Die vorliegende Erfindung betrifft molekulare Einschlussverbindungen aus biokatalytisch hergestellten, wasserunlöslichen, linearen Polysacchariden und aus Fettsäuren oder deren Derivaten, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung.

Die Herstellung von Mikro-oder Nanokapseln für die Ummantelung oder Verkapselung von Substanzen oder Substanzgemischen ist Gegenstand vielfacher Untersuchungen. Dabei werden Mikrokapseln entweder in fein verteilte Dispersionen, bei denen das zu verkapselnde Material in einer schwammartigen Matrix eingebettet ist (z. B. KR94-9400419), oder in Strukturen, bei denen das zu verkapselnde Material vom Kapselmaterial nicht durchsetzt, sondern nur umgeben ist (z. B. Arshady et al. 1990, Polymer Eng. Sci., 30 (15), 905-914 und 915-924), unterteilt.

In beiden Fällen liegen in Bezug auf das Kapselmaterial multimolekulare, undefinierte Aggregate vor. Im Fall der Dispersionen ist dabei die zu verkapselnde Verbindung Teil der multimolekularen Aggregate. Weiterhin ist bekannt, dass auch Stärkebestandteile wie Amylose und Amylopektin zur Bildung obiger Mikrokapseln verwendet werden können.

Die Mikrokapseln dienen dabei vor allem zum Schutz des verkapselten Materials gegen äußere Einflüsse (z. B. Hitze, UV-Licht, Oxidation), können aber auch wesentlich zur vereinfachten Verarbeitbarkeit beitragen (z. B. Rieselfähigkeit, Klebrigkeit, Überführung von flüssigen Produkten in feste Produkte). Eine weitere Anwendung der Mikrokapseln ist die orale Applikation unter Beeinflussung sensorischer Eigenschaften.

Es ist bekannt, dass zur Bildung von Mikrokapseln (MK) native Stärken verwendet werden können. Dabei werden u. a. auch Stärken mit einem hohen Anteil an resistenten Stärken (hoher RS-Gehalt) eingesetzt, die erst im Dickdarm fermentativ abgebaut werden und nicht wie üblich bereits durch Pankreas Amylase im Magen und Dünndarm Demgegenüber wurden auch Komplexverbindungen nach Art des Jod-Stärke- Komplexes beschrieben, bei denen ein oder mehrere Jod-oder Fettsäure-Moleküle in eine Stärkehelix eingelagert sind (vergleiche Fig. 1). Dieser Komplex wird im Folgenden als molekulare Einschlussverbindung bezeichnet. Helikale Jod-Stärke- Komplexe und deren Verwendung für die medizinische und pharmazeutische Applikation werden beispielsweise von Gehnt und Eskin in der US 5, 955, 101 beschrieben.

Von den gleichen Autoren wird in der US 5,910,318 ein ähnlicher Komplex für die Maskierung von Jod bei Jod-Mangelkrankheiten beschrieben.

In der WO 94/17676 wird eine Zusammensetzung aus hydrolysierter Stärke als Matrix für inkorporierte lipophile Verbindungen beschrieben.

In der DE 44 11 414 wird eine Kombination aus molekularem Einschluss und Dispersion vorgeschlagen. Es wird ein Produkt zur enteralen Versorgung von Fettsäuren offenbart, bei dem diese mit einem Anteil von mindestens 10% im Produkt vorliegen. Dabei liegt die Fettsäure fein dispergiert in einer plastifizierten Stärkematrix vor, wobei ein Teil der Fettsäuren zumindest abschnittsweise in eine Amylose-Helix eingeschlossen ist. Es ist jedoch nicht klar, wie hoch der entsprechende Prozentsatz an in der Amylose-Helix molekular eingeschlossenen Fettsäure-Molekülen ist.

Es sind also molekulare Einschlussverbindungen bekannt, die auf nativer und somit verzweigter, wasserlöslicher Stärke oder deren Abbauprodukten beruhen und in denen nach landläufigem, fachmännischen Wissen maximal 4,6-Gew. % Fettsäure bezogen auf den Stärke-Anteil als molekulare Einschlussverbindung inkorporiert sein können (auch : Beladung) (vergleiche dazu auch Beispiel 4 und Krüger et. al., Monatsschr. Brauwiss. (1984) 37 (12) S. 505-512). Fanta et al. beschreiben die Komplexierung (Beladung) von 4,6-Gew. % Myristinsäure in Amylose-reicher Stärke (Carbohydr. Polym. (1999) 38 (1) S. 1-6). Wünschenswert wären jedoch Materialien und Verfahren, die einen molekularen Einschluss wesentlich höherer Mengen Fettsäuren ermöglichen würden (höhere Beladung).

Molekulare Einschlussverbindungen sind nämlich besonders gut geeignet für die Verwendung in pharmazeutischen Zubereitungen, als funktionelle Nahrungsmittel ("Functional Foods"), in kosmetischen Zubereitungen und als Lebensmittelzusatzstoffe sowie als Nahrungsergänzungsmittel, da die eingeschlossenen Verbindungen beispielsweise sehr gut vor molekularen Einflüssen wie z. B. dem Angriff von Enzymen geschützt sind. Die Einsatzgebiete solcher molekularer Einschlussverbindungen hängen dabei auch ganz wesentlich von den Eigenschaften der zum Einschluss verwendeten Materialien ab.

Für bestimmte Anwendungen der erfindungsgemäßen molekularen Einschlussverbindungen ist es besonders wünschenswert, wenn die verwendeten Materialien a-Amylase resistent sind, so dass die erfindungsgemäßen molekularen Einschlussverbindungen erst im Dickdarm verdaut werden. Dadurch kann vermieden werden, dass ein bezogen auf den gesamten Verdauungsvorgang schneller enzymatischer/hydrolytischer Abbau der molekularen Einschlussverbindung stattfindet. Besonders vorteilhaft ist es, wenn die im Innern der molekularen Einschlussverbindungen geschützt vorliegenden lipophilen Moleküle erst im Dickdarm freigesetzt werden, so dass sie direkt von den Zellen der Darmwand resorbiert werden können, ohne dass sie dabei vorher zu einem wesentlichen Anteil beispielsweise durch Pankreas-Enzyme enzymatisch

gespalten oder modifiziert werden. Dadurch kann die Bioverfügbarkeit der Verbindungen in besonders günstiger Weise erhöht werden.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, Materialien und Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit denen eine quantitativ wesentlich höhere Komplexierung von Fettsäuren in sogenannten molekularen Einschlussverbindungen erreicht werden kann. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, molekulare Einschlussverbindungen sowie Verfahren zu ihrer Herstellung zur Verfügung zu stellen, bei denen die zum Einschluss verwendeten Materialien neue Eigenschaften aufweisen, die für molekulare Einschlussverbindungen neue Einsatzgebiete bzw. besondere Vorteile bei der Verwendung eröffnen. Auch war es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, verbesserte molekulare Einschlussverbindungen und Verfahren zu deren Herstellung zur Verfügung zu stellen, die aufgrund der verwendeten Materialien als Bestandteil von humamnedizinischen oder veterinärmedizinischen Zusammensetzungen, als Nahrungs-und Futtermittelbestandteil sowie für kosmetische Anwendungen verwendbar sind.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch Bereitstellen einer molekularen Einschlussverbindung, dadurch gekennzeichnet, dass diese mindestens aus (a) einem biokatalytisch hergestellten, linearen, wasserunlöslichen Polysaccharid und (b) einer (einem) oder mehrerer (mehreren) Fettsäure (n) oder Fettsäurederivat (en) besteht.

Weitere bevorzugte Ausführungsformen und Gegenstände der vorliegenden Anmeldung werden in den Ansprüchen beschrieben.

Überraschenderweise konnte von den Erfindern festgestellt werden, dass mit absolut unverzweigten, wasserunlöslichen Polysacchariden, wie sie z. B. über den Weg der biokatalytischen Produktion erhältlich sind, molekulare

Einschlussverbindungen mit einer wesentlich höhere Beladungen im Vergleich mit nativen Stärken hergestellt werden können.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher monomolekulare Einschlussverbindungen aus biokatalytisch hergestellten, wasserunlöslichen, linearen Polysacchariden und helikal komplexierten lipophilen Molekülen, z. B. Fettsäuren oder deren Estern, wobei die Menge an helikal komplexierter lipophiler Verbindung mindestens 5 Gew.-% bezogen auf das eingesetzte Polyglucan beträgt. Bevorzugt beträgt die Menge an helikal komplexierter lipophiler Verbindung jedoch mindestens 7 Gew.-% bezogen auf das eingesetzte Polysaccharid, besonders bevorzugt mehr als 9 Gew.-% bezogen auf das eingesetzte Polysaccharid, ganz besonders bevorzugt mehr als 10 Gew.-% bezogen auf das eingesetzte Polysaccharid.

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen molekularen Einschlussverbindungen werden biokatalytisch hergestellte, lineare, wasserunlösliche Polysaccharide in einer Mischung mit einer lipophilen Verbindung homogenisiert und zu einer homogenen Matrix verarbeitet. Ein etwaiger ungebundener Überschuß der liphophilen Verbindung wird anschließend durch Extraktion entfernt.

Gegebenenfalls kann auch ein Weichmacher zugesetzt werden. Dabei kann die Homogenisierung beispielsweise durch eine Extrusion herbeigeführt werden. Es ist dem Fachmann klar, dass noch weitere, beispielsweise geschmacksverbessernde, das Aussehen beeinflussende oder in allgemeiner Form die Verarbeitbarkeit beeinflussende Substanzen zugefügt werden können.

Bevorzugte Weichmacher gemäß der Erfindung sind geruchlos, farblos, licht-, kälte-und wärmebeständig, nur wenig bis gar nicht hygroskopisch, wasserbeständig, nicht gesundheitsschädlich, schwer brennbar und möglichst wenig flüchtig, neutral reagierend, mit Polymeren und Hilfsstoffen mischbar und weisen ein gutes Gelierverhalten auf. Insbesondere sollen sie gegenüber den

verwendeten Komponenten Verträglichkeit, Geliervermögen und weichmachende Wirksamkeit aufweisen. Beispiele für geeignete Weichmacher sind Wasser, Polyalkohole wie Ethylenglykol, Glycerin, Propandiol, Erythritol, Mannitol, Sorbitol, mehrwertige Alkansäuren wie Maleinsäure, Bernsteinsäure, Adipinsäure, mehrwertige Hydroxyalkansäuren wie Milchsäure, 2-Hydroxybuttersäure, Citronensäure, Apfelsäure, Dimethylsulfoxid, Harnstoff oder weitere Lösungsmittel für Stärke.

Die Verwendung von Weichmachern ist dem Fachmann geläufig. Bevorzugt werden die Weichmacher in einem Anteil von 2 Gew.-% bis 50 Gew.-%, bezogen auf die Polysaccharidkomponente des erfindungsgemäßen Gemischs, eingesetzt.

Auch Duft-oder Aromastoffe, Bindemittel u. ä. können zugesetzt werden, wenn beispielsweise eine kosmetische oder pharmazeutische Verwendung oder eine Verwendung als Nahrungsmittel oder Nahrungsbestandteil vorgesehen ist.

Der Beladungsgrad nativer Stärke an mit Chloroform nicht auswaschbarer Palmitinsäure liegt bei 2-3 Gew.-%. Überraschenderweise erhöht sich dieser Anteil bei der erfindungsgemäßen molekularen Einschlussverbindung unter Verwendung von biokatalytisch hergestelltem, linearem und wasserunlöslichem 1,4-a-D-Polyglucan als Polysaccharid auf 7,7 Gew.-%. Die Fettsäure wird aus der molekularen Einschlussverbindung erst nach Abbau durch geeignete Enzyme oder chemische Hydrolyse unter geeigneten Bedingungen freigesetzt und kann dann reisoliert werden.

"Lineare, wasserunlösliche Polysaccharide"im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Polysaccharide, die aus Monosacchariden, Disacchariden oder anderen monomeren Bausteinen derart aufgebaut sind, dass die Monosaccharide, Disaccharide oder anderen monomeren Bausteine stets in der gleichen Art miteinander verknüpft sind. Jede so definierte Grundeinheit oder Baustein hat genau zwei Verknüpfungen, jeweils eine zu einem anderen Monomer. Davon

ausgenommen sind die beiden Grundeinheiten, die den Anfang und das Ende des Polysaccharids bilden. Diese Grundeinheiten haben nur eine Verknüpfung zu einem weiteren Monomer. Bei drei Verknüpfungen an einer Grundeinheit (kovalente Bindungen) spricht man von einer Verzweigung. Lineare, wasserunlösliche Polysaccharide im Sinne der Erfindung weisen keine Verzweigungen oder allenfalls nur in untergeordnetem Maß auf, so dass die sehr kleinen Verzweigungsanteile mit herkömmlichen analytischen Methoden wie beispielsweise der"C-oder'H-NMR-Spektroskopie nicht nachweisbar sind.

Unter dem Begriff"wasserunlösliche Polysaccharide"werden für die vorliegende Erfindung Verbindungen verstanden, die nach der Definition des Deutschen Arzneibuches (DAB = Deutsches Arzneibuch, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH, Stuttgart, Govi-Verlag GmbH, Frankfurt, 9. Auflage, 1987) entsprechend den Klassen 4 bis 7 unter die Kategorien"wenig löslich", "schwer lösliche","sehr schwer lösliche"bzw."praktisch unlösliche" Verbindungen fallen.

Im Fall der erfindungsgemäß verwendeten Polysaccharide bedeutet dies, dass mindestens 98 % der eingesetzten Menge, insbesondere mindestens 99,5 %, unter Normalbedingungen (T = 25 °C +/-20 %, p= 101325 Pascal +/-20 %) in Wasser unlöslich ist (entsprechend den Klassen 4 bzw. 5). Erfindungsgemäß bevorzugte wasserunlösliche Polysaccharide lassen sich daher der Klasse 4 des DAB zuordnen, d. h. dass eine gesättigte Lösung des Polysaccharids bei Raumtemperatur und Normaldruck etwa 30 bis 100 Volumenteile Lösungsmittel, d. h. Wasser, pro Massenteil Substanz umfasst (lg Substanz auf 30-lOOml Wasser). Erfindungsgemäß mehr bevorzugte wasserunlösliche Polysaccharide lassen sich der Klasse 5 des DAB zuordnen, d. h. dass eine gesättigte Lösung des Polysaccharids bei Raumtemperatur und Normaldruck etwa 100 bis 1000 Volumenteile Lösungsmittel, d. h. Wasser, pro Massenteil Substanz umfasst (lg Substanz auf 100-1000ml Wasser). Erfindungsgemäß noch mehr bevorzugte wasserunlösliche Polysaccharide lassen sich der Klasse 6 des DAB zuordnen, d. h.

dass eine gesättigte Lösung des Polysaccharids bei Raumtemperatur und Normaldruck etwa 1000 bis 10000 Volumenteile Lösungsmittel, d. h. Wasser, pro Massenteil Substanz umfasst (lg Substanz auf 1000-lOOOOml Wasser). Erfindungsgemäß am meisten bevorzugte wasserunlösliche Polysaccharide lassen sich der Klasse 7 des DAB zuordnen, d. h. dass eine gesättigte Lösung des Polysaccharids bei Raumtemperatur und Normaldruck etwa 10000 bis 100000 Volumenteile Lösungsmittel, d. h. Wasser, pro Massenteil Substanz umfasst (lg Substanz auf 10000-100000ml Wasser).

Für die vorliegende Erfindung werden schwer lösliche bis praktisch unlösliche Polysaccharide, insbesondere sehr schwer lösliche bis praktisch unlösliche Polysaccharide, bevorzugt.

"Sehr schwer löslich"entsprechend Klasse 6 kann durch folgende Versuchsbeschreibung veranschaulicht werden : Ein Gramm des zu untersuchenden Polysaccharids wird in 1 1 entionisierten Wasser auf 130° C unter einem Druck von 1 bar erhitzt. Die entstehende Lösung bleibt nur kurzzeitig über wenige Minuten stabil. Beim Erkalten unter Normalbedingungen fällt die Substanz wieder aus. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur und Abtrennung mittels Zentrifugation können unter Berücksichtigung der experimentellen Verluste mindestens 66 % der eingesetzten Menge zurückgewonnen werden.

Bevorzugt handelt es sich um wasserunlösliches Poly-a-1, 4-D-Glucan.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden lineare, wasserunlösliche Polysaccharide, welche in einem biokatalytischen (Synonym : biotransformatorischem) oder einem fermentativen Prozess hergestellt wurden, bevorzugt.

Durch Biokatalyse (Synonym : Biotransformation) hergestellte lineare Polysaccharide im Rahmen dieser Erfindung bedeutet, dass das lineare Polysaccharid durch katalytische Reaktion von monomeren Grundbausteinen wie oligomeren Sacchariden, z. B. von Mono-und/oder Disacchariden, hergestellt wird, indem ein sogenannter Biokatalysator, üblicherweise ein Enzym, unter geeigneten Bedingungen verwendet wird. Biokatalysen können mit lebenden, wachsenden Zellen, mit Zellen im stationären Zustand, mit immobilisierten Zellen, mit isolierten oder gentechnisch hergestellten löslichen oder immobilisierten Enzymen, im Ein-oder Mehrphasensystem, durchgeführt werden.

Lineare Polysaccharide aus Fermentationen sind im Sprachgebrauch der vorliegenden Erfindung lineare Polysaccharide, die durch fermentative Prozesse unter der Verwendung von in der Natur vorkommenden Organismen wie Pilzen, Algen oder Bakterien oder unter Verwendung von in der Natur nicht vorkommenden Organismen unter Zuhilfenahme von gentechnischen Methoden allgemeiner Definition modifizierten natürlichen Organismen wie Pilzen, Algen oder Bakterien gewonnen werden oder unter Einschaltung und Mithilfe von fermentativen Prozessen gewonnen werden können.

Lineare Polysaccharide gemäß der vorliegenden Erfindung können neben dem bevorzugten 1,4-oc-D-Polyglucan auch weitere Polyglucane oder andere lineare Polysaccharide wie etwa Pullulane, Pektine, Mannane oder Polyfructane sein.

Darüber hinaus können lineare Polysaccharide zur Herstellung der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen molekularen Einschlussverbindungen auch aus der Reaktion weiterer nicht-linearer Polysaccharide dadurch gewonnen werden, dass nicht-lineare Polysaccharide, die Verzweigungen enthalten, derart mit einem Enzym behandelt werden, dass es zur Spaltung der Verzweigungen kommt, so dass nach ihrer Abtrennung lineare Polysaccharide vorliegen. Bei diesen Enzymen kann es sich beispielsweise um Amylasen, iso-Amylasen,

Gluconohydrolasen oder Pullulanasen handeln. Allerdings sollten die erfindungsgemäßen Polysaccharide immer strikt linear sein.

In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung ist das verwendete Polysaccharid 1,4-a-D-Polyglucan. Bevorzugt wird das 1,4-a-D- Polyglucan mittels eines biokatalytischen (biotransformatorischen) Prozesses mit Hilfe von Polysaccharidsynthasen, Stärkesynthasen, Glykosyltransferasen, a-1, 4- Glucantransferasen, Glycogensynthasen, Amylosucrasen oder Phosphorylasen hergestellt.

Die Molekulargewichte Mw der erfindungsgemäß verwendeten linearen Polysaccharide können in einem weiten Bereich von 103 g/mol bis 10'g/mol variieren. Für das vorzugsweise verwendete lineare Polysaccharid 1,4-a-D- Polyglucan werden Molekulargewichte Mw von 104 g/mol bis 105 g/mol, insbesondere 2 x 104 g/mol bis 5 x 104 g/mol bevorzugt.

Ferner können die erfindungsgemäßen a-Amylase-resistenten Polysaccharide dadurch gekennzeichnet sein, dass die 1,4-a-D-Polyglucane chemisch in an sich bekannter Weise modifiziert sind.

So können die 1,4-a-D-Polyglucane durch Veretherung oder Veresterung in 2-, 3- oder 6-Position chemisch modifiziert worden sein. Der Fachmann ist mit dieser chemischen Modifizierung hinlänglich vertraut ; vgl. beispielsweise folgende Literatur : 1. Functional Properties of Food Components, 2nd edition, Y. Pomeranz, Academic Press (1991).

2. Lehrbuch der Lebensmittelchemie, Belitz & Grosch, Springer Verlag (1992).

3. Citrat Starch Possible Application as Resistent Starch in Different Food Systems, B. Wepner et al., European Air Concerted Action, Abstract : air3ct94- 2203, Functional Properties of Non-digestible Carbohydrates, Pro Fibre-Tagung, Lissabon, Februar 1998, Seite 59.

Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung versteht man unter einem RS-Gehalt den Gehalt an a-Amylase-resistenten Polysacchariden, wie er nach der Methode von Englyst et al. (Classification and measurement of nutritionally important starch fractions, European Journal of Clinical Nutrition, 46 (Suppl. 23) (1992) 33- 50) bestimmt werden kann.

Weiterhin wird für die Zwecke der vorliegenden Erfindung unter einer molekularen Einschlußverbindung ebenso der einzelne Komplex aus lipophiler Verbindung und Polysaccharid (Figur 1), wie auch eine größere Menge dieser Verbindungen z. B. in Form eines Pulvers etc. verstanden.

Die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen molekularen Einschlussverbindungen weisen in einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung im Vergleich zu nativer Stärke einen hohen Grad an Resistenz gegenüber a-Amylase auf. In einem besonders bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung sind die erfindungsgemäßen a- Amylase-resistenten Einschlussverbindungen dadurch gekennzeichnet, dass ein RS-Gehalt nach Englyst von mindestens 30, bevorzugt von 50, besonders bevorzugt von 75 und ganz besonders bevorzugt von 95 Gew.-% vorliegt.

Es ist dabei für die vorliegende Erfindung von hoher Bedeutung, dass die erfindungsgemäß verwendbaren biokatalytisch hergestellten, linearen und wasserunlöslichen Polysaccharide sich in einer ganzen Reihe von Merkmalen sowohl von nativer Stärke als auch von im Stand der Technik beschriebenen

enzymatischen"Entzweigungsprodukten"nativer Stärke unterscheiden. Eine Zusammenstellung solcher Unterschiede ist in der folgenden Tabelle 1 angegeben.

Tabelle 1 Unterschiede zwischen nativer Stärke und erfindungsgemäß einsetzbaren, biokatalytisch hergestellten, linearen und wasserunlöslichen Polysacchariden, insbesondere 1,4-a-D-Polyglucane Native Stärke erfindungsgemäß verwendbares, biotechnisch hergestelltes, lineares 1,4--D-Polyglucan enthält nur Polyglucane mit verzweigten streng linear Ketten enthält Phosphorsäureester von Glucanen enthält keine Phosphorsäureester löslich in Glycerin nicht löslich in Glycerin kristalliner Anteil entspricht höchstens dem kann durch Umkristallisieren vollständig Anteil an Amylopektin kristallin hergestellt werden kann aus der Lösung durch Kristallisieren kann aus der Lösung durch Kristallisieren nicht gefällt werden gefällt werden Nach Schmelzen der"A"-Struktur kann Die"A"-Struktur kann durch diese durch Rekristallisation nicht Rekristallisation wiederhergestellt werden. wiederhergestellt werden. Filmbildung möglich Filmbildung nicht möglich

Obwohl darüber keine Sicherheit herrscht, gehen die vorstehend genannten Erfinder zur Zeit davon aus, dass die im Vergleich mit Einschlussverbindungen aus dem Stand der Technik überraschend hohe Bindekapazität der erfindungsgemäßen Einschlussverbindungen sich nicht auf ein einzelnes dieser Stoffinerkmale zurückführen lässt, sondern dass vielmehr die Summe dieser Eigenschaften, möglicherweise die strikte Linearität der erfindungsgemäßen Moleküle sowie das Fehlen der Phosphatester sowie die hohe Wasserunlöslichkeit in ihrer Summe dafür verantwortlich sind, dass die erfindungsgemäßen Einschlussverbindungen solche überraschend günstigen Eigenschaften aufweisen.

Da es sich bei dem linearen 1, 4-a-D-Polyglucan um eine im Vergleich zur nativen Stärke resistenteren Form (RS >30 %) handeln kann, hat dies Vorteile bei der oralen Applikation von Verbindungen, die ihre Wirkung erst nach dem Durchtritt des Magens und des Dünndarm entfachen sollen.

So können beispielsweise lipophile Wirkstoffe gezielt erst im Dickdarm freigesetzt werden.

Beispiel für erfindungsgemäß verwendbare lipophile Stoffe sind gesättigte Fettsäuren oder ungesättigte Fettsäuren, sogenannte PUFAs. Unter PUFAs (Englisch : Poly-Unsaturated Fatty Acids ; Deutsch : mehrfach ungesättigte Fettsäuren) versteht man im Sprachgebrauch der vorliegenden Erfindung Fettsäuren mit einer Kettenlänge von mehr als 12 Kohlenstoffatomen mit mindestens zwei Doppelbindungen (siehe Tabelle 2). Dabei können die Fettsäuren sowohl in Form der freien Fettsäuren, als Fettsäureester, als physiologisch verträgliche Salze der Fettsäuren, als Triglyceride oder in Form anderer Derivate verwendet werden.

Die folgende Tabelle zeigt eine nicht erschöpfende Zusammenstellung von erfindungsgemäß besonders gut geeigneten Fettsäuren.

Tabelle 2 : Erfindungsgemäß besonders gut geeigneten Fettsäuren IUPAC-Name Trivialname C 12 Dodecansäure Laurinsäure C 14 Tetradecansäure Myristinsäure C 14 : 1 cis-9-Tetradecensäure Myristoleinsäure C15 Pentadecansäure C16 Hexadecansäure Palmitinsäure C16 : 1 cis-9-Hexadecensäure Palmitoleinsäure C16 : 1 trans-9-Hexadecensäure Palmitelainsäure C 17 Heptadecansäure Margarinsäure/Standard C 18 Octadecansäure Stearinsäure C 18 : 1 cis-9-Octadecensäure Ölsäure C18 : 1 trans-9-Octadecensäure Elaidinsäure C18 : 1 trans (cis)-11-Octadecensäure C18 : 1 cis-6-Octadecensäure Petroselinsäure C 18 : 2 cis, cis-9, 12-Octadecadicensäure Linolsäure w-6 C 18 : 2 trans, trans-9, 12-Octaqdecadiensäure Linoleaidinsäure w-6 C18 : 2 Octadecadiensäure, conjugiert Konjuenfettsäure C 18 : 3 All-cis-9, 12, 15-Octadecatriensäure α-Linolensäure w-3 CIS : 3 All-cis-6, 9, 12-Octadecatriensäure γ-Linolensäure, GLA w-6 C18 : 4 All-cis-6, 9,12, 15-Octadecatetraensäure Stearidonsäure w-3 C20 Eicosansäure Arachidinsäure C20 : 1 cis-11-Eicosensäure C20 : 2 cis,cis-11,14-Eicosadiensäure w-6 C20 : 3 All-cis-8,11,14-Eicosatriensäure Homo-γ-Linolensäure w-6 C20 : 3 All-cis-11, 14, 17-Eicosatriensäure w-3 C20 : 4All-cis-5, 8,11, 14-Eicosatetraensäure Arachidonsäure, ARA w-6 C20 : 4 All-cis-8,11, 14, 17-Eicosatetraensäure ETA w-3 C20 : 5 All-cis-5, 8,11,14,17-Eicosapentaensäure EPA, Timnodonic acid w-3 C22 Docosansäure Behensäure C22 : 1 cis-13-Docosensäure Erucasäure C22 : 1 trans-13-Docosensäure C22 : 2 cis, cis-13, 16-Docosadiensäure w-6 C22 : 3 All-cis-13, 16,19-Docosatriensäure w-3 C22 : 4 All-cis-7, 10,13,16-Docosatetraensäure w-6 C22 : 5 All-cis-7, 10,13,16,19-DPA Fischöl w-3 Docosapentaensäure C22 : 5 All-cis-4, 7,10,13, 16- DPA Protisten w-6 Docosapentaensäure C22 : 6 All cis-4, 7,10,13,16,19- DHA w-3 Docosahexaensäure C24 Tetracosansäure C24 : 1 cis-15-Tetracosensäure Nervonsäure C26 Hexacosansäure Durch Einschluss in die erfindungsgemäßen besonders bevorzugten a-Amylase resistenten molekularen Einschlussverbindungen können diese Fettsäuren vor einem vorzeitigen Verdau im Verdauungssystem geschützt werden.

Es ist klar, daß es sich bei der Polysaccharidkomponente der erfindungsgemäßen Mischung auch um ein Gemisch unterschiedlicher biokatalytisch hergestellter, wasserunlöslicher und linearer Polysaccharide handeln kann.

Anwendungen für molekulare Einschlussverbindungen finden sich u. a. in den Krankheitsgebieten Darmkrebs (Bougnoux 1999, Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab.

Care, 2 (2), 121-126 ; Wisont 1999, Inform 10 (5), 380-397), entzündliche Darmerkrankungen (z. B. Morbus Crohn oder Collitis), mentale oder neurologische Erkrankungen (z. B. Depression, Schizophrenie, Alzheimer) und Gefäßerkrankungen (z. B. Bluthochdruck, Arteriosklerose).

Weitere wichtige Anwendungsgebiete der erfindungsgemäßen molekularen Einschlussverbindungen liegen in den Bereichen Kinderernährung, Säuglings-und Frühgeborenenernährung, klinische Ernährung, funktionelle Nahrungsmittel ("Functional Foods"), kosmetische Anwendungen und Lebensmittelzusatzstoffe.

Figur 1 zeigt eine schematische Darstellung der molekularen Einschlussverbindung. (A) : Vorgang der Bindung einer Fettsäure in die Polysaccharidhelix ; (B) vollständig eingelagerte Fettsäure.

Figur 2 zeigt Röntgenspektren für Poly-a-1, 4-D-Glucan mit 35% Glycerin (1) und zusätzlich 2,5% (2), 5% (3) und 10% (4) Palmitinsäure.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung näher.

Beispiel 1 : Herstellung von Poly-a-1, 4-D-Glucan In einem 5-1-Gefäss werden 5 1 einer sterilisierten 30-proz. Saccharose Lösung gegeben. Ein Enzymextrakt, der eine Amylosucrase aus Neisseria polysaccharea enthält (s. WO 95 31 553), wird in einer Portion zugegeben und gemischt. Die eingesetzte Enzymaktivität beträgt in diesem Experiment 148000 Units. Das verschlossene Gefäß wurde bei 37 OC inkubiert. Während der Dauer der Biotransformation bildet sich ein weißer Niederschlag. Die Reaktion wird nach 39 h beendet. Der Niederschlag wird abzentrifugiert, bei-70 °C eingefroren und anschließend gefriergetrocknet. Die Masse des gefriergetrockneten Feststoffes beträgt 526,7 g (70,2 % Ausbeute).

Zur Abtrennung niedermolekularer Zucker werden 200 g des Feststoffes mit Wasser 30 min unter Rühren bei Raumtemperatur gewaschen, bei-70 °C eingefroren und gefriergetrocknet. Der Gehalt an Fruktose und Saccharose wird nach Lösen des Feststoffes in DMSO durch einen gekoppelten enzymatischen Assayl bestimmt und beträgt 4,61 mg Fruktose pro 100 mg Feststoff (4,6 %). Der Gehalt an Saccharose liegt unter der Nachweisgrenze.

Der Überstand der Biotransformation wird bei 95 °C denaturiert. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde erneut zentrifugiert. Der klare Überstand wurde bei- 70 °C eingefroren und über 3 Tage bei 4 °C aufgetaut. Der so erzeugte Niederschlag wurde bei-70 °C eingefroren und gefriergetrocknet.

Zur Abtrennung niedermolekularer Zucker werden 39,5 g des Feststoffes mit Wasser 30 min unter Rühren bei Raumtemperatur gewaschen, bei-70 °C eingefroren und gefriergetrocknet. Der Gehalt an Fruktose und Saccharose wird nach Lösen des Feststoffes in DMSO durch einen gekoppelten enzymatischen Assay gemäß Stitt et al. (Meth. Enzym., 174 (1989) 518-552) bestimmt und beträgt 2,27 mg Fruktose pro 100 mg Feststoff. Der Gehalt an Saccharose liegt unter der Nachweisgrenze.

Beispiel 2 : Charakterisierung des Ausgangsmaterial Bestimmung des Molekulargewichts des mit Amylosucrase synthetisierten wasserunlöslichen Poly-a-1, 4-D-Glucan aus Beispiel 1 (Figur 1) Es werden 2 mg des Poly- (1, 4- (-D-glukans) aus Beispiel 1 bei Raumtemperatur in Dimethylsulfoxid (DMSO, p. a. von Riedel-de-Haen) gelöst und filtriert (2 (m).

Ein Teil der Lösung wird in eine Säule der Gelpermeationschromatographie infiziert. Als Elutionsmittel wird DMSO verwendet. Die Signalintensität wird mittels eines RI-Detektors gemessen und gegen Pullulanstandards (Firma Polymer Standard Systems) ausgewertet. Die Flußrate beträgt 1.0 ml pro Minute.

Die Messung ergibt ein Zahlenmittel des Molekulargewichts (Mn) von 2.326 g/mol und ein Gewichtsmittel des Molekulargewichts (Mw) von 3.367 g/mol. Die Wiederfindungsrate beträgt 100 %.

Beispiel 3 : Bestimmung des maximal möglichen Komplexierungsgrades Eine Mischung aus 200g Poly-a-1, 4-D-Glucan (Material aus Beispiel 1), 70g Glycerin und 5g, lOg, 20g bzw. 30g Palmitinsäure (entspricht 2,5%, 5%, 10% bzw. 15% bezogen auf den Gewichtsanteil des Polyglucans) werden vorgelegt und im Extruder bei 170°C und lOOupm homogenisiert. Vom Produkt werden nach dem Abkühlen Proben entnommen. Mit Hilfe der DSC (Digital Scanning Calorimetry) werden die Schmelzpeaks der Proben bestimmt. Anschließend werden mit Hilfe einer Soxhlet-Extraktion (Chloroform, 48h) durch Herauslösen der nicht komplexierten Palmitinsäure der Komplexierungsgrad Kx bestimmt.

Als Ergebnis der Komplexbildung wird Palmitinsäure in der Amylose-Helix eingeschlossen, es existiert keine kohärente Palmitinphase mehr. Erst bei einem Überschuß an Palmitinsäure liegt der nichtkomplexierte Teil der Säure als kohärente Phase mit eigenem Schmelzpeak vor. Die Abwesenheit des Palmitinsäure-Schmelzpeaks ist somit ein Beweis dafür, dass die Komplexierung vollständig stattgefunden hat. Ist noch ein Rest-Schmelzpeak vorhanden, so kann aus der Differenz der Flächen der Anteil der komplexierten Säure ermittelt werden. Diese Werte sind in Tabelle 3 aufgeführt und den Ergebnissen der Soxhlet-Extraktion gegenübergestellt. In der letzten Spalte der Tabelle 3 sind darüber hinaus Ergebnisse einer Soxhlet-Extraktion aufgeführt, bei der bei der Probenherstellung nach Beispiel 1 native Stärke (gereinigte Kartoffelstärke) anstelle von Poly-a-l, 4-D-Glucan eingesetzt wurde.

Tabelle 3 : Ergebnisse von DSC und Soxhlet-Extraktion Palmitin-Kx [%] Peak [°C] Peak [°C] Soxhlet-Extrakt Lineares Soxhlet-Extrakt säure [%] Aufheizen Aufheizen Abkühlen Polyglucan [%] native Stärke [%] 2, 5 2, 5 71--2, 2 1, 9 5 5,0 65 --- 4,7 2,4 10 7,6 65 34 7,4 2,5 15 7,7 66 49 7,5 2,5 100 --- 68 49 -- --- Die Resultate lassen darauf schließen, dass unter Verwendung von 35% Glycerin als Weichmacher 7,5-7,7% Palmitinsäure, bezogen auf das Gewicht des reinen Poly-a-1, 4-D-Glucan, komplexiert werden kann. Hingegen ist durch Verwendung von nativer Kartoffelstärke maximal eine Komplexierung von 2,5% Palmitinsäure möglich.

Beispiel 4 : Strukturuntersuchung durch Röntgenbeugung.

Die im Beispiel 3 beschriebenen Proben wurden einer Röntgen-Strukturanalyse unterzogen. Röntgenspektren für Poly-α-1, 4-D-Glucan mit 35% Glycerin (1) und zusätzlich 2,5% (2), 5% (3) und 10% (4) Palmitinsäure sind in Figur 2 dargestellt.

Es ist zu erkennen, dass sich das Spektrum für das reine, weichgemachte Poly-a- 1,4-D-Glucan (1) aus dem amorphen Halo, den drei größeren Peaks bei 13,7,15,5 und 21, 1° 20, sowie einigen kleineren Peaks zusammensetzt. Die Reflexe bei 13,7 und 21,1° sind charakteristisch für die einfache Helix der V-Amylose, ein Strukturtyp, der typisch für komplexierte Stärke ist. Daneben sind noch einige weitere Strukturen vorhanden, wie der Reflex bei 15,5° und die verschiedenen kleineren Reflexe belegen. Diese Strukturen nehmen mit der Zunahme des Palmitinsäureanteils ab, während der V-Amylose Strukturtyp sich weiter ausprägt,

deutlich sichtbar an Reflex 13,7. Dieser ist ohne Palmitinsäureanteil nur schwach ausgebildet und wird mit Zunahme des Palmitinsäureanteils ( (2)-> (4)) ausgeprägter. Beim maximalen Komplexierungsgrad liegt die gesamte kristalline Phase im V-Amylose Strukturtyp vor. Bei 10% Palmitinsäure (4) ist bei 7,5° 26 ein Reflex zu beobachten, der reiner kristallisierter Palmitinsäure zuzuordnen ist.

Die Anwesenheit von nicht-komplexierter Palmitinsäure bei dieser Konzentration ist im Einklang mit den Resultaten der DSC-Messung und der Soxhlet-Extraktion in den Röntgenspektren erst ab 10% Palmitinsäure festzustellen, bei 2,5 und 5% tritt kein Reflex auf.