APLICACIONES

SECTOR DE LA TÉCNICA

La presente invención pertenece al campo de la medicina, la farmacia y la química biológica, y se refiere, fundamentalmente, al uso y preparación de nuevas nanoestructuras basadas en dendrímeros para el diagnóstico de alergias a antibióticos betalactámicos, preferentemente aminopenicilinas, más preferentemente amoxicilina. Asimismo, la invención se refiere a procedimientos de obtención de dichas nanoestructuras y a aplicaciones de las mismas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los antibióticos betalactámicos (BL) son fármacos de primera elección en el tratamiento de numerosas infecciones bacterianas, aunque también son la causa más frecuente de reacciones adversas a fármacos mediadas por un mecanismo inmunológico específico. Se estima que la alergia a la penicilina la padece aproximadamente el 10% de la población, sin embargo, menos del 24% de los casos iniciales de sospecha son finalmente confirmados en la población adulta y esta cifra se reduce a menos de un 10% en la población infantil. El sobrediagnóstico de estas reacciones conlleva el uso innecesario de antibióticos alternativos, más caros y con más efectos adversos, influyendo en el incremento de las resistencias bacterianas. Por lo tanto, las implicaciones en salud pública de la alergia a BL son enormes y, un diagnóstico preciso es crucial para mejorar el uso de la terapia antibiótica, incrementar la seguridad del paciente y reducir costes al sistema sanitario.

Aunque todos los BL comercializados son capaces de inducir reacciones alérgicas, su prevalencia se suele correlacionar con los patrones de consumo. Dentro de las reacciones alérgicas a BL, las mediadas por IgE, o inmediatas, son las más graves y habituales. En las últimas décadas se ha incrementado la prescripción de la amoxicilina (AX), convirtiéndose en el BL que induce el mayor número de reacciones en la actualidad. Por ello el estudio de las reacciones inmediatas inducidas por la AX es importante. Los antibióticos BLs son moléculas pequeñas que no son capaces de activar al sistema inmune por si solos. Su capacidad inmunogénica se ha explicado por el modelo del hapteno, según el cual la AX forma conjugados con proteínas aumentando su tamaño y su capacidad de ser reconocida por el sistema inmune. El conjugado AX-proteína resultante es un antígeno multivalente, en el que varias moléculas del fármaco se unen a una proteína, induciendo la reacción alérgica. La apertura nucleofílica del anillo BL de la AX por los grupos aminos de las moléculas portadoras resulta en el determinante amoxiciloilo (AXO), una estructura lo suficientemente estable para ser aislada y caracterizada. Este complejo fármaco-proteína será reconocido, en las reacciones inmediatas, por los anticuerpos IgE específicos unidos a receptores de alta afinidad (FceRI) en la superficie de mastocitos tisulares y basófilos circulantes. El reconocimiento por al menos dos moléculas de IgE adyacentes desencadena una cascada enzimática que induce la degranulación de estas células y la liberación de mediadores inflamatorios. Este reconocimiento puede estar determinado por la naturaleza y estructura del fármaco, de la molécula portadora y del propio conjugado resultante.

El diagnóstico de las reacciones inmediatas a AX está basado en la realización de pruebas cutáneas e in vitro, aunque ninguna presenta una sensibilidad óptima, siendo necesaria, en muchos casos, la realización de una prueba de exposición controlada (PEC), que no está exenta de riesgo para el paciente y que está contraindicada en los casos más graves. En la realización de pruebas in vitro para la cuantificación de la IgE específica, tipo inmunoensayo, tanto comerciales (ImmunoCAP) como las realizadas en investigación, se emplea la estructura del determinante antigénico AXO unida a una molécula portadora y fijada a una fase sólida. En los últimos años, parece que la sensibilidad de los inmunoensayos, principalmente la del ImmunoCAP, está disminuyendo, encontrando menos del 20% de pacientes con resultados positivos, según nuestra experiencia. Otra de las pruebas in vitro más utilizadas en el diagnóstico de la alergia inmediata a AX es el test de activación de basófilos (TAB). Esta prueba celular füncional, basada en la cuantificación de la activación del basófilo tras su estimulación con la AX, presenta mayor sensibilidad que el inmunoensayo, aunque sólo permite el diagnóstico en el 50% de los pacientes. Aumentar la sensibilidad de las pruebas in vitro y su utilidad clínica se ha convertido en un gran desafío para Europa. Por lo tanto, una mejora en la sensibilidad de los métodos diagnósticos será de gran utilidad para estos pacientes, especialmente para aquellos en los que la PEC está contraindicada.

El desarrollo de la nanotecnología en el área de la biomedicina es fundamental para la mejora de los métodos diagnósticos. Se ha dedicado mucho esfuerzo en la incorporación de diferentes haptenos/ligandos y biomoléculas en la construcción de sistemas nanométricos capaces de emular in vitro los procesos de reconocimiento que ocurren in vivo. Se ha profundizado especialmente en el diseño de nanomateriales para cuantificar IgE específicas a BLs con diferentes abordajes: empleando diferentes determinantes antigénicos, moléculas portadoras, füncionalizaciones de superficies y soportes sólidos necesarios para realizar inmunoensayos, basándonos en un mayor control de los procesos químicos y caracterización de los materiales obtenidos. Como resultado se han conseguido importantes mejoras en los inmunoensayos utilizados para la evaluación de los pacientes.

Desde el punto de vista de la molécula portadora, nuestros trabajos han demostrado que a mayor densidad de haptenos en el portador y de conjugados haptenos-portador en la fase sólida se obtiene una mayor sensibilidad en el inmunoensayo. En la mayoría de los estudios hemos empleado nanoconjugados con dendrímeros de poliamidoamina (PAMAM), lo que permite trabajar con estructuras multivalentes, que mimetizan proteínas globulares, con conocimiento preciso del tamaño, estructura tridimensional y del número de grupos funcionales reactivos periféricos. Esto ha permitido obtener pruebas diagnósticas reproducibles y optimizar características del portador importantes para el reconocimiento por IgE. También hemos anclado estos nanoconjugados a fases sólidas de celulosa utilizando diferentes métodos de activación, consiguiendo un incremento de la densidad de nanonoconjugados de forma reproducible, con un consecuente aumento de la sensibilidad en los inmunoensayos. Otras fases sólidas novedosas en diagnóstico han consistido en zeolitas y nanopartículas de sílice, estas últimas con evaluación clínica positiva para el diagnóstico de alergia a AX. Por otro lado, los autores de la presente invención han desarrollado nanoestructuras que incluyen diferentes fármacos, bencilpeniciloilo (BPO) y AXO, en un solo portador dendrimérico habiendo permitido diagnosticar alergia tanto a BP como a AX y describir la distribución espacial y conformación tridimensional de estos determinantes en un conjugado. Todos estos trabajos demuestran la utilidad y versatilidad de la nanotecnología en la mejora de la sensibilidad del diagnóstico in vitro de la alergia a BLs.

Debido a que en la activación celular existen más restricciones estructurales, para los estudios celulares se necesita un diseño aún más complejo de las estructuras macromoleculares que mimeticen la estructura hapteno-portador. La activación de mastocitos y basófilos durante la respuesta alérgica requiere el reconocimiento simultaneo del antígeno por dos IgE fijadas a receptores de alta afinidad (FceRI) adyacentes en la superficie celular, y esto sólo es posible si este reconocimiento es inducido por un antígeno de cierto tamaño. Por lo tanto, existen una serie de requisitos que deben cumplirse en el diseño de estas estructuras para que sean capaces de activar a estas células, relacionados con la inclusión del determinante antigénico del fármaco reconocido específicamente por la IgE, su cantidad o valencia y la distancia entre ellos, que debe coincidir con la distancia entre dos receptores de alta afinidad (FceRI) adyacentes en la superficie celular. En este contexto, en la presente invención se presentan diferentes nanoestructuras diseñadas empleando ligandos/haptenos sintéticos soportados en estructuras bi- o multi-valentes, que se pueden manipular para controlar la ocupación del receptor y la agregación e inhibición de la respuesta celular.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Esquema de un compuesto de la invención.

Figura 2. Esquema de los procedimientos generales de síntesis. Condiciones de reacción:

(a) TsCl, CH ₂ CI ₂ , KOH, 0°C; (b) NaN ₃ , 80:20% de THF-H ₂ O, reflujo a 70°C; (c) Pd-C, H ₂ MeOH, t (h), (d) BuCOCl, NMM, CH ₂ Cl ₂ , 0°C; (e) compuesto 3, CH ₂ Cl ₂ ; (f) PBS, pH 6,5, TCEP; (g) compuesto 5, H ₂ O, DMSO; (h) AX, tampón de carbonato (0.05 M, pH 10.9).

Figura 3. Ensayos de desgranulación después de la incubación de células con la serie de BiAns a 10, 50 y 100 μM equivalentes de AXO. Se utilizaron HSA y HSA-AXO (a 10 μM de AXO) como control negativo y positivo, respectivamente. A) Porcentaje de liberación de β - hexosaminidasa en MC derivados de la médula ósea no sensibilizados (arriba) y sensibilizados (abajo); B) Porcentaje de β -hexosaminidasa liberada por células sensibilizadas con sueros de sujetos tolerantes (arriba) o con sueros de pacientes alérgicos a AX (abajo). Los datos se expresan como medias ± S.D. La línea base del porcentaje de liberación de β -hexosaminidasa está representada por la línea horizontal punteada.

Figura 4. Evaluación de la capacidad de activación de mastocitos de una línea celular mastocitos LAD2 sensibilizados con sueros de pacientes alérgicos a AX.

Figura 5. Mal-COOH

Figura 6. PEG (600)-[dG ₂ -(AXO) ₈ ] ₂ (7) BiAn(600)

Figura 7. PEG (600) - (N ₃ ) ₂ Figura 8. PEG (600)-(NH ₂ ) ₂ Figura 9. PEG (600) - (maleimida) ₂ Figura 10. PEG (600)-[dG ₂ ] ₂

EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se enfrenta al problema de proporcionar un método que permita la evaluación de la reacción alérgica a BLs, preferentemente a aminopenicilinas, más preferentemente AX, que presente una sensibilidad adecuada. De este modo, los autores de la presente invención han desarrollado nanoestructuras multivalentes basadas en dendrímeros que presentan epitopos de AX, dichos epitopos separados una distancia adecuada, así como diferentes procedimientos para su síntesis, útiles para la detección de anticuerpos IgE generados por la hipersensibilidad a BLs, preferentemente a aminopenicilinas, más preferentemente AX.

Los inventores han diseñado moléculas en la escala nano con estructuras altamente precisas, que exhiben grupos amoxiciloilo de forma multivalente, para estudiar las características arquitectónicas necesarias para promover la desgranulación celular inducida por alérgenos. Se sintetizaron nanoestructuras simétricas basadas en espaciadores de polietilenglicol (PEG) de diferentes longitudes (o pesos moleculares (MW)) (PEG 600 - PEG 12000), cuyos extremos se acoplaron con dendrones de poliamidoamina (PAMAM) fimcionalizados en la periferia con amoxiciloilo. Se exploró la influencia del tamaño de la nanoestructura en la promoción de la activación de mastocitos de médula ósea (MC) sensibilizados con IgE monoclonal frente a amoxicilina (AX) y células RBL-2H3 humanizadas sensibilizadas con anticuerpos policlonales de sueros de pacientes alérgicos a AX. Se observaron respuestas de activación dependientes de la dosis en ambos ensayos celulares, solo con estructuras que contenían espaciadores flexibles por encima del tamaño crítico (PEG 6000), siendo más eficaz con la estructura basada en PEG 10000. La visualización de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de los complejos anticuerpo-nanoestructura reveló una mayor proporción de inmunocomplejos y mayor número de anticuerpos por complejo con aquellas estructuras que mejor inducen respuestas celulares. Estos datos indican que la plataforma de nanoestructuras bidendrones simétricas es versátil y fiable en modelos in vitro de alergia para evaluar las estructuras conjugadas con hapteno / fármacos en la desgranulación de basófilos / mastocitos, lo que posteriormente puede tener utilidad en la mejora de los test in vitro diagnósticos.

Así pues, un primer aspecto de la presente invención se refiere a una nanoestructura multivalente basada en dendrímeros/dendrones que presenta epitopos de BLs, preferentemente a aminopenicilinas, más preferentemente AX, dichos epitopos separados una distancia adecuada, en adelante compuesto de la invención. Es decir, este primer aspecto de la invención se refiere a una estructura, de ahora en adelante estructura de la invención, o también denominada en otras partes de la memoria BiAn, de fórmula (I) B - D - L - H - L - D - B

Fórmula (I) donde, H es un polímero hidrofílico.

L es un linker (conector) un compuesto con grupos funcionales capaces de unirse, por un lado, a la cadena hidrofílica, y por otro, al grupo funcional del punto focal de los dendrones.

D es un dendrón que tiene un grupo funcional reactivo en el punto focal, y varios grupos funcionales superficiales (multivalencia) capaces de unirse a una betalactama o anillo betalactámico.

B es un compuesto que se selecciona de entre un antígeno y un compuesto con un anillo betalactámico (hapteno).

En una realización preferida de este aspecto de la invención, el polímero hidrofílico (H) se selecciona de la lista que consiste en polietilenglicol (PEG), ácido poliláctico, una cadena de ADN o ARN, copolímeros (aleatorios o de bloque) basados en monómeros tipo acrilato o metacrilato obtenido por polimerización radicalaria, o cualquiera de sus combinaciones. Más preferiblemente el polímero hidrofílico (H) es polietilenglicol (PEG). Tal y como se muestra en los ejemplos de la invención, las estructuras que mejor inducen respuestas celulares son aquellas que tienen espaciadores flexibles por encima del tamaño crítico de 6.000 Da (PEG 6.000) y la degranulación más eficaz se observó con la estructura basada en PEG 10.000 Da. Por tanto, en una realización más preferida de este aspecto de la invención, el polímero hidrofílico (H) PEG tiene un peso molecular de entre 6.000 y 12.000 Da. Aún más preferiblemente PEG tiene un peso molecular de 10.000 Da. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el linker (L) se selecciona de la lista que consiste en maleimida, acetileno, azida o un ácido carboxílico. Aún más preferiblemente el linker es maleimida.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el dendrón se selecciona de la lista que consiste en poli(amidoamina) (PAMAM), polietileniminas, polilisinas, polipropilenimina poliaminas, poliésteres basados en el ácido bismetilol propiónico. Los dendrímeros basados en poli(amidoamina) (PAMAM) contienen grupos amino primarios terminales que reaccionan espontáneamente frente a la betalactama. Por tanto, aún más preferiblemente el dendrón es PAMAM.

El dendrón, por un lado, se une al linker, y por el otro, tiene una serie de grupos füncionales (multivalencia), que pueden unirse a un compuesto (B). En una realización preferida de este aspecto de la invención, dicho compuesto (B) es un antígeno capaz de unirse a los grupos terminales del dendrón. Más preferiblemente, es un antígeno que tiene un grupo füncional capaz de unirse a un grupo amino. En otra realización preferida, es un compuesto que tiene un anillo betalactámico en su estructura. La unión del dendrón al compuesto con el anillo betalactámico se realiza, preferiblemente, mediante los grupos amino de la superficie extema del dendrímero.

Aún más preferiblemente, el compuesto (B) es un antibiótico betalactámico. Aún más preferiblemente es un antibiótico que se selecciona de la lista que consiste en derivados de la penicilina, cefalosporinas, monobactámicos, carbacefem, carbapenems e inhibidores de la betalactamasa.

Un segundo aspecto de la invención se refiere a composiciones que comprenden o consisten en al menos un compuesto de la invención, o cualquiera de sus combinaciones, en adelante composición de la invención.

Es decir, un segundo aspecto de la invención se refiere a una composición que comprende la estructura de la invención.

En otra realización preferida, la composición de la invención comprende al menos otro principio activo.

En otra realización preferida, la composición de la invención comprende al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

En otra realización preferida, la composición de la invención además comprende al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Otro aspecto de la invención se refiere a una forma farmacéutica que comprende o consiste en al menos un compuesto de la invención o la composición de la invención, en adelante forma farmacéutica de la invención.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, la forma farmacéutica de la invención se selecciona de la lista que consiste en: formas farmacéuticas líquidas para administración oral (gotas, jarabes, suspensiones), formas orales sólidas (comprimidos, cápsulas, gránulos, píldoras, pastillas, liofilizados), emplasto, pomada, pasta, crema, solución, suspensión, emulsión, loción, linimento, gel, hidrogel, hidrocoloide, espuma, polvo, o cualquiera de sus combinaciones.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, la forma farmacéutica de la invención es una solución o suspensión.

Otro aspecto de la invención se refiere a la estructura de la invención, , la composición de la invención, o la forma farmacéutica de la invención para su uso en medicina.

Otro aspecto de la invención se refiere a la estructura de la invención, la composición de la invención, o la forma farmacéutica de la invención, para la detección de anticuerpos IgE generados por la hipersensibilidad a BLs, preferentemente a aminopenicilinas, más preferentemente AX.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de la estructura de la invención. El método de obtención se muestra con detalle en los ejemplos.

Como se muestra en los ejemplos, las estructuras de la invención de determinado tamaño sirven para identificar individuos alérgicos a antibióticos betalactámicos (véase el apartado efecto de BiAns sobre la desgranulación inducida por IgE en células RBL-2H3). Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere a un método in vitro de obtención de datos útiles para la prevención, identificación, cribado y/o diagnóstico de la hipersensibilidad a antibióticos betalactámicos (BLs) preferentemente a aminopenicilinas, más preferentemente AX.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método in vitro para la prevención, identificación, cribado y/o diagnóstico de la hipersensibilidad a BLs, preferentemente a aminopenicilinas, más preferentemente AX.

Aún más preferiblemente, el método in vitro de obtención de datos útiles para el diagnóstico de la alergia a un antibiótico betalactámico en un paciente, comprende: a) añadir suero del paciente a una línea celular que exprese el receptor de IgE humano

(FceRI). b) añadir la estructura de la invención, o la composición de la invención, c) detectar si se produce degranulación dependiente de la vía IgE. Más preferiblemente la línea celular del paso a) es la línea de células de leucemia basófila de rata humanizadas HumRBL-2H3.

En otra realización preferida, el método in vitro de obtención de datos útiles para el diagnóstico de la alergia a un antibiótico betalactámico en un paciente comprende las siguientes etapas: a) Recoger una muestra biológica de un individuo, preferiblemente de sangre, más preferiblemente de sangre total, e incubarla con la estructura o la composición de la invención; b) cuantificar la cantidad de anticuerpos IgE específicos que se generan contra la estructura o la composición del apartado a); c) comparar la cantidad obtenida en la etapa b) con la cantidad obtenida en una muestra control negativa; y d) diagnosticar al individuo como alérgico cuando el valor obtenido en la etapa c) es superior al control negativo. En una realización preferida del método del segundo aspecto de la invención, el método se lleva a cabo mediante una técnica seleccionada de entre el grupo que consiste en: TAB (Test de Activación de Basófilos) o un inmunoensayo. Más preferiblemente, el inmunoensayo se selecciona de la lista que consiste en: ELISA (ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas), FAST (test de fluorescencia-alergoadsorción), MAST (test múltiple de quimioluminiscencia alergoadsorción) LAST (test látex alergoadsorción), RAST (test de radioalergoadsorción), RIA (Radioinmunoensayo), EIA (Enzimoinmunoensayo), y FIA (Fluoroinmunoensayo).

En otra realización preferida, el método in vitro de diagnóstico de la alergia a un antibiótico betalactámico en un paciente comprende las siguientes etapas: a) Recoger una muestra de sangre de un suj eto, preferiblemente una muestra de sangre total; b) Contactar in vitro la muestra de sangre del paso a) con una estructura o una composición de la invención; c) Determinar los niveles de expresión de los marcadores de activación de la superficie celular de los basófilos de la muestra de sangre del sujeto; d) Comparar los niveles de expresión del paso c) con los niveles de expresión de los marcadores de activación en ausencia del compuesto del paso b); donde si el valor obtenido en la etapa d) está incrementado con respecto al valor obtenido en ausencia del compuesto del paso b), éste resulta indicativo de que el sujeto presenta hipersensibilidad a los antibióticos betalactámicos.

En una realización preferida, el marcador de activación de la superficie celular de los basófilos se selecciona de la lista que consiste en CD203c, CD63, CD13, CD107a, CD164, CD80, CD86, CD40L, HLA15 DR, CD123, CRTH2, Ph-CREB, Ph-STAT5, Ph-S6rp, Ph-elIF4E, y CREB o cualquiera de sus combinaciones. Preferiblemente el marcador de activación es CD203c y/o CD63.

Otro aspecto de la invención se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en adelante kit o dispositivo de la invención, que comprende o consiste en la estructura de la invención, la composición de la invención o la forma farmacéutica de la invención.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, el kit o dispositivo de la invención además comprende los elementos necesarios para la realización de un test de activación de basófilos (TAB) y mastocitos (MAT).

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

REALIZACIÓN PREFERENTE DE LA INVENCIÓN

La descripción de la invención realizada anteriormente se complementa por medio de los siguientes ejemplos, de carácter no limitativo.

Conforme a lo anterior, se han preparado una serie de nanoestructuras globulares (dendrímeros antigénicos (DeAn)) y otras más largas y flexibles (dendrones antigénicos separados por cadenas de polietilenglicol (PEG) (BiAn)) decorados con determinantes antigénicos de amoxicilina.

La síntesis de los DeAn (más rígidos a altas generaciones), se realizó mediante ataque nucleofílico espontáneo de los grupos aminos en la periferia de los dendrímeros PAMAM (de diferentes generaciones) al anillo betalactámico de la amoxicilina (AX), quedando anclado el determinante amoxiciloilo (AXO).

Se obtuvieron DeAn de diferentes generaciones (G) y valencias (n): Gl, n = 8; G2, n = 16; G3, n = 32; G4, n = 64; G5, n=128; con rendimientos en el rango 69-82%, presentando más altos rendimientos los de menor generación.

Los bidendrones antigénicos separados por espaciadores flexibles (PEG) se obtuvieron mediante la siguiente secuencia sintética (figura 1):

(i) la conversión de los grupos hidroxilos en los extremos de las cadenas de PEG a grupos aminas se ha realizado mediante tratamiento con cloruro de tosilo (introducción de grupo saliente), azida sódica (sustitución nucleófila bimolecular) e hidrogenación catalítica con Pd/C (reducción de azida a amina) dando lugar a fimcionalización amina en los extremos;

(ii) estos extremos amina se anclaron a grupos maleimida, mediante activación del reactivo maleimida como anhídrido mixto, empleando isobutilcloroformiato;

(iii) los dendrímeros PAMAM con fimcionalización disulfuro en el núcleo (core), se trataron con tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) como agente reductor a pH 6.5 para dar lugar a dos dendrones PAMAM con fimcionalización tiol en el punto focal. Esta fimcionalización tiol permitió su acoplamiento a las maleimidas en los extremos de las cadenas PEG satisfactoriamente. Finalmente se realizó la funcionalización de los grupos aminos terminales de los dendrímeros a AX mediante ataque nucleofílico en tampón carbonato a pH básico. Este proceso sintético se ha empleado para una serie de cadenas PEG de diferentes longitudes (PEG peso molecular): PEG 600, PEG1000, PEG 2000, PEG 4000, PEG 6000, PEG 8000, PEG 10000, y PEG 12000. Se ha optimizado el proceso de purificación para cada una de estas nanoestructuras, resultando diferente para los diferentes tamaños. Las estructuras se caracterizaron mediante técnicas de RMN, incluyendo experimentos de difusión para medir su tamaño.

La capacidad de activación de estas nanoestructuras se evaluó en una línea de mastocitos derivados de médula ósea sensibilizados con un anticuerpo monoclonal anti-AX (figura 3), y en mastocitos humanos, RBL-2H3 humanizadas y LAD2, sensibilizados pasivamente con sueros de 3 pacientes alérgicos y 3 tolerantes a AX (figura 3 y 4 respectivamente). Los resultados son consistentes en todas las líneas celulares, mostrando que los dendrímeros DeAn de generaciones 3, 4 y 5; y aquellas nanoestructuras flexibles BiAn con PEG de pesos moleculares (6.000, 8000, 10.000 y 12.000) son las que activan. Así, estos datos indican que la distancia óptima entre determinantes de AX para que ocurra la degranulación puede encontrarse en nanoestructuras como los DeAn de generaciones 3, 4 y 5; y en los BiAn con PEG en el rango 6.000-12.000 Da.

Efecto de BiAns sobre la desgranulación inducida por IgE en células RBL-2H3.

Como ejemplo, elegimos la línea celular HumRBL-2H3 para la evaluación celular, que comparte algunas características tanto con MC como con basófilos, y expresa el receptor de IgE humana (FceRI)]. Se prepararon células con anticuerpos policlonales de sueros de pacientes alérgicos a AX y sujetos tolerantes, luego se trataron células RBL-2H3 sensibilizadas con diferentes concentraciones de BiAns (en términos de los mismos equivalentes de determinantes AXO), y posteriormente, se realizó el ensayo de β -hexosaminidasa. Los resultados, que se muestran en la Figura 4 a la derecha, indican que las células sensibilizadas con sueros de pacientes alérgicos y estimuladas con BiAns que contienen PEG de PM > 6000 Da indujeron significativamente la liberación de β -hexosaminidasa de una manera dependiente de la concentración, en comparación con los grupos de control negativo (células incubadas con PBS y HSA). Los controles de estructura blanco (PEG) no indujeron la desgranulación celular. Además, las concentraciones más altas de BiAns que contienen PM ≥ 6000 Da indujeron una liberación del 33% de β -hexosaminidasa, similar a la inducida por HSA-AXO (a 10 μM de concentración de AXO). Entre estos, BiAn (10000) y BiAn (12000) son los entrecruzadores intermoleculares más eficaces. No se observaron diferencias significativas en estos tratamientos con BiAns cuando las células se sensibilizaron con sueros de sujetos tolerantes y en células no sensibilizadas incluidas como control de la activación de IgE; mientras que se observó un efecto de respuesta a la dosis más específico cuando las células se sensibilizaron con sueros de pacientes, lo que sugiere que BiAns estimula la desgranulación en HumRBL-2H3 a través de una ruta de IgE.

Los resultados indican que el uso de este tipo de nanoestructuras podría mejorar la sensibilidad de los tests in vitro mediante activación de mastocitos humanos pasivamente sensibilizados con suero de pacientes, o mediante el BAT, realizado directamente en sangre del paciente.

METODOLOGÍA

Estudios celulares

Generación de mastocitos a partir de medula ósea de ratón

La eutanasia de los ratones se llevó a cabo mediante dislocación cervical tras la administración previa de CO ₂ por vía inhalatoria. A continuación, se extrajeron las células de la médula ósea de los fémures y se cultivaron en DMEM suplementado con glucosa, L-glutamina, suero fetal bovino, penicilina / estreptomicina y piruvato de sodio (Gibco, Life Technologies), además de 25 ng/mL de SCF, 30 ng/mL de IL-3, 5 ng/mL de IL-9 y 1 ng/mL de TGF-β (Peprotech, Rocky Hill, NJ). Todas las células se cultivaron durante un mínimo de 4 semanas antes de su uso y hasta un máximo de 8 semanas. La madurez y la pureza de las células se determinó mediante citometría de flujo analizando la expresión de c-Kit y FcεRI.

Ensayo de liberación de β -hexosaminidasa

Para la detección de la enzima B-hexosaminidasa se utilizó un método colorimétrico. Tras la activación celular llevada a cabo con las diferentes estructuras dendriméricas en 100 μL de solución Tyrode tamponada con HEPES, las células se centrifugaron a 200 g 10 minutos. 50 μL de los sobrenadantes fueron transferidos a una placa de 96 pocilios y mezclados con 100 μL de sustrato (3.5 mg/mL de p-nitrofenil-N-acetil-β-D-glucosaminida disuelto en 40 mM de ácido cítrico a pH 4.5). El pellet celular se liso con 150 μL de 0.1 Tritón X-100 y 50 μL se mezclaron con 100 μL de sustrato siguiendo el mismo procedimiento anterior. Las mezclas se incubaron a 37°C durante 90 minutos. Tras la incubación, se añadieron 100 μL de glicina (400 mM, pH 10.7) a cada pocilio y se midió la absorbancia a 405 nm. El porcentaje de β -hexosaminidasa segregado se calculó en base a la siguiente fórmula: β -Hexosaminidasa segregada (%) = [β -hexosaminidasa segregada] / [total β -hexosaminidasa] = [2 x (Asobrenadante (A405 nm)) / (Asobrenadante (A405 nm)) + (4 x Δlisado celular (A405 nm))] x 100 %.

Ensayo de activación de células RBL-2H3 humanizadas

Se cultivaron células HumRBL-2H3 en placas de 96 pocilios aúna densidad de 2 x 105 células / pocilio. A continuación, se sensibilizaron células HumRBL-2H3 en crecimiento confluente con suero (50% v / v) de pacientes alérgicos a AX (n = 3) y sujetos tolerantes (n = 3) durante 48 h a 37°C. Se utilizaron células no sensibilizadas como controles. Posteriormente, las células se estimularon con la serie de BiAns a diferentes concentraciones de unidades AXO (1 μM, 10 μM. 20 μM, 50 μM, 100 μM, 150 μM, 200 μM) durante 2 h. En experimentos paralelos, las células se estimularon con los correspondientes enlazadores de PEG (sin funcionalización), estructuras sin AXO conjugado, como controles negativos. El conjugado HSA-AXO (a una concentración de 10 μM de AXO) se utilizó como control positivo de la inducción de la desgranulación. La respuesta de desgranulación de las células HumRBL-2H3 se cuantificó midiendo el nivel de β -hexosaminidasa liberada en los sobrenadantes de cultivo. Después de la activación de HumRBL-2H3, las células se separaron por centrifugación a 150 x g durante 5 min a 4 ° C y luego los sobrenadantes se incubaron con 4-nitrofenil-N-acetil-β-D-glucosaminida (solución 2 mM diluida en 0,2 M tampón citrato, pH 4,5) a 37 °C durante 1 h. Después de 1 hora de incubación, las reacciones se detuvieron mediante la adición de solución de parada (tampón carbonato 0,1 M; pH 10). La absorbancia se midió a 405 nm usando un lector de microplacas Dynex MRX. Los resultados de la desgranulación celular se expresan como el porcentaje de desgranulación en relación con la muestra de control.

Estudios con la línea celular de mastocitos humana LAD2

La línea celular de mastocitos humana LAD2 ( human leukemic mast cell line), se cultivó en medio libre de suero (StemPro.34 SFM), suplementado con lmM de L-Glutamina, 100U/ml de penicilina, 50μg/ml de estreptomicina y 100ng/ml de factor de células madre humana (h-SCF). Las células fueron mantenidas semanalmente hasta la determinación de histamina. Para esta determinación, las células fueron sensibilizadas durante 24h con suero al 50% procedente de 3 pacientes alérgicos a AX y 3 sujetos tolerantes. Una vez transcurrido este tiempo, las células fueron lavadas y posteriormente activadas con las diferentes nanoestructuras a diferentes concentraciones ( 0,1mM, lmM, 10mM, 20mM, 50mM y 100mM). Células sin activar y un control positivo (Sustancia P a 0,1nM, 1nM, 10nM, 100nM, 1μM y 10μM) fueron incluidos. Después de lh de activación con las diferentes nanoestructuras, las células fueron centrifugadas y el sobrenadante recogido. La determinación de histamina liberada fue determinada en el sobrenadante recogido mediante HISTAREADER™ 501.

Síntesis de compuestos

Procedimiento general para la síntesis de PEG- (Ts) ₂ (figura 2)

El polietilenglicol (PEG) (1 equiv.) disuelto en CH ₂ CI ₂ anhidro y cloruro de 4-toluenosulfonilo (TSCl) (3 equiv.), se colocaron en un matraz de fondo redondo de 250 mL, burbujeando con N ₂ y enfriado a 0 °C. Se añadió KOH en polvo (4 equiv.) a la mezcla en pequeñas porciones para que la temperatura de la mezcla permanezca por debajo de 5 °C. Después de agitar durante 5 horas a 0 °C, la reacción tuvo lugar a temperatura ambiente durante la noche. La reacción se lavó luego con H ₂ O. La fase orgánica se separó y la fase acuosa se extrajo con CH ₂ CI ₂ (3x15 mL). La fase orgánica combinada se secó sobre MgSO ₄ anhidro, se filtró y el disolvente se eliminó mediante evaporador rotatorio para obtener un producto.

Procedimiento general para la síntesis de PEG- (N3) ₂ (figura 2)

PEG- (Ts) ₂ (1 equiv.) se disolvió en 50 ml de H ₂ O destilada: THF (80:20% v / v), se añadió NaN ₃ (3 equiv.) al producto disuelto y se calentó a reflujo a 70 °C durante la noche. Después de enfriar la reacción a temperatura ambiente, el producto se extrajo con THF (3x30 mL) mientras se lavaba con HCl 1 M y salmuera. La capa orgánica recogida se secó sobre MgSCfi anhidro, se filtró y el disolvente se eliminó a presión reducida para obtener el crudo de reacción.

Procedimiento general para la síntesis de PEG- ( NH ₂ ) ₂ (figura 2)

A una solución que contiene una cantidad pesada de PEG-(N ₃ ) ₂ disuelto en 15 mL de MeOH, 20% del peso se añadió de Pd/C al 10%. La solución resultante se dejó agitar a 300 rpm bajo hidrógeno gaseoso (H ₂ , 50 bar, ta). La reacción se monitorizó mediante RMN- ¹ H (la presencia de pico perteneciente a CH ₂ -N ₃ ). El catalizador se eliminó mediante filtración a través de celita y lavados con MeOH. El disolvente se eliminó a presión reducida en evaporador rotatorio para producir un producto.

Procedimiento general para la síntesis de PEG- (maleimida) ₂ (figura 2)

A una solución agitada del compuesto 1 (2,2 equiv.) en CH ₂ CI ₂ anhidro a 0 °C, se añadieron gota a gota N-metilmorfolina (NMM) (2,3 equiv.) y cloroformiato de isobutilo (BuCOCl) (2,3 equiv.). Posteriormente, 1 h más tarde, se añadió PEG- (NH ₂ ) ₂ (1 equiv.) disuelto en CH ₂ CI ₂ anhidro (15 ml). La mezcla se dejó reaccionar lentamente a temperatura ambiente y permaneció durante 48 h. El producto se lavó con H ₂ O, solución acuosa de HCl al 5%, H ₂ O, solución acuosa de NaHCO ₃ al 10%. La capa orgánica recogida se secó sobre MgSO ₄ anhidro, se filtró y el disolvente se eliminó a presión reducida con un rotavapor. El producto bruto se purificó por cromatografía de permeación en gel usando soporte Bio-Beads ™ S-X1 (malla 200-400, Bio- Rad) usando THF como eluyente.

Procedimiento general para la síntesis de PEG- [dG2] ₂ (figura 2)

Se obtuvo disolviendo el dendrímero PAMAM, el núcleo de cistamina, generación 2 (G2) (1.1 equiv.) en PBS (1x, pH 6.5) después de eliminar MeOH a vacío. La solución resultante se desoxigenó purgando con gas N2. Se añadió tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) (10 equiv.) a la solución anterior y la reducción del enlace disulfuro se controló por TLC usando Ellman y ninhidrina como reactivos. E1 PEG-(maleimida) ₂ (1 equiv.) se disolvió en 5 ml de H ₂ O destilada con pocas gotas de DMSO como codisolvente y se lavó con gas N2. Como paso final, se añadió PEG-(maleimida) ₂ a la solución anterior y la reacción se desarrolló durante la noche. El producto resultante se concentró a presión reducida y se redisolvió en H ₂ O destilada y se purificó por cromatografía de filtración en gel usando PD MidiTrap G-25.

Procedimiento general para la síntesis de PEG- [dG2-(AXO) ₈ ] ₂ (figura 2)

Se obtuvo disolviendo 1 equivalente de PEG- (dG2) ₂ entampón de carbonato (0,05 M, pH 10,9) y añadiendo 32 equiv. de AX (empleando 2 equiv. por grupo NH2). La reacción tiene lugar a 4 °C bajo agitación magnética durante 7 días refrescando con la adición de un 20% de la masa inicial de AX en tres ocasiones. La purificación se realizó por cromatografía de filtración en gel usando columnas PD MidiTrap G-10. Mal-COOH (1) (Fig. 5)

En un matraz de fondo redondo, se disolvieron ácido γ-aminobutírico (6 g, 58.2 mmol) y anhídrido maleico (6.8 g, 69.9 mmol) mediante agitación en 120 mL de ácido acético glacial a 120 °C durante 6 horas. La reacción se enfrió a temperatura ambiente antes de verterla en 50 ml de agua y se extrajo con 50 ml de acetato de etilo en tres ocasiones. Las capas orgánicas recogidas se combinaron y se secaron sobre MgSO ₄ anhidro. El disolvente se eliminó a presión reducida por evaporación rotatoria. La purificación se realizó por recristalización del producto bruto cuatro veces en 1: 1 de hexano: acetato de etilo para obtener un producto con un rendimiento del 65%. 1H RMN (400 MHz, CDCl ₃ ) δ: 10.81 (s, 1H), 6.71 (s, 2H), 3.60 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.37 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.93 (qt, J = 7,1 Hz, 2H). 13C (101 MHz, CDCl3) δ: 178.3, 170.9, 134.2, 37.1, 31.2, 23.6.

PEG (600) - (Ts) ₂ (2)

Sintetizado de acuerdo con el procedimiento general A. PEG (MW ~ 600 Da) (9 g, 15 mmol), CH ₂ CI ₂ (30 ml), TsCl (8,5 g, 45 mmol) y KOH (3,4 g, 60 mmol) se usaron en la reacción. El crudo de reacción se purificó por cromatografía en columna usando CH ₂ CI ₂ : MeOH (15: 1 v / v) como disolvente de elución para obtener un producto semisólido blanco con un rendimiento del 93,3%. 1H RMN (400 MHz, CDCl ₃ ) δ 7.78 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.31 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 4.12 (t, 4H), 3.67 - 3.55 (m, 56H), 2.42 (s, 6 H). 13C NMR (101 MHz, CDCl ₃ ) δ 144.8, 133.0, 129.8, 128.0, 70.6, 69.3, 68.7, 21.7.

PEG (600) - (N ₃ ) ₂ (3) (Figura 6)

Se obtuvo de acuerdo con el procedimiento general B. El compuesto 2 (8,4 g, 9,24 mmol), 50 mi de H ₂ O destilada: THF (80:20% v / v) y NaN ₃ (1,8 g, 27,6 mmol) se usaron en la reacción. El producto se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice usando CH ₂ Cl ₂ :MeOH (9: 1 v / v) como eluyente (84% de rendimiento). 1H RMN (400 MHz, CDCI ₃ ) δ 3.82 - 3.37 (m, 56H), 3.32 (t, J = 5.1 Hz, 4H). 13C NMR (101 MHz, CDCI ₃ ) δ 70.7 - 70.4 (m), 70.0, 50.6.

PEG (600)-(NH ₂ ) ₂ (4) (Figura 7) Se obtuvo de acuerdo con el procedimiento general C. Se usó el compuesto 3 (500 mg, 0,76 mmol), 15 ml de MeOH, Pd / C (100 mg). La reacción se llevó a cabo durante 6 h para obtener un producto semisólido blanco con 84,5% de rendimiento. 1H RMN (400 MHz, CDCl ₃ ) δ 3.67 - 3.57 (m, 56H), 3.48 (t, J = 5.2 Hz, 4H), 2.83 (t, J = 5.2 Hz, 4H). 13C NMR (101 MHz, CDCl ₃ ) δ 73.3, 70.6, 70.3, 41.7

PEG (600)-(maleimida) ₂ (5) (Figura 8)

Se sintetiza de acuerdo con el procedimiento general D. Compuesto 1 (314 mg, 1.72 mmol), CH ₂ CI ₂ (15 mL), NMM (200.74 mg, 1.79 mmol), BuCOCl (234 mg, 1.79 mmol.) y compuesto 4 (466mg, 0.78 mmol) disueltos en 15 ml de CH ₂ CI ₂ para obtener un producto con un rendimiento del 60%. 1H RMN (400 MHz, CDCl ₃ ) 5 6.70 (s, 4H), 6.43 (s, 2H), 3.67 - 3.61 (m, 56H), 3.51-3.45 (m, 8H), 3.44 (t, J = 5.2 Hz, 4H), 2,17 (t, J = 7,2 Hz, 4H), 1,97 - 1,88 (m, 4H).

13C NMR (101 MHz, CDCl ₃ ) 5 172.3, 171.2, 134.6, 70.9, 70.6, 70.3, 39.7, 37.7, 25.1.

PEG (600)-[dG ₂ ] ₂ (6) (Figura 9) Se sintetizó de acuerdo con el procedimiento general E, empleando G2 (614 mg, 0,18 mmol), 5 mi de PBS (1x, pH 6,5), TCEP (525 mg, 1,83 mmol), compuesto 5 (150 mg, 0,166 mmol), 5 ml de H ₂ O y gotas de DMSO. La purificación se realizó por cromatografía de filtración en gel usando columnas PD MidiTrap G-10 y recogiendo las fracciones de pequeños volúmenes. 1H RMN (400 MHz, D ₂ O) δ 3.73 - 3.67 (m, 56H), 3.66- 3.59 (m, 8H), 3.55 - 3.26 (m, 88H), 3.15 (t, J = 6.0 Hz, 8H), 2.87 - 2,76 (m, 56H), 2,68 - 2,56 (m, 30H), 2,50 - 2,39 (m, 56H), 2,17 - 2,08

(m, 8H), 1,92 - 1,83 (m, 4H). 13C NMR (101 MHz, D ₂ O) δ 179.7, 178.7, 172.9, 172.6, 69.7, 69.6, 69.0, 51.9, 49.7, 49.5, 39.1, 37.0, 34.5, 30.2, 29.0, 28.4, 23.5, 22.9.

PEG(600)-[dG ₂ -(AXO) ₈ ] ₂ (7) BiAn(600) (Figura 10)

Se obtuvo siguiendo el procedimiento general F, mediante reacción del compuesto 6 (80,5 mg, 0,021 mmol) con AX (252,7 mg, 0,65 mmol). La reacción se refrescó con 50,5 mg de AX en tres ocasiones diferentes. Después de la purificación, el producto se recogió como un polvo amarillento con un 59% de rendimiento. 1H RMN (400 MHz, D ₂ O) δ 7.29 (d, J = 7.8 Hz, 32H), 6.87 (d, J = 7.8 Hz, 32H), 4.96 (d, J = 8.0 Hz, 16H), 4.59 (s, 16H ), 4.27 (d, J = 8.0 Hz, 16H), 3.75 - 3.55 (m, 56H), 3.62 - 3.57 (m, 8H), 3.35 (s, 16H), 3.33 - 3.18 (m, 88H), 3.12 - 3.01 (m, 8H), 2.86 - 2.69 (m, 56H), 2.67 - 2.51 (m, 30H), 2.49 - 2.32 (m, 56H), 2.18- 2.05 (m, 8H), 1.97 - 1.75 (m, 4H ), 1.47 (s, 48H), 1.20 (s, 48H). 13C NMR (101 MHz, D ₂ O) δ 175.6, 175.1, 174.6, 171.6, 160.5, 156.2, 129.7, 128.8, 115.9, 74.9, 69.8, 69.6, 68.9, 64.9, 59.5, 59.1, 58.2, 51.4, 49.1, 39.4, 38.9 , 38.7, 36.9, 36.9, 3.7, 28.9, 28.2, 26.8, 23.6, 23.0.

PEG (lk)- (Ts) ₂ (8)

Sintetizado según el procedimiento general A, emplando PEG (MW ~ 1000 Da) (10 g, 10 mmol), CH ₂ CI ₂ (30 ml), TsCl (5,7 g, 30 mmol) y KOH (2,2 g, 40 mmol) en la reacción. El producto en crudo se purificó por cromatografía en columna usando CH ₂ Cl ₂ : MeOH (9: 1 v / v) como disolvente de elución para obtener un producto en polvo blanco con un rendimiento del 97%. 1H RMN (400 MHz, CDCl ₃ ) δ 7.77 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.32 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 4.14 (t, 4H), 3.68 - 3.54 (m, 93H), 2.43 (s, 6 H). 13C NMR (101 MHz, CDCl ₃ ) δ 144.7, 133.1, 129.7, 127.9, 70.6, 69.3, 68.7, 21.7.

PEG (lk)-(N ₃ ) ₂ (9)

Se obtuvo según el procedimiento general B, empleando el compuesto 8 (8,7 g, 6,65 mmol), 50 mi de H ₂ O destilada: THF (80:20% v / v) y NaN3 (1,3 g, 19,95 mmol). El producto se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice usando CH ₂ CE:MeOH 9: 1 (v / v) como eluyente para obtener un polvo blanco con un rendimiento del 93%. 1H RMN (400 MHz, CDCl ₃ ) δ 3.64 - 3.56 (m, 93H), 3.34 (t, J = 5.1 Hz, 4H). 13C NMR (101 MHz, CDCl ₃ ) δ 70.5, 70.0, 50.6. PEG (lk)-(NH ₂ ) ₂ (10)

Se obtuvo de acuerdo con el procedimiento general C, empleando el compuesto 9 (200 mg, 0,19 mmol), 15 ml de MeOH y Pd/C (40 mg). La reacción tuvo lugar durante 12 h para obtener un producto con un rendimiento del 88%. 1H RMN (400 MHz, CDCl ₃ ) δ 3.65 - 3.55 (m, 93H), 3.46 (t, J = 5.2 Hz, 4H), 2.81 (t, J = 5.2 Hz, 4H), 2.22 (s, 4H). 13C NMR (101 MHz, CDCl ₃ ) δ

73.3, 70.5, 70.2, 41.7.

PEG (lk)-(maleimida) ₂ (ll) Se sintetizó de acuerdo con el procedimiento general D. Compuesto 1 (80.7 mg, 0.44 mmol), NMM (53.8 mg, 0.46 mmol), BuCOCl (62.8 mg, 0.46 mmol), compuesto 10 (200 mg, 0.2 mmol) y 15 mL de CH ₂ CI ₂ se usaron para obtener un producto con 75% de rendimiento. 1H RMN (400 MHz, CDCl ₃ ) δ 6.69 (s, 4H), 6.52 (s, 2H), 3.68 - 3.59 (m, 93 H), 3.57-3.51 (m, 8H), 3.44 (t, J = 5.2 Hz , 4H), 2,17 (t, J = 7,2 Hz, 4H), 1,93 - 1,88 (m, 4H). 13C NMR (101 MHz, CDCl ₃ ) δ 172.0, 171.0, 134.2, 70.7, 70.6, 70.3, 39.4, 37.4, 24.8.

PEG (lk)-[dG ₂ ] ₂ (12)

Se sintetizó de acuerdo con el procedimiento general E, empleando G2 (100 mg, 0,075 mmol), 5 ml de PBS (1x, pH 6,5), TCEP (237,4 mg, 1,83 mmol), compuesto 11 (276 mg, 0,083 mmol) disuelto en 5 ml de H ₂ O y algunas gotas de DMSO. La purificación se realizó por cromatografía de filtración en gel usando columnas PD MidiTrap G-10. El producto se aisló como un polvo blanco (rendimiento 72%). 1H NMR (400 MHz, D ₂ O) δ 3.75 - 3.68 (m, 93H), 3.67- 3.59 (m, 8H), 3.56 - 3.22 (m, 88H), 3.17 ( t, J = 6.0 Hz, 8H), 2.87 - 2.74 (m, 56H), 2.73 - 2.55 (m, 30H), 2.52 - 2.41 (m, 56H), 2.22-2.08 (m, 8H), 1.92 - 1.83 ( m, 4H). 13C NMR (101 MHz, D ₂ O) δ 179.7, 179.5, 173.0, 172.7, 69.8, 69.6, 69.6, 51.9, 49.7, 49.4, 39.2, 38.9, 37.0, 34.5, 29.6, 29.1, 28.5, 23.5, 22.9.

PEG(lk)-[dG ₂ -(AXO) ₈ ] ₂ (13) BiAn(1000)

Se obtuvo siguiendo el procedimiento general F, mediante reacción del compuesto 12 (96,7 mg, 0,021 mmol) con AX (256,3 mg, 0,65 mmol), y refrescando con 51 mg de AX en tres ocasiones diferentes. Tras purificación, el producto se recogió como un polvo amarillento (rendimiento 75%). 1H RMN (400 MHz, D ₂ O) δ 7.29 (d, J = 7.8 Hz, 32H), 6.87 (d, J = 7.8 Hz, 32H), 4.96 (d, J = 8.0 Hz, 16H), 4.59 (s, 16H ), 4.27 (d, J = 8.0 Hz, 16H), 3.75 - 3.55 (m, 93H), 3.62 - 3.57 (m, 8H), 3.35 (s, 16H), 3.33 - 3.18 (m, 88H), 3.12 - 3.01 (m, 8H), 2.86 - 2.69 (m, 56H), 2.67 - 2.51 (m, 3 OH), 2.49 - 2.32 (m, 56H), 2.18 - 2.05 (m, 8H), 1.84 - 1.72 (m, 4H ), 1.47 (s, 48H), 1.20 (s, 48H). 13C NMR (101 MHz, D ₂ O) δ 176.0, 175.4, 175.0, 172.0, 160.8, 156.6, 130.0, 129.1, 116.5, 75.1, 70.1, 69.9, 69.3, 65.2, 59.94, 59.4, 58.5, 51.7, 49.5, 39.8, 39.1 , 37.2, 33.1, 29.2, 28.5, 27.2, 23.5, 23.4.

PEG (2k)- (Ts) ₂ (14) Sintetizado de acuerdo con el procedimiento general A, empleando PEG (MW ~ 2000 Da) (10 g, 5 mmol), CH ₂ CI ₂ (30 ml), TSC1 (2.8 g, 15 mmol) y KOH (2.24 g, 40 mmol). El crudo se purificó por cromatografía en columna usando CH ₂ CI ₂ : MeOH (9: 1 v / v) como eluyente para obtener un producto sólido blanco (rendimiento 78%). 1H RMN (400 MHz, CDCfi) δ 7.76 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.33 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 4.12 (t, J = 5.6 Hz, 4H), 3.67 - 3.54 (m , 184H), 2.42 (s, 6H) ,13C NMR (101 MHz, CDCfi) δ 144.7, 133.1, 129.6, 128.0, 77.1, 70.3, 69.3, 68.7, 21.5.

PEG (2k)-(N ₃ ) ₂ (15)

Se obtuvo de acuerdo con el procedimiento general B, empleando el compuesto 14 (10,7 g, 4,6 mmol), 50 ml de H ₂ O destilada: THF (80:20% v / v) y NaN ₃ (900 mg, 13,8 mmol). El producto se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice eluyendo con CH ₂ CI ₂ : MeOH 9: 1 (v / v) para obtener un polvo blanco (93% de rendimiento). 1H RMN (400 MHz, CDCl ₃ ) δ 3.67 - 3.54 (m, 186H), 3.39 (t, J = 5.1 Hz, 4H). 13C NMR (101 MHz, CDCfi) δ 70.6, 70.0, 50.7.

PEG (2k)-(NH ₂ ) ₂ (16)

Se obtuvo de acuerdo con el procedimiento general C, empleando el compuesto 15 (200 mg, 0,097 mmol), 15 ml de MeOH y Pd/C (40 mg) durante 12 h de reacción para obtener un producto (89%). 1H RMN (400 MHz, CDCfi) δ 3.73 - 3.55 (m, 186H), 3.52 (t, J = 5.2 Hz, 4H), 2.88 (t, J = 5.2 Hz, 4H), 1.95 (s, 4H). 13C NMR (101 MHz, CDCfi) δ 73.6, 70.7, 70.4, 41.7.

PEG (2k)-(maleimida) ₂ (17)

Se sintetiza de acuerdo con el procedimiento general D, empleando el compuesto 1 (101 mg, 0.56 mmol), NMM (151 mg, 1.3 mmol), BuCOCl (176 mg, 1.3 mmol), PEG (2000)-diamina (500 mg, 0.25 mmol) y 15 mi de CH ₂ CI ₂ para obtener un producto sólido blanco (79% rendimiento). 1H RMN (400 MHz, CDCfi) δ 6.70 (s, 4H), 6.39 (s, 2H), 3.70 - 3.59 (m, 186 H), 3.58-3.53 (m, 8H), 3.45 (t, J = 5.2 Hz , 4H), 2,16 (t, J = 7,2 Hz, 4H), 1,98 - 1,90 (m, 4H). 13C NMR (101 MHz, CDCfi) δ 172.0, 171.0, 134.2, 70.7, 70.6, 70.3, 39.4, 37.4, 24.8.

PEG (2k)-[dG ₂ ] ₂ (18)

Se sintetizó de acuerdo con el procedimiento general E, empleando G2 (157 mg, 0,047 mmol), 5 ml de PBS (1x, pH 6,5), TCEP (135 mg, 0,47 mmol), compuesto 17 (100 mg, 0,043 mmol) disuelto en 5 ml de H ₂ O y pocas gotas de DMSO. La purificación se realizó por cromatografía de filtración en gel usando columnas PD MidiTrap G-25. El producto se aisló como un polvo blanco (rendimiento 64%). 1H NMR (400 MHz, D ₂ O) δ 3.77 - 3.66 (m, 186H), 3.62- 3.48 (m, 8H), 3.46 - 3.19 (m, 88H), 3.17 ( t, J = 6.0 Hz, 8H), 2.85 - 2.68 (m, 56H), 2.67 - 2.53 (m, 30H), 2.50 - 2.40 (m, 56H), 2.17-2.06 (m, 8H), 1.92 - 1.77 ( m, 4H). 13C NMR (101 MHz, D ₂ O) δ 179.8, 178.6, 173.0, 172.8, 69.9, 69.7, 69.1, 52.1, 49.8, 49.6, 39.3, 39.0, 37.2, 34.7, 29.2, 28.6, 23.7, 23.0.

PEG(2k)-[dG ₂ -(AXO) ₈ ] ₂ (19) BiAn(2000)

Se obtuvo siguiendo el procedimiento general F, mediante reacción del compuesto 18 (98,2 mg, 0,0173 mmol) con AX (214,45 mg, 0,554 mmol). La reacción se refrescó con 43 mg de AX en tres ocasiones diferentes. Después de la purificación, el producto se recogió como un polvo amarillento (71% rendimiento). 1H RMN (400 MHz, D ₂ O) δ 7.30 (d, J = 7.8 Hz, 32H), 6.88 (d, J = 7.8 Hz, 32H), 4.95 (d, J = 8.0 Hz, 16H), 4.67 (s, 16H ), 4.27 (d, J = 8.0 Hz, 16H), 3.89 - 3.56 (m, 186H), 3.54 - 3.43 (m, 8H), 3.35 (s, 16H), 3.33 - 3.20 (m, 88H), 3.16 - 3.11 (m, 8H), 2.90 - 2.69 (m, 56H), 2.68 - 2.53 (m, 30H), 2.50 - 2.29 (m, 56H), 2.27 -2.09 (m, 8H), 1.92- 1.71 (m, 4H ), 1.46 (s, 48H), 1.20 (s, 48H). 13C NMR (101 MHz, D ₂ O) δ 175.7, 175.1, 174.9, 171.6, 160.4, 156.3, 129.7, 129.0, 116.2, 74.9, 69.8, 69.6, 69.0, 64.9, 59.6, 59.1, 57.9, 51.4, 49.1, 39.4, 38.7 , 37,3, 32,7, 28,9, 28,2, 26,8, 23,7, 23,1.

PEG (4k)-(Ts) ₂ (20)

Sintetizado según el procedimiento general A, empleando PEG (MW ~ 4000 Da) (10 g, 2.5 mmol), CH ₂ Cl ₂ (30 ml), TsCl (1.43 g, 7.5 mmol) y KOH (1.68 g, 3 mmol). El producto bruto se purificó por cromatografía en columna usando CH ₂ Cl ₂ : MeOH (9,5: 0,5 v / v) como eluyente para obtener un producto en polvo blanco (84% rendimiento). 1H RMN (400 MHz, CDCl ₃ ) δ 7.77 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.34 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 4.14 (t, 4H), 3.68 - 3.54 (m, 373H), 2.43 (s, 6 H). 13C NMR (101 MHz, CDCl ₃ ) δ 144.8, 132.9, 129.6, 128.0, 77.1, 70.6, 69.3, 68.7, 21.5.

PEG (4k)-(N ₃ ) ₂ (21)

Se obtuvo según el procedimiento general B, empleando el compuesto 20 (9,1 g, 2,1 mmol), 50 mi de H ₂ O destilada: THF (80:20% v / v) y NaN3 (0,41 g, 6,34 mmol). El producto se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice usando CH ₂ Cl ₂ : MeOH 9: 1 (v / v) como eluyente para obtener un polvo blanco con un rendimiento del 90%. 1H RMN (400 MHz, CDCl ₃ ) δ 3.85 - 3.44 (m, 373H), 3.38 (t, J = 5.1 Hz, 4H). 13C NMR (101 MHz, CDCl ₃ ) δ 70.6, 70.2, 50.8.

PEG (4k)-(NH ₂ ) ₂ (22)

Se obtuvo de acuerdo con el procedimiento general C, empleando el compuesto 21 (200 mg, 0,049 mmol), 15 ml de MeOH y Pd / C (40 mg). La reacción tuvo lugar durante 12 h para obtener un producto con un rendimiento del 97%. 1H RMN (400 MHz, CDCI ₃ ) δ 3.73 - 3.54 (m, 373H), 3.51 (t, J = 5.2 Hz, 4H), 2.86 (t, J = 5.2 Hz, 4H), 1.74 (s, 4H). 13C NMR (101 MHz, CDCl ₃ ) δ 73.6, 70.7, 70.4, 41.9.

PEG (4k)-(maleimida) ₂ (23)

Se sintetiza de acuerdo con el procedimiento general D, empleando compuesto 1 (46.8 mg, 0.256 mmol), NMM (61.6 mg, 0.526 mmol), BuCOCl (71.8 mg, 0.526 mmol), compuesto 22 (500 mg, 0.125 mmol) y 15 mL CH ₂ Cl ₂ para obtener un producto (rendimiento 76%). 1H RMN (400 MHz, CDCl ₃ ) δ 6.70 (s, 4H), 6.50 (s, 2H), 3.68 - 3.60 (m, 373 H), 3.59-3.53 (m, 8H), 3.45 (t, J = 5.2 Hz , 4H), 2,35 (t, J = 7,2 Hz, 4H), 1,97 - 1,86 (m, 4H). 13C NMR (101 MHz, CDCl ₃ ) δ 172.0, 171.3, 134.2, 70.7, 70.3, 70.0, 39.3, 37.5, 33.63, 24.5.

PEG (4k)-[dG ₂ ] ₂ (24)

Se sintetizó de acuerdo con el procedimiento general E, empleando G2 (84.7 mg, 0.0253 mmol), 5 ml de PBS (1x, pH 6.5), TCEP (72.5 mg, 0.253 mmol), compuesto 23 (100 mg, 0.023 mmol) disuelto en 5 ml de H ₂ O y algunas gotas de DMSO. La purificación se realizó por cromatografía de filtración en gel usando columnas PD MidiTrap G-25. El producto se aisló como un polvo blanco (83% rendimiento). 1H NMR (400 MHz, D ₂ O) δ 3.83 - 3.68 (m, 373 H), 3.68- 3.59 (m, 8H), 3.58 - 3.22 (m, 88H), 3.17 (t, J = 6.0 Hz, 8H), 2.92 - 2.79 (m, 56H), 2.78 - 2.59 (m, 30H), 2.58 - 2.44 (m, 56H), 2.22- 2.11 (m, 8H), 1.91 - 1.80 (m, 4 H). 13C NMR (101 MHz, D ₂ O) δ 178.5, 178.4, 172.9, 172.5, 69.9, 69.7, 69.1, 52.1, 49.9, 49.6, 39.3, 39.0, 37.1, 34.6, 29.7, 29.0, 27.6, 23.2, 22.6.

PEG(4k)-[dG ₂ -(AXO) ₈ ] ₂ (25) BiAn(4000) Se obtuvo siguiendo el procedimiento general F, mediante reacción de el compuesto 24 (93,5 mg, 0,0122 mmol) con AX (151 mg, 0,39 mmol), y refrescando con 30 mg de AX en tres ocasiones diferentes. Después de la purificación, el producto se recogió en forma de polvo amarillento (57% rendimiento). 1H RMN (400 MHz, D ₂ O) δ 7.30 (d, J = 7.8 Hz, 32H), 6.87 (d, J = 7.8 Hz, 32H), 4.96 (d, J = 8.0 Hz, 16H), 4.59 (s, 16H ), 4.27 (d, J = 8.0 Hz, 16H), 3.85 - 3.62 (m, 373H), 3.57 - 3.49 (m, 8H), 3.36 (s, 16H), 3.34 - 3.12 (m, 88H), 3.11 - 3.01 (m, 8H), 2.88 - 2.67 (m, 56H), 2.66 - 2.49 (m, 30H), 2.47 - 2.29 (m, 56H), 2.18 - 2.08 (m, 8H), 1.91 - 1.73 (m, 4H ), 1.48 (s, 48H), 1.21 (s, 48H). 13C NMR (101 MHz, D ₂ O) δ 174.3, 174.2, 173.9, 170.9, 160.1, 155.6, 129.1, 128.2, 115.5, 74.0, 69.0, 68.9, 68.7, 64.1, 58.8, 58.3, 57.5, 51.6, 48.2, 38.2, 38.0 , 36.2, 32.0, 28.1, 27.53, 26.1, 23.05, 22.4.

PEG (6k)-(Ts) ₂ (26)

Sintetizado según el procedimiento general A. Se usaron PEG (MW ~ 6000 Da) (10 g, 1,67 mmol), CH ₂ CI ₂ (30 ml), TsCl (960 mg, 5 mmol) y KOH (840 mg, 15 mmol) en la reacción. El producto bruto se purificó por cromatografía en columna usando CH ₂ CE: MeOH (9,5: 0,5 v / v) como disolvente de elución para obtener un producto sólido blanco (rendimiento 82%). 1H RMN (400 MHz, CDCl ₃ ) δ 7.79 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.34 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 4.14 (t, J = 5.6 Hz, 4H), 3.68 - 3.52 (m, 560H), 2.42 (s, 6H) .13C NMR (101 MHz, CDCl ₃ ) δ 144.7, 133.1, 129.9, 128.1, 70.6, 69.35, 68.7, 21.6.

PEG (6k)-(N ₃ ) ₂ (27)

Se obtuvo de acuerdo con el procedimiento general B. El compuesto 26 (8,5 g, 1,35 mmol), 50 mi de H20 destilada: THF (80:20% v / v) y NaN3 (263 mg, 4,04 mmol) se usaron en la reacción.

Como punto final, el producto se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice usando CH2Cl2: MeOH 9,5 : 0,5 (v / v) como eluyente para obtener un polvo blanco con un rendimiento del 95,5%. 1H RMN (400 MHz, CDCl ₃ ) δ 3.69 - 3.49 (m, 560H), 3.34 (t, J = 5.1 Hz, 4H). 13C RMN (101 MHz, CDCl ₃ ) δ 70.5, 70.0, 50.5.

PEG (6k) -(NH ₂ ) ₂ (28)

Se obtuvo de acuerdo con el procedimiento general C. Se usó el compuesto 27 (200 mg, 0,033 mmol), 15 ml de MeOH, Pd / C (40 mg). La reacción se dejó correr durante 24 h para obtener un producto con 96.3%. 1H RMN (400 MHz, CDCl ₃ ) δ 3.72 - 3.59 (m, 560H), 3.48 (t, J = 5.2 Hz, 4H), 2.88 (t, J = 5.2 Hz, 4H), 1.92 (s, 4H). 13C NMR (101 MHz, CDCl ₃ ) δ 73.5, 70.5, 70.3, 41.6.

PEG (6k)-(maleimida) ₂ (29)

Se sintetiza de acuerdo con el procedimiento general D. Compuesto 1 (33.6 mg, 0.183 mmol), NMM (49.3 mg, 0.421 mmol), BuCoCl (57.5 mg, 0.421 mmol.) Y Compuesto 29 (500 mg, 0.083 mmol) y 15 mL Se utilizaron CH2Cl2 para obtener un producto sólido blanco con 82,3% de rendimiento. 1H RMN (400 MHz, CDCl ₃ ) δ 6.69 (s, 4H), 6.39 (s, 2H), 3.79 - 3.54 (m, 560 H), 3.61-3.53 (m, 8H), 3.47 (t, J = 5.2 Hz , 4H), 2,33 (t, J = 7,2 Hz, 4H), 1,98 - 1,88 (m, 4H). 13C NMR (101 MHz, CDCl ₃ ) δ 172.2, 170.9, 134.0, 70.7, 70.3, 69.9, 39.1, 37.2, 33.6, 24.7.

PEG (6k)-[dG ₂ ] ₂ (30)

Se sintetizó de acuerdo con el procedimiento general E, empleando G2 (58 mg, 0.017 mmol), 5 mi de PBS (1x, pH 6.5), TCEP (45.3 mg, 0.158 mmol), compuesto 29 (100 mg, 0.016 mmol) disuelto en 5 ml de H ₂ O y algunas gotas de DMSO. La purificación se realizó por cromatografía de filtración en gel usando columnas PD MidiTrap G-25. El producto se aisló como un polvo blanco (rendimiento 66%). 1H NMR (400 MHz, D ₂ O) δ 3.74 - 3.69 (m, 560H), 3.68- 3.60 (m, 8H), 3.57- 3.28 (m, 88H), 3.18 ( t, J = 6.0 Hz, 8H), 2.91 - 2.80 (m, 56H), 2.79 - 2.70 (m, 30H), 2.60 - 2.47 (m, 56H), 2.22- 2.13 (m, 8H), 1.93 - 1.80 ( m, 4H). 13C NMR (101 MHz, D ₂ O) δ 178.5, 177.6, 173.0, 172.6, 69.9, 69.8, 69.2, 52.0, 49.7, 49.6, 39.3, 39.0, 37.2, 34.6, 29.4, 29.4, 29.1, 23.2, 22.5.

PEG(6k)-[dG ₂ -(AXO) ₈ ] ₂ (31) BiAn(6000)

Se obtuvo siguiendo el procedimiento general F. Se hicieron reaccionar el compuesto 30 (100 mg, 0,0103 mmol) y AX (128 mg, 0,554 mmol). La reacción se refrescó con 25,6 mg de AX en tres ocasiones diferentes. Después de la purificación, el producto se recogió como un polvo amarillento (rendimiento 48%). 1H RMN (400 MHz, D20) δ 7.27 (d, J = 7.8 Hz, 32H), 6.86 (d, J = 7.8 Hz, 32H), 4.97 (d, J = 8.0 Hz, 16H), 4.59 (s, 16H ), 4.26 (d, J = 8.0 Hz, 16H), 3.79 - 3.67 (m, 560H), 3.56 - 3.50 (m, 8H), 3.35 (s, 16H), 3.33 - 3.12 (m, 88H), 3.10 - 2.99 (m, 8H), 2.90 - 2.70 (m, 56H), 2.66 - 2.49 (m, 30H), 2.45 - 2.27 (m, 56H), 2.18 -2.07 (m, 8H), 1.97- 1.70 (m, 4H ), 1.47 (s, 48H), 1.20 (s, 48H). 13C NMR (101 MHz, D20) δ 175.2, 174.7, 171.8, 161.0, 156.5, 129.8, 128.9, 116.3, 74.9, 69.9, 69.8, 65.0, 59.7, 59.2, 58.4, 51.6, 49.3, 38.8, 37.0, 33.0, 29.1 , 27.9, 27.0, 23.9, 23.0.

PEG (8k)-(Ts) ₂ (32)

Sintetizado según el procedimiento general A. PEG (MW ~ 8000 Da) (10 g, 1,25 mmol), CH2Cl2 (30 ml), TSC1 (710 mg, 3,75 mmol) y KOH (210 mg, 3,75 mmol) se usaron en la reacción. El producto bruto se purificó por cromatografía en columna usando CH2Cl2: MeOH (7: 1 v / v) como disolvente de elución para obtener un producto sólido blanco (rendimiento 86%). 1H RMN (400 MHz, CDCl ₃ ) δ 7.76 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.33 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 4.14 (t, J = 5.6 Hz, 4H), 3.76 - 3.51 (m , 746H), 2.42 (s, 6H) .13C NMR (101 MHz, CDCl ₃ ) δ 144.6, 133.0, 129.8, 127.8, 70.6, 69.2, 68.7, 21.7.

PEG (8k)-(N ₃ ) ₂ (33)

Se obtuvo según el procedimiento general B. El compuesto 32 (8,8 g, 1,06 mmol), 50 ml de H20 destilada: THF (80:20% v / v) y NaN3 (210 mg, 3,18 mmol) se usaron en la reacción. Como punto final, el producto se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice usando (7: 1 v / v) CH2Cl2: MeOH como eluyente para obtener un polvo blanco (rendimiento 89%). 1H RMN (400 MHz, CDCl ₃ ) δ 3.68 - 3.44 (m, 746H), 3.27 (t, J = 5.1 Hz, 4H). 13C NMR (101 MHz, CDCl ₃ ) δ 70.4, 69.9, 50.5.

PEG (8k)-(NH ₂ ) ₂ (34)

Se obtuvo de acuerdo con el procedimiento general C. Se usó el Compuesto 33 (200 mg, 0,025 mmol), 15 ml de MeOH, Pd / C (40 mg). La reacción se dejó correr durante 72 h para obtener un producto (rendimiento 85%). 1H RMN (400 MHz, CDCl ₃ ) δ 3.78 - 3.57 (m, 746H), 3.46 (t, J = 5.2 Hz, 4H), 2.87 (t, J = 5.2 Hz, 4H), 1.83 (s, 4H). 13C NMR (101 MHz, CDCI ₃ ) δ 73.6, 70.6, 69.9, 41.7.

PEG (8k)-(maleimida) ₂ (35)

Se sintetiza de acuerdo con el procedimiento general D. Compuesto 1 (5 mg, 0.0275 mmol), NMM (7.2 mg, 0.0616 mmol), BuCoCl (8.4 mg, 0.0616 mmol.) Y Compuesto 34 (100 mg, 0.0125 mmol) y 15 mL Se utilizaron CH ₂ Cl ₂ para obtener un producto sólido blanco (rendimiento 68%). 1H RMN (400 MHz, CDCl ₃ ) δ 6.70 (s, 4H), 6.32 (s, 2H), 3.80 - 3.52 (m, 746H), 3.62-3.53 (m, 8H), 3.48 (t, J = 5.2 Hz, 4H), 2.33 (t, J = 7.2 Hz, 4H), 1.98 - 1.83 (m, 4H) .13C NMR (101 MHz, CDCl ₃ ) δ 171.8, 170.9, 134.2, 70.6, 70.3, 70.0, 39.1, 37.2, 33.424.7.

PEG (8k)-[dG ₂ ] ₂ (36)

Se sintetizó de acuerdo con el procedimiento general E, empleando G2 (31 mg, 0,0092 mmol), 5 ml de PBS (1x, pH 6,5), TCEP (24 mg, 0,084 mmol), compuesto 35 (70 mg, 0,0084 mmol) disuelto en 5 ml de H ₂ O y gotas de DMSO. La purificación se realizó por cromatografía de filtración en gel usando columnas PD MidiTrap G-25. El producto se aisló como un polvo blanco (rendimiento 57%). 1H NMR (400 MHz, D ₂ O) δ 3.75 - 3.69 (m, 746H), 3.68- 3.61 (m, 8H), 3.59- 3.25 (m, 88H), 3.18 ( t, J = 6.0 Hz, 8H), 2.92 - 2.80 (m, 56H), 2.79 - 2.69 (m, 30H), 2.61 - 2.47 (m, 56H), 2.23- 2.14 (m, 8H), 1.96 - 1.81 ( m, 4H). 13C NMR (101 MHz, D ₂ O) δ 178.3, 177.5, 172.6, 172.2, 69.7, 69.6, 69.0, 51.8, 49.7, 49.4, 39.1, 38.8, 36.9, 34.4, 29.2, 29.2, 28.9, 23.0, 22.3, 15.5, 15.0.

PEG(8k)-[dG ₂ -(AXO) ₈ ] ₂ (37) BiAn(8000)

Se obtuvo siguiendo el procedimiento general F. Se hicieron reaccionar el compuesto 36 (47 mg, 0,004 mmol) y AX (50 mg, 0,129 mmol), refrescando con 10 mg de AX en tres ocasiones diferentes. Después de la purificación, el producto se recogió como un polvo amarillento (rendimiento 45%). 1H RMN (400 MHz, D ₂ O) δ 7.31 (d, J = 7.8 Hz, 32H), 6.87 (d, J = 7.8 Hz, 32H), 4.94 (d, J = 8.0 Hz, 16H), 4.62 (s, 16H ), 4.29 (d, J = 8.0 Hz, 16H), 3.80 - 3.61 (m, 746H), 3.56 - 3.44 (m, 8H), 3.34 (s, 16H), 3.32 - 3.05 (m, 88H), 3.14 - 3.02 (m, 8H), 2.90 - 2.71 (m, 56H), 2.68 - 2.50 (m, 30H), 2.47 - 2.26 (m, 56H), 2.18 -2.08 (m, 8H), 1.90- 1.72 (m, 4H ), 1,46 (s, 48H), 1,19 (s, 48H). 13C NMR (101 MHz, D ₂ O) δ 175.1, 175.0, 174.6, 171.6, 160.9, 156.3, 129.7, 128.8, 116.2, 74.8, 69.8, 69.6, 69.6, 64.9, 59.5, 59.0, 58.2, 51.3, 49.1, 39.4, 38.8 , 36,9, 32,8, 28,9, 26,8, 23,7, 23,1.

PEG (10k)-(Ts) ₂ (38)

Sintetizado de acuerdo con el procedimiento general A. Se usaron PEG (MW ~ 10000 Da) (10 g, 1 mmol), CH ₂ Cl ₂ (30 ml), TsCl (570 mg, 3 mmol) y KOH (168 mg, 3 mmol) en la reacción. El producto bruto se purificó por cromatografía en columna usando CH ₂ Cl ₂ : MeOH (6: 1 v / v) como disolvente de elución para obtener un producto sólido blanco (rendimiento 71%). 1H RMN (400 MHz, CDCl ₃ ) δ 7.80 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.32 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 4.14 (t, J = 5.6 Hz, 4H), 3.74 - 3.45 (m , 933H), 2.44 (s, 6H) .13C NMR (101 MHz, CDCl ₃ ) δ 144.9, 133.1,

129.9, 128.1, 70.6, 69.3, 68.7, 21.8.

PEG (10k)-(N ₃ ) ₂ (39)

Se obtuvo según el procedimiento general B, empleando el compuesto 38 (7,2 g, 0,7 mmol), 50 mi de H ₂ O destilada: THF (80:20% v / v) y NaN3 (136 mg, 2,1 mmol). El producto se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice usando (6: 1 v / v) CH ₂ Cl ₂ : MeOH como eluyente para obtener un polvo blanco (rendimiento 90%). 1HNMR (400 MHz, CDCl ₃ ) δ 3.62 - 3.41 (m, 933H), 3.27 (t, J = 5.1 Hz, 4H) .13C NMR (101 MHz, CDCl ₃ ) δ 70.2, 69.7, 50.3.

PEG (10k) -(NH ₂ ) ₂ (40)

Se obtuvo de acuerdo con el procedimiento general C, empleando el compuesto 39 (100 mg, 0,00995 mmol), 15 ml de MeOH, Pd / C (20 mg). La reacción tuvo lugar durante 96 h para obtener un producto con 84%. 1H RMN (400 MHz, CDCl ₃ ) δ 3.74 - 3.58 (m, 933H), 3.45 (t, J = 5.2 Hz, 4H), 2.87 (t, J = 5.2 Hz, 4H), 1.78 (s, 4H). 13C NMR (101 MHz, CDCl ₃ ) δ 73.6, 70.6,

69.9. 41.9.

PEG (10k)-(maleimida) ₂ (41)

Se sintetiza según el procedimiento general D. Compuesto 1 (3,8 mg, 0,021 mmol), NMM (5,6 mg, 0,0475 mmol), BuCOCl (6,5 mg, 0,0475 mmol) y compuesto 40 (94 mg, 0,0094 mmol) en 15 ml de CH ₂ CI ₂ para obtener un producto sólido blanco con 54% de rendimiento. 1H RMN (400 MHz, CDCl ₃ ) δ 6.70 (s, 4H), 6.32 (s, 2H), 3.79 - 3.61 (m, 933H), 3.62-3.53 (m, 8H), 3.47 (t, J = 5.2 Hz, 4H), 2.33 (t, J = 7.2 Hz, 4H), 1.99 - 1.87 (m, 4H) .13C NMR (101 MHz, CDCl ₃ ) d 172.01, 170.9, 134.2,70.7, 70.3, 70.0, 39.3, 37.2, 33.424.9.

PEG (lk)-[dG ₂ ] ₂ (42)

Se sintetizó de acuerdo con el procedimiento general E. G2 (18 mg, 0.0055 mmol), 5 ml de PBS (1x, pH 6.5), TCEP (15.8 mg, 0.055 mmol), Compuesto 41 (52 mg, 0.0084 mmol) disuelto en 5 mi de H20 y algunas gotas de DMSO. La purificación se realizó por cromatografía de filtración en gel usando columnas PD MidiTrap G-25. El producto se aisló como un polvo blanco con un rendimiento del 59%. 1HNMR (400 MHz, D20) δ 3.74 - 3.69 (m, 993H), 3.68- 3.61 (m, 8H), 3.58- 3.28 (m, 88H), 3.18 ( t, J = 6.0 Hz, 8H), 2.91 - 2.82 (m, 56H), 2.80 - 2.69 (m, 3 OH), 2.61 - 2.46 (m, 56H), 2.25- 2.14 (m, 8H), 1.93 - 1.81 ( m, 4H). 13C NMR (101 MHz, D20) δ 178.2, 178.1, 172.8, 172.5, 69.8, 69.8, 69.5, 51.9, 49.7, 49.6, 39.1, 39.1, 38.9, 38.9, 34.4, 29.2, 29.2, 28.9, 23.03, 22.3.

PEG(10k)-[dG ₂ -(AXO) ₈ ] ₂ (43) BiAn(10000)

Se obtuvo siguiendo el procedimiento general F. Se hizo reaccionar el compuesto 42 (40 mg, 0,0029 mmol) y AX (36,3 mg, 0,095 mmol). La reacción se refrescó con 7 mg de AX en tres ocasiones diferentes. Después de la purificación, el producto se recogió como un polvo amarillento con un 45% de rendimiento. 1H RMN (400 MHz, D20) δ 7.29 (d, J = 7.8 Hz, 32H), 6.89 (d, J = 7.8 Hz, 32H), 4.94 (d, J = 8.0 Hz, 16H), 4.63 (s, 16H ), 4.29 (d, J = 8.0 Hz, 16H), 3.88 - 3.57 (m, 993H), 3.56 - 3.51 (m, 8H), 3.34 (s, 16H), 3.32 - 3.05 (m, 88H), 3.12 - 3.03 (m, 8H), 2.89 - 2.69 (m, 56H), 2.66 - 2.51 (m, 30H), 2.48 - 2.26 (m, 56H), 2.18 -2.06 (m, 8H), 1.90-

1.77 (m, 4H ), 1,46 (s, 48H), 1,19 (s, 48H). 13C NMR (101 MHz, D20) δ 175.1, 174.6, 171.6, 160.7, 156.3, 129.7, 128.9, 116.2, 74.8, 69.8, 64.9, 59.6, 59.0, 58.1, 51.4, 49.3, 49.2, 39.4, 38.6, 36.9, 32.9 , 28,9, 26,8, 26,7, 23,99, 23,0. PEG (12k)-(Ts) ₂ (44)

Sintetizado según el procedimiento general A. Se usaron PEG (MW ~ 12000 Da) (10 g, 0,83 mmol), CH ₂ CI ₂ (30 ml), TsCl (480 mg, 2,5 mmol) y KOH (140 mg, 2,5 mmol) en la reacción. El producto del crudo se purificó por cromatografía en columna usando CH ₂ CI ₂ : MeOH (5: 1 v / v) como disolvente de elución para obtener un producto sólido blanco con un rendimiento del

70 %. 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 7.79 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.32 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 4.14 (t, J = 5.6 Hz, 4H), 3.78 - 3.49 (m , 1120H), 2.43 (s, 6H) .13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 144.8, 133.5, 129.9, 128.1, 70.6, 69.3, 68.7, 21.6. PEG (12k)-(N ₃ ) ₂ (45)

Se obtuvo según el procedimiento general B. El compuesto 44 (7,2 g, 0,585 mmol), 50 ml de H20 destilada: THF (80:20% v / v) y NaN3 (114 mg, 1,75 mmol) se usaron en la reacción. Como punto final, el producto se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice usando (5: 1 v / v) CH ₂ CI ₂ : MeOH como eluyente para obtener un polvo blanco con 81% de rendimiento. 1H NMR (400 MHz, CDCl ₃ ) δ 3.73 - 3.44 (m, 1120H), 3.34 (t, J = 5.1 Hz, 4H) . 13C NMR (101 MHz, CDCl ₃ ) 70.5, 70.0, 50.6.

PEG (12k)-(NH ₂ ) ₂ (46)

Se obtuvo de acuerdo con el procedimiento general C. Se usó el compuesto 45 (100 mg, 0,0083 mmol), 15 ml de MeOH, Pd / C (20 mg). La reacción tuvo lugar durante 5 días para obtener un producto con 96% de rendimiento. 1H RMN (400 MHz, CDCl ₃ ) δ 3.74 - 3.58 (m, 1120H), 3.45 (t, J = 5.2 Hz, 4H), 2.87 (t, J = 5.2 Hz, 4H), 1.78 (s, 4H). 13C NMR (101 MHz, CDCl ₃ ) δ 73.6,

70.6, 69.9, 41.9

PEG (12k)-(maleimida) ₂ (47)

Se sintetiza de acuerdo con el procedimiento general D, empleando Compuesto 1 (3,2 mg, 0,0174 mmol), NMM (2,13 mg, 0,0182 mmol), BuCOCl (2,48 mg, 0,0182 mmol), compuesto 46 (95 mg, 0,0079 mmol) en 15 ml de CH ₂ Cl ₂ para obtener un producto sólido blanco con 57% de rendimiento. 1H RMN (400 MHz, CDCl ₃ ) δ 6.70 (s, 4H), 6.32 (s, 2H), 3.79 - 3.61 (m, 1120H), 3.62-3.53 (m, 8H), 3.47 (t, J = 5.2 Hz, 4H), 2.33 (t, J = 7.2 Hz, 4H), 1.99 - 1.87 (m, 4H) .13C NMR (101 MHz, CDCl ₃ ) δ 172.0, 170.9, 134.2,70.7, 70.3, 70.0, 39.3, 37.2, 33.424.9.

PEG (12k)-[dG ₂ ] ₂ (48)

Se sintetizó de acuerdo con el procedimiento general E, empleando G2 (29,9 mg, 0,0089 mmol), 5 ml de PBS (1x, pH 6,5), TCEP (25,5 mg, 0,089 mmol), compuesto 47 (100 mg, 0,0081 mmol) disuelto en 5 mL de H ₂ O y gotas de DMSO. La purificación se realizó por cromatografía de filtración en gel usando columnas PD MidiTrap G-25. El producto se aisló como un polvo blanco con 51% de rendimiento. 1H NMR (400 MHz, D20) δ 3.81 - 3.61 (m, 1120H), 3.66- 3.60 (m, 8H), 3.58- 3.25 (m, 88H), 3.17 (t, J = 6.0 Hz, 8H), 2.91 - 2.82 (m, 56H), 2.80 - 2.69 (m, 3 OH), 2.61 - 2.46 (m, 56H), 2.23- 2.14 (m, 8H), 1.92 - 1.81 (m, 4H). 13C NMR (101 MHz, D20) δ 179.17, 178.95, 172.84, 172.84, 172.42, 77.48, 77.16, 77.16, 76.84, 69.8, 69.8, 51.9,

49.7, 49.5, 39.1, 38.9, 37.0, 34.4, 30.4, 28.9, 27.7, 22,8, 22,1.

PEG(12k)-[dG ₂ -(AXO) ₈ ] ₂ (49) BiAn(12000) Se obtuvo siguiendo el procedimiento general F. Se hicieron reaccionar el compuesto 48 (64 mg, 0,0041 mmol) y AX (50,6 mg, 0,131 mmol), refrescando con 10 mg de AX entres ocasiones diferentes. Después de la purificación, el producto se recogió en forma de polvo amarillento con un 54% de rendimiento. 1H RMN (400 MHz, D ₂ O) δ 7.29 (d, J = 7.8 Hz, 32H), 6.89 (d, J = 7.8 Hz, 32H), 4.94 (d, J = 8.0 Hz, 16H), 4.63 (s, 16H ), 4.29 (d, J = 8.0 Hz, 16H), 3.88 - 3.57 (m, 1120H), 3.56 - 3.51 (m, 8H), 3.34 (s, 16H), 3.32 - 3.05 (m, 88H), 3.12 - 3.03 (m, 8H), 2.89 - 2.69 (m, 56H), 2.66 - 2.51 (m, 30H), 2.48 - 2.26 (m, 56H), 2.18 -2.06 (m, 8H), 1.90- 1.77 (m, 4H ), 1,46 (s, 48H), 1,19 (s, 48H). 13C NMR (101 MHz, D ₂ O) δ 175.6, 175.1, 174.6, 171.6, 156.2, 129.7, 128.8, 115.9, 77.1, 74.9, 69.8, 69.6, 68.9, 64.9, 59.5, 59.1, 58.2, 39.4, 38.9, 38.7, 36.9 , 36.9, 32.7, 28.9, 28.2, 26.8, 23.6, 23.0.

Síntesis de antígenos dendriméricos

G ₁ -(AXO) ₈ Se disolvió una cantidad pesada de G1-PAMAM (100 mg, 0,067 mmol) en 2 ml de tampón de carbonato (0,05 M, pH = 10,9) después de evaporar MeOH al vacío. Se añadió un exceso de AX (433 mg, 1,12 mmol) correspondiente a 16 equivalencias a la solución anterior y se hizo reaccionar a 4 °C bajo agitación magnética durante 7 días. La reacción se refrescó con un 20% de la masa inicial de AX en tres ocasiones diferentes. La purificación se realizó por cromatografía de filtración en gel usando columnas PD MidiTrap G-10 recogiendo el producto en pequeñas fracciones. El producto se aisló como una potencia amarilla con un rendimiento del 88%. 1H RMN (400 MHz, D ₂ O) δ 7.27 (d, J = 8.1 Hz, 16H), 6.85 (d, J = 8.1 Hz, 16H), 4.93 (d, J = 7.8 Hz, 8H), 4.61 (s, 8H ), 4.26 (d, J = 7.8 Hz, 8H), 3.33 (s, 8H), 3.31 - 3.06 (m, 40H), 2.87 - 2.71 (m, 24H), 2.62 -2.50 (m, 12H), 2.46- 227 (m, 24H), 1.45 (s, 24H), 1.18 (s, 24H) .13C NMR (101 MHz, D20) δ 174.8, 174.7, 174.1, 171.3, 160.3, 156.0, 130.2, 129.4, 128.7, 115.9, 74.6, 64.6, 59.3, 59.1, 58.8, 57.8, 51.1, 48.9, 39.2, 38.5, 36.7, 32.5, 26.6.

G ₂ -(AXO) ₁₆ Se obtuvo disolviendo G2-PAMAM (100 mg, 0,031 mmol) en 2 ml de tampón de carbonato (0,05 M, pH = 10,9) y dejando reaccionar con (380,7 mg, 0,98 mmol) de AX durante 7 días a 4 ° C. La reacción se refrescó con un 20% de la cantidad inicial de AX en tres ocasiones diferentes. La purificación se realizó por cromatografía de filtración en gel usando PD MidiTrap G-25. Se recogió como producto un polvo amarillo con un rendimiento del 83%. 1H RMN (400 MHz, D20) δ 7.28 (d, J = 8.1 Hz, 32H), 6.86 (d, J = 8.1 Hz, 32H), 4.96 (d, J = 7.8 Hz, 16H), 4.57 (s, 16H ), 4.26 (d, J = 7.7 Hz, 16H), 3.35 (s, 16H), 3.31 - 3.19 (m, 88H), 2.85 - 2.68 (m, 56H), 2.66 -2.51 (m, 28H), 2.45- 2,24 (m, 56H), 1,46 (s, 48H), 1,19 (s, 48H). 13C NMR (101 MHz, D20) d 175.2, 175.0, 174.6, 171.7, 161.1, 156.7, 131.0, 129.8, 128.9, 116.3, 74.9, 64.9, 59.6, 59.5, 59.1, 58.3, 51.5, 49.2, 38.9, 37.0, 32.927,0.

G ₃ -(AXO)32

Se obtuvo disolviendo G3-PAMAM (100 mg, 0,0145 mmol) en 2 ml de tampón de carbonato (0,05 M, pH = 10,9) y dejando reaccionar con AX (360 mg, 0,93 mmol) durante 7 días a 4 ° C. La reacción se refrescó con un 20% de la cantidad inicial de AX en tres ocasiones diferentes. La purificación se realizó por cromatografía de filtración en gel usando PD MidiTrap G-25. Se recogió como producto un polvo amarillo con un rendimiento del 73%. 1H RMN (400 MHz, D20) δ 7.30 (d, J = 8.1 Hz, 64H), 6.88 (d, J = 8.1 Hz, 64H), 4.95 (d, J = 7.8 Hz, 32H), 4.65 (s, 32H ), 4.27 (d, J = 7.8 Hz, 32H), 3.32 (s, 32H), 3.30 - 3.18 (m, 184H), 2.89 - 2.71 (m, 120H), 2.64 -2.54 (m, 60H), 2.47- 2,27 (m, 120H), 1,43 (s, 96H), 1,18 (s, 96H). 13C NMR (101 MHz, D20) δ 175.1, 174.9, 174.5, 171.6, 160.6, 156.4, 130.1, 129.7, 129.1, 116.3, 75.0, 65.0, 59.6, 59.4, 59.1, 58.0, 51.5, 49.3, 39.5, 38.8, 36.9, 32,8, 26,9.

G ₄ -(AXO) ₆₄

Se obtuvo disolviendo (100 mg, 0,0074 mmol) de G4-PAMAM en 2 ml de tampón de carbonato (0,05 M, pH = 10,9) y dejando reaccionar con (367 mg, 0,947 mmol) de AX durante 7 días a 4 ° C. La reacción se refrescó con un 20% de la cantidad inicial de AX en tres ocasiones diferentes. La purificación se realizó por cromatografía de filtración en gel usando PD MidiTrap G-25. Se recogió como producto un polvo amarillo con un rendimiento del 77%. 1H RMN (101 MHz, D20) δ 7.26 (d, J = 8.1 Hz, 128H), 6.84 (d, J = 8.1 Hz, 128H), 4.95 (d, J = 7.8 Hz, 64H), 4.57 (s, 64H ), 4.27 (d, J = 7.8 Hz, 64H), 3.36 (s, 64H), 3.33 - 3.15 (m, 376H), 2.92 - 2.69 (m, 248H), 2.66 -2.50 (m, 124H), 2.47- 2,27 (m, 248H), 1,47 (s, 192H), 1,20 (s, 192H). 13C NMR (400 MHz, D20) δ 175.3, 174.8, 174.6, 171.3, 159.5, 156.3, 130.6, 129.4, 128.5, 116.0, 74.6, 64.7, 59.3, 59.1, 58.8, 58.0, 51.2, 48.9, 38.6, 38.4, 36.6, 32,6, 26,6.

G5-(AXO)l28

Se obtuvo disolviendo (100 mg, 0,0035 mmol) de G5-PAMAM en 2 ml de tampón de carbonato (0,05 M, pH = 10,9) y dejando reaccionar con (348 mg, 0,896 mmol) de AX durante 7 días a 4 ° C. La reacción se refrescó con un 20% de la cantidad inicial de AX en tres ocasiones diferentes. La purificación se realizó por cromatografía de filtración en gel usando PD MidiTrap G-25. Se recogió como producto un polvo amarillo con un rendimiento del 73%. 1H RMN (400 MHz, D20) δ 7.25 (d, J = 8.1 Hz, 256H), 6.83 (d, J = 8.1 Hz, 256H), 4.94 (d, J = 7.8 Hz, 128H), 4.58 (s, 8H ), 4.26 (d, J = 7.8 Hz, 128H), 3.35 (s, 128H), 3.31 - 3.07 (m, 760 H), 2.90 - 2.66 (m,

504H), 2.64 -2.48 (m, 252H), 2.45 -2,22 (m, 504H), 1,45 (s, 384H), 1,18 (s, 384H). 13C NMR (101 MHz, D20) δ 175.2, 174.9, 174.6, 171.7, 161.5, 156.6, 130.8, 129.7, 129.0, 116.4, 75.0, 65.1, 59.7, 59.5, 59.1, 58.3, 51.6, 49.3, 39.6, 38.8, 37.1, 32,9, 27,0.