La présente invention relève du domaine de la synthèse de copolymères fonctionnalisés d'intérêt biologique. Elle concerne plus particulièrement des nucléotides nécessaires à la synthèse d'acides nucléiques, notamment d'acides nucléiques de grande longueur, un kit renfermant de tels nucléotides et leur utilisation pour la production de gènes ou séquences d'acides nucléiques synthétiques.

État de la technique antérieure

A ce jour il existe deux grandes catégories de synthèse in vitro des acides nucléiques : les synthèses chimiques ou les synthèses enzymatiques.

La méthode de synthèse chimique des acides nucléiques in vitro la plus courante est la méthode de polymérisation au moyen de phosphoramidites décrite par Adams et al. (1983, J. Amer. Chem. Soc. 105:661 ) et Froehler et al. (1983, Tetrahedron Lett. 24:3171 ). Dans cette méthode, chaque nudéotide à ajouter est protégé au niveau du groupe 5'-OH de façon à éviter une polymérisation incontrôlée de plusieurs nucléotides du même type. Généralement la protection du groupe 5'-OH est réalisée par un groupement trityle. Afin d'éviter une éventuelle dégradation due à l'utilisation de réactifs puissants, les bases portées par les nucléotides peuvent également être protégées. Généralement la protection utilisée fait intervenir un groupement isobutyryle (Reddy et al. 1997, Nucleosides & Nucleotides 16: 1589). Après chaque incorporation de nouveaux nucléotides, le groupe 5'-OH du dernier nudéotide de la chaîne subit une réaction de déprotection en vue de le rendre disponible pour l'étape suivante de polymérisation. Les bases azotées portées par les nucléotides composant l'acide nucléique, elles, ne sont déprotégées qu'après achèvement de la polymérisation complète.

Ces méthodes de synthèses chimiques se révèlent coûteuses et dangereuses à utiliser en raison de la nature des réactifs mis en jeux. De plus elles sont inefficaces pour fa synthèse de longs fragments d'acides nucléiques (fragments supérieurs à une centaine de nucléotides). En vue de développer des méthodes de synthèse d'acides nucléiques, notamment pour la production de fragments de grande longueur avec des rendements élevés, ainsi que des méthodes compatibles avec les éléments génétiques déjà existants, tels que les plasmides d'ADN, ont été mises au point des techniques de synthèse utilisant des catalyseurs enzymatiques pour réaliser la réaction de couplage entre les nucléotides, même en l'absence de brin matrice.

Dans certaines de ces méthodes de synthèses enzymatiques, l'enzyme permettant la polymérisation est directement ajouté aux nucléotides naturels (Deng et al. 1983, Meth. Enzymol. 100 :96). A partir d'un fragment d'acide nucléique initiai appelé primer, i'enzyme de polymérisation ainsi que des nucléotides d'un même type sont ajoutés. La réaction de polymérisation est alors amorcée, l'acide nucléique grandit de façon séquentielle par répétition de ces étapes de création de liaison phosphodiester, jusqu'à ce que ladite polymérisation soit arrêtée par une méthode physique ou chimique.

L'utilisation de nucléotides naturels (c'est-à-dire non modifiés et non protégés) entraine une polymérisation incontrôlée aboutissant à un mélange très hétérogène de molécules d'acides nucléiques. En effet rien ne prévient l'addition de plusieurs nucléotides d'un même type après une première addition. Dans la pratique une telle méthode de synthèse se révèle inutilisable pour la synthèse de fragments d'acide nucléiques ayant une séquence désirée.

L'utilisation de nucléotides protégés permet dans une certaine mesure de résoudre ce phénomène de polymérisation incontrôlée. Les nucléotides protégés permettent l'arrêt de la synthèse en empêchant de manière totale ou partielle la création de liaisons phosphodiester ultérieures à celle désirée.

Les nucléotides sont les « monomères » utilisés pour la synthèse d'acides nucléiques. Leurs propriétés chimiques ainsi que leur capacité à réagir ou non sont garantes du bon déroulement de la synthèse désirée. De façon à pouvoir synthétiser un fragment d'acide nucléique comportant la séquence voulue, il est important de pouvoir polymériser un à un les nucléotides dans l'ordre désiré. Cette polymérisation équivaut à l'addition de nucléotides les uns après les autres dans un ordre qui doit être strictement respecté, il faut notamment veiller à ce que plusieurs nucléotides comportant la même base azotée et introduits au même instant ne réagissent pas en chaîne, entraînant la croissance incontrôlée de la chaîne oligomérique et de ce fait l'obtention d'une séquence erronée d'acide nucléique. il existe des nucléotides modifiés comportant certaines modifications structurelles par rapport aux nucléotides naturels, qui leur confèrent certains avantages lors de !eur utilisation pour la synthèse d'acides nucléiques. Ils sont généralement obtenus par modifications chimiques ou enzymatiques des nucléotides naturellement présents dans les cellules. Certains nucléotides modifiés sont dits protégés car ils comportent des groupements chimiques interdisant la modification d'une fonction chimique à préserver au cours d'autres réactions. Les groupements protecteurs peuvent être disposés à différents endroits de la molécule du nucléotide. Une classe particulière de nucléotides protégés possède une fonction de terminaison de la réaction de polymérisation. Le rôle de ces nucléotides « terminateurs de chaîne» consiste à empêcher la polymérisation excessive et non désirée des nucléotides introduits dans le milieu réactionnel. Lorsqu'un nucléotide terminateur est incorporé à une molécule d'acide nucléique, i! entrave la polymérisation ultérieure d'un autre nucléotide. Ainsi, un seul nucléotide peut être ajouté à chaque molécule d'acide nucléique lors de l'étape d'élongation. Même si les différents nucléotides, composant le fragment d'acide nucléique à synthétiser, sont introduits séquentiellement il est nécessaire d'utiliser des nucléotides « terminateurs » pour éviter les phénomènes de répétitions indésirables.

L'emploi de nucléotides « terminateurs » garantit la fiabilité et la reproductibilité des méthodes de synthèse d'acides nucléiques, qu'elles soient chimiques ou enzymatiques. Ils peuvent avoir une grande influence sur les performances de synthèse d'une méthode donnée. Les nucléotides protégés employés pour la synthèse chimique d'acides nucléiques comportent en position 5'-OH une protection par liaison covalente à un groupe DMT (4,4 ^, -diméthoxytrityle) et en position 3'-OH un groupe phosphoramidite jouant le rôle de catalyseur de la réaction de polymérisation des nucléotides entre eux. Ces nucléotides comportant les groupes DMT et phosphoramidite sont appelés nucléotides phosphoramidites protégés. La protection contre la polymérisation incontrôlée est assurée par le groupe DMT protégeant le 5'-OH. Lors de la synthèse d'acides nucléiques par voie chimique, une première phase de déprotection appelée dé- tritylation intervient afin de retirer le groupement DMT et obtenir un groupe 5'-OH disponibie pour réagir avec le nucléotide à insérer. Il est particulièrement important d'avoir une réaction de déprotection la plus efficace possible afin de permettre l'ajout du nucléotide suivant dans la totalité des cas. Les nucléotides phosphoramidites protégés sont exclusivement employés lors de la synthèse chimique d'acides nucléiques. Leur fonction de "terminateur" est en effet assurée par le groupement DMT lié au 5'-OH. La synthèse chimique s'effectuant dans le sens 3' vers 5', l'existence d'un groupement DMT protecteur du 5'-OH permet d'éviter toute polymérisation excessive jusqu'à l'étape suivante de déprotection.

Ainsi les nucléotides phosphoramidites protégés ne conviennent pas aux méthodes de synthèses enzymatiques.

Certains nucléotides « terminateurs » ont aussi été développés pour des méthodes de séquençage dites de seconde génération. Cependant, en plus d'être totalement inadaptés à la synthèse d'acide nucléique, les nucléotides terminateurs employés pour le séquençage possèdent un certain nombre de limitations rédhibitoires.

La principale limitation est leur capacité à être utilisés par les enzymes d'élongation. En effet les marqueurs fluorescents liés aux nucléotides terminateurs pour le séquençage ont une taille importante. Or les enzymes d'élongation possèdent extrêmement peu d'espace au sein de leur site actif et ont donc peu de chance de pouvoir accepter, afin de Ses polymériser, des nucléotides terminateurs arborant d'imposants groupements fluorescents, tels que les groupements comportant des cycles aromatiques conjugués.

Les techniques de séquençage de l'ADN modernes reposent sur les interactions complémentaires entre un brin matrice, brin séquencé, et un brin en cours d'élongation. De manière générale les nucléotides modifiés utilisés pour le séquençage doivent posséder des propriétés intactes d'appariement avec leurs nucléotides complémentaires. Les nucléotides modifiés devraient conserver ces propriétés d'interactions primordiales pour leur utilisation. Or les bases azotées qui constituent les nucléotides modifiés pour le séquençage sont des analogues des bases azotées naturelles telles que l'adénine, la guanine, la thymine, l'uracile et la cytosine, et donc ne possèdent pas la même structure chimique : certains atomes sont substitués par d'autres et certains groupements sont ajoutés ou supprimés. Ces bases azotées non naturelles peuvent présenter de nombreux inconvénients comme celui par exemple de ne pas être reconnues par les organismes vivants.

Une fois incorporés, les nucléotides terminateurs sont déprotégés afin de permettre l'addition du nucléotide suivant. L'étape de déprotection fait intervenir un moyen physique ou chimique permettant de supprimer le groupement responsable de la fonction terminatrice. Les autres groupements fonctionnels associés au nucléotide modifié sont supprimés au cours d'étapes de déprotection similaires. Il faut donc généralement plusieurs étapes de déprotection au cours des différents processus de séquençage pour pouvoir passer à la détermination du nucléotide suivant. Ces différentes étapes de déprotection s'accumulent et multiplient l'emploi de réactifs puissants ou de conditions physiques extrêmes favorisant la dégradation des différentes espèces présentes dans le milieu réactionnel et notamment la dégradation des acides nucléiques. De plus, un grand nombre d'étapes de déprotection diminue considérablement la rapidité du processus et ses performances.

Encore un problème majeur rencontré lors de l'utilisation de nucléotides modifiés pour le séquençage est l'apparition de cicatrices après les étapes de déprotection. Les différentes structures chimiques servant de lien entre les groupements fonctionnels et le nucléotide sont susceptibles d'être rompus lors des étapes de déprotection. Cette rupture ne permet cependant pas de séparer l'intégralité des structures chimiques de liaison. Ainsi des parties plus ou moins importantes de ces structures restent accrochées aux nucléotides malgré les différentes étapes de déprotection. Ces résidus ont un effet très nocif sur le processus de séquençage et sur toute utilisation ou modification des acides nucléiques en général.

Quelle que soit la structure du nucléotide retenue, les nucléotides modifiés existants ne permettent pas de répondre aux attentes des méthodes de synthèses enzymatiques. Leur utilisation médiocre par les enzymes d'élongation, le placement des différents groupes fonctionnels, l'emploi systématique de bases azotées modifiées, l'obligation de conservation des interactions avec les nucléotides complémentaires, les nombreuses étapes de déprotection et la présence de cicatrices résiduelles, interdisent l'utilisation de ces nucléotides pour la synthèse enzymatique d'acide nucléique.

A ce jour, il n'existe donc pas de solution technique satisfaisante proposant des nucléotides protégés compatibles avec la synthèse d'acides nucléiques par voie enzymatique, notamment pour la synthèse enzymatique de fragments d'acide nucléique de grande longueur.

Buts de l'invention

Un premier but de l'invention est de fournir des nucléotides modifiés adaptés à une synthèse enzymatique d'acides nucléiques. Un autre but de l'invention est de proposer des nucléotides naturels modifiés par différents groupes fonctionnels permettant de les rendre compatibles à leur utilisation au cours d'un processus de synthèse d'acide nucléique. Un autre but de l'invention est de fournir des nucléotides modifiés permettant de synthétiser des acides nucléiques de grande longueur, c'est à dire d'au moins plusieurs centaines ou plusieurs milliers de nucléotides, et plus particulièrement selon le procédé décrit dans !a demande de brevet du même déposant non encore publiée FR 14-53455.

Description de l'invention

A cet effet la présente invention propose un nucléotide modifié, destiné à la synthèse par voie enzymatique, d'acides nucléiques, tels que des acides nucléiques à longues chaînes, comprenant une base azotée « naturelle » ou un analogue de base azotée naturelle, un glucide ribose ou désoxyribose, et au moins un groupement phosphate, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un groupement R ou R', dénommé groupement modificateur, porté :

- par ladite base azotée naturelle ou analogue

- et/ou par l'oxygène en position 3' de la molécule de ribose ou désoxyribose, permettant de bloquer la polymérisation dudit nucléotide (le groupement modificateur est alors un groupement protecteur) et/ou de permettre l'interaction dudit nucléotide avec une autre molécule, différente d'un autre nuciéotide, telle qu'une protéine, lors de la synthèse des acides nucléiques, R comprenant au moins un groupement terminal fonctionnel (qui peut encore être dénommé groupement effecteur).

Plus particulièrement, le groupement modificateur n'est avantageusement pas un groupement de taille importante, tel qu'un groupement comportant des cycles aromatiques conjugués, notamment afin de permettre l'accès de l'enzyme au site réactionnel.

Le nucléotide selon l'invention peut être un mono-, un di- ou un triphosphate, ie ou les groupement(s) phosphate étant libre(s), c'est-à-dire non modifié(s).

Le nucléotide se!on l'invention se présente sous la forme d'une des formules (I), (III) ou (IV) suivantes : (Formule I)

(Formule III)

(Formule IV) dans lesquelles :

(PP)PO représente un groupement mono-, di- ou iriphosphate,

(OH) décrit la possibiiité d'une molécule de ribose ou de désoxyribose, T est un hydrogène, ou un radical clivable choisi parmi -NH ₂ , -N _3i -(C=0)H, -C _n H _2n+1 avec n compris entre 1 et 30, de préférence compris entre 1 et 12, -triméthylsilyle, - phosphate, ~S0 ₃ , avec n compris entre 1 et 30, de préférence compris entre 1 et 12, -(C=0)SC _n H _2n+ avec n compris entre 1 et 30, de préférence compris entre 1 et 12 , -nitrobenzène, -benzyle, -halogènobenzyle, -amide, -carbonate, -benzoyle, -peroxyle, -nitrile, -thiol, -imide, -carbamate, -cyanate, -aicyne, -phényle, - halogènophényle, -picolyl,

M, éventuellement présent, est un groupement lié de manière covalente à Q et à Z, M étant choisi parmi alkyl, alcényl, alcyne, aryl, alkylaryl, hétéroaryl, acyl, aikyloxy, alkylamino, alkoxyamino, amido, alkylimido, alkenylimido, arylimido, fluoroalkyl, alkylphosphate, alkylthio, thioacyl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, alkylsuifinyl, alkylammonium, alkylsulfonium, alkyîsilyl, alkyicarbonyl, alkylcarbonyl, alky!carbanyl, alkylcarbamoyl ou alky!hydroxyiamino,

Z est un groupement clivable, choisi parmi -0-,-S-, =SH-, =S=, ≡S-, -SiH ₂ -, =SiH-, =Si=, ≡Si-, -Se-, =SeH-, =Se-, =Se=, -SeH ₂ -, -PH-, =P-, =PH=, ≡P=, =PH-, -PH ₃ -, - AsH-, =As-, =AsH=,≡As=,≡AsH-, -ASH ₃ -, aminé, ester, silyi, alkyl, benzyl, nitrobenzyl, amide, carbonate, benzoyle, peroxyî, nitrile, thiol, imide, carbamate, cyanate, hydroxyîamine, sulfoxyde, sulfonate, thiosulfinate, thioester, halogénure d'acyie, hypoiodyl, alcyne, haîogèno-phényl, halobenzyl, picolyl, diol ou disulfure, ou choisi parmi -CH ₂ ou -NH- quand M est un -nitrobenzyl-, un -nitrotolyi-, un -nitroxylyl-, un - nitronaphtyl- ou un -nitrophényl-,

Q est un groupement fonctionnel, ou effecteur, terminal du groupement R ou R', G étant choisi parmi la biotine, une protéine, un polynucléotide de séquence définie, un glucide, un antigène, une hormone, un neurotransmetteur, un glycoside tel que la digoxine, un radical sulfuré, en particulier portant une fonction thiol tel que le glutathion, ou un ligand bidentate tel que le catéchol,

R et R' pouvant être présents indépendamment ou simultanément, et lorsque R et R' sont présents simultanément :

Ses groupements Z peuvent être identiques ou différents,

les groupements M peuvent être identiques ou différents,

les groupements Q peuvent être identiques ou différents.

"base" représente une base azotée "naturelle" choisie parmi l'adénine, la thymine, !a cytosine, la guanine ou Turacile ou un analogue de base azotée naturelle, à l'exception de la thymine quand R' est présent et Q comprend la biotine. De manière préférée, T, lorsqu'il n'est pas hydrogène, ainsi que R et R' constituent des groupements assurant la terminaison de chaîne de l'étape d'élongation d'un processus de synthèse d'acides nucléiques. Par radical ou groupement clivable, on entend un radical ou un groupement lié de manière covalente à l'oxygène en position 3' ou 2' de la molécule de rlbose ou en position 3' de la molécule de désoxyribose, ou à un atome de la base azotée, ladite liaison pouvant être rompue par voie chimique ou photochimique. De manière avantageuse, la rupture de l'ensemble des liaisons des radicaux ou groupements clivables T et Z de la molécule de nucléotide selon l'invention s'effectue intégralement et simultanément, c'est-à-dire au cours de la même étape de "déprotection", en particulier par l'application d'une même condition ou par l'action conjointe d'un même réactif. Cette suppression des groupes modificateurs est de préférence totale pour aboutir à la génération de nucléotide exempt de tout groupe modificateur, c'est-à-dire identique à un nucléotide naturel (à la structure de la base azotée près).

Comme indiqué précédemment, les groupements R et R' sont des groupements assurant avantageusement Sa terminaison de chaîne de l'étape d'élongation d'un procédé de synthèse d'acides nucléiques. Ces groupements R et R' peuvent posséder des propriétés, au moyen du groupement fonctionnel Q placé à l'extrémité libre de R et R', d'accrochage à une autre molécule, différente d'un acide nucléique, par exemple une molécule présente sur un support.

En effet, au cours du processus de synthèse d'acides nucléiques, par exemple dans le procédé décrit dans FR 14-53455 cité plus haut, certaines étapes supposent que les nucléotides modifiés employés puissent interagir avec des supports solides. Ces supports solides comportent à leur surface des molécules, protéines ou fonctions chimiques compatibles avec les groupements modificateurs des présents nucléotides. Cette fonctionnalité des nucléotides modifiés est alors primordiale pour le bon déroulement du processus de synthèse d'acides nucléiques. Dans un mode de réalisation préféré, les nucléotides modifiés comportent un groupement qui leur permet de s'associer à un support solide afin d'être purifiés, par exemple, en formant, avec les molécules présentes à la surface d'un support solide, des complexes d'association ayant une constante de dissociation très faible, en particulier inférieure à 1 0 ^"6 mol/L. A la suite de l'étape de déprotection le groupement assurant cette fonction d'association est alors susceptible d'être détruit supprimant ainsi l'interaction entre le nucléotide et le support solide. Dans ce cas, le nuciéotide selon l'invention présente un double avantage, à savoir la présence d'un groupement permettant la purification et la capacité de destruction de ce même groupement simultanément aux autres groupements modificateurs, sur un même nucléotide.

De manière préférée, le groupemeni R modificateur est porté par la base azotée et forme l'une des structures (V) suivantes :

Structure à base Adénine (V _a ) Structure à base Thymine (V _t )

Sucre O ²

Structure à base Cytosine (V _c ) Structure à base Guanine (V _g )

Structure à base Uracile structures dans lesquelles :

« sucre » représente la liaison entre ladite base azotée et la molécuie de ribose ou de désoxyribose de la molécuie de nucléotide,

Zi et Z ₂ sont des groupes Z clivables, identiques ou différents, Les groupements Z, M et Q ont les significations décrites précédemment.

Dans ce mode de réalisation de l'invention les nucléotides sont modifiés par des groupements portés par les atomes des bases azotées habituellement impliqués dans les mécanismes d'appariement Watson-Crick, c'est-à-dire portés par les atomes d'azote des fonctions aminés normalement impliquées dans i'appariement à un nucléotide complémentaire. L'accrochage des différents groupements modificateurs aux atomes constituants les bases azotées est toujours réalisé par l'intermédiaire des groupements Z, de type ciivables, par une liaison de type covalente.

Dans le cas de base azotée de type adénine, un mode de réalisation préféré de la présente invention consiste à lier le groupement modificateur au groupe aminé primaire 6-NH ₂ (structure V _a ).

Dans le cas de base azotée de type thymine, un autre mode de réalisation préféré de la présente invention consiste à lier Se groupement modificateur au groupe aminé secondaire 3-NH (structure V _t ).

Dans le cas de base azotée de type cytosine, un autre mode de réalisation préféré de la présente invention consiste à lier le groupement modificateur au groupe aminé primaire 4-NH ₂ (structure V _c ).

Dans le cas de base azotée de type uracile, un autre mode de réalisation préféré de l'invention consiste à lier le groupement modificateur au groupe aminé secondaire 3- NH (structure V _u ).

Dans Se cas de base azotée de type guanine, un autre mode de réaSisation préféré de la présente invention consiste à lier le groupement modificateur à l'un des deux, ou simultanément aux deux, groupes aminé, l'un secondaire 1-NH et l'autre primaire 2- NH ₂ , par S'intermédiaire de groupements ciivables (Structure V _g ). Dans Se cas particulier ou les deux groupes aminé 1 -NH et 2-NH ₂ sont simultanément utilisés pour porter les groupements modificateurs un cycle, préférentîelSement composé de 6 atomes, peut apparaître entre Ses différents sous-groupes séparateurs. Ce cycle entraîne éventuellement une stabilisation de la structure des groupements modificateurs.

Dans ces modes de réalisations où le groupement modificateur est porté par la base azotée, les sites 3ΌΗ et/ou 2ΌΗ des nucléotides sont libres, favorisant leur utilisation en tant que substrats pour les enzymes d'éiongation lors de la synthèse d'acides nucléiques. Des liaisons hydrogène intermoléculaires peuvent avoir lieu. En effet, le groupement R modificateur orté par la base azotée peut former l'une des structures (VI) suivantes :

Structure à base Adénine (Vl _a ) Structure à base Thymine (Vl _t )

Structure à base Cytosine (VI _C ) Structure à base Guanine (Vi _g )

Structure à base Uraciie (VI _u ) dans lesquelles :

« Sucre » représente la liaison entre ladite base azotée et la molécule de ribose ou de désoxyribose de la molécule de nucléotide,

X-i et X ₂ , identiques ou différents, représentent des atomes d'azote, d'oxygène ou de soufre portés par M et aptes à former avec lesdites bases azotées du nucléotide modifié des liaisons hydrogène intramoléculaires (ces liaisons hydrogène sont alors similaires aux liaisons hydrogène intermoléculaires observées lors des appariements classiques entre nucléotides complémentaires). Cette configuration renforce la stabilité des nucléotides modifiés. Elle influence aussi !a compacité des groupements modificateurs et permet leur utilisation par des enzymes d'élongation dépendants habituellement de la présence d'un brin matrice. Dans le cas de base azotée de type adénine, un mode de réaiisation préféré de la présente invention consiste à lier le groupement modificateur au groupe aminé primaire 6-NH ₂ (structure Vl _a ). Le groupement X présent favorise la création d'une liaison hydrogène intramoiéculaire avec l'atome d'azote 1 du cycle purinique. Ainsi la présence d'une thymine complémentaire est mimée.

Dans le cas de base azotée de type thymine, un mode de réalisation préféré de la présente invention consiste à lier le groupement modificateur au groupe aminé secondaire 3-NH (structure Vl _t ). Le groupement ΧΊ présent favorise la création d'une liaison hydrogène intramoiéculaire avec l'atome d'oxygène en position 4 du cycle pyrimidique. Ainsi la présence d'une adénine complémentaire est mimée.

Dans le cas de base azotée de type cytosine, un mode de réaiisation préféré de la présente invention consiste à lier le groupement modificateur au groupe aminé primaire 4-NH ₂ (structure Vl _c ). Les groupements X et X ₂ présents favorisent la création de liaisons hydrogène intramoléculaires avec l'atome d'azote en position 3 et l'oxygène en 2 du cycle pyrimidique. Ainsi la présence d'une guanine complémentaire est mimée.

Dans le cas de base azotée de type guanine, un mode de réalisation préféré de la présente invention consiste à lier le groupement modificateur aux deux groupes aminés, le premier secondaire 1 -NH et le second primaire 2-NH ₂ (structure Vl _g ) par l'intermédiaire de groupements Z ₁ et Z ₂ clivables. Le groupement X-ι présent favorise la création d'une liaison hydrogène intramolécuiaire avec l'atome d'oxygène en 6 du cycle purinique. Ainsi la présence d'une cytosine complémentaire est mimée.

Dans le cas de base azotée de type uracile, un mode de réalisation préféré de l'invention consiste à lier le groupement modificateur au groupe aminé secondaire 3- NH (structure Vi _u ). Le groupement X ₁ présent favorise la création d'une liaison hydrogène avec l'oxygène en position 4 du cycle pyrimidique. Ainsi, la présence d'une adémine complémentaire est mimée.

Les nucléotides modifiés selon la présente invention n'ont pas nécessairement vocation à s'apparier à un éventuel nucléotide complémentaire porté par un quelconque brin matrice. Lors de l'utilisation des nucléotides modifiés objets de la présente invention, pour la génération d'acides nucléiques, ces derniers ne sont pas obligatoirement destinés à être incorporés par interaction compiémentaire avec un éventuel brin matrice.

Les nuciéotides modifiés objets de la présente invention possèdent des caractéristiques leur permettant de perdre leurs groupements modificateurs lors d'étapes spécifiques. A l'issue de la perte de la totalité de leurs groupements modificateurs les nuciéotides de la présente invention ainsi transformés recouvrent alors leur capacité à s'apparier à des nuciéotides complémentaire portés par des brins matrice. Selon un mode de réalisation particulier, le nudéotide selon l'invention est alors utilisable comme substrat de polymérases normalement dépendantes de la présence d'un brin d'acide nucléique matrice complémentaire du brin en cours de synthèse, même en absence d'un brin complémentaire. Le radical Q terminal fonctionnel du groupement R ou R' est de préférence apte à permettre, lors de la synthèse d'acide nucléique, l'accrochage dudit nudéotide à un support solide, par l'intermédiaire d'une molécule différente d'un acide nucléique, telle qu'une protéine, fixée à la surface dudit support, et plus particulièrement apte à interagir avec des molécules autres qu'un acide nucléique, selon l'un ou l'autre des couples d'interactions suivants : antigène/anticorps, hormone/récepteur, biotine/(strept)avidine, neurotransmetteur/récepteur, polymérase/promoteur, digoxine/antidigoxtne, glucide/lectine, radical sulfuré/métal tel que l'or, glutathion/glutathionne S-transférase, ou encore ligand bidentate/oxyde métallique. Les oxydes métalliques peuvent être, par exemple, Ti0 ₂ , Zr0 _2> Ce0 ₂ , Fe ₃ 0 ₄ , Ga ₂ 0 ₃ , ln ₂ 0 ₃ , Cr ₂ 0 ₃ , Ai ₂ 0 ₃ , ZnO, CuO, Cu ₂ 0 ₃ , Mn ₃ 0 ₄ , Mn ₂ 0 ₃ , V ₂ 0 _3î MO0 ₂ .

Les ligands bidentate peuvent être le catéchol, l'hydroxamate ou un hydroxycarboxylate.

Le radical T est dit "bloqueur" en ce qu'il protège le groupement hydroxy 3' ou le groupement hydroxy 2' du glucide contre toute addition nucléotidique supplémentaire.

De préférence, T et Z, ou Z Z ₂ sont clivables, lors de la synthèse d'acide nucléique, par irradiation dudit nudéotide au moyen de rayonnements électromagnétiques de longueur d'onde comprise entre 10~ ³ et 10 ^"11 mètre, notamment par exposition à des rayonnements ultra-violets.

Des modes de réalisation avantageux de l'invention concernent les nucléotides suivants :

- un nucléotide pour lequel X et X ₂ sont -NH, T est -NH ₂ , Z est -CH ₂ , M est méthyl nitro benzyl-, et Q est -biotine,

- un nucléotide pour lequel X-i et X ₂ sont -NH, T est -NH ₂ , Z , Z^ et Z ₂ sont chacun -O- , M est -nitronaphty!- et Q est -biotine,

- un nucléotide de formule (I) portant uniquement le groupement R' dans lequel : Z est -(C=0)-, M est -C ₈ H ₁₆ - et Q est -NH-biotinyl,

- un nucléotide de structure particulière (V) dans laquelle Z, Z-, et Z ₂ sont chacun - (COO)-, M est -ter- butylnitrobenzyl- et Q est -NH-biotinyl. La présente invention concerne également l'utilisation de nucléotides, tels que décrits précédemment, dans un procédé de production de gènes, de séquence d'acides nucléiques synthétiques, d'ADN, d'ARN ou de polymères d'acides nucléiques, en particulier selon un procédé de synthèse enzymatique.

Une utilisation avantageuse est pour l'incorporation dudit nucléotide dans une chaîne poîynucîéotidique préalablement immobilisée sur un support solide, plus particulièrement lorsque la chaîne poîynucîéotidique est fixée par son extrémité 5' et l'incorporation dudit nucléotide est réalisée par l'extrémité 3' de la chaîne de polynucléotide. Néanmoins, les nucléotides selon l'invention se présentent sous forme libre, en association avec un contre ion si besoin. Bien qu'ayant la capacité de se fixer à support solide, ces nucléotides sont libres de tout support au moment de leur incorporation dans la chaîne poîynucîéotidique. Leur structure chimique n'est donc pas liée à un support solide quelconque. La nature libre des nucléotides modifiés est particulièrement importante pour leur utilisation dans le procédé décrit dans la demande de brevet non encore publiée FR 14-53455 car les nucléotides sont ajoutés à des fragments d'acides nucléiques eux-mêmes immobilisés. Ces fragments sont libérés puis, grâce au groupement effecteur des nucléotides venant d'être incorporés, sont ensuite fixés par l'extrémité opposée à un second support solide. Ce sont donc les chaînes d'acide nucléique complètes, ou polynuciéotides, de séquence désirée qui sont fixées à un support solide et non les nucléotides selon l'invention, servant à construire les polynucléotides.

La présente invention concerne également un kit comprenant au moins un nuciéotide modifié selon l'invention, plus particulièrement ledit kit peut comprendre différents nucléotides modifiés, un enzyme d'éiongation et un support solide apte à fixer au moins l'un des dits nucléotides.

La présente invention va être décrite plus en détail au moyen des exemples iISustratifs ci-après en relation avec les figures annexées dans lesquelles :

La Figure 1 montre les différentes structures générales des nucléotides modifiés objets de la présente invention ;

La Figure 2 présente les structures particulières des nuciéotides modifiés de formule (V) ;

La Figure 3 présente Ses formules des bases azotées naturelles adénine, thymine, cytosine et guanine ;

La Figure 4 montre des exemples de groupements modificateurs capables d'interactions de type liaisons hydrogène intramoléculaires, de formule (VI) ;

La Figure 5 schématise la synthèse du composé NH ₂ -dTTP-NitroB-Biot ;

La Figure 6 schématise la synthèse du composé NH ₂ -dGTP-NitroN-Biot ;

La Figure 7 schématise la synthèse des composés FA-Biot-dNTP ;

La Figure 8 schématise la synthèse du composé dATP-NitroB-Biot :

La Figure 9 schématise la synthèse du composé dCTP-NitroB-Biot ;

La Figure 10 montre un exemple de déprotection du composé NH ₂ -dT-NitroB-Biot polymérisé. ;

La Figure 1 1 montre un exemple de déprotection du composé NH ₂ -dG-NitroB-Biot polymérisé. ;

La Figure 12 montre un exemple de déprotection de composé FA-Biot-dNTP polymérisé ;

La Figure 13 montre un exemple de déprotection par photo-clivage du composé dA- NitroB-Biot polymérisé ;

La Figure 14 montre un exemple de déprotection par clivage chimique du composé dC-NitroB-Biot polymérisé ;

La Figure 15 présente un exemple de nuciéotide modifié selon la présente invention, le groupement Q étant un catéchol ; La Figure 16 schématise la synthèse du composé FA-Cat-dNTP.

Exemples

Synthèse de nucléotides modifiés (protégés) - exemples illustratifs 1 à 6 Exemple 1 - Synthèse du composé NH ₂ -dTTP-NitroB-Biot (Fig 5) Etape A1 : A 5 g de 2'-deoxythymidine solubilisés dans de la pyridine sont ajoutés 2,2 mL de Et ₃ N (Triéthylamine) et 175 mg de DMAP {4-diméthylaminopyridine) puis 5,25 g de D TCI (chlorure de 4,4'-Diméthoxytrityle) à température ambiante durant la nuit. 2,4 mL de Et ₃ N et 1 ,27 mL de MsCI (Chlorure de Méthane sulfonyl) sont ensuite ajoutés au mélange. Après 2 h d'incubation à température ambiante, le mélange est filtré et lavé à l'acétate d'éthyle. Le filtrat est concentré et dissout dans 75 mL d'éthanol à quoi est ajouté 1 M de NaOH. Après chauffage à reflux pendant 1 ,5 h le mélange est refroidi à température ambiante et 1 M de HCi est ajouté. L'éthanoi est évaporé par évaporateur rotatif et le résidu est extrait avec CH ₂ CI ₂ . Après purification sur colonne de gel de silice le produit dTTP-A1 est obtenu.

Etape A2 : A une solution de 2,237 mmol de produit dTTP-A1 , 2,1 g de triphenylphosphine et 1 ,3 g de N-hydroxyphthalimide dans 50 mL de tétrahydrofurane est ajouté 1 ,75 mL de N-N'-diisopropyl azodicarboxyîate à 0°C. Après réchauffement à température ambiante durant la nuit le produit de la réaction est traité avec 0,3 mL d'eau et le solvant est évaporé sous vide. La plus grande partie des impuretés est élliminée par chromatographie donnant alors le produit dTT-A2.

Etape A3 : A un équivalent de composé dTT-A2 sont ajoutés 10 équivalents de LiH dans du DMF à température ambiante. Le mélange réagit pendant 30 min. La réaction est poursuivie par l'addition de 3-amino-4-(bromométhyl)-5-nitrophényi-biotine, puis le mélange est agité pendant plusieurs heures. Le produit dTT-A3 est obtenu.

Etape A4 : le composé dTTP-A3 est ressuspendu dans du méthanol et traité avec de l'acide chlorhydrique concentré aqueux. La solution est refroidie à -20°C durant la nuit aboutissant au produit dTTP-A4. Etape A5 : A 425 mg de nucléoside 5'-OH analogue dTTP-A4 solubilisé dans 2 mL de pyridine et 1 ,7 mL de dioxane est ajouté une solution de 130 mg de 2-chloro-4H-1 ,2,3- benzodioxaphosphorin-4-one dans 1 ,3 mL de dioxane. Le mélange est laissé à température ambiante durant 20 min. Un mélange de 1 ,4 mmol de tributylammonium pyrophosphate dans du DMF et 3,2 mmol tributylamine est ajouté. Après 20 min une solution de 180 mg d'iode et d'eau 0,28 mL dans 14 mL de pyridine est ajoutée. Après 30 min Sa réaction est stoppée par l'ajout d'une solution à 5% de Na ₂ S0 ₃ aqueux. Les solvants sont évaporés sous vide. 25 mL d'eau et 20 mL de CH ₃ CN sont ajoutés. Le mélange est filtré et purifié par HPLC inverse pour donner un composé triphosphate, en l'occurrence dTTP-A5.

Etape A6 : 0,385 mL de méthylhydrazine froide est ajoutée à 3,725 mmol de composé dTTP-A5 dans du CH ₂ CI ₂ anhydre à -5°C. Après 10 min un précipité de ,2-dihydro-4- hydroxy-2-méthyi-1-oxophthalizine est formé. Le mélange est agité durant 1 h à température ambiante. Le précipité est retiré par filtration et lavé par du CH ₂ CI ₂ . Le filtrat est ensuite concentré sous évaporateur rotatif et purifié par chromatographie pour donner le produit NH ₂ -dTTP-NitroB-Biot.

Exemple 2 - Synthèse du composé NH ₂ -dGTP-NitroN-Biot (Fig 6)

Etape B1 : A une solution agitée de 1 ,845 mmol de 2'-déoxyguanine et de 326 mg d'imidazole dans du DMF anhydre est ajouté 2,4 mmol de chlorure de tert- butyldimethylsilyle. La réaction est incubée sous agitation à température ambiante durant 20 h. Les solvants sont éliminés sous vide et le résidu est purifié par chromatographie pour donner le produit dGTP-B1.

Etape B2 : A une solution de 2,237 mmol de produit dGTP-B1 , 2,1 g de triphénylphosphine et 1 ,3 g de N-hydroxyphthalimide dans 50 mL de tetrahydrofurane est ajouté 1 ,75 mL de N-N'-diisopropyl azodicarboxylate à 0°C. Après réchauffement à température ambiante durant la nuit le produit de la réaction est traité avec 0,3 mL d'eau et le solvant est évaporé sous vide. La plus grande partie des impuretés est éliminée par chromatographie donnant alors le produit dGTP-B2.

Etape B3 : 3,785 mmol de composé dGTP-B2 sont séchées plusieurs fois par utilisation de 10 mL pyridine et évaporation sous vide. Le résidu est dissout dans 12,5 mL de CH ₂ CI ₂ . 9 mmol de diisopropyléthyiamine et 7,57 mmol de 6-amino-4,5- bis(iodooxy)-3-niironaphtha[en-1 -yl 5-biotine sont ajoutés. Lorsque la réaction est complète, le mélange est dilué dans 100 mL de CH ₂ CI ₂ , la phase organique est lavée par 50 mL de bicarbonate de sodium et 50 mL d'eau. Il est ensuite séché sur du sulfate de sodium. Les solvants sont évaporés sous vide et le produit purifié par chromatographie pour donner dGTP-B3.

Etape B4 : 3,75 mmol de composé dGTP-B3 sont dissoutes dans 20 mL de THF et traitées par 1 M de TBAF (fluorure de tetra-n-butylammonium) dans du THF. La réaction est complète au bout d'environ 2 h sous agitation. Le mélange est extrait au CH ₂ CI ₂ et purifié par chromatographie pour donner dGTP-B4.

Etape B5 : A 425 mg de nucléoside 5'-OH analogue sont traités de manière similaire à l'étape A5 de l'exemple 1 . Le mélange final est filtré et purifié par HPLC inverse pour donner un composé triphosphate, en l'occurrence dGTP-B5.

Etape B6 ; 0,385 mL de méthylhydrazine froide est ajoutée à 3,725 mmol de composé dGTP-B5 dans du CH ₂ CI ₂ anhydre à -5°C. Après 10 min un précipité de 1 ,2-dihydro-4- hydroxy-2-méthyl-1-oxophthalizine est formé. Le mélange est agité durant 1 h à température ambiante. Le précipité est retiré par filtration et lavé par du CH ₂ C! ₂ . Le filtrat est ensuite concentré sous évaporateur rotatif et purifié par chromatographie pour donner le produit NH ₂ -dGTP-NitroN-Biot.

Exemple 3 - Synthèse des composés FA-Biot-dNTP (Fig 7) Etape C1 : 100 pL d'acide ωΐ-biotine nonanoïque 1 M dans du DMF sont mélangés à 100 pL de carbonyidiimidazole 1 M dans du DMF. La formation d'imidazolide est réalisée en 30 s à température ambiante. Ensuite 100 pL de desoxyribonucléotides 5'- triphosphate 50 mM dans de l'eau sont ajoutés au mélange. Le produit est formé en 12 h température ambiante, il est ensuite précipité à l'acétone et dissout dans de l'eau pour être finalement purifié par chromatographie pour donner le produit FA-Biot-dNTP.

Exemple 4 - Synthèse du composé dATP-NitroB-Biot (Fig 8)

Etape D1 : A 5 g de 2'-déoxyadénine solubilisés dans de la pyridine sont ajoutés 2,2 mL de Et ₃ N et 175 mg de DMAP puis 5,25 g de DMTCi à température ambiante durant la nuit. 2,4 mL de Et ₃ N et 1 ,27 mL de MsC! sont ensuite ajoutés au mélange. Après 2 h d'incubation à température ambiante, le mélange est filtré et lavé à l'acétate d'éthyle. Le filtrat est concentré et dissout dans 75 mL d'éthanoi à quoi est ajouté 1 M de NaOH. Après chauffage à refiux pendant 1 ,5 h le mélange est refroidi à température ambiante et 1 M de HCI est ajouté. L'éthanol est évaporé par évaporateur rotatif et le résidu est extrait avec CH ₂ CI ₂ . Après purification sur colonne de gel de silice le produit dATP-D1 est obtenu.

Etape D2 : A une solution agitée de 1 ,845 mmo! de dATP-D1 et de 326 mg d'imidazole dans du DMF anhydre sont ajoutés 2.4 mmol de chlorure de tert-butyldimethylsily!e. La réaction est incubée sous agitation à température ambiante durant 20 h. Les solvants sont retirés par application du vide et le résidu est purifié par chromatographie pour donner le produit dATP-D2.

Etape D3 : le composé dATP-D2 est ressuspendu dans du méthanol et traité avec de l'acide chlorhydrique concentré aqueux. La solution est refroidie à -20°C durant ia nuit aboutissant au produit dATP-D3.

Etape D4 : A 425 mg de nucléoside 5 '-OH analogue sont traités de manière similaire à l'étape A5 de l'exemple 1. Le mélange final est filtré et purifié par HPLC inverse pour donner un composé triphosphate, en l'occurrence dATP-D4.

Etape D5 : 3, 1 Mmol du composé dATP-D4 dans 200 μί de NaHC0 ₃ 0,1 M pH 8,0 sont mélangés à 3,4 pmol de 2,2-terbutyl- 1-(2-nitro-4-biotine)phényle)hexyl (2,5- dioxopyrrolidin-1 -yl) carbonate dans 200 pL de dimethylformamide. La réaction est conduite à température ambiante durant toute la nuit pour donner dATP-D5 (Olejnik et al., PNAS, 1995, Vol 92, 7590-7594).

Etape D6 : 3,75 mmol du composé dATP-D5 sont dissous dans 20 mL de THF et traité par 1 M de TBAF (fluorure de tetra-n-butylammonium) dans du THF. La réaction est complète au bout d'environ 2 h sous agitation. Le mélange est extrait au CH2CI2 et purifié par chromatographie pour donner dATP-NitroB-Biot.

Exemple 5 - Synthèse du composé dCTP-NitroB-Biot (Fig 9) Etape E1 : A 5 g de 2'-deoxycytidine solubilisés dans de la pyridine sont ajoutés 2,2 mL de Et ₃ N et 175 mg de DMAP puis 5,25 g de DMTCI à température ambiante durant la nuit. 2,4 mL de Et ₃ N et 1 ,27 ml_ de MsCI sont ensuite ajoutés au mélange. Après 2 h d'incubation à température ambiante, le mélange est filtré et lavé à l'acétate d'éthyie. Le filtrat est concentré et dissout dans 75 mL d'éthanol à quoi est ajouté 1 M de NaOH. Après chauffage à reflux pendant 1 ,5 h le mélange est refroidit à température ambiante et 1 M de HCI est ajouté. L'éthanol est évaporé par évaporateur rotatif et le résidu est extrait avec CH ₂ CI ₂ . Après purification sur colonne de gel de silice le produit dCTP-E1 est obtenu.

Etape E2 : A une solution agitée de 1 ,845 mmol de dCTP-E1 et de 326 mg d'imidazole dans du DMF anhydre est ajouté 2.4 mmol de chlorure de tert-butyldimethylsiiyl. La réaction est incubée sous agitation à température ambiante durant 20 h. Les solvants sont retirés par application du vide et le résidu est purifié par chromatographie pour donner le produit dCTP-E2. Etape E3 : Le composé dCTP-E2 est dissout dans de l'éthanol absolu et refroidit à 0°C. Une solution équimoiaire de 2,2-terbutyl-1-(2-nitro-4-biotine)phényle)propy! phényle carbonate dans de l'éthanol absolu est ajoutée goûte à goûte. Le mélange est agité à température ambiante durant toute la nuit. La solution est filtrée, lavée à l'eau et extraite au CH ₂ CI ₂ pour donner dCTP-E3.

Etape E4 : le composé dCTP-E3 est ressuspendu dans du méthanol et traité avec de l'acide chlorhydrique concentré aqueux. La solution est refroidie à ~20°C durant la nuit aboutissant au produit dCTP-E4. Etape E5 : A 425 mg de nucléoside 5'~OH analogue sont traités de manière similaire à l'étape A5 de l'exemple 1. Le mélange final est filtré et purifié par HPLC inverse pour donner un composé triphosphate, en l'occurrence dCTP-E5.

Etape E6 : 3,75 mmol du composé dCTP-E5 sont dissous dans 20 mL de THF et traité par 1 M de T8AF (fluorure de tetra-n-buty!ammonium) dans du THF. La réaction est complète au bout d'environ 2 h sous agitation. Le mélange est extrait au CH ₂ CI ₂ et purifié par chromatographie pour donner dCTP-NitroB-Biot.

Exemple 6 - Synthèse des composés FA-Cat-dNTP (figure 16)

Etape F1 : 100 pL de catechol ester modificateur 1 M dans du DMF sont mélangés à 110 μ!_ de dicyclohexylcarbodiimide (DCC) 1 M et 5 μ[_ de 4-(Diméthylamino)pyridine 100% dans du DMF. Le mélange est incubé à 0°C pendant 5 min. Ensuite 500 μί de désoxyribonucléotide 5'-triphosphate 50 mM dans du DMF sont ajoutés au mélange. Le produit est formé en 3 h à température ambiante. Il est ensuite précipité à l'acétone et dissous dans de l'eau pour être finalement purifié par chromatographie pour donner le produit FA-Cat-dNTP.

Déprotection

Après l'addition du nucléotide à une chaîne d'acide nucléique, les exemples suivants 7 à 1 1 illustrent des modes de réalisation de la déprotection dudit nucléotide, c'est-à-dire l'élimination du ou des groupement(s) modificateur(s).

Exemple 7 - Déprotection des nucléotides poiymérisés NH ₂ -dT-NitroB-Biot (Fig 10) Le clivage des différents groupements modificateurs est réalisé simultanément lors du processus suivant. 20mM de composé NH ₂ -dT-NitroB-Biot en solution aqueuse sont traités avec une solution comprenant 350 à 700 mM de NaN0 ₂ et 1 M NaOAc pH 5,5. Après 1 à 2 min d'incubation à température ambiante exposé sous lumière UV de longueur d'onde 365 nm, la réaction est stoppée par l'addition de tampon phosphate 1 M pH 7,0 et l'arrêt de l'illumination. Le produit de la réaction de déprotection est dT.

Exemple 8 - Déprotection des nucléotides poiymérisés NH ₂ -dG-NitroN-Biot (Fig 1 1 )

Le clivage des différents groupements modificateurs est réalisé simultanément lors du processus suivant : 20mM de composé NH ₂ -dG-NitroN-Biot en solution aqueuse sont traités avec une solution comprenant 350 à 700 mM de NaN0 ₂ et 1 M NaOAc pH 5,5. Après 1 à 2 min d'incubation à température ambiante exposé sous lumière UV de longueur d'onde 365 nm, la réaction est stoppée par l'addition de tampon phosphate 1 M pH 7,0 et l'arrêt de l'illumination. Le produit de la réaction de déprotection est dG.

Exemple 9 - Déprotection des nucléotides poiymérisés de type FA-Biot-dN (Fig 12)

Le clivage des groupements modificateurs portés par l'extrémité 3'-OH est réalisé par hydrolyse de la fonction ester par une solution aqueuse d'ammoniaque, 1 à 100 mM, à température ambiante pendant 1 h. Le produit obtenu est de type dN. Exemple 10 - Déprotection des nucléotides polymérisés dA-NitroB-Biot par photoclivage (Fig 13)

Le clivage des groupements modificateurs portés au niveau de la base azotée est réalisé par photo-clivage. Le composé dA-NitroB-Biot est exposé à une source d'UV de longueur d'onde de 300 à 370 nm à température ambiante. La source d'UV est arrêtée après 30 à 300 secondes pour donner le produit dA.

Exemple 11 - Déprotection des nucléotides polymérisés dC-NitroB-Biot par clivage chimique (Fig 14)

Le clivage des groupements modificateurs portés au niveau de la base azotée est réalisé par clivage chimique. 0,01 mmoi de composé dC-NitroB-Biot est dissout dans 0,1 mL d'éthanol. Une solution de 0,02 mmol de sodium de tetrachîoropalladate II dissout dans de l'éthanol est ajoutée. Du dihydrogène gazeux est bulié dans le mélange sous agitation pendant 20min. Le produit obtenu est dC.

Une procédure similaire est décrite par Kobayashi et al (Science, 2004, 304, 1305- 1308) utilisant du palladium immobilisé et un flux de H ₂ de 1 mL/min dans du THF peut être utilisée en variante.

Exemple 12 - Utilisation de nucléotides selon l'invention pour une synthèse d'acides nucléiques

Les nucléotides modifiés objet de la présente invention peuvent être avantageusement utilisés pour réaliser la synthèse enzymatique d'acides nucléiques sans présence de brins matrices selon le procédé décrit dans la demande de brevet FR 14-53455. L'enzyme choisie pour la réalisation de l'étape d'addition des nucléotides modifiés est la terminale déoxynucléotidyl transférase ou TdT disponible commercialement. L'amorce utilisée pour initier la synthèse est donnée ci-dessous:

5'-AGCCAAGCGGTCGCGATGAT-3' Seq N°1

Les nucléotides modifiés utilisés sont NH ₂ -dTTP-NitroB-Biot préparés selon l'exemple 1. ls permettent d'ajouter un T à la séquence N°1 présentée. Il est attendu qu'un seul et unique nucléotide sera ajouté à chaque fragment d'ADN au cours de chaque étape d'élongation, tel que décrit ci-après.

Une plaque de verre portant des fragments « de capture » ayant la séquence suivante: 5'-GTCCGCTTGGCT-3' Seq N°2

fixés par leur extrémité 3' à cette plaque de verre, est utilisée pour capturer les amorces de séquence 1. Cette plaque en verre constitue le fond d'une chambre réactionnelie paralélipipédique d'un volume de 50 pL. La capture est réalisée en utilisant une solution tampon comprenant: 20 mM Tris-HCI (pH=7,5), 500 mM LiCi et 1 m M EDTA dans laquelle sont ajoutés 2 pmol d'amorce. L'étape de capture est réalisée en 30 min à température ambiante. Une fois les amorces capturées, la plaque est lavée par l'ajout et i'éiimination de 3 fois 50pL de la solution tampon suivante : 20 mM Tris-HCI (pH=7,5), 200 mM LiCI et 1 mM EDTA.

La synthèse démarre par l'ajout des réactifs suivants dans la chambre réactionnelie: 50 U de TdT, 1 M de cacodylate de potassium, 125 mM de Tris-HCI, 0,05% (v/v) de Triton X-100, 5 mM de CoCI2, à pH 7,2. Sont ensuite ajoutés 100 μΜ de nucléotides NH2-dTTP-NitroB-Biot libres et en solution avec leur contre ions. L'enzyme à 2μΜ est finalement ajoutée pour démarrer la réaction d'addition. Le volume total de réaction est de 50 pL. Le mélange est incubé pendant 5 min à 37°C.

Une fois la réaction de synthèse achevée, la plaque est lavée 3 fois avec la solution tampon suivante : 20 mM Tris-HCI (pH=7,5), 200 mM LiCi et 1 mM EDTA.

Cela a pour effet d'assurer que les nucléotides NH2-dTTP-NitroB-Biot introduits en excès sont éliminés laissant la chambre réactionnelie et le support solide vierge de tout nucléotide n'ayant pas réagi. A la fin du lavage, 50pL d'un tampon 20 mM Tris-HCI (pH=7,5) sont ajoutés dans la chambre réactionnelie et la température est élevée jusqu'à 90°C. Cela a pour effet d'assurer le décrochage des fragments ayant incorporé Se nucléotide modifié NH2-dTTP-NitroB-Biot. Ces fragments sont collectés et transférés dans un tube épendorf neuf.

Les fragments d'ADN ayant incorporés le nucléotide protégé NH ₂ -dTTP-NitroB-Biot sont ensuite purifiés selon la procédure suivante. Des billes magnétiques revêtues de streptavidine commerciales (ThermoScientific) préparées selon le protocole du fabriquant sont ajoutées aux 50 pL du mélange réactionnel précédent. Après 1 h d'incubation à température ambiante les billes magnétiques sont collectées grâce à un aimant adapté. Le surnageant est ensuite retiré. Les billes sont ensuite lavées 3 fois avec !e tampon de lavage: tampon tris pH 7,2 avec 0,1 % de Tween-20.

Les billes magnétiques auxquelles se sont fixés les fragments d'ADN ayant incorporé les nucléotides modifiés NH ₂ -dTTP-NitroB-Biot sont re-suspendues dans une solution comprenant 350 à 700 mM de NaN0 ₂ et 1 M NaOAc à pH 5,5. Le méiange est incubé durant 1 à 2 min à température ambiante sous exposition aux UV (365 nm). La réaction est stoppée par l'addition de tampon phosphate 1 M à pH 7,0 et l'arrêt de l'illumination. Cette opération permet le "décrochage" des fragments d'ADN de leurs supports (billes).

Les billes magnétiques sont collectées grâce à un aimant adapté. Le surnageant est récupéré et analysé par gel d'électrophorèse et spectromètre ALDI-TOF MS pour vérifier la bonne incorporation de la base T au niveau de l'extrémité 3' de la séquence N°1 dans plus de 99% des cas.

Une nouvelle étape d'éiongation peut ensuite être réalisée si nécessaire selon le même protocole.

Exemple 13 - Autre exemple d'utilisation de nucléotides selon l'invention pour une synthèse d'acides nucléiques

Les nucléotides modifiés objet de la présente invention peuvent être avantageusement utilisés pour réaliser la synthèse enzymatique d'acides nucléiques sans présence de brins matrices selon ie procédé décrit dans la demande de brevet FR 14-53455. L'enzyme choisie pour la réalisation de l'étape d'addition des nucléotides modifiés est la terminale déoxynucléotidyl transférase ou TdT disponible commercialement.

L'amorce utilisée pour initier la synthèse est donnée ci-dessous:

5 -AGCCAAGCGGTCGCGATGAT-3' Seq N°1

Les nucléotides modifiés utilisés sont NH2-dGTP-NitroB-Biot préparé seion î'exemple 2. lis permettent d'ajouter un G à ia séquence N°1 présentée, il est attendu qu'un seul et unique nuciéotide sera ajouté à chaque fragment d'ADN au cours de chaque étape d'éiongation, tel que décrit ci-après. Une plaque de verre présentant des fragments de capture ayant Sa séquence suivante: 5'-GTCCGCTTGGCT-3' Seq N°2

et fixés par leur extrémité 3 ¹ à cette plaque de verre, est utilisée pour capturer les amorces de séquence 1 . Cette plaque en verre constitue le fond d'une chambre réactionnelle paralélipipédique d'un volume de 50 μΙ_. La capture est réalisée en utilisant une solution tampon comprenant: 20 mM Tris-HCI (pH=7,5), 500 mM LiCI et 1 mM EDTA dans laquelle sont ajoutés 2 pmol d'amorce. L'étape de capture est réalisée en 30 min à température ambiante. Une fois les amorces capturées, la plaque est lavée par l'ajout et l'élimination de 3 fois 50pL de la solution tampon suivante : 20 mM Tris-HC! (pH=7,5), 200 mM LiCI et 1 mM EDTA.

La synthèse démarre par l'ajout des réactifs suivants dans la chambre réactionnelle: 50 U de TdT, 1 M de cacodylate de potassium, 125 mM de Tris-HCI, 0.05% (v/v) de Triton X-100, 5 mM de CoCI2, pH 7,2. Sont ensuite ajoutés 100 μΜ de nucléotides NH2-dGTP-NitroB-Biot libre et en solution avec leur contre ions. L'enzyme à 2μΜ est finalement ajoutée pour démarrer la réaction d'addition. Le volume total de réaction est de 50 pL. Le mélange est incubé pendant 5 min à 37°C.

Une fois la réaction de synthèse achevée, la plaque est lavée 3 fois avec la solution tampon suivante : 20 mM Tris-HCI (pH=7,5), 200 mM LiCI et 1 mM EDTA. Cela a pour effet d'assurer que les nucléotides NH2-dGTP-NitroB-Biot introduits en excès sont éliminés laissant la chambre réactionnelle et le support solide vierge de tout nucléotide n'ayant pas réagit. A la fin du lavage, 50pL d'un tampon 20 mM Tris-HCI (pH=7,5) sont ajoutés dans la chambre réactionnelle et la température est élevée jusqu'à 90°C. Cela a pour effet d'assurer le décrochage des fragments ayant incorporé le nucléotide modifié NH2-dGTP-NitroB-8iot. Ces fragments sont collectés et transférés dans un tube épendorf neuf.

Les fragments d'ADN ayant incorporé le nucléotide protégé NH2-dGTP-NitroB-Biot sont ensuite purifiés selon la procédure suivante. Des billes magnétiques revêtues de streptavidine commerciales (ThermoScientific) préparées selon le protocole du fabriquant sont ajoutées aux 50 pL du mélange réactionne! précédent. Après 1 h d'incubation à température ambiante les billes magnétiques sont collectées grâce à un aimant adapté. Le surnageant est ensuite retiré. Les billes sont ensuite lavées 3 fois avec la solution tampon de lavage: tampon tris pH 7,2 avec 0,1 % de Tween-20. Les bi!les magnétiques auxquelles se sont fixés les fragments d'ADN ayant incorporé les nuciéotides modifiés NH2-dGTP-NîtroB-Biot sont re-suspendues dans une solution comprenant 350 à 700 mM de NaN02 et 1 M NaOAc à pH 5,5. Le mélange est incubé durant 1 à 2 min à température ambiante sous exposition aux UV (365nm). La réaction est stoppée par l'addition de tampon phosphate 1 M pH 7,0 et l'arrêt de l'illumination. Cette opération permet le "décrochage" des fragments d'ADN de leurs supports (billes).

Les billes magnétiques sont collectées grâce à un aimant adapté. Le surnageant est récupéré et analysé par gel d'éiectrophorèse et spectromètre MALDI-TOF S pour vérifier la bonne incorporation de la base T au niveau de l'extrémité 3' de la séquence N°1 dans plus de 99% des cas.

Si nécessaire, une nouvelle étape d'éiongation peut ensuite être réalisée selon le même protocole.

Application industrielle

Les nuciéotides modifiés objets de la présente invention améliorent les performances de procédés de synthèse d'acides nucléiques en permettant notamment la synthèse d'acides nucléiques de grande longueur de très grande qualité. Ces nuciéotides peuvent être utilisés pour la production, à plus ou moins grande échelle, de gènes ou séquences d'acides nucléiques synthétiques. Ces nuciéotides modifiés sont particulièrement destinés à la synthèse d'acides nucléiques tels que l'ADN ou ARN à des fins de recherche, de développement ou d'industrialisation dans le domaine de la biotechnologie ou plus généralement dans le domaine large de la biologie.