La presente invención se encuadra en el campo de Ia biomedicina y se refiere a células madre multipotentes derivadas de estroma de mesenterio, y, preferiblemente, de estroma de epiplón, con capacidad para diferenciarse y dar lugar a células con características de células especializadas, y a los métodos de obtención de las mismas. Dichas células pueden usarse en Ia preparación de medicamentos y composiciones farmacéuticas para Ia prevención o el tratamiento de lesiones, enfermedades degenerativas o genéticas, así como en

Ia evaluación de Ia respuesta celular a agentes biológicos o farmacológicos.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

Actualmente, el desarrollo de Ia tecnología en el campo de las células madre ha hecho que éstas sean consideradas como una prometedora terapia para diversas patologías humanas, incluyendo: lesiones condrales, óseas y musculares, enfermedades neurodegenerativas, rechazo inmunológico, enfermedades cardiacas y desórdenes de Ia piel (US 5.811.094, 5.958.767, 6.328.960, 6.379.953, 6.497.875).

Por otra parte, las células madre pueden ser una fuente potencial de cantidades virtualmente ilimitadas de células, tanto indiferenciadas como diferenciadas, para Ia realización de ensayos in vitro dirigidos a Ia búsqueda y desarrollo de nuevos compuestos terapéuticos (Patente US 6.294.346), así como para determinar su actividad, metabolismo y toxicidad.

Según el origen de las células madre podemos diferenciar entre células madre embrionarias (células ES) y células madre adultas. Las células ES proceden de Ia masa celular interna de los blastocistos y tienen como característica principal el hecho de ser pluripotenciales, Io que significa que pueden dar lugar a cualquier tejido adulto derivado de las tres capas embrionarias (Evans y Kaufman, 1981 ; Thomson et al., 1998; Patente US 6.200.806). Las células madre adultas son células parcialmente comprometidas presentes en tejidos adultos, las cuales pueden permanecer décadas en el cuerpo humano, aunque con el paso del tiempo comienzan a escasear (Fuchs y Segre, 2002).

A pesar de Ia alta pluripotencialidad de las células ES, las terapias basadas en el uso de células madre adultas presentan una serie de ventajas técnicas sobre aquellas basadas en células ES. En primer lugar, las células derivadas de células ES son normalmente objeto de rechazo por parte del sistema inmunológico mientras que las células madre adultas no son rechazadas por el sistema inmune si han sido obtenidas por trasplante autólogo o transplante heterólogo de células inmunocompatibles. Además el hecho de que estén parcialmente comprometidas reduce el número de etapas de diferenciación necesarias para generar células especializadas. Por otra parte, el uso de este tipo de células no está asociado a ningún tipo de controversia ética o legal. Finalmente, aunque este tipo de células presente una menor potencialidad de diferenciación que las células ES, Ia mayoría de ellas son realmente multipotentes (Joshi y Enver, 2002) Io que significa que pueden diferenciarse a más de un tipo de tejido.

Actualmente, las dos fuentes más empleadas para derivar células madre multipotentes han sido Ia médula ósea y el tejido adiposo subcutáneo, fundamentalmente obtenido de liposucciones.

En el primer caso, Ia extracción de médula ósea es un procedimiento clínico muy invasivo, normalmente limitado a pacientes con diferentes patologías hematológicas y del cual Ia cantidad de material celular obtenido es muy limitada. Es importante destacar que para el uso potencial de células madre multipotentes en terapias celulares es muy importante partir de una cantidad celular suficiente desde Ia propia derivación de las células. Por su propia naturaleza, las células madre multipotentes proliferan in vitro y es posible mantenerlas durante un elevado numero de pases de cultivo, con Io cual es posible expandir su cultivo para obtener una cantidad celular elevada, sin embargo, para su uso en terapias de reemplazo no se debe utilizar células que han sido mantenidas durante un elevado número de pases de cultivo, fundamentalmente para minimizar riesgos de transformación celular y pérdidas de capacidad de diferenciación. Por tanto, es importante encontrar otros tejidos que proporcionen una mayor cantidad inicial de células madre multipotentes, como es el caso del tejido adiposo.

En cuanto a Ia obtención de células madre multipotentes derivadas de tejido adiposo, hasta el momento se han descrito líneas derivadas de liposucciones y grasa subcutánea, siendo en ambos casos el rendimiento de derivación más elevado que en el caso de médula ósea. No obstante, no todo el tejido adiposo humano tiene exactamente las mismas funciones endocrinas y por tanto su naturaleza y composición celular varía.

Actualmente, las células madre multipotentes son Ia materia prima con mayor potencial de éxito para su uso en terapias de reemplazo celular. Además, constituyen una fuente de células indiferenciadas y diferenciadas de gran utilidad para Ia realización de ensayos in vitro dirigidos al desarrollo de compuestos terapéuticos. Existe por tanto una necesidad de obtener células madre multipotentes con elevada plasticidad y capacidad de expansión en cultivo por periodos largos.

EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a células madre multipotentes derivadas de estroma de mesenterio, y, preferiblemente, de estroma de epiplón, con capacidad para diferenciarse y dar lugar a células con características de células especializadas, y a los métodos de obtención de las mismas. Dichas células pueden usarse en Ia preparación de medicamentos y composiciones farmacéuticas para Ia prevención o el tratamiento de lesiones, enfermedades degenerativas o genéticas, así como en Ia evaluación de Ia respuesta celular a agentes biológicos o farmacológicos.

Los inventores han obtenido líneas de células madre multipotentes derivadas del estroma de mesenterio, y concretamente, de estroma de epiplón humano. Estas líneas celulares poseen Ia capacidad para ser expandidas por periodos largos de cultivo y tienen una elevada plasticidad celular, por Io que pueden ser empleadas en terapia celular de lesiones, enfermedades degenerativas o genéticas, con las ventajas técnicas que presentan las células madre adultas multipotentes, tales como Ia simplificación del protocolo para Ia inducción de su diferenciación o Ia reducción de Ia posibilidad de rechazo inmunológico en el transplante. Por otra parte, estas líneas celulares pueden ser utilizadas para el desarrollo de estudios farmacológicos, toxicológicos, farmacogenómicos o genéticos.

Un primer aspecto de Ia invención, se refiere a una célula madre multipotente aislada derivada de estroma de mesenterio de mamífero, de ahora en adelante, "célula madre multipotente de Ia invención", caracterizada por:

a) ser positiva para los siguientes antígenos de superficie: CD105,

CD90, CD73, CD29, CD49d y CD49a. b) ser negativa para los siguientes antígenos de superficie: CD45, CD34, CD14 y HLA DR.

El mesenterio, es un término en anatomía animal, incluyendo humanos, que designa a una membrana serosa que constituye un repliegue plano del peritoneo, principalmente de tejido conjuntivo, que contiene numerosos vasos sanguíneos y linfáticos con destino a las visceras abdominales, y que une al estómago y al intestino con las paredes posteriores del abdomen, dando así posicionamiento a estos órganos digestivos. En el mesenterio, en especial de personas obesas, se acumula un elevado número de células adiposas. Los mésentenos incluyen: el mesenterio, propiamente dicho, que envuelve a determinadas regiones del intestino delgado (como, por ejemplo, el yeyuno y el ¡león), el mesocolon, que envuelve a determinadas regiones del colon (como, por ejemplo, el mesoapéndice, que envuelve el apéndice vermiforme; el mesocolon transverso, que retiene al colon transverso; o el mesocolon sigmoide, que envuelve al colon sigmoideo); el ligamento ancho del útero, que envuelve al útero; y el omento o epiplón, que es un repliegue específico del peritoneo (que se divide en dos partes: el epiplón mayor o gastrocólico, y el epiplón menor o gastrohepático). El epiplón mayor o gastrocólico recubre Ia curvatura mayor del estómago y Io une con el bazo y el colon transverso y se continúa como un delantal situado en Ia cara anterior del intestino. Es el lugar de acumulación de tejido adiposo en las personas obesas. La unión específica peritoneana de Ia curvatura mayor del estómago con el bazo se Ie llama también epiplón gastroesplénico. Desde el bazo también parte un pliegue que se une con Ia cola del páncreas, llamado epiplón pancreático-esplénico. El epiplón menor o gastrohepático recubre el borde izquierdo del hígado uniéndolo con el borde derecho del estómago, duodeno y a Ia curvatura menor del estómago.

En una realización preferida de este aspecto de Ia invención, Ia célula madre multipotente de Ia invención es derivada de epiplón de mamífero. En una realización más preferida, Ia célula madre multipotente de Ia invención procede de un primate y, en una realización aún más preferida, procede de un humano.

Las células madre se pueden clasificar según su potencial de diferenciación: las células madre totipotenciales son capaces de producir tejido embrionario y extraembrionario; las células madre pluripotenciales tienen Ia habilidad de diferenciarse en tejidos procedentes de cualquiera de las tres capas embrionarias y, por último, las células madre multipotenciales, capaces de diferenciarse en distintos tipos celulares procedentes de Ia misma capa embrionaria (Weissman et al. Annu Rev CeII Dev Biol 2001 ; 17:387-403). Por tanto, el término "célula madre multipotencial" o "células madre multipotenciales", tal y como se utiliza en Ia presente descripción, se refiere a célula capaces de diferenciarse en distintos tipos celulares procedentes de Ia misma capa embrionaria.

Otro aspecto de Ia invención se refiere a una población celular aislada constituida por, o que comprende, células madre multipotentes derivadas de estroma de mesenterio de mamífero ("células madre multipotentes de Ia invención"), caracterizada por:

a) ser positiva para los siguientes antígenos de superficie: CD105,

CD90, CD73, CD29, CD49d y CD49a. b) ser negativa para los siguientes antígenos de superficie: CD45, CD34, CD14 y HLA DR.

En una realización preferida de este aspecto de Ia invención, esta población celular está constituida por, o comprende, células madre multipotentes derivadas de estroma de epiplón de mamífero. Preferiblemente, esta población celular constituida por, o que comprende, células madre multipotentes derivadas de estroma procede de un primate y, más preferiblemente, de un humano.

La célula madre multipotente de Ia invención, o Ia población celular constituida por, o que comprende, las células madre multipotentes de Ia invención, puede ser caracterizada mediante Ia identificación de proteínas de superficie y/o intracelulares, genes, y/u otros marcadores indicativos de su estado indiferenciado. En el Ejemplo 1 de Ia patente, Ia población de células madre multipotentes es caracterizada mediante inmunocitometría. Otros métodos que pueden ser utilizados para Ia caracterización incluyen, pero no se limitan a: análisis inmunocitoquímico, análisis por northern blot, RT-PCR, análisis de expresión génica en microarrays, estudios proteómicos o análisis por differential display. Las células madre multipotentes derivadas del estroma pueden ser inducidas a diferenciarse in vitro para dar lugar a células que expresen al menos una característica propia de una célula especializada. Tales tipos celulares parcial o totalmente diferenciados incluyen, pero no se limitan a linajes celulares propios de los siguientes tejidos y órganos: cartílago, hueso, grasa, músculo, tejido nervioso, piel, hígado o páncreas, por ejemplo, condrocitos, osteocitos, adipocitos, miocitos, cardiomiocitos, neuronas, astrocitos, oligodendrocitos, queratinocitos, hepatocitos o células pancreáticas.

Otro aspecto de Ia presente invención, se refiere a una célula aislada diferenciada a partir de Ia célula madre multipotente de Ia invención caracterizada porque expresa, al menos, una característica propia de una célula especializada. En una realización preferida de Ia invención, Ia célula diferenciada a partir de Ia célula madre multipotente de Ia invención expresa, al menos, una característica propia de una célula especializada seleccionada de Ia lista que comprende: condrocito, osteocito, adipocito, miocito, cardiomiocito, neurona, astrocito, oligodendrocito, queratinocito, hepatocito o célula pancreática. En una realización más preferida de Ia presente invención, Ia célula diferenciada a partir de Ia célula madre multipotente de Ia invención expresa, al menos, una característica propia de una célula especializada seleccionada de Ia lista que comprende: condrocito, osteocito o adipocito.

Otro aspecto de Ia invención se refiere a una población celular aislada diferenciada a partir de Ia célula madre multipotente de Ia invención, o a partir de una población celular aislada constituida por, o que comprende, las células madre multipotentes de Ia invención, caracterizada porque expresa, al menos, una característica propia de una célula especializada. En una realización preferida de este aspecto de Ia invención, esta población celular diferenciada se caracteriza porque expresa, al menos, una característica propia de una célula especializada de Ia lista que comprende: condrocito, osteocito, adipocito, miocito, cardiomiocito, neurona, astrocito, oligodendrocito, queratinocito, hepatocito o célula pancreática. En una realización más preferida de este aspecto de Ia invención, esta población celular diferenciada se caracteriza porque expresa, al menos, una característica propia de una célula especializada de Ia lista que comprende: condrocito, osteocito o adipocito.

Los términos "célula diferenciada" o "población celular diferenciada" se refieren a Ia célula aislada o a Ia población celular aislada obtenida al cultivar a Ia célula o las células madre multipotentes de Ia invención en condiciones que favorezcan Ia inducción de su diferenciación a células especializadas, y que como consecuencia de ello, expresan, al menos, una característica propia de una célula especializada.

La célula diferenciada o Ia población celular diferenciada puede ser caracterizada mediante Ia identificación de proteínas de superficie y/o intracelulares, genes, y/u otros marcadores indicativos de diferenciación de las células madre de Ia presente invención a diversos linajes. Métodos utilizados para Ia caracterización incluyen, pero no se limitan a: inmunocitometría, análisis inmunocitoquímico, análisis por northern blot, RT-PCR, análisis de expresión génica en microarrays, estudios proteómicos o análisis por differential display. Algunos de los métodos que pueden emplearse para Ia caracterización se explican en el Ejemplo 2 de Ia patente.

Otro aspecto de Ia invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende las células o las poblaciones celulares descritas anteriormente en este documento.

Otro aspecto de Ia invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende las células o las poblaciones celulares descritas anteriormente en este documento para su uso en terapia celular somática.

Se entiende por "terapia celular somática" Ia utilización de células somáticas vivas, tanto autólogas (procedentes del propio paciente), como alogénicas (de otro ser humano) o xenogénicas (de animales), cuyas características biológicas han sido alteradas sustancialmente como resultado de su manipulación, para obtener un efecto terapéutico, de diagnóstico o preventivo, por medios metabólicos, farmacológicos o inmunológicos. Entre los medicamentos de terapia celular somática se encuentran, por ejemplo, pero sin limitarse: células manipuladas para modificar sus propiedades inmunológicas, metabólicas o funcionales de otro tipo en aspectos cualitativos o cuantitativos; células clasificadas, seleccionadas y manipuladas, que se someten posteriormente a un proceso de fabricación con el fin de obtener el producto terminado; células manipuladas y combinadas con componentes no celulares (por ejemplo, matrices o productos sanitarios biológicos o inertes) que ejercen Ia acción pretendida en principio en el producto acabado; derivados de células autólogas expresadas ex vivo (in vitro) en condiciones específicas de cultivo; o células modificadas genéticamente o sometidas a otro tipo de manipulación para expresar propiedades funcionales homologas o no homologas anteriormente no expresadas.

Otro aspecto de Ia invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende las células o las poblaciones celulares descritas anteriormente en este documento para su uso en Ia prevención o el tratamiento de lesiones, enfermedades degenerativas o genéticas de: cartílago, hueso, músculo, corazón, sistema nervioso central o periférico, piel, hígado o páncreas. Una realización preferida de este aspecto de Ia presente invención, se refiere a una composición farmacéutica que comprende las células o las poblaciones celulares descritas anteriormente en este documento para su uso en Ia prevención o el tratamiento de lesiones, enfermedades degenerativas o genéticas de: cartílago o hueso.

Otro aspecto de Ia invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende las células o las poblaciones celulares descritas anteriormente en este documento para su uso en terapia celular somática para Ia prevención o el tratamiento de lesiones, enfermedades degenerativas o genéticas de: cartílago, hueso, músculo, corazón, sistema nervioso central o periférico, piel, hígado o páncreas. Una realización preferida de este aspecto de Ia presente invención, se refiere a una composición farmacéutica que comprende las células o las poblaciones celulares descritas anteriormente en este documento para su uso en terapia celular somática para Ia prevención o el tratamiento de lesiones, enfermedades degenerativas o genéticas de: cartílago o hueso.

En una realización preferida de estos aspectos de Ia invención, Ia composición farmacéutica comprende cualquiera de las células o las poblaciones celulares descritas anteriormente en este documento, y además, un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Otro aspecto de Ia invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende cualquiera de las células o las poblaciones celulares descritas anteriormente en este documento, y, además, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, otro principio activo.

Como se emplea aquí, el término "principio activo", "substancia activa", "substancia farmacéuticamente activa", "ingrediente activo" ó "ingrediente farmacéuticamente activo" significa cualquier componente que potencialmente proporcione una actividad farmacológica u otro efecto diferente en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento, o prevención de una enfermedad, o que afecta a Ia estructura o función del cuerpo del hombre u otros animales.

Las composiciones farmacéuticas de Ia presente invención pueden formularse para su administración en una variedad de formas conocidas en el estado de Ia técnica.

Tales composiciones y/o sus formulaciones pueden administrarse a un animal, incluyendo un mamífero y, por tanto, al hombre, en una variedad de formas, incluyendo, pero sin limitarse a, parenteral, intraperitoneal, intravenosa, intradérmica, epidural, intraespinal, intraestromal, intraarticular, intrasinovial, intratecal, intralesional, intraarterial, intracardiaca, intramuscular, intranasal, intracraneal, subcutánea, intraorbital, intracapsular, tópica, mediante parches transdérmicos, vía rectal, vía vaginal o uretral, mediante Ia administración de un supositorio, percutanea, espray nasal, implante quirúrgico, pintura quirúrgica interna, bomba de infusión o vía catéter.

La dosificación para obtener una cantidad terapéuticamente efectiva depende de una variedad de factores, como por ejemplo, Ia edad, peso, sexo o tolerancia, del mamífero. En el sentido utilizado en esta descripción, Ia expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a Ia cantidad de Ia composición farmacéutica de Ia invención que produzcan el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de dicha composición farmacéutica y el efecto terapéutico a conseguir. Los "adyuvantes" y "vehículos farmacéuticamente aceptables" que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los vehículos conocidos en el estado de Ia técnica.

Las composiciones farmacéuticas de Ia presente invención pueden utilizarse en un método de tratamiento de forma aislada o conjuntamente con otros compuestos farmacéuticos.

Otro aspecto de Ia presente invención, se refiere al uso de cualquiera de las células o las poblaciones celulares aisladas descritas anteriormente en este documento para Ia elaboración de un medicamento.

Otro aspecto de Ia presente invención, se refiere al uso de cualquiera de las células o las poblaciones celulares descritas anteriormente en este documento para Ia elaboración de un medicamento de terapia celular somática.

Otro aspecto de Ia presente invención, se refiere al uso de cualquiera de las células o las poblaciones celulares descritas anteriormente en este documento para Ia elaboración de un medicamento para Ia prevención o el tratamiento de lesiones, enfermedades degenerativas o genéticas de: cartílago, hueso, músculo, corazón, sistema nervioso central o periférico, piel, hígado o páncreas. Una realización preferida de este aspecto de Ia presente invención, se refiere al uso de cualquiera de las células o las poblaciones celulares descritas anteriormente en este documento para Ia elaboración de un medicamento para Ia prevención o el tratamiento de lesiones, enfermedades degenerativas o genéticas de: cartílago o hueso.

Otro aspecto de Ia presente invención, se refiere al uso de cualquiera de las células o las poblaciones celulares descritas anteriormente en este documento para Ia elaboración de un medicamento de terapia celular somática para Ia prevención o el tratamiento de lesiones, enfermedades degenerativas o genéticas de: cartílago, hueso, músculo, corazón, sistema nervioso central o periférico, piel, hígado o páncreas. Una realización preferida de este aspecto de Ia presente invención, se refiere al uso de cualquiera de las células o las poblaciones celulares descritas anteriormente en este documento para Ia elaboración de un medicamento de terapia celular somática para Ia prevención o el tratamiento de lesiones, enfermedades degenerativas o genéticas de: cartílago o hueso.

Cualquiera de las células o las poblaciones celulares descritas anteriormente en este documento pueden ser aplicadas al desarrollo de ensayos in vitro e in vivo con los siguientes propósitos industriales: búsqueda de fármacos, estudios farmacológicos, estudios toxicológicos, estudios farmacogenómicos y/o estudios genéticos. Tales ensayos pueden ser utilizados para Ia identificación y/o caracterización de una multitud de dianas biológicas, compuestos bioactivos y/o agentes farmacológicos.

La célula madre multipotente de Ia invención, o Ia población celular constituida por, o que comprende, las células madre multipotentes de Ia invención, proporciona un sistema único en el cual esta célula o estas células pueden diferenciarse para dar lugar a linajes específicos del mismo individuo. Además, Ia célula madre multipotente de Ia invención, o Ia población celular constituida por, o que comprende, las células madre multipotentes de Ia invención, proporcionan una fuente de células en cultivo a partir de una potencial variedad de individuos genéticamente diversos que pueden responder de distinta manera a diversos agentes biológicos y farmacológicos. Al comparar las respuestas de las células procedentes de una población estadísticamente significativa de individuos se pueden determinar los efectos de los agentes biológicos o farmacológicos ensayados sobre el tipo celular concreto. A diferencia de Ia mayoría de los cultivos primarios, las células madres multipotentes de Ia invención se pueden mantener en cultivo y de esta forma se pueden estudiar según vaya transcurriendo el tiempo. Por Io tanto, múltiples cultivos celulares procedentes de un único o de distintos individuos pueden ser tratados con el agente de interés para determinar si existen diferencias en el efecto que tiene dicho agente en ciertos tipos de células con el mismo perfil genético o, alternativamente, en tipos celulares similares procedentes de individuos genéticamente distintos.

La utilización de cualquiera de las células o las poblaciones celulares descritas anteriormente en este documento en un sistema de escrutinio de alto rendimiento (high-throughput screening) permite analizar una amplia gama de agentes biológicos y/o farmacológicos, así como bibliotecas combinatoriales de los mismos, de una forma efectiva, para de esta forma elucidar sus efectos en las células humanas. Dichos agentes incluyen, pero no están limitados a: péptidos, anticuerpos, citoquinas, quimioquinas, factores de crecimiento, hormonas, partículas virales, antibióticos, compuestos inhibitorios, agentes quimoterapéuticos, agentes citotóxicos, mutágenos, aditivos alimentarios, composiciones farmacéuticas o preparados de vacunas.

Otro aspecto de Ia invención se refiere al uso de cualquiera de las células o las poblaciones celulares descritas anteriormente en este documento para evaluar in vitro Ia respuesta celular a, al menos, un agente biológico o farmacológico. Una realización preferida de dicho método para evaluar in vitro Ia respuesta celular a agentes biológicos o farmacológicos, o a bibliotecas combinatoriales de dichos agentes, comprende Io siguiente: a) aislar las células proporcionadas por Ia presente invención a partir de un individuo o de una población estadísticamente significativa de individuos; b) diferenciar opcionalmente las células aisladas a un tipo celular concreto; c) expandir las células en cultivo; d) diferenciar opcionalmente las células expandidas a un tipo celular concreto; e) poner en contacto el cultivo con uno o más agentes biológicos o farmacológicos o con una biblioteca combinatorial de dichos agentes; y f) evaluar los posibles efectos biológicos de dichos agentes sobre las células del cultivo.

En una realización preferida de este aspecto de Ia invención, dicho agente biológico o farmacológico se selecciona de Ia lista que comprende péptidos, anticuerpos, citoquinas, quimioquinas, factores de crecimiento, partículas virales, hormonas, antibióticos, compuestos inhibitorios, agentes quimoterapéuticos, agentes citotóxicos, mutágenos, aditivos alimentarios, composiciones farmacéuticas o preparados vacunales.

La presente invención provee, además, de métodos de obtención de las células o las poblaciones celulares aisladas descritas anteriormente en este documento.

Otro aspecto de Ia presente invención, se refiere a un método de obtención de una célula madre multipotente aislada de Ia invención, o de una población celular aislada constituida por, o que comprende, células madre multipotentes, caracterizado porque comprende los siguientes pasos:

a) obtener una muestra biológica aislada de mesenterio; y b) seleccionar las células madre multipotentes derivadas del estroma de Ia muestra biológica obtenida en (a). En una realización preferida de este aspecto de Ia presente invención Ia muestra biológica aislada de mesenterio es de epiplón de mamífero. Preferiblemente, Ia célula madre multipotente, o Ia población celular aislada constituida por, o que comprende, células madre multipotentes de Ia invención obtenidas mediante este método, procede de un primate y, más preferiblemente, de un humano.

Es posible obtener una muestra biológica aislada del mesenterio y, preferiblemente, del epiplón, por ejemplo, pero sin limitarse mediante intervención quirúrgica abdominal abierta o intervención quirúrgica laparoscópica. La intervención quirúrgica abdominal abierta es una técnica quirúrgica que permite que Ia cavidad abdominal sea dejada abierta temporalmente, utilizando diversos procedimientos conocidos en el estado de Ia técnica, para facilitar el acceso al abdomen; Ia ventaja de este tipo de intervención quirúrgica es que Ia accesibilidad al tejido es completa y por tanto se pueden obtener una muestra biológica aislada de mesenterio y, preferiblemente, de epiplón mayor. La cirugía laparoscópica es una técnica quirúrgica que se practica través de pequeñas incisiones, usando Ia asistencia de una cámara de video que permite al equipo médico ver el campo quirúrgico dentro del paciente y accionar en el mismo; Ia ventaja de este tipo de intervención quirúrgica es que es mínimamente invasiva y posibilita un periodo post-operatorio más rápido y confortable.

La selección de las células madre multipotentes derivadas de estroma de mesenterio y, preferiblemente, de epiplón, puede realizarse mediante diferentes procedimientos descritos en el estado de Ia técnica, y que pueden incluir, por ejemplo, pero sin limitarse, procesado mecánico, tratamiento enzimático (por ejemplo, pero sin limitarse, con una colagenasa), centrifugación, lisis eritrocitaria, filtración, cultivo en plástico sin ningún otro soporte o matriz extracelular, cultivo en medios que favorecen Ia proliferación de estas células o inmunocitometría. Algunos de estos métodos se explican en detalle en el

Ejemplo 1 de Ia patente. La célula madre multipotente de Ia invención, o Ia población celular aislada constituida por, o que comprende, células madre multipotentes de Ia invención, obtenida mediante el método anteriormente descrito puede ser caracterizada para identificar las proteínas intracelulares y/o de superficie, genes, y/u otros marcadores indicadores de su estado indiferenciado mediante métodos ampliamente conocidos en el estado de Ia técnica. En el Ejemplo 1 de Ia patente, Ia población de células madre multipotentes derivadas de estroma obtenidas mediante este método es caracterizada mediante inmunocitometría. Otros métodos que pueden ser utilizados para Ia caracterización incluyen, pero no se limitan a: análisis inmunocitoquímico, análisis por northern blot, RT-PCR, análisis de expresión génica en microarrays, estudios proteómicos o análisis por differential display.

Preferiblemente, Ia célula madre multipotente de Ia invención, o Ia población celular aislada constituida por, o que comprende, células madre multipotentes de Ia invención, obtenida mediante el método anteriormente descrito, está caracterizada por:

a) ser positiva para los siguientes antígenos de superficie: CD105, CD90, CD73, CD29, CD49d y CD49a. b) ser negativa para los siguientes antígenos de superficie: CD45, CD34, CDH y HLA DR.

Otro aspecto de Ia presente invención, se refiere a un método de obtención de una célula diferenciada o de una población celular aislada diferenciada a partir de Ia célula madre multipotente de Ia invención, o a partir de Ia población constituida por, o que comprende, células madre multipotentes de Ia invención, caracterizado porque comprende los siguientes pasos:

a) obtener una muestra biológica aislada de mesenterio; b) seleccionar las células madre multipotentes derivadas de estroma de Ia muestra biológica obtenida en (a); y c) cultivar las células madre multipotentes de (b) en condiciones que favorezcan Ia inducción de su diferenciación a células especializadas.

Los métodos que se pueden usar para inducir Ia diferenciación de las células madre multipotentes de Ia invención a diversos tipos celulares especializados concretos son conocidos por los expertos en Ia materia. Algunos de estos métodos se explican en el Ejemplo 2 de Ia patente.

La célula diferenciada o Ia población celular diferenciada obtenida mediante el método anteriormente descrito puede ser caracterizada mediante Ia identificación de proteínas de superficie y/o intracelulares, genes, y/u otros marcadores indicativos de diferenciación de las células madre de Ia presente invención a diversos linajes. Métodos utilizados para Ia caracterización incluyen, pero no se limitan a: inmunocitometría, análisis inmunocitoquímico, análisis por northern blot, RT-PCR, análisis de expresión génica en microarrays, estudios proteómicos o análisis por differential display. Algunos de ellos se explican en el Ejemplo 2 de Ia patente.

A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Muestra Ia capacidad adipogénica de las líneas celulares derivadas obtenidas a partir de estroma de epiplón. En tres experimentos diferentes varias líneas celulares derivadas de estroma de epiplón humano se cultivaron durante 21 días en un medio de cultivo de inducción de diferenciación adipocítica (Poietics, Lonza), siguiendo el protocolo recomendado. Para comprobar el grado de diferenciación, las células se tiñeron con OiI Red O

(SIGMA). (A) Control negativo. Células no tratadas con el medio de diferenciación adipogénica. (B) Células diferenciadas a adipocitos que acumulan numerosas vacuolas lipídicas positivas para Ia tinción con OiI Red O.

Figura 2. Muestra el estudio de Ia capacidad osteogénica de las líneas celulares derivadas obtenidas a partir de estroma de epiplón. En tres experimentos diferentes varias líneas celulares derivadas de estroma de epiplón humano se cultivaron durante 21 días en un medio de cultivo de inducción de diferenciación osteogénica (Poietics, Lonza). Para comprobar el grado de diferenciación las células se tiñeron con Alizarin Red (SIGMA). (A) Control negativo. Células no tratadas con el medio de diferenciación osteogénica. (B) Células positivas para Ia tinción con Alizarin Red de Ia matriz extracelular de calcio generada como consecuencia de Ia diferenciación osteogénica.

Figura 3. Muestra el estudio de Ia capacidad condrogénica de las líneas celulares derivadas obtenidas a partir de estroma de epiplón. En tres experimentos diferentes varias líneas celulares derivadas de estroma de epiplón humano se cultivaron durante 21 días mediante Ia técnica de diferenciación celular de inducción en micromasa (Poietics, Lonza). Para comprobar el grado de diferenciación condrogénica las células se tiñeron con Alcian Blue 8G (SIGMA). (A) Control negativo de células no tratadas con el medio de cultivo de diferenciación condrogénica. (B) Células teñidas con Alcian Blue formando estructuras y con morfología típicas cartilaginosas. (C) Magnificación (2Ox) de Ia imagen del panel B.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar Ia naturaleza de Ia presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a Ia invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran Ia invención sin limitar el campo de aplicación de Ia misma.

EJEMPLO 1. Obtención, derivación, expansión y caracterización de líneas de células madre multipotentes a partir de estroma de epiplón humano:

Obtención de epiplón humano como fuente de células madre multipotentes derivadas de estroma: Para Ia realización de Ia presente invención se utiliza tanto epiplón derivado de donantes sanos-delgados, como de pacientes con obesidad mórbida. El epiplón se obtiene tanto por intervenciones quirúrgicas mediante laparoscopia, como intervenciones de cirugía bariátrica a obesos mórbidos, donde Ia cantidad de tejido accesible es muy elevada.

Derivación de líneas de células madre multipotentes derivadas a partir de estroma de epiplón humano: El epiplón se procesa inmediatamente tras Ia obtención de Ia muestra de tejido. Para asegurar el máximo de garantía, rendimiento y reproducibilidad en el proceso de derivación de las células madre multipotentes, todo el procedimiento de derivación e inicio del cultivo celular se ha optimizado para completarlo en las tres horas posteriores a Ia obtención del tejido. El epiplón se divide en porciones menores, para facilitar el aislamiento de Ia fracción vascular del estroma del tejido, que es Ia fuente celular donde residen las células madre multipotentes. El tejido se lava varias veces con volúmenes iguales de HBSS + 2% P/S {Hank ^' s Balancee! Saline Solution + 2% Penicilina/Streptomicina) (GIBCO). Una vez lavado el tejido se incuba, durante 30 minutos a 37 ⁰ C, con una solución al 0.075% de colagenasa I (GIBCO) para digerir Ia matriz extracelular del mismo y liberar el estroma del tejido. Tras Ia digestión, Ia colagenasa se neutraliza con DMEM F12 + 10% FBS + 1 % antibióticos (Dulbeco ^' s Modified Eagle Media F12 + 10% Fetal Bovine Serum) (GIBCO) y Ia suspensión celular se centrifuga a 1200 rpm durante 10 minutos para obtener un pellet de alta densidad de Ia fracción vascular del estroma del tejido. El pellet del estroma del tejido adiposo se resuspende en tampón de lisis de eritrocitos (BD Biosciences) y se incuba a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de Ia incubación Ia suspensión celular se filtra a través de una malla de nylon de 100 mieras para eliminar debris celulares y se vuelve a centrifugar a 1200 rpm durante 5 minutos. Por último, el pellet celular se resuspende directamente en el medio de cultivo inicial de expansión de células madre multipotentes: DMEM F12 + 10% FBS + 1 % antibiótico/antimicótico. Las células se siembran en frascos de cultivo y se incuban durante 16-18 horas a 37 ⁰ C en un incubador al 5% de CO2 en atmósfera húmeda. Tras Ia incubación las células se lavan varias veces con PBS (Phosphate Buffered Saline) (GIBCO) para eliminar células sanguíneas no adherentes residuales. Las células se mantendrán en medio de cultivo inicial de expansión para fomentar Ia selección y homogenización de los cultivos para el linaje mesenquimal.

Expansión de líneas de células madre multipotentes derivadas de estroma de epiplón humano: El protocolo de trabajo está optimizado para garantizar Ia obtención de cultivos homogéneos de células madre multipotentes derivadas de estroma de epiplón humano. Para ello, el procedimiento de expansión se ha diseñado aprovechando las propias características de las células madre multipotentes, actualmente descritas por Ia ISCT (International Society for Cellular Therapy). Las células madre multipotentes presentan adherencia al plástico de cultivo y son capaces de proliferar indiferenciadas sin necesidad de ningún otro soporte o matriz extracelular, a diferencia de otros linajes celulares presentes en el estroma del tejido adiposo, por tanto estas características permiten iniciar un cultivo selectivo para potenciar el crecimiento y generación de líneas homogéneas de células madre multipotentes. Una vez que el cultivo inicial adquiere Ia confluencia necesaria para pasar (subcultivar) las células, se procede a un cambio de medio, el cual potencia todavía más Ia expansión selectiva de las células madre multipotentes. El medio de expansión mesenquimal presenta una formulación compuesta de diferentes factores de crecimiento y libre de suero (Mesempro, GIBCO). En estas condiciones de cultivo las líneas celulares derivadas pueden ser mantenidas en constante proliferación por un número muy elevado de pases de cultivo.

EJEMPLO 2. Caracterización de las células madre multipotentes derivadas de estroma de epiplón:

Una vez en fase de expansión de los cultivos es necesario llevar acabo su caracterización para corroborar Ia derivación de líneas homogéneas de células madre multipotentes. Las líneas celulares derivadas presentan Ia morfología típica mesenquimal. Regularmente las células se someten a un análisis inmunofenotípico para corroborar que cumplen con los paneles de expresión de antígenos descritos por Ia ISCT (Dominici y cois., Cytotherapy 2007). Por último, para asegurar que las líneas de células madre derivadas de estroma de epiplón cumplen con todos los requisitos marcados por Ia ISCT, se realizan ensayos de diferenciación celular adipogénica, osteogénica y condrogénica, para corroborar Ia naturaleza multipotente de estas células.

Para asegurar el máximo control y garantía en los ensayos de diferenciación adipogénica, osteogénica y condrogénica, las células se cultivan utilizando medios de cultivo comerciales para Ia inducción de diferenciación a esos linajes celulares (Lonza) y siguiendo los protocolos de trabajo proporcionados por el distribuidor. Para corroborar Ia capacidad de diferenciación celular se realiza un estudio a tres niveles: morfológico, mediante tinciones específicas para cada tipo celular bien descritas en Ia bibliografía y análisis de expresión de marcadores de linaje celular específicos. Los resultados de estos análisis se muestran en las Figuras 1 , 2 y 3.