Gegenstand der Erfindung sind nanoskalige Melamin-Formaldehyd-Partikel (MF-Partikel) mit einem Partikeldurchmesser von 10 bis 95 nm, die Fluoreszenzfarbstoffe enthalten können und vorzugsweise monodispers sind sowie ein Verfahren zur deren Herstellung.

Fluoreszierende Substanzen haben zahlreiche Anwendungen vor allem in der Biochemie. An Biomoleküle kann durch eine chemische Reaktion eine fluoreszierende chemische Gruppe angehängt werden, die dann als sehr sensitiver Marker für dieses Molekül dient. In der Immunologie werden Antikörper mit einer fluoreszierenden chemischen Gruppe versehen, so dass die Orte, an die die Antikörper binden, anhand der Fluoreszenz erkennbar sind. Die Antigen-Konzentration kann damit sogar quantitativ bestimmt werden. Mit fluoreszierenden Markern ist es möglich unterschiedliche Biomoleküle in einer Zelle nachzuweisen. Die Marker fluoreszieren in verschiedenen Farben und so lässt sich die Fluoreszenzverteilung z.B. im Gewebe, unter dem Fluoreszenzmikroskop beobachten.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es fluoreszenzmarkierte Nanopartikel mit einem möglichst kleinen Durchmesser (< 100nm) herzustellen. An diesen Partikeln sollte dann Streptavidin immobilisiert werden, um damit dann biotinmarkierte Proteine nachzuweisen. Die Nanopartikel sollten so klein sein, dass sie in Microarrays eingesetzt werden können. Eine möglichst monodisperse Größenverteilung und eine möglichst große Fluoreszenz sollten das Ziel der Partikelsynthese sein. Mit Fluoreszenzfarbstoffen markiertes Streptavidin gibt es bereits, allerdings ist dabei das resultierende Messsignal sehr klein. In einem Nanopartikel (Durchmesser <100nm) hingegen können viele Fluoreszenzfarbstoff- Moleküle enthalten sein. Somit stünde eine hochempfindliche Methode zum Proteinnachweis zur Verfügung. Das System Biotin-Streptavidin eignet sich besonders gut für solche Nachweise, da es sehr gut untersucht ist und die

Affinität zwischen Biotin (Vitamin H) und Streptavidin sehr hoch ist. Die Bindung zwischen Biotin und Streptavidin ist sehr fest, so dass die Bindungspartner nicht dissoziieren, bevor die Messung abgeschlossen ist.

Fluoreszierende Melamin-Formaldehyd-Partikel werden, wie vorher erwähnt, in der Diagnostik als Trägermaterialien verwendet und von einer Reihe von Firmen auch vertrieben, z.B. von Sigma-Aldrich oder MicroParticles. Die dabei angebotenen MF-Partikel sind im Bereich von 1 bis 15 μm. Unbekannt sind bisher MF-Partikel, die einen Partikeldurchmesser deutlich kleiner als 1μm besitzen. Für den Bereich 0.1 bis 3 μm sind vorwiegend Polystyrolbasierende fluoreszierende Mikrokugeln bekannt (z.B. von Merck Estapor), die allerdings den Nachteil haben, dass die kleinsten Durchmesser von etwa 0.1 μm nicht monodispers sind. Melamin-basierende Nanopartikel weisen jedoch gegenüber Polystyrol- basierenden Materialien noch einige andere Vorteile auf. Sie haben z.B. eine höhere Dichte (1.51 g/cm ³ ), sind sehr stabil, können unbegrenzt gelagert werden, können in Wasser resuspendiert werden, sind hitzebeständig bis 200 ⁰ C und liegen in Wasser monodispers vor. Außerdem können fluoreszierende Farbstoffe in die MF-Partikel einfach eingebaut werden (siehe WO 03/074614). Sie lassen sich nicht auswaschen. Es wird angenommen, dass Farbstoffe in den Partikeln nicht kovalent gebunden werden wie z.B. in Silicapartikeln, sondern nur eingeschlossen werden.

Aus der DD-224 602 ist ein Verfahren zur Herstellung monodisperser Melamin-Formaldehyd-Latices mit Teilchengrößen im Bereich von 0.1 bis 15 μm bekannt, wobei die MF-Partikel durch Polykondensation von Melamin und Formaldehyd in wässrigem Medium mit schwach konzentrierter Ameisensäure (0.87 %) hergestellt werden. Weiterhin ist die Funktionalisierung dieser Latices und der Einbau von Farbstoffen, insbesondere Fluoreszenzfarbstoffen, beschrieben.

Die Funktionalisierung von MF-Partikeln kann auf zwei Wegen erfolgen.

Zum einen kann bei der Polykondensation eine hydrophile Substanz mit der gewünschten Funktionalität zugegeben werden. Diese wird in die Partikel integriert. Es werden sich funktionelle Gruppen auf der Oberfläche befinden, allerdings wird ein Teil dieser Substanz im Partikelinneren eingeschlossen sein. Bei dieser Art der Funktionalisierung ist es schwierig, die Belegung der

Oberfläche zu steuern.

Zum anderen können die Partikel nachträglich funktionalisiert werden. Auf der Oberfläche der Melaminharzpartikel befinden sich reaktive Gruppen. Diese lassen sich beispielsweise dadurch nachweisen, indem man die

Oberfläche mit einem langkettigen Carbonsäurechlorid modifiziert, so dass die Partikel anschließend hydrophob sind.

Überraschenderweise konnten nun nanoskalige MF-Partikeln mit einem Partikeldurchmesser von 10 bis 95 nm entwickelt werden, die einen oder mehrere hydrophile metallorganische oder organische Fluoreszenzfarbstoffe enthalten. Bevorzugt besitzen die MF-Partikel einen Durchmesser von 30 bis 50nm und sind monodispers.

Melaminharze basieren auf dem 1 ,3,5-Triamino-2,4,6-triazin Grundkörper. Mit 2-6 Mol Formaldehyd pro Mol Melamin kann ein methyloliertes Melamin hergestellt werden. Da die Methylolmelamine in Wasser wenig beständig sind, werden sie in handelsüblichen Produkten verethert. Mit Methanol veretherte Melamine sind gut wasserlöslich, wohingegen mit Butanol veretherte gut in organischen Lösungsmitteln löslich sind.

Das handelsübliche, hier eingesetzte Melamin-Formaldehyd-Harz (Madurit SMW 818 der Fa. Surface Specialties) ist eine 75%ige wässrige Lösung. Das Molverhältnis Melamin zu Formaldehyd liegt im Bereich von 1 :2.8 bis 1 :3.8 und 45-55% aller Methylolgruppen sind methanolverethert. Die Herstellung von monodispersen Melaminpartikeln ist z.B. in DD-224 602 beschrieben. Sie lassen sich, wie schon erwähnt, während der Polykondensation einfach funktionalisieren, wobei die Polykondensation im

Sauren stattfindet. Die Größe der Partikel ist beeinflussbar durch Art und Konzentration des eingesetzten Methylolmelamins, den pH-Wert und die Temperatur bei der Säurezugabe. Höhere Temperaturen, niedriger pH-Wert, Melaminharz mit vielen Methylolgruppen und niedrige Harzkonzentration verschieben jeweils die Reaktion zu kleineren Partikeln hin.

Die Polykondensation im Sauren ist auch beschrieben in DE 4019844, wobei als Säurekatalysator Schwefelsäure verwendet wird.

Die erfindungsgemäßen nanoskaligen MF-Partikel werden hergestellt, indem man MF-Harz bei Temperaturen im Bereich zwischen 60 bis 8O ⁰ C in einer ausreichend großen Wassermenge aufrührt und anschließend mit 98 bis 100%iger Ameisensäure versetzt, so dass Partikel mit einem Durchmesser zwischen 10 und 95 nm entstehen. Ameisensäure hat sich als anwendbarer Kondensationsinitiator erwiesen, weil mit ihr die Ergebnisse reproduzierbar sind. Mit Salzsäure- die einen deutlich höheren pKA-Wert hat- hingegen lassen sich Ergebnisse nicht reproduzieren. Vorzugsweise setzt man 15 bis 20 Gew.% konzentrierte Ameisensäure (also 98 bis 100%ig) zu.

Um fluoreszierende nanoskalige MF-Partikel zu erhalten, werden den MF- Partikeln vor der Umsetzung mit konzentrierter Ameisensäure hydrophile metallorganische oder organische Fluoreszenzfarbstoffe zugesetzt. Die Farbstoffe müssen vorher nicht modifiziert werden, da sie in die Partikel eingeschlossen, aber nicht kovalent gebunden werden. Um in die MF- Partikel integriert zu werden, müssen die Farbstoffe lediglich hydrophil sein. Als hydrophile organische Farbstoffe können beispielsweise

Fluoreszenzfarbstoffe wie z.B. Rhodamin B und Rhodaminderivate (rot), Fluoreszein und Fluoreszeinderivate (gelb), Aminomethylcoumarin und Coumarinderivate (blau) eingesetzt werden. Als metallorganische Farbstoffe können beispielsweise Terbium ³⁺ Tiron-Komplex (grün) und Europium-tris-dipikolinat (rot) eingesetzt werden.

Bevorzugt wird 8-Hydroxy-1 ,3,6-pyrentrisulfonsäure-Trinatriumsalz eingesetzt, wobei die Partikel dann stark grün fluoreszieren.

Je kleiner die Partikel sind, desto größer ist ihre spezifische Oberfläche. Wenn diese Oberfläche dicht mit funktionellen Gruppen belegt ist, kann prinzipiell auch von kleinen MF-Partikeln viel Streptavidin gebunden werden.

Bei der Kopplung von Streptavidin an die nanoskaligen MF-Partikel ist es wichtig, dass die Biotinbindekapazität vom Streptavidin erhalten bleibt. Streptavidin kann durch eine Einstufenreaktion oder eine Zweistufenreaktion an Partikel gebunden werden (siehe GT. Hermanson et al., Immobilized Affinity ligand Techniques (1992)). EDC (N-(3-Dimethylamino-propyl)-N^ ethylcarbodiimid) ist ein gebräuchliches Reagenz, um Proteine an andere Moleküle zu koppeln. In der Einstufenreaktion reagiert EDC mit einer Carboxylgruppe zu einem Esterintermediat, das mit einem primären Amin reagieren kann. Mit NHS (N-Hydroxylsuccinimid) entsteht bei der Zweistufenreaktion ein stabileres Esterintermediat, das anschließend mit dem Protein umgesetzt wird.

EDC kann sowohl mit einer Carboxylgruppe auf einem MF-Partikel, als auch mit einer am Streptavidin reagieren. Deshalb können theoretisch auch zwei oder mehr Streptavidinmoleküle miteinander vernetzt werden, diese stünden dann nicht mehr für eine Reaktion mit der MF-Partikeloberfläche zur Verfügung. Um dieser möglichen Quervernetzung vorzubeugen, kann, wie vorher erwähnt, eine Zweistufenreaktion durchgeführt werden. Dabei werden zuerst die nanoskaligen MF-Partikel mit EDC und NHS umgesetzt und die überschüssigen Reagenzien ausgewaschen, so dass EDC nicht mit Streptavidin reagieren kann. Erst danach wird die Streptavidin-Lösung zugegeben. Da nur die Partikeloberfläche aktiviert ist, können die Streptavidinmoleküle auch nur mit dieser reagieren. Nebenbei sei angemerkt, dass es kaum einen Unterschied zwischen der Umsetzung mit EDC (Einstufenreaktion) und der mit EDC/NHS (Zweistufenreaktion) gibt. Mit beiden Methoden wird ungefähr die gleiche Menge Streptavidin an die Oberfläche der nanoskaligen MF-Partikel gebunden.

Um zu überprüfen, ob Streptavidin an den Partikeln immobilisiert ist, wird der Partikelsuspension Fluorescein-Biotin zugesetzt. Das ungebundene Fluorescein-Biotin kann in einem Fluoreszenzspektrometer quantitativ bestimmt werden.

Die nanoskaligen, vorzugsweise monodispersen und fluoreszierenden MF- Partikel können als Trägermaterial zur Herstellung von Biomarker, Inkjet- Tinten, als Fluoreszenzmarker in und auf Gebrauchsgegenständen aller Art (z.B. Dokumenten und/oder Geldscheinen) und/oder als Adsorptionsmaterial für chromatographische Trennungen verwendet werden, wobei für chromatographische Anwendungen auch die nicht fluoreszierenden MF- Paritkel genügen.

Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung näher erläutern ohne sie einzuschränken.

Beispiel 1 :

Farblose nanoskalige Melamin-Formaldehyd-Partikel

450 g Wasser werden auf 70 ⁰ C erwärmt. Bei 70 ⁰ C wird das in 50 g Wasser aufgerührte Melamin-Formaldehyd-Harz (15 g Madurit SMW818) zugegeben. Die Lösung bleibt klar. Wenn die Temperatur wieder auf 7O ⁰ C angestiegen ist werden 2 ml 98-100 %ige Ameisensäure zugegeben und es wird noch weitere 20 min bei dieser Temperatur gerührt. Es ist kaum eine Trübung zu erkennen, aber mit Hilfe einer Taschenlampe ist der dem Fac hmann bekannte Tyndalleffekt gut zu beobachten.

Die nach der Aufreinigung per Ultrafiltration (30 kDalton Membran) erhaltenen Partikel haben einen im Rasterelektronenmikroskop ausgemessenen mittleren Durchmesser von ca. 40 nm.

Beispiel 2:

Fluoreszierende nanoskalige Melamin-Formaldehyd-Partikel

450 g Wasser und der 25 mg 8-Hydroxy-1 ,3,6-pyrentrisulfonsäure- Natriumsalz werden auf 70 ⁰ C erwärmt. Bei 70 ⁰ C wird das in 50 g Wasser aufgerührte Harz (15 g Madurit SMW818) zugegeben. Die Lösung bleibt klar. Wenn die Temperatur wieder auf 70 ⁰ C angestiegen ist werden 2 ml 98- 100 %ige Ameisensäure zugegeben und es wird noch weitere 20 min bei dieser Temperatur gerührt. Nach ca. 1 min trübt sich der Ansatz leicht. Die nach der Aufreinigung per Ultrafiltration (30 kDalton Membran) erhaltenen Partikel haben einen im Rasterelektronenmikroskop vermessenen Durchmesser von ca. 46 nm.

Beispiel 3:

Konjugation der Nanopartikel mit Streptavidin über EDC-Lösung

(Einstufenreaktion)

1ml einer 10 Gew.% Melaminpartikel enthaltenden Suspension (=100 mg

Feststoff) werden in ein Eppendorf-Cap eingewogen, in 1 ml 50 mM MES- Puffer (2-Morpholinoethansulfonsäure (Merck) pH 5,5) suspendiert und anschließend in einer Ultrazentrifuge bei 60.000 min ^"1 abzentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und der Waschvorgang wird wiederholt. Dann werden die Partikel in 1 ml Proteinlösung (10 mg/ml Streptavidin in MES- Puffer) resuspendiert und in ein verschließbares Glasröhrchen überführt. Die Partikel werden 30 Minuten durch Rollen in Suspension gehalten. Dann werden 100 μl EDC-Lösung (10 mg/ml N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'- ethylcarbodiimid (Merck) in destilliertem Wasser oder MES-Puffer, unmittelbar vor Gebrauch angesetzt) zugegeben. Die Partikel werden über Nacht bei Raumtemperatur in Suspension gehalten. Dabei reagiert das EDC mit den Carboxylgruppen auf der Partikeloberfläche und das Streptavidin mit dem entstehenden Konjugat. Die Probe wird wieder zentrifugiert und der

Überstand verworfen. Nach Zugabe von 1 ml Ethanolamin-Lösung (1 M

Ethanolamin (Merck), pH 9.0, 25 mM tetra-Natriumdiphosphat-Decahydrat

(Merck)) wird die Probe noch eine Stunde gerollt bevor wieder zentrifugiert

wird. Ethanolamin reagiert mit den restlichen aktivierten Estern zu Amiden. Danach wird drei mal mit je 1 ml PBS-Puffer (10 mM NaH2PO4 (Merck), pH 7,5, 150 mM NaCI (Merck)) gewaschen. Die Partikel werden ein letztes Mal in PBS-Puffer resuspendiert und können bei 4 ⁰ C im Kühlschrank aufbewahrt werden.

Beispiel 4:

Konjugation der Nanopartikel mit Streptavidin über EDC/NHS

(Zweistufenreaktion) 1 ml einer 10 Gew.% Melaminpartikel enthaltenden Suspension (=100 mg Feststoff) werden in ein Eppendorf-Cap eingewogen, in 1 ml 50 mM MES- Puffer (2-Morpholinoethansulfonsäure (Merck) pH 5.5) suspendiert und anschließend in einer Ultrazentrifuge bei 60.000 min ^"1 abzentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und der Waschvorgang wird wiederholt. Dann werden die Partikel in 1 ml MES-Puffer resuspendiert und in ein verschließbares Glasröhrchen überführt. Es werden 100 μl EDC/NHS- Lösung (100 mg/ml EDC, 16 mg/ml N-Hydroxylsuccinimid (Merck) in MES- Puffer) zugegeben. Die Partikel werden 1 Stunde durch Rollen bei Raumtemperatur in Suspension gehalten, dabei wird das NHS an die Carboxylgruppen auf der Partikeloberfläche gekoppelt. Die Probe wird wieder zentrifugiert und der Überstand wird verworfen. Es wird noch einmal mit 1 ml MES-Puffer gewaschen.

Die Partikel werden in 1 ml Protein-Lösung resuspendiert und über Nacht bei Raumtemperatur gerollt. Die Gegenproben werden in 1 ml MES-Puffer (keine Zugabe von EDC/NHS und Proteinlösung) resuspendiert und über Nacht gerollt. Die Probe wird zentrifugiert und nach Zugabe von 1 ml Ethanolamin-Lösung wird die Probe noch eine Stunde gerollt bevor wieder zentrifugiert wird. Ethanolamin reagiert mit den restlichen aktivierten Estern zu Amiden. Danach wird drei mal mit je 1 ml PBS-Puffer gewaschen. Dann werden die Partikel noch einmal in PBS-Puffer resuspendiert und können bei 4 ⁰ C im Kühlschrank aufbewahrt werden.

Beispiel 5:

Nachweis der Bindung des Streptavidins an die Nanopartikel über

Fluorescein-Biotin

Um zu überprüfen, ob Streptavidin an den Partikeln immobilisiert ist, wird der Partikelsuspension Fluorescein-Biotin zugesetzt. Ein Streptavidinmolekül kann 4 Biotinmoleküle binden. Da eine definierte Menge Biotin (M= 244,31 g/mol) zu den mit Streptavidin umgesetzten Partikeln gegeben wird, kann daraus bis auf diesen Faktor 4 die Menge des gebundenen Streptavidins berechnet werden. Von jeder Probe werden 10 μl Suspension (dies entspricht 1 mg Partikel) in ein neues Eppendorf-Cap pipettiert. Den Proben werden nun jeweils 200 μl Biotin-Fluorescein-Lösung (1 gmol/μl in PBS-Puffer) zugesetzt. Sie werden 15 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt und anschließend zentrifugiert. Jetzt werden die Proben auf eine Mikrotiterplatte übertragen um sie im Fluoreszenzspektrometer messen zu können. Dazu werden 125 μl PBS- Puffer in jedem Well vorgelegt und dann 75 μl des Überstandes aus dem Eppendorf-Cap zugegeben. Von jeder Probe wird eine Doppelbestimmung durchgeführt. Als Nullwert werden 200 μl PBS-Puffer gemessen, als Maximalwert 75 μl der Biotin-Fluorescein-Lösung in 125 μl PBS-Puffer. Es wird also das nicht gebundene Biotin bestimmt. Aus diesem Wert kann man die Menge des gebundenen Biotins berechnen, da man durch den Maximalwert weiß, wieviel Biotin auf die Probe gegeben wurde. Um zu untersuchen, wie groß die Hintergrundbindung von Biotin ist, werden nach der Messung die mit Biotin belegten Partikel noch einmal mit 200 μl 1 M NaCI gewaschen und zentrifugiert. 2 mal 75 μl des Überstandes werden wieder in 125 μl PBS-Puffer gemessen. Dieser Wert muss bei der Auswertung von dem Wert des gebundenen Biotins abgezogen werden. Das Biotin, was sich mit 1 M NaCI wieder in Lösung bringen lässt, war nur unspezifisch an der Oberfläche adsorbiert.