эндотоксичности. Очевидно, что снижение эндотоксичности S-LPS до клинически приемлемого уровня при сохранении их способности к индукции

специфических протективных антител к полисахаридным эпитопам

открывает принципиальную возможность использования

низкоэндотоксичных модифицированных S-LPS эндотоксичных бактерий - возбудителей актуальных инфекций, в качестве профилактических вакцин и лекарственных препаратов.

Исследования в направлении трансформации эндотоксичных LPS,

содержащих «классический» липид А, в низкоэндотоксичные производные, проводимые с помощью методов химической, ферментативной и

генетической детоксификации, начались уже более 20 лет тому назад.

Так, согласно патенту US 4, 912, 094, методом контролируемого щелочного гидролиза LPS, приводящим к селективному удалению β- гидроксимиристиновой кислоты, присоединённой сложноэфирной связью к восстанавливающему концу глюкозамина в положении 3, получены

пентаацильные производные R-LPS (включающие липид А с пятью

остатками жирных кислот) эндотоксичных бактерий -Salmonella enterica sv minnesota и Escherichia coli. При этом данные по снижению эндотоксичности модифицированных R-LPS весьма ограничены; в тесте токсичности для куриных эмбрионов отмечено снижение токсичности примерно лишь в 50 раз. Фармацевтические тесты оценки снижения токсичности R-LPS

(побочные реакции, пирогенность) не применялись.

Согласно патенту US 6, 482, 807 , методом генной инженерии получен пентаацильный LPS из генетически модифицированной рекомбинантной бактерии Neisseria meningitis со сниженной эндотоксичностью, посредством блокировки продукции клеткой гексаацильной формы LPS. Однако

полученный LPS демонстрировал незначительное снижение токсичности (по данным теста на продукцию TNFa in vitro наблюдалось только 100-кратное её снижение). Модифицированный штамм лишь в 7 раз отличался от исходного по снижению активности в LAL-тесте. Данные фармацевтического теста по оценке пирогенности препарата LPS в патенте не представлены. Препарат позиционирован в первую очередь как адъювант, но не как вакцинный антиген.

В настоящее время очевидно, что пентаацильные производные LPS

эндотоксичных бактерий сохраняют существенный уровень эндотоксичности для экспериментальных животных и, следовательно, не могут найти клинического применения в качестве компонентов фармацевтических препаратов.

Согласно патенту US 4, 929, 604, методом избирательного ферментативного гидролиза вторичных жирных кислот липидного компонента LPS

эндотоксичных бактерий под действием ацилоксиацилгидролаз получены их производные, содержащие, в основном, первичные остатки 3- гидроксимиристиновой кислоты. Однако удаление вторичных жирных кислот происходит неполно, и даже при максимальной длительности обработки ферментом удаляется до 80 - 90% вторичных жирных кислот. Таким образом, продуктом указанной ферментативной обработки является смесь тетраацильных производных LPS (включающих липид А с четырьмя остатками жирных кислот) с не вступившими в реакцию пента - и

гексаацильными производными LPS (включающими липид А с пятью и шестью остатками жирных кислот соответственно) эндотоксичных бактерий семейств Escherichia или Haemophilis, или Neisseria. При этом были

исследованы иммунобиологические свойства не тетраацильных производных S-LPS как таковых, а, соответственно, вышеуказанной смеси их с пента- и гексаацильными производными. Результаты исследований оказались неудовлетворительными: отмечено лишь 20-кратное снижение активности смеси модифицированных LPS в LAL-тесте по сравнению с исходным LPS. Снижение уровня пирогенности в тесте на кроликах, оцениваемое по индексу термального ответа, является незначительным (лишь в 2,5 - 3 раза). Оценка снижения кожного сенсибилизируещего действия максимально деацилированного LPS в реакции Шварцмана указана в тексте патента противоречиво (от 10- до 100- кратного снижения).

Смесь пента- и тетрааацильных производных R-LPS и S-LPS эндотоксичных бактерий Н. influenzae и В. pertussis получена также из генетически

модифицированных штаммов путём трансформации их ферментных систем (US 7,005,129 В1 ; WO 2006065139 А2). Однако полученные смеси

мутантных LPS обладают высокой остаточной эндотоксичностью и не могут быть использованы в качестве потенциальных иммуногенов для человека.

Таким образом, описанные в патентах методы энзиматической обработки LPS, приводящие к получению смеси тетра-, пента- и гексаацильных производных LPS эндотоксичных бактерий, не приводят к существенному снижению эндотоксичности LPS, что препятствует их клиническому применению в качестве компонента фармацевтических препаратов.

Уровень техники свидетельствует о том, что препараты модифицированных LPS из эндотоксичных бактерий, представляющие собой пентаацильные производные, либо комбинацию тетра- , пента- и гексаацильных

производных, ни в коей мере не отвечают критериям клинической

безопасности. По-видимому, по этой же причине авторами вышеуказанных патентов даже не проводились стандартные исследования иммуногенности препаратов в качестве кандидатных вакцин. Препараты модифицированных LPS рассматривались инвенторами, прежде всего, в качестве

иммуностимуляторов, поэтому изучение иммуногенности препаратов и оценка иммунного ответа по отношению к О-антигенному домену LPS также не проводились.

В связи с неудовлетворительным уровнем безопасности вышеописанных модифицированных LPS, образующихся в результате неэффективного деацилирования их липида А, данное направление исследований оказалось практически в тупике. Поэтому с конца прошлого века не были получены патенты и не опубликованы работы, посвященные получению других модифицированных LPS и, в частности, модифицированных S-LPS из актуальных эндотоксичных полевых штаммов (генетически

немодифицированных) бактерий и применению их в качестве потенциальных вакцинных препаратов для введения человеку. Таким образом, из поля зрения исследователей выпала сама принципиальная возможность

использования ди-, три- и тетраацильных производных S-LPS эндотоксичных бактерий в качестве вакцин. Эта область никогда ранее не становилась предметом целенаправленного практического интереса вакцинологов.

Исследования и, соответственно, патентование в области конструирования клинически применимых вакцинных препаратов трансформировались в иную парадигму, а именно использование элементов расщепления S-LPS - 0-PS, фрагмента O-PS-κορ с диглюкозамиными остатками или липидом А

полностью деацилированным гидразином в качестве специфических антигенов для конъюгации с белковыми носителями (US 7, 553, 490; Konadu Е., Shiloach J., Bryla D.A., Robbins J.B., Szu S.C. Synthesis, characterization and immunological properties in mice of conjugates composed of detoxified

lipopolysaccharide of Salmonella paratyphi A bound to tetanus toxoid with emphasis on the role of O-acetyls. Infect. Immun., 1996, July, 64(7): 2709-15; Pavliakova D., Moncrief J.S., Lyerly D.M., Schiffman G., Bryla D.A., Robbins J.B., Schneerson R. Clostridium difficile recombinant toxin A repeating units as a carrier protein for conjugate vaccines: studies of pneumococcal type 14,

Escherichia coli Kl and Shigella flexneri type 2a polysaccharides in mice. Infect. Immun., 2000, Apr., 68(4):2161-6).

Таким образом, из предшествующего уровня техники никоим образом не вытекают перспективы получения заявляемых модифицированных

липополисахаридов - индивидуальных ди- , три- и тетраацильных

производных S-LPS эндотоксичных бактерий и клинического применения их непосредственно в виде вакцинных препаратов, содержащих

модифицированные S-LPS по отдельности в качестве монокомпонентной или их комбинаций в качестве двух- и трёхкомпонентной активной субстанции соответственно.

Косвенное отношение к заявляемым объектам имеют сведения о

деацилированных LPS бактерии Porphyromonas gingivalis - компонента микрофлоры полости рта. Согласно патенту US 7, 622, 128, получены пента- , тетра-, триацильные LPS P. gingivalis и представлена принципиальная возможность использования пентаацильного и тетраацильного производного лишь в качестве иммуномодуляторов в составе соответствующих

композиций. При этом отсутствуют какие-либо данные, характеризующие их уровень безопасности и возможности их клинического использования.

P. gingivalis продуцирует LPS с весьма низкой эндотоксичностью и

пирогенностью (с 1000-кратным снижением способности к активации провоспалительных цитокинов и со 100-кратным снижением токсичности на галактозаминовой модели по сравнению с ЛПС из эндотоксичной бактерии Е. coli ), что объясняется, в первую очередь, особенностями структуры липида А.

P. gingivalis является возбудителем местной вялотекущей инфекции ротовой полости и использование её LPS в вакцинопрофилактике в качестве

протективного антигена при данной инфекции требует разработки

специальных подходов (Darveau R.P., Cunningham M.D., Bailey Т., Seachord С, Ratcliffe К., Bainbridge В., Dietsch М., Page R.C., Aruffo A. Ability of bacteria associated with chronic inflammatory disease to stimulate E-selectin expression and promote neutrophil adhesion. Infect. Immun., 1995, Apr.,

63(4):1311-7; Bainbridge B. and Darveau R. P. Porphyromonas gingivalis

Lipopolysaccharide: an Unusual Pattern Recognition Receptor Ligand for the Innate Host Defense System. Acta. Odontol. Scand., 2001, 59:131-8).

Показано, что по меньшей мере половина высших жирных кислот в липиде А LPS P. gingivalis имеют необычно разветвленную структуру и обнаруживают в своем составе нечетное число атомов углерода, что резко отличает данный LPS от LPS эндотоксичных бактерий, содержащих «классический» липид А. Ближайшими аналогами заявляемых объектов в части модифицированных S- LPS эндотоксичных бактерий являются, исключительно по формальным соображениям, технические решения по патенту US 4, 912, 094 и

WO 9514026 А1.

В необоснованно широких патентных формулах указанных документов общей структурной формулой охарактеризована большая группа

модифицированных S-LPS, R-LPS и модифицированных липидов А эндотоксичных бактерий, в то время как реально получены и исследованы в части иммунобиологических свойств в первом случае - только

пентаацильные производные R-LPS и липидов A S. enterica sv minnesota и Е. coli, а во втором - триацильные и тетраацильные производные только липидов А Е. coli, Haemophilis influenzae и Pseudomonas aeruginosa.

Если данные по патенту US 4, 912, 094 интерпретированы выше, то

содержащаяся в документе WO 9514026 А1 информация подлежит

подробному обсуждению.

Триацильные производные липидов А вышеуказанных бактерий оказались мощными индукторами ключевого медиатора эндотоксической реакции - TNF-α in vivo, а также другого про-воспалительного цитокина-1Ь-6 (данные патента-аналога RU 2154068 С2). В культуре PMN in vitro триацильные производные липида А индуцировали продукцию TNF-a даже более высокую по сравнению с LPS Westphal.

В этой связи заключение в документе WO 9514026 А1 и патентах-аналогах о низкой эндотоксичности препаратов модифицированных липидов А на основании их низкой активности в LAL- тесте (1000-кратное снижение) является необоснованным. Оценка эндотоксичности LPS только на

основании проведенного in vitro теста LAL, основанного на гелеобразующей активности белка Limulus, без учета результатов тестов in vivo, отражающих продукцию про-воспалительных цитокинов (концентрация в сыворотки крови, пирогенность, побочные реакции), является неполной. В указанных документах отсутствуют данные об уровне пирогенности и, следовательно, безопасности полученных препаратов.

Последующие публикации авторов указанных документов свидетельствуют о том, что три- и тетраацильные липиды А разрабатывались как компоненты противораковых иммунопрепаратов, обладающих существенной остаточной эндотоксичностью и уровнем безопасности, не приемлемым для

традиционных вакцинных препаратов (Brandenburg К., Lindner В., Schramm A., Koch М.Н J., Bauer J., Merkli A., Zbaeren С, Davies J.G., Seydel U.

Physicochemical characteristics of triacyl lipid A partial structure ОМ- 174 in relation to biological activity. Eur. J. Biochem., 2000, v. 267, pp. 3370-7).

Модифицированные липиды А не могут быть использованы в качестве вакцины (не содержат O-PS антигенов бактерий), а использование их в качестве дополнительного компонента - адъюванта, проблематично в силу отсутствия данных, подтверждающих их низкую пирогенность.

Совершенно неожиданными в свете вышеизложенного оказались результаты сравнительного исследования индукции in vivo провоспалительного

цитокина и медиатора эндотоксической реакции TNFa, вызываемой

триацильным липидом А из E.coli ОМ- 174 и, соответственно, ди- , три- и тетраацильными S-LPS эндотоксичных бактерий, проведенные авторами настоящего документа и представленные в Примере 1.

В отличие от модифицированных липидов А, соответствующие

модифицированные S-LPS эндотоксичных бактерий оказались слабыми индукторами медиаторов эндотоксического шока и обнаружили низкую пирогенность и эндотоксичность для лабораторных животных и человека. Эти оригинальные результаты вносят определенные коррективы в

общепринятые представления о вкладе полисахаридной составляющей в иммунобиологические свойства S-LPS, а также позволяют установить корреляцию между глубиной модификации S-LPS эндотоксичных бактерий и оптимальным соотношением уровней их безопасности и иммуногенности, открывающем перспективы их клинического применения. Раскрытие изобретений

Задачами заявляемых изобретений являются:

(i) получение индивидуальных (без примеси пента- и гексаацильных

производных) модифицированных S-LPS эндотоксичных бактерий (ди-, три- и тетраацильных производных) и их комбинаций;

(ii) разработка на основе указанных объектов вакцин и фармацевтических композиций, содержащих модифицированные S-LPS по отдельности в качестве монокомпонентной или их комбинаций в качестве двух- и

трёхкомпонентной активной субстанции соответственно.

Техническими результатами, обеспечиваемыми заявляемыми изобретениями, являются:

(a) высокая степень безопасности (при парентеральном введении

добровольцам индивидуальных модифицированных S-LPS или их

комбинаций в разовых дозах до 200 мкг отсутствуют эндотоксические реакции - озноб, лихорадка, тахикардия, повышение артериального

давления);

(b) низкая пирогенность (1000 - 10000-кратное снижение пирогенной дозы индивидуальных модифицированных S-LPS и их комбинаций в тесте пирогенности на кроликах по сравнению с классическим LPS Westphal;

слабые, до 37, 6 °С, температурные реакции добровольцев при

парентеральном введении указанных препаратов в разовых дозах до 200 мкг);

(c) противошоковая активность (предварительное введение индивидуальных модифицированных S-LPS или их комбинаций обеспечивает 80%-ную выживаемость животных при эндотоксическом шоке, вызванном введением летальных доз эндотоксина; кроме того, введение указанных препаратов обусловливает коррекцию септического шока и замедляет развитие

перитонита на 18-30 часов);

(d) высокая эффективность и специфичность (иммунизация добровольцев и экспериментальных животных индивидуальными модифицированными S- LPS или их комбинациями обусловливает продукцию высоких уровней LPS- специфических и О-антиген-специфических IgG, IgA, IgM; четырёхкратную сероконверсию антител и прямую защиту животных на моделях

экспериментальных инфекций);

(e) широкий спектр действия (разработка комбинированных поливалентных вакцин, включающих индивидуальные модифицированные S-LPS или их комбинации, на основе двух или нескольких серотипов);

(f) синергетический эффект, обнаруживаемый комбинациями

модифицированных S-LPS в части снижения пирогенности и усиления иммуногенности;

(g) хорошие химико-фармацевтические характеристики как индивидуальных модифицированных S-LPS, так и их комбинаций (термостабильность, длительный срок хранения, резистентность к воздействию факторов внешней среды).

Впервые получены индивидуальные (без примеси пента- и гексаацильных производных) ди-, три- и тетраацильные S-LPS эндотоксичных бактерий, а также их комбинации и исследованы их иммунобиологические, физико- химические и химико-фармацевтические свойства.

Для уточнения объёма притязаний в части источников получения заявляемых объектов следует определиться с понятием «эндотоксичные бактерии» родов Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria,

Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium.

Такими бактериями следует называть штаммы природных, генетически не модифицированных, грам-отрицательных бактерий, полученные от больных инфекционными заболеваниями или иных источников внешней среды, продуцирующие эндотоксичные агонистические формы молекул LPS, которые характеризуются высокой токсичностью и пирогенностью в свободном или ассоциированном с клеткой виде, высокой степенью

ацилирования липида А (пента- или гексаацилированным). Течение

инфекционного процесса, вызванного эндотоксичным штаммом бактерии - активным продуцентом эндотоксичного LPS, отягощено выраженными температурными реакциями, лихорадкой и другими проявлениями синдрома системной воспалительной реакции (SIRS).

С другой стороны, низкоэндотоксичные грам-отрицательные бактерии природного происхождения обладают в 100 - 1000 раз меньшей

эндотоксичностью. Так, для достижения сравнимых уровней активации рецепторов эпителиальных клеток, PMN,TNF- a, IL-6, необходимо в 100 - 1000 раз больше клеток низкоэндотоксичных бактерий {Helicobacter pylori, P.gingivalis, Treponema pallidum) по сравнению с количеством клеток эндотоксичных бактерий (Е. coli) (Darveau R.P., Cunningham M.D., Bailey Т., Seachord С, Ratcliffe К., Bainbridge В., Dietsch М., Page R.C., Aruffo A. Ability of bacteria associated with chronic inflammatory disease to stimulate E-selectin expression and promote neutrophil adhesion. Infect. Immun., 1995, Apr.,

63(4):1311-7).

Низкоэндотоксичные бактерии либо являются авирулентными, либо вызывают вялотекущие, часто субклинические, формы инфекций на слизистых, за что их иногда называют «бактерии - невидимки». LPS низкоэндотоксичных бактерий всегда имеет структурные особенности, обусловливающие его низкую эндотоксичность-низкая степень

ацилирования липида А (три- или тетраацилирование),

дефосфорилированные формы липида А, уникальная структура жирных кислот (Alexander С, Rietschel Е.Т. Bacterial lipopolysaccharides and innate immunity. J. Endotoxin Res., 2001, v.7, pp. 167-202.,).

Получен модифицированный липополисахарид (S-LPS) эндотоксичных бактерий, включающий О-специфический полисахарид, состоящий из одного или более повторяющихся звеньев, олигосахарид кора и

полностью О-деацилированный липид А, содержащий два ацильных остатка.

Заявленный липополисахарид обладает не менее 85%-ной степенью очистки (Пример 2В), вызывает защиту от бактерий рода Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium и их комбинаций путём индукции синтеза специфических антибактериальных IgG, IgA, IgM антител в организме млекопитающих и человека (Пример 2D, 3F), обладает противошоковой активностью при септическом и/или эндотоксическом шоке, является модулятором реакций иммунной системы млекопитающих, включая человека (Примеры 3F, 4С), и апирогенен для кролика в дозе до 100 мкг/кг веса в тесте пирогенности на кроликах (Пример 2С).

Получен модифицированный липополисахарид (S-LPS) эндотоксичных бактерий, включающий О-специфический полисахарид, состоящий из одного или более повторяющихся звеньев, олигосахарид кора и частично О-деацилированный липид А, содержащий три ацильных остатка.

Заявленный липополисахарид обладает не менее 80%-ной степенью очистки (Пример 2В), вызывает защиту от бактерий рода Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium и их комбинаций путём индукции синтеза специфических антибактериальных IgG, IgA, IgM антител в организме млекопитающих, включая человека (Примеры 2D, ЗС, 3F), обладает

противошоковой активностью при септическом и/или эндотоксическом шоке (Пример 3D), является модулятором реакций иммунной системы

млекопитающих, включая человека (Примеры 3F, 4С), и апирогенен для кролика в дозе до 100 мкг/кг веса в тесте пирогенности на кроликах (Пример 2С).

Получен модифицированный липополисахарид (S-LPS) эндотоксичных бактерий, включающий О-специфический полисахарид, состоящий из одного или более повторяющихся звеньев, олигосахарид кора и частично О-деацилированный липид А, содержащий четыре ацильных остатка.

Заявленный липополисахарид обладает не менее 80%-ной степенью очистки (Пример 2В), вызывает защиту от бактерий рода Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium и их комбинаций путём индукции синтеза специфических антибактериальных IgG, IgA, IgM антител в организме млекопитающих, включая человека (Пример 2D), обладает противошоковой активностью при септическом и/или эндотоксическом шоке, является модулятором реакций иммунной системы млекопитающих, включая человека, и апирогенен для кролика в дозе до 100 мкг/кг веса в тесте пирогенности на кроликах (Пример 2С).

Получена комбинация модифицированных липополисахаридов (S-LPS) эндотоксичных бактерий, включающая диацильные и триацильные

производные в любых соотношениях. Заявленная комбинация обнаруживает синергетический эффект в части усиления иммуногенности по сравнению диацильным производным липополисахарида (Пример 2D), вызывает защиту от бактерий рода Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium и их комбинаций путём индукции синтеза специфических антибактериальных IgG, IgA, IgM антител в организме млекопитающих, включая человека (Пример 2D), обладает противошоковой активностью при септическом и/или эндотоксическом шоке, является модулятором реакций иммунной системы млекопитающих, включая человека (Пример ЗС), и апирогенна для кролика в дозе до 100 мкг/кг веса в тесте пирогенности на кроликах (Пример 2С).

Получена комбинация модифицированных липополисахаридов (S-LPS) эндотоксичных бактерий, включающая диацильные и тетраацильные производные в любых соотношениях. Заявленная комбинация обнаруживает синергетический эффект в части усиления иммуногенности по сравнению диацильным производным липополисахарида (Пример 2D), вызывает защиту от бактерий рода Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium и их комбинаций путём индукции синтеза специфических антибактериальных IgG, IgA, IgM антител в организме млекопитающих, включая человека (Пример 2D), обладает противошоковой активностью при септическом и/или эндотоксическом шоке, является модулятором реакций иммунной системы млекопитающих, включая человека, и апирогенна для кролика в дозе до 100 мкг/кг веса в тесте пирогенности на кроликах (Пример 2С).

Получена комбинация модифицированных липополисахаридов (S-LPS) эндотоксичных бактерий, включающая триацильные и тетраацильные производные в любых соотношениях. Заявленная комбинация обнаруживает синергетический эффект в части снижения пирогенности по сравнению с тетраацильным производным липополисахарида, вызывает защиту от бактерий рода Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium и их комбинаций путём индукции синтеза специфических антибактериальных IgG, IgA, IgM антител в организме млекопитающих, включая человека (Пример 2D), обладает противошоковой активностью при септическом и/или эндотоксическом шоке, является модулятором реакций иммунной системы млекопитающих, включая человека, и апирогенна для кролика в дозе до 100 мкг/кг веса в тесте пирогенности на кроликах (Пример 2С).

Получена комбинация модифицированных липополисахаридов (S-LPS) эндотоксичных бактерий, включающая диацильные, триацильные и

тетраацильные производные в любых соотношениях. Заявленная комбинация обнаруживает синергетический эффект в части усиления иммуногенности по сравнению диацильным и триацильным производным липополисахарида (Пример 2D, 3F), вызывает защиту от бактерий рода Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium и их комбинаций путём индукции синтеза специфических антибактериальных IgG, IgA, IgM антител в организме млекопитающих, включая человека (Примеры 2D, 3F, ЗС), обнаруживает противошоковую активность при септическом и/или эндотоксическом шоке (Пример 3D), является модулятором реакций иммунной системы

млекопитающих, включая человека (Примеры 3F, 4В, 4С), и апирогенна для кролика в дозе до 100 мкг/кг веса в тесте пирогенности на кроликах (Пример 2С). Разработаны вакцины для профилактики и/или лечения инфекционных заболеваний, вызываемых грам-отрицательными бактериями.

Заявленная вакцина включает профилактически и/или терапевтически эффективное количество модифицированного липополисахарида (S-LPS) эндотоксичных бактерий - его диацильного или триацильного, или

тетраацильного производного. Заявленная вакцина вызывает защиту от бактерий рода Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium и их комбинаций путём индукции синтеза специфических антибактериальных IgG, IgA, IgM антител в организме млекопитающих, включая человека

(Примеры ЗС, 3F), обеспечивает профилактику и/или коррекцию течения септического и эндотоксического шока (Пример 3D). Модифицированные липополисахариды в заявленной вакцине являются апирогенными для кролика в дозе до 100 мкг/кг веса в тесте пирогенности на кроликах (Пример ЗВ).

Заявленная вакцина может включать фармацевтически приемлемые добавки, в качестве которых могут быть использованы стабилизаторы рН или консерванты, или адъюванты, или изотонизирующие агенты, или их

комбинации (Пример ЗА). Кроме того, вакцина может включать

модифицированный липополисахарид как в неконъюгированной, так и в конъюгированной форме. При этом вакцина, включающая конъюгированную форму липополисахарида, дополнительно содержит белковый носитель, а именно дифтерийный анатоксин или столбнячный анатоксин, или

экзопротеин А P. aeruginosa, или другие белки (Пример ЗН, 31).

Заявленная вакцина включает профилактически и/или терапевтически эффективное количество комбинации модифицированных

липополисахаридов (S-LPS) эндотоксичных бактерий - диацильных и триацильных производных или диацильных и тетраацильных производных, или триацильных и тетраацильных производных, или диацильных,

триацильных и тетраацильных производных. Заявленная вакцина вызывает защиту от бактерий рода Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella,

Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya,

Corynobacterium и их комбинаций путём индукции синтеза специфических антибактериальных IgG, IgA, IgM антител в организме млекопитающих, включая человека (Примеры ЗС, 3F), обеспечивает профилактику и/или коррекцию течения септического и эндотоксического шока (Пример 3D). Комбинация модифицированных липополисахаридов в заявленной вакцине является апирогенной для кролика в дозе до 100 мкг/кг веса в тесте

пирогенности на кроликах (Пример ЗВ).

Заявленная вакцина может включать фармацевтически приемлемые добавки, в качестве которых могут быть использованы стабилизаторы рН, или консерванты, или адъюванты, или изотонизирующие агенты или их

комбинации (Пример ЗА). Кроме того, вакцина может включать

модифицированные липополисахариды как в неконъюгированной, так и в конъюгированной форме. При этом вакцина, включающая конъюгированную форму липополисахаридов, дополнительно содержит белковый носитель, а именно дифтерийный анатоксин или столбнячный анатоксин, или

экзопротеин А P. aeruginosa, или другие белки (Пример 3G).

Следует отметить, что заявляемые вакцины на основе как индивидуальных S-LPS, так и их комбинаций, одновременно могут индуцировать наиболее широкий спектр антител к различным антигенным детерминантам различных доменов молекулы LPS (O-PS, верхний кор, нижний кор), что может рассматриваться как важный фактор эффективности протективного

иммунитета.

Кроме того, показана возможность создания комбинированных вакцин, в которых каждый из вариантов моновакцины содержит антиген, специфичный в отношении наиболее эпидемически значимого вида грам-отрицательных бактерий (Пример 31).

Разработана фармацевтическая композиция, включающая эффективное количество модифицированного липополисахарида (S-LPS) эндотоксичных бактерий - его диацильного или триацильного, или тетраацильного производного. Заявленная фармацевтическая композиция является

модулятором реакций иммунной системы млекопитающих и человека

(Пример 4С); включённый в её состав модифицированный липополисахарид является апирогенным для кролика в дозе до 100 мкг/кг веса в тесте

пирогенности на кроликах (Пример 2С).

Заявленная фармацевтическая композиция может включать фармацевтически приемлемые целевые добавки, в качестве которых могут быть использованы консерванты или стабилизаторы, или растворители, или их комбинации. Заявленная фармацевтическая композиция обладает широким спектром фармакологической активности и обнаруживает, в частности, эффективное лечебное противовирусное действие против инфекции, вызываемой вирусом гриппа A H1N1 (Пример 4В). Кроме того, фармацевтическая композиция обнаруживает толерогенный эффект для коррекции патологических

состояний, связанных с повышенной продукцией про-воспалительных цитокинов (Пример 4С).

Разработана фармацевтическая композиция, включающая эффективное количество комбинации модифицированных липополисахаридов

эндотоксичных бактерий - диацильных и триацильных производных или диацильных и тетраацильных производных, или триацильных и

тетраацильных производных, или диацильных, триацильных и

тетраацильных производных. Заявленная фармацевтическая композиция является модулятором реакций иммунной системы млекопитающих и человека (Пример 4В, 4С); включённые в её состав комбинации

модифицированных липополисахаридов являются апирогенными для кролика в дозе до 100 мкг/кг веса в тесте пирогенности на кроликах (Пример 2С).

Заявленная фармацевтическая композиция может включать фармацевтически приемлемые целевые добавки, в качестве которых могут быть использованы консерванты или стабилизаторы, или растворители, или их комбинации. Заявленная фармацевтическая композиция обладает широким спектром фармакологической активности и обнаруживает, в частности,

эффективное лечебное противовирусное действие против инфекции, вызываемой вирусом гриппа A H1N1 (Пример 4В). Кроме того,

фармацевтическая композиция обнаруживает толерогенный эффект для коррекции патологических состояний, связанных с повышенной продукцией про-воспалительных цитокинов (Пример 4С).

Следует также отметить, что несомненным преимуществом заявленных препаратов (вакцин и фармкомпозиций) по сравнению с препаратами- аналогами иных классов являются их хорошие химико-фармацевтические характеристики: термостабильность, широко известная для молекул LPS, обусловливающая возможность длительного срока их хранения,

относительная резистентность к воздействию факторов внешней среды.

Заявлено также применение модифицированного липополисахарида (S-LPS) эндотоксичных бактерий - его диацильного или триацильного, или

тетраацильного производного для производства фармацевтического средства. При этом модифицированный липополисахарид вызывает защиту от

бактерий рода Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium и их комбинаций путём индукции синтеза специфических антибактериальных IgG, IgA, IgM антител в организме млекопитающих и человека (Пример 2D, ЗС), обеспечивает профилактику и/или коррекцию течения септического и эндотоксического шока (Пример 3D), является модулятором реакций

иммунной системы млекопитающих, включая человека (Пример 4С), и апирогенен для кролика в дозе до 100 мкг/кг веса в тесте пирогенности на кроликах (Пример ЗВ).

Фармацевтическое средство предназначено для парентерального,

перорального, ректального, интравагинального, накожного, сублингвального и аэрозольного введения млекопитающим, включая человека. Заявлено применение комбинаций модифицированных липополисахаридов (S-LPS) эндотоксичных бактерий - диацильных и триацильных производных или диацильных и тетраацильных производных, или триацильных и

тетраацильных производных, или диацильных, триацильных и

тетраацильных производных для производства фармацевтического средства. При этом комбинации модифицированных липополисахаридов вызывают защиту от бактерий рода Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella,

Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya,

Corynobacterium и их комбинаций путём индукции синтеза специфических антибактериальных IgG, IgA, IgM антител в организме млекопитающих, включая человека (Примеры 2D, 3F), обнаруживают противошоковую активность при септическом и/или эндотоксическом шоке (Примеры 3D), являются модуляторами реакций иммунной системы млекопитающих, включая человека (Примеры 3F, 4В, 4С), и апирогенны для кролика в дозе до 100 мкг/кг веса в тесте пирогенности на кроликах (Пример 2 С).

Фармацевтическое средство предназначено для парентерального,

перорального, ректального, интравагинального, накожного, сублингвального и аэрозольного введения млекопитающим, включая человека.

Заявлено применение модифицированного липополисахарида (S-LPS) эндотоксичных бактерий - его диацильного или триацильного, или

тетраацильного производного в качестве иммуностимулирующего носителя для производства вакцины против бактериальных, вирусных, или иных инфекций.

При этом модифицированный липополисахарид конъюгирован с

протективным антигеном или гаптеном, которые предпочтительно имеют синтетическую или белковую, или полисахаридную природу. Модифицированный липополисахарид является апирогенным для кролика в дозе до 100 мкг/кг веса в тесте пирогенности на кроликах (Пример 2С).

Заявлено применение комбинаций модифицированных липополисахаридов (S-LPS) эндотоксичных бактерий - диацильных и триацильных производных или диацильных и тетраацильных производных, или триацильных и тетраацильных производных, или диацильных, триацильных и

тетраацильных производных в качестве иммуностимулирующего носителя для производства вакцины против бактериальных, вирусных, или иных инфекций.

При этом модифицированные липополисахариды конъюгированы с

протективным антигеном или гаптеном, которые предпочтительно имеют синтетическую или белковую, или полисахаридную природу.

Комбинации модифицированных липополисахаридов являются

апирогенными для кролика в дозе до 100 мкг/кг веса в тесте пирогенности на кроликах (Пример 2С).

Краткое описание чертежей

Изобретения иллюстрируются следующими фигурами.

На Фиг.1 представлены графики продукции in vivo медиатора

эндотоксической реакции TNF- а и провоспалительного цитокина IL-6 в сыворотке крови после внутривенного введения мышам триацильного липида А Е. coli - ОМ174 (А и В) и LPS Westphal Е. coli 0:111В4 (С), по данным патента RU 2154068. При этом на оси ординат представлены значения концентраций TNF- а (в пг/мл) и значения концентраций IL-6 (в нг/мл). На оси абсцисс (А и В) указаны значения доз введения мышам препарата ОМ174 (в мг/кг). На оси абсцисс (С) указаны значения доз введения мышам LPS (в мг/мл; положительный контроль) и физраствора

(0,85% - ный раствор NaCl; отрицательный контроль).

Сплошные линии представляют собой линии экстраполяции при значениях доз ОМ174 : 0,20; 2,00; 2,01; 3,40 и 28,10 (А и В) и значениях доз LPS

Westphal Е. coli О:111В4 : 0,002; 0,020; 0,200 и 2,000 (С).

На Фиг.2 представлен ¹³ С-ЯМР-спектр деацилированного S-LPS S. jlexneri

2а.

На Фиг.З представлены фотографии окрашенных серебром треков, полученных в результате SDS-электрофореза в полиакриламидном геле образцов исходного LPS Westphal (А) и модифицированного S-LPS (В) S. flexneri 2a (1 A, IB), E. coli 0:55 (2A, 2B), K. pneumoniae (ЗА, 3B), S. enterica sv typhi O:901 (4A, 4B).

На Фиг.4 представлен ESI-MS масс-спектр липида А, полученного из диацильного S-LPS S. flexneri 2a.

На Фиг.5 представлен ESI-MS масс-спектр липида А, полученного из триацильного S-LPS S. flexneri 2a.

На Фиг.6 представлен ESI-MS масс-спектр липида А, полученного из тетраацильного S-LPS S. flexneri 2a.

1

На Фиг.7 представлен С-ЯМР-спектр предварительно деацилированного S-LPS S. enterica sv typhi 0:901.

На Фиг.8 представлены диаграммы продукции IgG антител (15 день) после первичной (А) и вторичной (В) иммунизации мышей препаратами 2-acLPS,

3- acLPS и 4-acLPS S. flexneri 2a, а также их комбинаций (2-acLPS + 3-acLPS +

4- acLPS), (3-acLPS + 4-acLPS), (2-acLPS + 3-acLPS) и (2-acLPS + 4-acLPS) при массовом соотношении компонентов 1 : 1 : 1, 3: 1, 1 : 1 и З: 1 соответственно, и препаратом LPS Westphal S. flexneri 2a, в дозе 25 мкг на мышь. На оси ординат указаны значения титра разведения сыворотки.

На Фиг.9 представлены диаграммы продукции IgG антител (15 день) после первичной (А) и вторичной (В) иммунизации мышей препаратами 2-acLPS,

3- acLPS и 4-acLPS S. enterica sv typhi 0:901, а также их комбинаций (2-acLPS + 3-acLPS + 4-acLPS), (3-acLPS + 4-acLPS), (2-acLPS + 3-acLPS) и (2-acLPS +

4- acLPS) при массовом соотношении компонентов 1 : 1 : 1 , 3: 1 , 1 : 1 и З: 1 соответственно, и препаратом LPS Westphal S. enterica sv typhi 0:901, в дозе 25 мкг на мышь. На оси ординат указаны значения титра разведения сыворотки.

На Фиг.10 представлены диаграммы продукции IgG антител ( 15 день) после первичной (А) и вторичной (В) иммунизации мышей препаратами 2-acLPS и 3-acLPS К. pneumoniae , а также комбинации (2-acLPS + 3-acLPS + 4-acLPS) при массовом соотношении компонентов 1 : 1 : 1 , и препаратом LPS Westphal К. pneumoniae, в дозе 25 мкг на мышь. На оси ординат указаны значения титра разведения сыворотки.

На Фиг.1 1 представлены диаграммы продукции IgG антител ( 15 день) после первичной (А) и вторичной (В) иммунизации мышей препаратами 2-acLPS,

3- acLPS и 4-acLPS Е. coli 0:55, а также их комбинаций (2-acLPS + 3-acLPS +

4- acLPS), (3-acLPS + 4-acLPS), (2-acLPS + 3-acLPS) и (2-acLPS + 4-acLPS) при массовом соотношении компонентов 1 : 1 : 1, 3: 1, 1 : 1 и З: 1 соответственно, и препаратом LPS Westphal Е. coli 0: 55, в дозе 25 мкг на мышь. На оси ординат указаны значения титра разведения сыворотки.

На Фиг.12 представлены диаграммы продукции IgG антител ( 15 день) после первичной (А) и вторичной (В) иммунизации мышей коньюгатами Vi- антигена и столбнячного анатоксина (CAT) с иммуностимулирующим носителем - комбинацией (2-acLPS + 3-acLPS + 4-acLPS) S. enterica sv typhi O:901 при массовом соотношении компонентов 1 : 1 : 1, а также чистых Vi- антигена и CAT, в дозе 25 мкг полисахарида или 20 мкг белка на мышь. На оси ординат указаны значения титра разведения сыворотки.

На Фиг.13 представлены диаграммы продукции IgG антител (15 день) после первичной (А) и вторичной (В) иммунизации мышей поливалентной

дизентерийно-брюшнотифозно-эш� �рихиозной вакциной в дозе 100 мкг на мышь, а также отдельными её компонетами - комбинацией (2-acLPS + 3- acLPS + 4-acLPS) в массовом соотношении 1 : 1 : 1 , 5". flexneri 2а или S. sonnei, или S. enterica sv typhi О:901, или Е. coli 0:55, в дозе 25 мкг на мышь. На оси ординат указаны значения титра разведения сыворотки.

На Фиг.14 представлены графики выживаемости двух групп мышей, инфицированных дозой LD100 вирулентного штамма вируса гриппа A H1 N1.

Лучшие варианты осуществления изобретений

Пример 1.

Индукция in vivo медиатора эндотоксической реакции TNF- а после внутривенного (в/в) введения мышам модифицированных S-LPS и модифицированных липидов А эндотоксичных бактерий

Согласно данным патента RU 2154068, триацильные и тетраацильные липиды А Е. coli, Н. influenzae и P. aeruginosa являются мощными

индукторами медиатора эндотоксической реакции-TNF-a. Так,

экстраполированные из графиков Фиг. 1 (А, В, С) данные относительно продукции in vivo TNF-a в сыворотке после в/в введения мышам

триацильного липида A (3-acLA) Е. coli - ОМ- 174 и LPS Westphal Е. coli - О:111В4, представлены в табл. ЬОбнаружены всего лишь 10-кратные отличия по индукции TNF-α in vivo между триацильным липидом А Е. coli ОМ- 174 и эндотоксином коммерческого производства LPS Westphal Е. coli 0:111 В4, что свидетельствует о существенной эндотоксичности

триацильного липида А Е. coli, исключающей его использование как в качестве вакцины, так и в качестве вакцинного компонента (адъюванта). Таблица 1

Продукция in vivo медиатора эндотоксической реакции TNF- а в сыворотке крови после в/в введения мышам триацильного липида А Е. coli - ОМ 174 и LPS Westphal Е. coli 0: 1 11В4 , по данным патента RU 2154068

Сравнительное исследование индукции in vivo медиатора эндотоксической реакции TNF-α после в/в введения мышам диацильных S-LPS (2-acLPS), триацильных S-LPS (3-acLPS), тетраацильных S-LPS (4-acLPS) и,

соответственно, диацильных липидов A (2-acLA), триацильных липидов А (3-acLA), тетраацильных липидов A (4-acLA), полученных из актуальных энтеробактерий S.flexneri 2а, S. enterica sv typhi 0:901 , Е. coli 0:55,

К. pneumoniae, выявило существенные различия в концентрации цитокина в сыворотке животных. Полученные данные представлены в табл. 2, при этом модифицированные S-LPS и липиды указанных бактерий получали согласно Примеру 2А. Содержание TNF-α в сыворотках крови мышей определяли с помощью тест системы Quantikine Mouse TNF-а/ TNFSF1A (R&D Systems, USA) методом твердофазного ИФА согласно стандартной методике производителя. Кровь у животных забирали через 90 минут после введения. Таблица 2

Концентрация TNF-α (в пг/мл) в сыворотке через 2 часа после в/в введения мышам препаратов модифицированных S-LPS и модифицированных

Представленные в табл.2 данные свидетельствуют, что, в отличие от модифицированных липидов А, соответствующие модифицированные S-LPS энтеробактерий являются слабыми индукторами TNF-α - медиатора

эндотоксического шока и могут быть использованы в качестве вакцинных препаратов.

Пример 2

Получение и характеристика индивидуальных модифицированных S-LPS эндотоксичных бактерий и их комбинаций

А. Получение индивидуальных модифицированных S-LPS и их комбинаций Культуру бактерий S. flexneri 2а получали путём глубинного

культивирования в жидкой питательной среде. Отделение бактериальных клеток от жидкой фазы осуществляли с помощью проточной центрифуги. Полученные влажные клетки промывали сначала физраствором, далее водой, а затем лиофилизовали.

20 г сухих бактериальных клеток подвергали экстракции методом Вестфаля (Westphal О., Luderitz О. Chemische Erforschung von Lipopolysacchariden Gram-negativer Bakterien. Angew. Chemie., 1954, vol. 66, pp.407- 17) горячим 45%-ным водным фенолом при 68-70°С; из водного слоя после

последовательных диализа и лиофилизации получали 960 мг неочищенного LPS, который растворяли в 0,05 М трис-буфере, рН = 7,2, содержащем 0,01 мас.% СаС1 ₂ и MgCl ₂ , добавляли RNA-азу и DNA-азу в количествах 100 мкг/мл и 10 мкг/мл соответственно, и через 16 часов перемешивания при 37°С реакционную смесь обрабатывали протеиназой К (20 мкг/мл) в течение 2-х часов при температуре 55°С. Полученный раствор подвергали диализу с использованием установки для ультрафильтрации Владисарт с пределом прохождения мембраны 50 kDa.

Сконцентрированный после диализа раствор лиофилизировали и получали 530 мг очищенного LPS, содержащего не более 2-х мас.% белков,

определяемых методом Бредфорда (Bradford М.М. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 1976, vol. 72, pp. 248-54), и не более 2-х мас.% нуклеиновых кислот, определяемых методом Спирина (Спирин А.С. Спектрофотометрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот. Биохимия, 1958, т. 23, ΝΩ 4, с. 656).

Полученный LPS охарактеризован данными SDS-гель электрофореза, которые демонстрируют «классическую» картину с набором правильно чередующихся полос, каждая из которых соответствует молекулам S-LPS с определенным количеством повторяющихся звеньев в О-специфической полисахаридной цепи, причем наиболее быстро мигрирующая (самая нижняя) зона соответствует R-LPS (Фиг.З 1А).

LPS, выделенный из сухих бактериальных клеток S. flexneri 2а, растворяли в водном гидроксиде аммония, полученный раствор перемешивали на магнитной мешалке и охлажденную до 5-10°С реакционную смесь

нейтрализовали 10%-ной соляной кислотой; полученный раствор выливали при перемешивании в 8-10 кратный объем этилового спирта, выпавший осадок отделяли центрифугированием, затем процедуру высаживания повторяли еще два раза, полученный осадок растворяли в спирте, после чего полученный раствор лиофилизировали. В результате получали чистый частично деацилированный S-LPS, что подтверждалось данными

электрофореза (Фиг.З; 1 А). Варьируя условия щелочной деградации LPS S. flexneri 2а, в частности, температуру и продолжительность реакции омыления, а также концентрацию гидроксида аммония, получали частично деацилированные S-LPS, содержащие в липидном компоненте два или три, или четыре остатка высшей жирной кислоты (ди-, три- и тетраацильные производные - 2-acLPS, 3-acLPS и 4-acLPS).

В. Структура, состав и физико-химические свойства индивидуальных модифицированных S-LPS

Данные о жирнокислотном составе были получены, исходя из анализа липида А каждого из S-LPS, которые были выделены из каждого S-LPS с помощью мягкого гидролиза (1 %-ная АсОН, 100 град., 1 час). На Фиг. 4, Фиг. 5 и Фиг. 6 представлены типичные масс-спектры липидов А, полученных из деацилированных S-LPS S. fiexneri 2а. Характеристическими в масс-спектрах являются сигналы с m/z 871, 1053 и 1279 (без учёта долей m/z). Эти мажорные в каждом спектре сигналы отвечают, соответственно, ди- (Фиг.4), три- (Фиг.5) и тетраацильным (Фиг.6) производным липида А. Необходимо отметить полное отсутствие в масс-спектрах деацилированных липидов А сигналов пента- и гексаацильных (с m/z 1506 и 1716

соответственно) производных, интенсивность которых в спектрах липида А исходных S-LPS была очень высока.

Для оценки соотношения мажорного и минорного/минорных компонентов в полученных препаратах деацилированных S-LPS измеряли интенсивность соответствующих сигналов в масс-спектрах, причем учитывалась

интенсивность пиков, соответствующих не только моно-, но и

дифосфорилированным производным. Так, в случае диацильного S-LPS содержание основного вещества составляло 91 мас.%, в случае триацильного - 85 мас.%, а в случае тетраацильного - 88 мас.%. Масс-спектроскопию высокого разрешения с ионизацией электрораспылением и регистрацией ионов с помощью ион-циклотронного резонанса выполняли на спектрометре Bruker Daltonics модели Apex II с магнитом 7 (Tesla).

Анализ LPS и полученных из него частично деацилированных S-LPS проводили также с помощью ¹³ С-ЯМР. ¹³ С-ЯМР-спектроскопию выполняли на спектрометре Bruker модели DRX-500 с программным обеспечением XWINNMR и импульсными последовательностями от производителя.

Съемку спектров проводили в D20 (99 : 95 %) с ацетоном в качестве

стандарта (31,5 ррт). Сопоставление ¹³ С-ЯМР-спектров исходного и частично деацилированных S-LPS показало их полную идентичность, за исключением уширенного сигнала, соответствующего метиленовым

остаткам высших жирных кислот липида А в области 30-34 м.д.,

интегральная интенсивность которого существенно уменьшается в спектрах S-LPS, полученных в результате щелочной деградации. Кроме того, 13

сравнительный анализ полученных ^' С-ЯМР-спектров свидетельствует о том, что в процессе модификации (деацилирования) LPS не происходит

изменений первичной структуры повторяющегося звена 0-PS.

На Фиг. 2 представлен типичный 13 С-ЯМР-спектр деацилированного S-LPS S. flexneri 2а, который полностью совпадает в областях сигналов,

принадлежащих полисахаридному компоненту, со спектром 0-PS,

выделенного из соответствующего не модифицированного S-LPS. Полное совпадение полученных спектральных данных с литературными (Andrei V. Perepelov, Vyacheslav L. L'vov, Bin Liu, Sof'ya N. Senchenkova, Maria E.

Shekht, Alexander S. Shashkov, Lu Feng, Petr G. Aparin, Lei Wang, Yuriy A. Knirel. A similarity in the O-acetylation pattern of the O-antigens of Shigella flexneri types la, lb, 2a. Carbohydr. Res., 2009, vol. 344, pp.687-92)

свидетельствует о том, что полученный препарат представляет собой деацилированный S-LPS с длинными 0-PS цепями, так как в спектре практически отсутствуют сигналы, принадлежащие олигосахаридному кору. Содержание нуклеиновых кислот и белков в полученных препаратах не превышало 1 мас.%.

Из сухих бактериальных клеток S. enterica sv typhi или Е. coli 0:55

описанным выше способом (Пример 2А) получали нативный S-LPS, который подвергали щелочной обработке для получения предварительно

деацилированного S-LPS, из которого далее выделяли индивидуальные его ди-, три- и тетраацильные производные. 13 С-ЯМР-спектр предварительно деацилированного S-LPS S. enterica sv typhi представлен на Фиг. 7.

Индивидуальные ди-, три- и тетраацильные S-LPS из бактерии К. pneumoniae получали аналогичным способом из коммерческого образца S-LPS бактерии К. pneumoniae (Sigma L4288). Данные элекрофореза (Фиг.З, 2А - 4В) свидетельствуют о том, что препараты являются S-LPS, выделенными из & enterica sv typhi О:901, К. pneumoniae, Е. coli 0:55.

Для исследования иммунобиологических свойств комбинаций

деацилированных S-LPS эндотоксичных бактерий предварительно получали их лиофилизированные субстанции. Субстанцию двухкомпонентной

комбинации готовили путём растворения в апирогенной воде необходимых массовых долей 2-acLPS и 3-acLPS; 2-acLPS и 4-acLPS; 3-acLPS и 4-acLPS, после чего полученный раствор лиофилизовали. Аналогично готовили субстанцию трехкомпонентной комбинации, содержащей 2-acLPS, 3-acLPS и 4-acLPS в массовом соотношении 1 : 1 : 1.

С. Пирогенность индивидуальных модифицированных S-LPS и их

комбинаций

Низкий и клинически приемлемый уровень эндотоксичности препаратов индивидуальных деацилированных S-LPS эндотоксичных бактерий и их комбинаций подтвержден специальными исследованиями их пирогенности in vivo на экспериментальных животных и клиническими исследованиями пирогенности и безопасности.

Пирогенность препаратов индивидуальных модифицированных S-LPS - 2-acLPS, 3-acLPS, 4-acLPS и их комбинаций - (2-acLPS + 3-acLPS + 4-acLPS), (3-acLPS + 4-acLPS), (2-acLPS + 3-acLPS), (2-acLPS + 4-acLPS) бактерий

S.flexneri 2a, S. enterica sv typhi 0:901, K. pneumoniae, E. coli 0:55, а также LPS, полученного классическим методом Westphal из S. flexneri 2a,

определяли в сравнении с коммерческой Vi-антигенной вакциной. Тест проводился на кроликах породы Шиншилла массой 2,80 - 3,05 кг в

соответствии с требованиями Европейской Фармакопеи (European

Pharmacopoeia.7-th Edition, July 2010, pp. 162-163) и Технического регламента ВОЗ для Vi-полисахаридной вакцины (Requirements for Vi-polysaccharide typhoid vaccine.WHO Technical Report Series No.840, 1994, Annex 1). После в/в введения каждого препарата трижды измеряли ректальную температуру кроликов с интервалом в 1 час. Апирогенным считали препарат, для которого суммарное повышение температуры не превышало 1 , 15 С. Полученные данные представлены в табл.3.

2-acLPS S.flexneri 2а и S. enterica sv typhi О:901, К. pneumoniae, Е. coli 0:55 является весьма апирогенным препаратом. В тесте пирогенности на кроликах апирогенные дозы его введения составили 34, 21, 37 и 14 мкг/кг

соответственно. По параметру пирогенности диацильное производное S-LPS существенно превышает требования Комитета экспертов ВОЗ для

полисахаридной Hib - вакцины (Recommendations for the production and control Haemophilis influenzae type b conjugate vaccines. WHO Technical Report Series, No.897, 2000). 3-acLPS также является апирогенным препаратом.

Апирогенные дозы введения 3-acLPS S.flexneri 2а и S. ente ica sv typhi 0:901, К. pneumoniae, Е. coli 0:55 составили 0,2; 0,1; 0,1 и 0,1 мкг/кг,

соответственно. Таким образом, по снижению эндотоксичности 3-acLPS превосходит соответствующие параметры 4-acLPS, однако уступает 2-acLPS по степени детоксикации.

Таблица 3

Сравнительная оценка пирогенности индивидуальных модифицированных S-LPS и их комбинаций бактерий S. flexneri 2а, S. enterica sv typhi О:901,

4-acLPS S. flexneri 2a 0,025 Апирогенен

4-acLPS S. enterica sv typhi 0:901 0,025 Апирогенен

(2-acLPS + 3-acLPS + 4-acLPS)

S. flexneri 2a в массовом 0,6 Апирогенен соотношении 1 : 1 : 1

(2-acLPS +3-acLPS +4-acLPS)

S. enterica sv typhi O:901 в 0,4 Апирогенен массовом соотношении 1 : 1 : 1

(2-acLPS +3-acLPS +4-acLPS)

K. pneumoniae в массовом 0,5 Апирогенен соотношении 1 : 1 : 1

(2-acLPS +3-acLPS +4-acLPS)

E. coli 0:55 в массовом 0,4 Апирогенен соотношении 1 : 1 :1

(3-acLPS+4-acLPS)

S. flexneri 2a в массовом 0,05 Апирогенен соотношении 3 : 1

(3-acLPS + 4-acLPS)

S. enterica sv typhi O:901 в 0,05 Апирогенен массовом соотношении 3: 1

(2-acLPS + 3-acLPS)

S. flexneri 2a в массовом 0,5 Апирогенен соотношении 1 : 1

(2-acLPS + 3-acLPS)

S. enterica sv typhi O:901 в 0,5 Апирогенен массовом соотношении 1 : 1

(2-acLPS + 4-acLPS)

S. flexneri 2a в массовом 0,55 Апирогенен соотношении 3: 1

(2-acLPS + 4-acLPS)

S. enterica sv typhi O:901 в 0,05 Апирогенен массовом соотношении 3: 1

LPS Westphal S. flexneri 2a 0,0001 Апирогенен

Вместе с тем, по параметру пирогенности 3-acLPS соответствует

требованиям Комитета экспертов ВОЗ для полисахаридной Vi- вакцины. 4- acLPS S. flexneri 2а и S. enterica sv typhi О:901 является умеренно

апирогенным препаратом - дозы до 0,025 мкг/кг при в/в его введении являются апирогенными. Трёхкомпонентные комбинации индивидуальных деацилированных S-LPS - (2-acLPS + 3-acLPS + 4-acLPS) бактерий S. jlexneri 2а и S. enterica sv typhi 0:901, К. pneumoniae, E. coli 0:55, при массовом соотношении компонентов в них 1 : 1 : 1, обнаружили низкую пирогенность в тесте пирогенности на кроликах. Дозы указанных комбинаций до 0,6 мкг/кг веса кролика при в/в их введении являются апирогенными. Сравнительная оценка наиболее чувствительного параметра снижения эндотоксичности in vivo - пирогенности - демонстрирует преимущество трёхкомпонентных комбинаций по сравнению с такими входящими в них компонентами, как 3-acLPS и 4-acLPS. При указанном массовом соотношении компонентов наблюдается синергизм их антипирогенного действия: смешение

слабопирогенного 2-acLPS с более пирогенными 3-acLPS и 4-acLPS

аттенуирует остаточную эндотоксичность последних примерно в 3-5 раз и приводит к повышению апирогенной дозы в составе комбинаций, в

частности 4-acLPS, до 8 раз. Следует отметить, что данная трёхкомпонентная комбинация обеспечивает более или менее выраженный синергетический апирогенный эффект при любых соотношениях входящих в неё компонентов, в частности, и при следующих их массовых соотношениях: (45:45: 10);

(45:10:45); (10:45:45).

Двухкомпонентные комбинации индивидуальных деацилированных S-LPS - (2-acLPS + 3-acLPS), (2-acLPS + 4-acLPS) и (3-acLPS + 4-acLPS) бактерий

S. jlexneri 2a и S. enterica sv typhi O:901, K. pneumoniae, E. coli 0:55 также обнаруживают синергетическое взаимодействие компонентов в части снижения остаточной эндотоксичности 3-acLPS или 4-acLPS при любом массовом соотношении входящих в них компонентов. Однако максимальным синергетическим антипирогенным эффектом обладают двухкомпонентные комбинации (2-acLPS + 3-acLPS) и (2-acLPS + 4-acLPS) с содержанием в них

2- acLPS не менее Уг от общей массы (табл. 3), что позволяет признать их наиболее перспективными в части безопасности. Так, комбинации (2-acLPS+

3- acLPS) S. flexneri la. и S. enterica sv typhi O:901 с массовым соотношением компонентов в них 1 : 1 обнаруживают низкую пирогенность (дозы введения кроликам составляют 1 ,0 и 0,5 мкг/кг соответственно), а комбинации (2- acLPS+4-acLPS) с массовым соотношением компонентов в них 3 : 1 обладают сравнимым уровнем пирогенности. Удельная апирогенная доза 3-acLPS в двухкомпонентных комбинациях возрастает в 3 - 5 раз, a 4-acLPS -до 2-х раз. D. Иммуногенность индивидуальных модифицированных S-LPS и их комбинаций

Группы мышей линии (СВАХС57В1/6) FI внутрибрюшинно (в/б)

иммунизировали препаратами индивидуальных модифицированных S-LPS - 2-acLPS, 3-acLPS, 4-acLPS и их комбинаций - (2-acLPS + 3-acLPS + 4-acLPS) в массовом соотношении компонентов 1 :1:1, (3-acLPS + 4-acLPS) в массовом соотношении компонентов 3:2, (2-acLPS + 3-acLPS) в массовом соотношении компонентов 1 : 1, (2-acLPS + 4-acLPS) в массовом соотношении компонентов 3: 1 бактерий S. flexneri 2а, S. enterica sv typhi О:901, К. pneumoniae, Е. coli 0:55, а также LPS, полученного классическим методом Westphal из

вышеуказанных бактерий, в дозе 25 мкг на мышь.

На 15 день после иммунизации проводили отбор сывороток крови животных для оценки уровней S-LPS специфических IgG антител методом ELISA. Для адсорбции на микроплейтах использовали LPS, соответствующих О- серотипов. Для изучения вторичного иммунного ответа, те же группы мышей иммунизировали указанными препаратами повторно в дозе 25 мкг на мышь через месяц после первичного введения. На 15 день после вторичной

иммунизации проводили повторный отбор сывороток крови.

Полученные данные показывают, что диацильное производное S-LPS из бактерий S. flexneri 2а и S. enterica sv typhi О:901, К. pneumoniae, Е. coli 0:55 менее иммуногенно, чем три- и тетраацильные производные, и вызывает низкий первичный иммунный ответ у лабораторных животных (Фиг. 8А, 9А, 1 1 А). При этом наиболее высокий первичный иммунный ответ вызывает диацильное производное К. pneumoniae (Фиг. 10А). Уровень вторичного иммунного IgG ответа при иммунизации лабораторных животных 2-acLPS S. flexneri 2a, S. enterica sv typhi 0:901 и E. coli 0:55 был существенно выше по сравнению с первичным ответом, однако в 8,0; 8,0 и 7,4 раза ниже по сравнению со вторичным ответом на 3-acLPS и в 12,0; 1 1,7 и 10,2 раз ниже по сравнению со вторичным ответом на 4-acLPS, полученные из гомологичной бактерии (Фиг. 8В, 9В, 11В). При этом вторичный иммунный IgG ответ на 2- acLPS К. pneumoniae лишь в 2,4 раза отличался от такового на 3-acLPS (Фиг. 10В).

Уровни продукции IgG антител при первичном ответе на 3-acLPS S. flexneri 2а, S. enterica sv typhi O:901 и E. coli 0:55 были, соответственно, в 3,0; 1 , 1 и 3,4 раза ниже по сравнению с первичным ответом на 4-acLPS

соответствующего серотипа (Фиг. 8 А, 9А, 1 1 А). Вторичный иммунный ответ при иммунизации лабораторных животных 3-acLPS S. flexneri 2а, S. enterica sv typhi O:901 и E. coli 0:55 был высоким (титр антител превышал 1600, 4000, 1800), но при этом несущественно ниже по сравнению с ответом на 4-acLPS соответствующего серотипа (Фиг. 8В, 9В, 1 IB). 4-acLPS S.flexneri 2а,

S. enterica sv typhi O:901 и E. coli 0:55 индуцировал первичный иммунный ответ у лабораторных животных в 3,0; 1,1 и 3,4 раза более высокий по сравнению с таковым 3-acLPS (Фиг. 8 А, 9 А, 1 1 А). Уровень вторичного иммунного ответа при иммунизации лабораторных животных 4-acLPS был в 1,4; 1,5 и 1,2 раза выше по сравнению с таковым 3-acLPS соответствующего серотипа (Фиг. 8В, 9В, 1В). Несколько более высокая иммуногенность 4- acLPS антигена обусловлена, по-видимому, высокой степенью ацилирования его липид А домена и, вследствие чего, выраженной способностью к

образованию им агрегатных структур по сравнению с другими

модифицированными S-LPS, особенно в сравнении с 2-acLPS.

Комбинации индивидуальных модифицированых S-LPS эндотоксичных бактерий демонстрируют высокий иммуногенный потенциал, несмотря на существенную модификацию канонической структуры их липид А домена. Так, трёхкомпонентная комбинация (2-acLPS + 3-acLPS + 4-acLPS) при массовом соотношении компонентов в ней 1 : 1 : 1 , индуцировала первичный иммунный ответ к О-антигену S. flexneri 2а и S. enterica sv typhi, К. pneumoniae, Е. coli 0:55, уровень которого был весьма высоким и

достоверно не отличался от уровня ответа на классический LPS Westphal, полученный из соответствующего бактериального штамма (Фиг. 8А, 9А, 1 1 А). Таким образом, иммуногенные потенциалы низкоэндотоксичного комбинированного модифицированного S-LPS иммуногена и эндотоксичного и пирогенного LPS, полученного по методу Westphal, были определены приблизительно равными, что свидетельствует о том, что в составе

комбинации находятся особые, высокоиммуногенные, с разной степенью ацилирования, ассоциаты из модифицированных S-LPS, которые и

обеспечивают синергетический эффект в части усиления её иммуногенных свойств.

Так, трёхкомпонентные комбинации (2-acLPS + 3-acLPS + 4-acLPS) из бактерий S. flexneri 2а, S. enterica sv typhi 0:901, К. pneumoniae и E. coli 0:55 с массовым соотношением компонентов в них 1 : 1 : 1 , индуцировали при иммунизации лабораторных животных вторичный IgG иммунный ответ, который был в 32,0; 33,6; 8,0 и 32,0 раза выше по сравнению с ответом на 2- acLPS; в 4,0; 4,2; 3,3 и 4,3 раза выше по сравнению с ответом на 3-acLPS и в 2,7; 2,8; - и 3,1 раза выше по сравнению с ответом на 4-acLPS (Фиг. 8В, 9В, 11В). При этом вводимая доза индивидуального модифицированного S-LPS в составе данных комбинаций составляет лишь 33 % по весу от дозы, вводимой в качестве соответствующего монокомпонента. Следует отметить, что данная трёхкомпонентная комбинация S-LPS обеспечивает более или менее выраженный синергетический эффект, направленный на повышение иммуногенности, при любых соотношениях компонентов в ней, в частности, и при следующих их массовых соотношениях: (10:45:45); (45: 10:45);

(45:45:10).

Двухкомпонентные комбинации индивидуальных модифицированных S-LPS - (2-acLPS + 3-acLPS), (2-acLPS + 4-acLPS) и (3-acLPS + 4-acLPS) бактерий S.flexneri 2a и S. enterica sv typhi O:901, K. pneumoniae, E. coli 0:55 также обнаруживают синергетическое взаимодействие компонентов в части усиления иммуногенности при любом массовом соотношении входящих в них компонентов. При этом наиболее высокий вторичный иммунный ответ к О-антигенам шигелл или сальмонелл индуцируют комбинации (2-acLPS + 3- acLPS) с массовым соотношением компонентов 1 : 1 , (3-acLPS + 4-acLPS) с массовым соотношением компонентов 3: 1 и (2-acLPS+4-acLPS) с массовым соотношением компонентов 3: 1. Так, уровень IgG ответа был наиболее высоким на комбинацию (3-acLPS + 4-acLPS) с массовым соотношением компонентов 3: 1 S.flexneri 2а и комбинацию (2-acLPS + 3-acLPS) с массовым соотношением компонентов 1 : 1 5 ^* . enterica sv typhi О:90\ (Фиг. 8B, 9В).

Следует отметить, что трёхкомпонентные комбинации обеспечивают более выраженный синергетический эффект по сравнению с двухкомпонентными. Так, при сравнительном исследовании иммуногенности трёхкомпонентных комбинаций из бактерий S.flexneri 2а и S. enterica sv typhi 0:901 с массовым соотношением компонентов 1 : 1 : 1 и двухкомпонентных, низкопирогенных, гомологичных по О-антигену комбинаций (2-acLPS + 3-acLPS), (3-acLPS + 4- acLPS) и (2-acLPS+4-acLPS) с массовым соотношением компонентов 1 : 1, 3: 1 и 3: 1 соответственно, установлены несколько более высокие уровни IgG ответа после иммунизации трёхкомпонентными комбинациями (Фиг. 8А, 9А).

Таким образом, иммуногенность комбинаций модифицированных S-LPS детерминирована составом, количеством и соотношением компонентов в них. В качестве наиболее эффективных могут рассматриваться

трёхкомпонентные комбинации. Вместе с тем, иммуногенность комбинаций модифицированных S-LPS определяется также и структурой (серотипом) О- антигена энтеробактерии. Для ряда серотипов высокие подъемы IgG антител могут быть достигнуты и при использовании двухкомпонентных

низкопирогенных комбинаций модифицированных S-LPS. Пример 3

Вакцины, включающие модифицированные S-LPS эндотоксичных бактерий и их комбинации

A. Применение модифицированных S-LPS и их комбинаций для

производства неконъюгированной вакцины (фармацевтического средства) Приготовление неконъюгированной вакцины включает получение

индивидуальных ди-,три- и тетраацильных производных S-LPS и их

комбинаций согласно Примерам 2А, 2В с последующим стерильным розливом в ампулы или шприцы раствора, содержащего активную

субстанцию и фармацевтически приемлемые целевые добавки, в качестве которых могут быть использованы стабилизаторы рН, консерванты, адъюванты, изотонизирующие агенты или их комбинации. Прививочная доза вакцины содержит: неконъюгированную форму модифицированного S-LPS или комбинацию неконъюгированных форм модифицированных S-LPS, в количестве от 0,010 мг до 10 мг; фенол (консервант), не более 0,75 мг, с добавлением натрия хлорида - 4,150 мг, натрия фосфата двузамещенного - 0,052 мг и натрия фосфата однозамещенного - 0,017 мг; воду апирогенную стерильную для инъекций, 0,5 мл (ФС 42-2620-97, ЕР IV 2002).

B. Пирогенность неконъюгированной вакцины

Пирогенность вакцин, включающих 2-acLPS, З-acLPS, комбинацию (2-acLPS +3-acLPS+4-acLPS) в массовом соотношении 1 : 1 : 1, S. flexneri 2а ; 2-acLPS, 3- acLPS , комбинацию (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) в массовом соотношении 1:1:1, S. enterica sv typhi О:901 определяли в сравнении с пирогенностью коммерческой Vi-антигенной вакцины. Все указанные вакцинные препараты обнаруживают апирогенность в дозе 0,050 мкг/кг веса кролика. Результаты тестов представлены в табл. 4.

C. Протективные свойства неконъюгированной вакцины

Оценку протективных свойств вакцин, включающих комбинации

модифицированных S-LPS, проводили на экспериментальных моделях Таблица 4

Пирогенность неконъюгированных вакцин, включающих модифицированные S-LPS и комбинации модифицированных S-LPS бактерий S. flexneri 2а и S. enterica sv typhi 0:901 в дозе 0,050 мкг/кг веса кролика

дизентерийной инфекции (тест Sereny; Sereny В. A new method for the measurement of protective potency of disentery vaccines. Acta Microbiol.,

Acad.Sci. Hung., 1962, v.9, pp. 55-60) и брюшнотифозной инфекции (тест активной защиты мышей).

Для изучения формирования протективного шигеллезного мукозального иммунитета у морских свинок, опытных животных массой 200-250 г иммунизировали подкожно вакциной, включающей 3-acLPS или комбинацию (2acLPS+3acLPS+4acLPS) в массовом соотношении 1 : 1 : 1 , или комбинацию (2-acLPS+3-acLPS) в массовом соотношении 3: 1, S. flexneri 2а в дозах 25 и 50 мкг на животное, в область спины двукратно, с интервалом в 10 дней. Контрольным животным вместо вакцинного препарата вводили физиологический раствор. Через 10 дней после последней иммунизации у опытных и контрольных животных вызывали дизентерийный

кератоконъюнктивит (тест Sereny) путём введения в конъюнктиву глаза суспензии клеток вирулентного штамма S. flexneri 2а в дозе, близкой к ИДюо (10 ⁹ клеток), и в дозе, близкой к 2ИДюо (2x10 ⁹ клеток), в 30 мкл стерильного физиологического раствора. У всех животных контрольной группы, инфицированных дозой 2x10 ⁹ клеток, и у 90% животных контрольной группы, инфицированных дозой 10 ⁹ клеток, развился дизентерийный кератоконъюнктивит (табл. 5).

Иммунизация вакциной, включающей комбинацию (2-acLPS+3-acLPS+4- acLPS) S. flexneri 2a в массовом соотношении 1 : 1 : 1 , в дозе 25 мкг,

обеспечивала защиту глаз у 75% опытных животных при заражении их дозой в 10 ⁹ клеток; при заражении же дозой в 2х10 ⁹ клеток, уровень защиты глаз животных составлял 60% . Иммунизация же вакциной в дозе 50 мкг обеспечивала защиту глаз у 70% опытных животных при заражении их дозой в 10 ⁹ клеток; при заражении дозой в 2х10 ⁹ , уровень защиты глаз животных составлял 60%).

Уровни защиты глаз от экспериментальной дизентерийной инфекции при иммунизации морских свинок вакцинами, включающими 3-acLPS или комбинацию (2-acLPS+3-acLPS) в массовом соотношении 3: 1 , бактерии S. flexneri 2а также варьировали от 55 до 75 %.

Таким образом, при подкожной иммунизации животных вакциной, включающей 3-acLPS или комбинацию (2-acLPS+3-acLPS+-4acLPS) в массовом соотношении 1 : 1 : 1 , или комбинацию (2-acLPS+3-acLPS) в Таблица 5

Протективный мукозальный иммунитет у морских свинок после системной иммунизации их вакцинами, включающими модифицированный S-LPS и комбинации моди ици ованных S-LPS бакте ии S. exneri 2а

массовом соотношении 3: 1, S. flexneri 2а, регистрировался выраженный мукозальный противодизентерийный иммунитет. Для изучения протективного брюшнотифозного иммунитета опытную группу мышей линии (СВАХС57В1/6) F1 в/б иммунизировали градиентом доз вакцины, включающей 3-acLPS S. enterica sv typhi 0:901 , а также вакциной, включающей комбинацию (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) S. enterica sv typhi 0:901 в массовом соотношении 1 : 1 : 1. Контрольной группе животных вводили физ. раствор. Через 12-14 дней обе группы животных в/б заражали вирулентным штаммом брюшного тифа S. enterica sv typhi Ту2 N24446 1000 м.к. в дозе 80 LD ₅₀ B стерильном физ. растворе, содержащем 5 мас.% муцина III типа (Sigma, USA) согласно прописи Joo (Joo I., Pusztai Z., Juhasz V.P. Mouse-protective ability of the international reference preparations of typhoid vaccine. Z. Immun. Forsch. exp. Ther., 1968, v.135, pp.365-72). Выживаемость животных в обеих группах регистрировали в течение 3-5 дней.

Как следует из табл. 6, тест активной защиты мышей выявил существенную протективную эффективность заявляемых вакцин. Так, вакцина, включающая комбинацию (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) S. enterica sv typhi O:901 в

массовом соотношении 1 : 1 : 1, обладает протективной активностью,

сравнимой в тесте на мышах с вакцинным препаратом TYPHIM-Vi, и соответствует требованиям количественной стандартизации протективной активности брюшнотифозных вакцин.

D. Противошоковая активность неконъюгированной вакцины

Защиту животных от эндотоксического шока осуществляли посредством профилактической иммунизации опытных групп мышей линии

(CBAXC57B 1/6)F1 в/б вакциной, включающей комбинацию (2-acLPS+3- acLPS+4-acLPS) S. sonnei в массовом соотношении компонентов 1 : 1 : 1 , и вакциной, включающей комбинацию (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) Е. coli 0:55 в массовом соотношении компонентов 1 : 1 : 1 , в дозах 50, 100 и 200 мкг/ мышь (эквивалентным дозам 2,5; 5 и 10 мг/кг соответственно), в 0,5 мл 0,9%- ного раствора хлорида натрия за 72 часа до индукции эндотоксического шока. Эндотоксический шок индуцировали в/б введением стандартного Таблица 6

Сравнительная характеристика протективных свойств вакцин, включающих модифицированный S-LPS или комбинацию модифицированных S-LPS

эндотоксина E. coli 0:55 (Sigma-Aldrich, USA) в дозе 2 мг/мышь (100 мг/кг), составляющей приблизительно 4 LD100. Контрольной группе мышей вводили в/б 0,5 мл физ.раствора по той же схеме. Выживаемость животных оценивали в течение 3-х дней после введения эндотоксина (табл. 7).

Из табл. 7 следует, что заявляемые вакцины, несмотря на сниженнную эндотоксичность, оказались эффективными профилактическими

препаратами, обеспечивающими в дозах 100 и 200 мкг/мышь 80%-ную и 40- 60%-ную соответственно, выживаемость экспериментальных животных на фоне массивной (4 LD100) эндотоксической нагрузки и корректирующими, таким образом, патогенетический механизм эндотоксического шока. При этом вакцина, включающая комбинацию модифицированных S-LPS S. sonnei, обладала более выраженной противошоковой активностью, чем аналогичная вакцина Е. coli 0:55.

Защиту животных от септического шока осуществляли посредством

профилактической иммунизации опытных групп мышей линии

(CBAXC57B 1/6)F1 в/б вакциной, включающей комбинацию (2-acLPS+3- acLPS+4-acLPS) S. sonnei в массовом соотношении 1 : 1 : 1, и вакциной, включающей комбинацию (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) Escherichia coli 0: 55 в массовом соотношении 1:1:1, в дозах 10 и 50 мкг/ мышь (эквивалентным дозам 0,5 и 2,5 мг/кг соответственно) два раза, с интервалом в 30 дней, до моделирования септического шока. Моделирование шока проводили через 18 дней после вторичной иммунизации. Контрольную группу составляли интактные прооперированные животные (табл. 8).

Моделирование септического шока (экспериментального перитонита) проводили с помощью метода прокола и перевязки слепой кишки (CLP- модель). Опытные и контрольные группы мышей усыпляли под общей анестезией, вскрывали брюшину и извлекали слепую кишку и аппендикс. Слепую кишку перевязывали в прилегающей к аппендиксу области и прокалывали её насквозь 2 раза иглой диаметром 22G. Содержимое слепой кишки выдавливали через образовавшиеся отверстия для обсеменения Таблица 7

Выживаемость мышей линии (CBAxC57Bl/6)Fl, иммунизированных вакцинами, включающими комбинации модифицированных S-LPS S. sonnei и Escherichia coli 0:55, при индукции у них эндотоксического шока в/б введением 4 LD 100 LPS E.coli 0:55

содержимым кишечника перитонеальной полости, затем возвращали органы обратно в брюшину и зашивали брюшную полость.

Из табл. 8 следует, что иммунизация животных заявляемыми вакцинами в дозе 10 мкг/мышь оказалась более эффективной, обеспечивая задержку развития у них экспериментального перитонита (на 30 и 18 часов по

сравнению с контролем) и увеличение выживаемости на фоне сепсиса (на 36 и 24 часа по сравнению с контролем).

Е. Безопасность неконъюгированной вакцины

Дизентерийную вакцину, включающую комбинацию (2-acLPS+3-acLPS+4- acLPS) S. flexneri 2a в массовом соотношении компонентов 1 : 1 : 1 , и вакцину, Таблица 8

Коррекция септического шока у мышей, иммунизированных вакцинами, включающими комбинации модифицированных S-LPS S. sonnei и Е. coli 0:55, при проведении CLP-операции, на 8-е сутки после первичной

включающую комбинацию (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) S. enterica sv typhi O:901 в массовом соотношении компонентов 1 : 1 : 1, в дозе 50 мкг антигена, содержащегося в 0,5 мл фенол-фосфатного буфера в качестве растворителя, и препарат сравнения - вакцину брюшнотифозную Vi-антигенную «Вианвак», в дозе 25 мкг, вводили однократно подкожно трем группам по 20 взрослых добровольцев, в верхнюю треть плеча. В течение первых трех суток после иммунизации определяли температурные реакции на введение указанных препаратов, общие побочные и местные реакции. Вакцина, включающая комбинацию модифицированных S-LPS S. jlexneri 2а, показала высокий уровень безопасности для взрослых добровольцев. Температурные реакции в диапазоне 37,1 -37,5°С были выявлены лишь у 5% добровольцев, более высокие температурные и общие побочные реакции отсутствовали; местная реакция (болезненность в месте инъекции) была зафиксирована только у одного добровольца (табл. 9). Температурные реакции в диапазоне 37,1 - 37,5°С при введении вакцины, включающей комбинацию модифицированных S-LPS S. enterica sv typhi 0:901 или вакцины брюшнотифозной Vi- антигенной «Вианвак», были выявлены лишь у 10 % добровольцев (Табл. 9). Таблица 9.

Безопасность вакцин, включающих комбинацию модифицированных S-LPS S. flexneri 2а и S. enterica sv typhi 0:901, при иммунизации взрослых

Для оценки безопасности заявленных вакцин при их парентеральном (подкожном) введении человеку также изучали продукцию про- воспалительных цитокинов. Вакцины, включающие комбинации

модифицированных S-LPS S. jlexneri 2а и S. enterica sv typhi 0:901, в дозе 50 мкг антигена, содержащегося в 0,5 мл фенол-фосфатного буфера в качестве растворителя, вводили добровольцам однократно подкожно в наружную поверхность верхней трети плеча.

После иммунизации добровольцы находились под наблюдением врача на протяжении 5 дней. В первые сутки наблюдения они проходили медицинское обследование через 2, 4, 6 и 24 часа после введения препаратов. Для

изучении цитокинового статуса у добровольцев брали кровь из вены до введения заявляемых вакцин (0 часов) и через 2, 4 и 6 часов после введения. Согласно литературным данным, TNF-a, IL-Ιβ, IL-6 составляют триаду провоспалительных цитокинов - основных медиаторов сепсиса (Casey L.C., Balk R.A., Bone R.C. Plasma cytokine and endotoxin levels correlate with survival in patients with the sepsis syndrome. Ann. Intern. Med., 1993; 119: 771-78.). В/в введение LPS Westphal E. coli в дозе 0,06 - 0,2 нг/кг вызывает подъём уровня циркулирующих TNF-α и IL-6 в 2-100 раз (Taudorf S., Krabbe K.S., Berg R.M.G., Pedersen B.K., Moller К. Human models of low-grade inflammation: bolus versus continuous infusion of endotoxin. Clin. Vaccine Immunol., 2007; 14(3): 250-55), тогда как в эксперименте при иммунизации добровольцев вакциной, включающей комбинацию модифицированных S-LPS S. jlexneri 2а и вакциной брюшнотифозной, включающей комбинацию

модифицированных S-LPS S. enterica sv typhi О:901, в дозе 50 мкг

(эквивалентной дозе 0,8-1 мкг/кг), концентрации провоспалительных цитокинов были низкими и достоверно не отличались от таковых в

сыворотках, взятых у добровольцев перед введением вакцин (табл. 10). При этом концентрация TNF- а несколько возрастала через 2 часа, IL-6-через 4 часа после введения заявляемых вакцин, а концентрация IL- 1 β практически не менялась и оставалась на базальном уровне. Таблица 10

Профили провоспалительных цитокинов в сыворотки крови добровольцев при иммунизации вакциной дизентерийной, включающей комбинацию модифицированных S-LPS S. jlexneri 2а и вакциной брюшнотифозной, включающей комбинацию модифицированных S-LPS S. enterica sv typhi

0:901

F. Иммуногенность неконъюгированной вакцины

Иммунный ответ добровольцев исследовали после подкожной иммунизации их вакцинами, включающими модифицированный S-LPS и комбинацию модифицированных S-LPS S. flexneri 2а , а также вакциной, включающей комбинацию модифицированных S-LPS S. enterica sv typhi О:901, в дозе 50 мкг антигена, содержащегося в 0,5 мл фенол-фосфатного буфера в качестве растворителя, путём однократного введения группам испытуемых, по 20 взрослых добровольцев, в верхнюю треть плеча. Вторичную иммунизацию проводили аналогично, по истечении 30 дней после первичной иммунизации. Сыворотки крови для исследований брали у испытуемых до вакцинации и через 30 дней после первичной и вторичной вакцинации соответственно.

Основные классы специфических анти-LPS S. fiexneri 2а и S. enterica sv typhi 0:901 антител определяли с помощью метода ELISA, используя изотип- специфические анти-lgA, анти-lgG и анти-lgM антитела, конъюгированные с ПХ. Иммуногенность вакцины оценивали по приросту 4-х кратных и более повышений уровня LPS-специфических антител в иммунных сыворотках - сероконверсий по сравнению с фоновыми сыворотками.

Таблица 1 1

Иммуногенность вакцин, включающих модифицированныцй S-LPS S. fiexneri 2а и комбинации модифицированных S-LPS S. flexneri 2а и S. enterica sv typhi

Таблица 12

Иммуногенность вакцин, включающих модифицированные S-LPS S.flexneri 2а и комбинации модифицированных S-LPS S. flexneri 2а и S. enterica sv typhi

Установлено, что высокие уровни специфических IgA-антител как по частоте выявления, так и по конечному титру наблюдались после первичной и вторичной иммунизации добровольцев вакцинами, включающими

комбинации модифицированных S-LPS S. flexneri 2а и S. enterica sv typhi О:901 (табл. 1 1, 12).

Частота выявления 4-х кратного и более прироста титра IgA анти-LPS антител после иммунизации вакциной, включающей комбинацию модифицированных S-LPS S. flexneri 2a, составила 80% после первичной и вторичной иммунизации, максимальная же частота выявления 4-х кратных Ig сероконверсий IgG антител в 70% зафиксирована после вторичной

иммунизации.

4-х кратный и более прирост титра IgA анти-LPS антител после первичной и вторичной иммунизации вакциной, включающей комбинацию

модифицированных S-LPS S. enterica sv typhi 0:901, отмечен у 70 и 75% добровольцев соответственно, максимальная же частота выявления 4-х кратных и более сероконверсий IgG антител у привитых составила 80% после первичной иммунизации.

4-х кратный и более прирост титра специфических IgA антител после первичной и вторичной иммунизации вакциной, включающей 3-acLPS S. flexneri 2а, отмечен у 40 и 40% добровольцев соответственно. Частота 4-х кратных и более сероконверсий IgG антител у привитых составила 40 и 40% после первичной и вторичной иммунизации 3-acLPS S.flexneri2a

соответственно.

Нарастание уровня LPS-специфических IgM-антител у добровольцев, иммунизированных вакцинами, включающими как комбинацию

модифицированных S-LPS S.flexneri 2а, так и 3-acLPS S.flexneri 2а, было незначительным и обусловило после вторичной иммунизации 10 и 15% 4-х кратных и более сероконверсий, соответственно.

Нарастание частоты сероконверсий IgM-антител у добровольцев,

иммунизированных вакциной, включающей комбинацию

модифицированных S-LPS S. enterica sv typhi О:901, было существенным и составило 55%) после первичной и 60% после вторичной иммунизации.

Зарегистрирован вторичный иммунный ответ у добровольцев,

иммунизарованных вакциной, включающей 2-acLPS S.flexneri 2а, в виде подъемов IgA и IgG антител к LPS S. flexneri 2а.

Таким образом, результаты клинических исследований свидетельствуют о высокой иммуногенности для человека дизентерийной вакцины, включающей комбинацию модифицированных S-LPS S. flexneri 2a, и брюшнотифозной вакцины, включающей комбинацию модифицированных S-LPS S. enterica sv typhi О:901. Специфические антитела представлены наиболее важными для мукозального иммунитета классами IgA- и IgG- антител.

G. Применение комбинаций модифицированных S-LPS в качестве

иммуностимулирующего носителя для производства конъюгированной вакцины (фармацевтического средства)

Комбинацию (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) с массовым соотношением компонентов 1 : 1 : 1 получали из бактерии S. enterica sv typhi 0:901 согласно Примерам 2 А и 2В. Для генерирования в модифицированных S-LPS

активных функциональных группировок, полученная комбинация была подвергнута парциальному периодатному окислению с последующим окислением образовавшихся альдегидных групп в карбоксильные. Далее частично окисленные модифицированные S-LPS могут конъюгировать с вакцинными антигенами по любому из известных методов. В настоящем исследовании был использован метод конъюгации с полисахаридным антигеном - капсульным Vi-антигеном или белковым антигеном - столбнячным анатоксином (CAT) с использованием 1-этил-3-(3- диметиламинопропил) карбодиимида (КДИ).

Конъюгацию частично окисленной комбинации модифицированных S-LPS S. enterica sv typhi О:901 с Vi-антигеном или CAT проводили в 0,2М растворе хлористого натрия в присутствии КДИ в течение 4- 18 часов, поддерживая значение рН 5,6 с помощью рН-стата. Конъюгаты очищали на колонке с Сефарозой CL-6B от неконъюгированных исходных биополимеров и низкомолекулярных примесей, используюя в качестве элюента 0,2М раствор хлористого натрия. Фракции, содержащие конъюгаты и элюирующиеся вблизи холостого объема колонки, объединяли для последующего

стерильного розлива в ампулы с добавлением фармацевтически приемлемых целевых добавок, в качестве которых использовались стабилизаторы рН или консерванты, или адъюванты, или изотонизирующие агенты или их комбинации.

Вакцинный конъюгат комбинации модифицированных S-LPS S. enterica sv typhi 0:901 с Vi-антигеном содержал 50 мае. % серологически активного Vi- антигена, определяемого методом ELISA.

Вакцинный же конъюгат данной комбинации с CAT содержал 40 мае. % белка, определяемого методом Бредфорда (Bradford М.М. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 1976, v. 72, pp.248-54). Одна прививочная доза конъюгированной вакцины содержит: коньюгат комбинации модифицированных S-LPS, от 0,010 до 0,200 мг; фенол

(консервант), не более 0,75 мг, с добавлением натрия хлорида - 4,150 мг, натрия фосфата двузамещенного -0,052 мг и натрия фосфата

однозамещенного - 0,017 мг; воду апирогенную, стерильную, для инъекций, 0,5 мл (ФС 42-2620-97, ЕР IV 2002).

Н. Иммуногенность конъюгированных вакцин

Изучали иммунный ответ мышей на конъюгаты полисахаридного Vi- антигена и белкового CAT с иммуностимулирующим носителем - комбинацией (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) S. enterica sv typhi O:901 в массовом соотношении компонентов 1 : 1 : 1.

Группы мышей линии (СВАХС57В1/6) FI в/б иммунизировали

вышеуказанным конъюгатом Vi- антигена и чистым Vi- антигеном в дозе 25 мкг полисахарида на мышь. Конъюгат индуцировал гуморальный иммунный ответ и на 15 сутки после однократного его введения в сыворотках

периферической крови животных методом ELISA определяли 5,8 - кратное увеличение количества IgG антител по сравнению с ответом на чистый Vi- антиген (Фиг.12 А).

Для изучения вторичного иммунного ответа те же группы мышей

иммунизировали указанными вакцинами повторно в дозе 25 мкг

полисахарида на мышь через месяц после первичного введения. На 15 сутки после повторной иммунизации конъюгатом зарегистрировано 8,2-кратное увеличение количества IgG анти- Vi антител (Фиг.12В).

Конъюгат белкового антигена CAT с иммуностимулирующим носителем - комбинацией модифицированных S-LPS S. enterica sv typhi О:901 и чистый CAT также вводили группам мышей линии (СВАХС57В1/6) FI в/б в дозе 20 мкг белка на мышь. Конъюгат индуцировал гуморальный иммунный ответ после однократного введения и на 15 сутки в сыворотках периферической крови животных определяли 3-х кратное увеличение количества IgG антител по сравнению с ответом на чистый CAT (Фиг.12А).

Для изучения вторичного иммунного ответа те же группы мышей

иммунизировали вакцинами повторно в дозе 20 мкг белка на мышь через месяц после первичного введения. На 15 сутки вторичного ответа после повторной иммунизации конъюгатом зарегистрировано 6,4 -кратное увеличение количества IgG анти- CAT антител (Фиг.12В).

Следует отметить, что уровни О-специфических антител к

иммуностимулирующему носителю - комбинации модифицированных S-LPS S. enterica sv typhi О:901, индуцированные конъюгатом с CAT, также повышались: при первичном ответе -в 3,2 раза, а при вторичном - в 1,5 раза (Фиг.12А и В). Таким образом, при введении конъюгата S-LPS с белковым антигеном, наблюдалось дополнительное повышение иммунного ответа как на белковый антиген, так и на носитель.

I. Поливалентная дизентерийно-брюшнотифозная-эше рихиозная вакцина Для получении субстанции поливалентной вакцины против шигеллеза

Флекснера и Зонне, брюшного тифа и энтерогеморрагической эшерихиозной инфекции Е. coli 0:55, растворяли в апирогенной воде равные весовые доли субстанций комбинации (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) в соотношении компонентов 1 : 1 : 1 серотипов S.flexneri 2а, S. sonnei, S. enterica sv typhi O:901 и E. coli 0:55, полученные согласно Примерам 2 А и 2B. Финальную форму вакцины готовили в соответствии с Примером ЗА. Иммуногенность поливалентной дизентерийно-брюшнотифозно- эшерихиозной вакцины определяли в тестах на мышах линии

(СВАХС57В1/6) FI, которых иммунизировали в/б поливалентной вакциной в дозе 100 мкг на мышь. Компоненты поливалентной вакцины-комбинации (2- acLPS+3-acLPS+4-acLPS) в соотношении 1 : 1 : 1 S. flexneri 2а или S. sonnei, или S. enterica sv typhi О:901 , или E.coli 0:55 также вводили отдельно различным группам мышей в дозе 25 мкг на мышь. На 15 сутки проводили отбор сывороток крови животных. Для изучения вторичного иммунного ответа те же группы мышей иммунизировали указанными препаратами повторно в дозе 100 или 25 мкг на мышь через месяц после первичного введения. На 15 сутки после вторичной иммунизации проводили отбор сывороток крови животных. Поливалентная вакцина индуцировала иммунный ответ после первичной и вторичной иммунизации. При этом поливалентная вакцина повышала титр IgG антител на все отдельные её компоненты- брюшнотифозный S. enterica sv typhi О:901, на дизентерийный Флекснер S. flexneri 2а, на дизентерийный Зонне S.sonnei и на ешерихиозный Е. coli О:55 до уровней, сравнимых с уровнем ответа при отдельном введении

соотвествующего компонента в дозе 25 мкг (Фиг.13 А, В).

Таким образом, поливалентная дизентерийно-бр шнотифозно-эшерихиозная вакцина одновременно индуцирует иммунный ответ у мышей на

модифицированные S-LPS антигены, полученные из 4-х видов бактерий, относящихся к трем различным семействам эндотоксичных бактерий.

Пример 4

Фармацевтическая композиция, включающая модифицированные S-LPS и их комбинации

А. Применение модифицированных S-LPS и их комбинаций для

производства фармацевтической композиции (фармацевтического средства) Приготовление фармацевтической композиции включает получение модифицированных S-LPS и их комбинаций согласно Примерам 2А и 2В с последующим стерильным розливом в ампулы или шприцы раствора, содержащего активную субстанцию и фармацевтически приемлемые целевые добавки, в качестве которых могут быть использованы консерванты, стабилизаторы, растворители или их комбинации. Лечебная доза

фармацевтической композиции содержит: комбинацию (2-acLPS+3-acLPS+4- acLPS) в массовом соотношении компонентов 1 : 1 : 1 сальмонелл S. enterica sv typhi 0:901, от 0,010 до 50,000 мг; фенол (консервант), не более 0,75 мг с добавлением натрия хлорида - 4,150 мг; - 0,052 мг и натрия фосфата однозамещенного - 0,017 мг; воду апирогенную стерильную для инъекций, 0,5 мл (ФС 42-2620-97, ЕР IV 2002).

B. Противовирусное действие фармацевтической композиции

Противовирусное действие фармацевтической композиции, включающей комбинацию (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) в массовом соотношении

компонентов 1 : 1 : 1 из сальмонелл S. enterica sv typhi О:901, изучали на белых мышах. Опытные и контрольные группы самцов весом 18-20 г (по 10 животных в группе) инфицировали дозой LD100 вирулентного штамма гриппа A H1N1, после чего осуществляли лечение опытных групп путём ежедневного в/б введения животным препарата, включающего комбинацию (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) в массовом соотношении компонентов 1 : 1 : 1 S. enterica sv typhi О:901, в дозе 100 мкг на животное. Контрольным группам мышей аналогично вводили физ. раствор. Выживаемость животных

определяли в течение двух недель после инфицирования. В контрольной группе мышей выживаемость составила 0 %, в опытной группе -40% (Фиг. 14). При этом средние показатели продолжительности жизни опытных групп мышей статистически достоверно (р > 0,001) были выше контрольных. Таким образом, полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что заявленная фармацевтическая композиция обладает модулирующим реакции иммунной системы действием.

C. Толерогенное действие фармацевтической композиции

Опытные группы мышей линии (CBAxC57Bl/6)FI иммунизировали в/б фармацевтическими композициями, включающими 2-acLPS S. enterica sv typhi 0:901 или 3-acLPS S. enterica sv typhi 0:901 , или комбинацию (2- acLPS+3-acLPS+4-acLPS) в массовом соотношении 1 : 1 : 1 S. enterica sv typhi 0:901 , в дозах 50, 100 и 200 мкг/ мышь соответственно (эквивалентным дозам 2,5; 5 и 10 мг/кг) в 0,5 мл 0,9%-ного раствора хлорида натрия (физ. раствора) за 72 часа до введения стандартного эндотоксина LPS Е. coli 0:55 (Sigma-Aldrich, США) в дозе 2 мг/мышь, эквивалентной дозе 100 мг/кг, равной LD100. Группе контрольных мышей вводили в/б 0,5 мл физ. раствора по той же схеме.

Содержание TNF-α в сыворотках крови мышей определяли с помощью тест системы Quantikine Mouse TNF-a/ TNFSF1A (R&D Systems, USA) методом твердофазного ИФА согласно стандартной методике производителя. Кровь у животных забирали через 90 минут после индукции эндотоксического шока. Результаты исследования представлены в табл. 13.

Таблица 13

Продукция TNF-a у мышей после предварительного введения заявляемых фармацевтических композиций, проведенного за 72 часа до индукции эндотоксического шока

Предварительное введение мышам заявляемых фармацевтических композиций обеспечивало снижение продукции макрофагами TNF-α in vivo до уровня ниже 500 пг/мл, в то время как в контрольной группе такой уровень составлял более 900 пг/мл (таблица 13). Дозо-зависимое подавление продукции TNF-a при иммунизации заявляемыми фармацевтическими композициями свидетельствует об их толерогенном действии, которое может быть использовано для коррекции различных патологических состояний, ассоциированных с гиперпродукцией про-воспалительных цитокинов.