NEUE PROTEINE GEEIGNET ZUR BEKÄMPFUNG VON KRANKHEITEN SOWIE ZUM SCHUTZ VON WEIDEVIEH GEGEN ZECKEN

Beschreibung

5 Die vorliegende Erfindung betrifft neue Proteine und deren Herstellung.

Es ist bereits bekannt, daß Blutegel einen die Blutgerinnung hemmende Substanz, das Hirudin, produzieren (vgl. The Merck Index, 10. Auflage, Nr. 4613). Hirudin ist ein Polypeptid mit dem Molekulargewicht von etwa 106.500.

Substanzen, die die Blutgerinnung hemmen, werden auch von anderen blut¬ saugenden Parasiten, z.B. den Zecken, produziert. Diese Substanzen sind aber bislang weder in reiner Form erhalten noch synthetisch hergestellt 5 worden (Naturwissenschaften 11, 30 (1961).

Es wurde nun ein neues Protein aus Zecken isoliert.

Gegenstand der Erfindung ist ein neues Protein welches ein Molekular- 0 gewicht von etwa 15.000 Dalton besitzt und am Aminoterminus die Amino¬ säuresequenz

SDYEFPPPKKXRPG

5 aufweist, worin X S oder N ist, sowie dessen Muteine.

Als Muteine sind Proteine zu verstehen, die sich von dem neuen Protein durch Austausch, Deletion und/oder Addition von Aminosäuren oder Peptiden in der Proteinkette entstehen, ohne daß sich dadurch die Wirkung des neuen 0 Proteins wesentlich verändert.

Das neue Protein läßt sich aus Zecken isolieren. Hierzu werden die Zecken in einem Puffer bei pH 6 bis 9, vorzugsweise 7,5, aufgenommen. Nach dem Homogenisieren der Mischung mit einem Homogenisator werden die unlöslichen 5 Bestandteile abzentrifugiert. Aus der so erhaltenen Lösung wird durch Zu¬ gabe von Trichloressigsäure bis zu einer Endkonzentration von 2,5 % un¬ wirksames Protein ausgefällt und durch Zentrifugieren entfernt. Aus der so erhaltenen Lösung werden etherlösliche Bestandteile durch Extraktion ent¬ fernt und anschließend das Protein mit kaltem Aceton ausgefällt. Das neue Protein läßt sich durch Ionenaustausch- und pH-Gradientenchromatographie aus dem ausgefälllten Produkt isolieren.

Das hier beschriebene Protein liegt in den Zecken in Konzentration zwischen 1 - 100 μg/kg vor. Um das Protein für pharmazeutische Zwecke in größeren Mengen verfügbar zu machen, kann man bekannte gentechnische Methoden (vgl. Maniatis, T. et al: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., 1982) heranziehen. Für diesen Zweck muß zunächst die genetische Information für das neue Protein identifiziert und die entsprechende Nukleinsäure isoliert werden. Dazu wird das reine Protein mit Dithiothreitol reduziert, dann wird lodacetamid zur Derivati- sierung der freien SH-Gruppen zugesetzt und anschließend wird das so be- handelte Protein mit Bromcyan und Trypsin in kleine Peptide gespalten. Die Auftreπnung der Peptide erfolgt über reversed phase-Chromatographie. Die N-terminale Sequenzierung eines dieser gereinigten Peptide ergab die Sequenz SDYEFPPPKKSRPG.

Die vorhandenen Peptidsequenzen erlauben nun durch die Synthese entspre¬ chende Oligonukleotide eine eindeutige Identifizierung des Gens aus dem Genom oder aus entsprechenden c-DNA-Bänken durch sequenzspezifische Filterhybridisierung.

Die so erhaltene genetische Information für das Protein kann dann in verschiedene Wirtszellen, wie eukaryontische Zellen, Hefen, Bacillus subtilis oder E. coli nach bekannten Methoden zur Expression gebracht und das Protein so erhalten werden. In den eukaryotischen Zellen entsteht dabei das Protein in glykosylierter Form.

Die Muteine, die sich durch Austausch, Deletion oder Addition von Amino¬ säuren oder Peptiden von den neuen Proteinen ableiten, werden vorzugsweise nach gentechnischen Methoden dargestellt.

Das neue Protein besitzt blutgerinnungshemmende Eigenschaften und kann zur Prävention und Behandlung von Gefäßerkrankungen wie Herzinfarkt, Lungen- embolie, arterielle Embolie und Phlebothro bose eingesetzt werden. Weiter eignen sich zur Konservierung von Blut, on Vorteil für diese Verwendungen ist die niedrige Toxizität des neuen Proteins.

Weiter eignet sich das neue Protein zur Immunisierung von Weidevieh gegen zeckenspezifische Proteine. So kann durch neutralisierende Antikörper die Nahrungsaufnahme der Zecken gestört werden. Dadurch werden die Zecken zum Verlassen des Wirtes und damit zum Absterben gebracht.

Beispiel 1 bis 3

Beispiel 1

Reinigung des Thrombininhibitors

Eine im Labor bei 28°C und 80 % relativer Luftfeuchte gehaltene Kultur Lederzecken (Ornithodorus oubata) wurde in 14-tägigen Abständen dadurch gefüttert, daß sie an Kaninchen saugen konnten. Zecken aller Entwicklungs- Stadien vor oder nach der Fütterung wurden bei -20°C eingefroren und bei der anschließenden Aufarbeitung eingesetzt. 10 g Zecken wurden hierzu in 20 ml Phosphat-gepufferter Saline aufgenommen (20 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, 1 M EDTA, pH 7,5 und bei 20°C homogenisiert. Die unlöslichen Bestandteile wurden durch Zentrifugation abgetrennt.

Der klare, rote überstand wurde mit Trichloressigsäure (TCA) bis zu einer Endkonzentration von 2, 5 % TCA versetzt. Es bildete sich ein massiger, roter Niederschlag der durch Zentrifugation abgetrennt wurde. Danach wurde die Lösung mit 1/10 ihres Volumens an Ether 3mal ausgeschüttelt. Die wäßrige Lösung wurde mit NaOH neutralisiert.

Dazu wurde das 4fache Volumen an kaltem (-78°C) Aceton gegeben. Die Lösung stand dabei in der Kälte auf Trockeneis. Es bildete sich im Verlauf von bis zu 24 h ein flockiges, weißes Präzipitat. Dieses wurde abzentrifugiert und im Exsikkator getrocknet. Die Ausbeute lag bei 1 % des Gewichts der eingesetzten Zecken. In der SDS-Gelelektrophorese zeigte dieses Produkt noch 10 bis 20 Proteinbanden im niedermolekularen Bereich bis 40 kDa nach Färbung mit Coomassie Brilliantblau. Der isoelektrische Punkt dieser Proteine lag zwischen pH 4 und pH 7.

Dieses Proteingemisch (200 mg) wurde nun zu einer Proteinkonzentration von 20 mg/ml in Phosphat-gepufferter Saline, pH 5, aufgenommen und auf eine Q-Sepharose® Säule (Pharmacia Fine Chemicals, fast-f ow) aufgetragen. Das Volumen der Säule betrug 10 ml. Die Säule wurde mit dem gleichen Puffer äquilibriert, in dem auch die Probe aufgenommen wurde. Nach Waschen der Säule mit drei Säulenvolumina Squilibrierungspuffer wurde die Säule mit einem pH-Gradienten eluiert. Dazu wurden 10 Säulenvolumina des Wasch¬ puffers (pH 5,0) über einen Gradientenmischer langsam mit 10 Säulen¬ volumina Waschpuffer (pH 1 bis 3) gemischt. Unter diesen Bedingungen elu- ierte der Thrombininhibitor bei pH 4,5. Das Protein wurde so in reiner und aktiver Form erhalten. In der Gelelektrophorese zeigte es ein Molekular¬ gewicht von 15.000 +_ 1000. Die aminoterminale Sequenz dieses Proteins lautet: SDYEFPPPKKSRPG. Sein isoelektrischer Punkt liegt bei pH 4 bis 5.

Beispiel 2

Trennung aktiver von inaktiven Thrombininhibitor-Molekülen.

Das nach Molekulargewicht homogene, nach Beispiel 1 erhaltene und durch Thrombininhibitor-Wirkung identifizierte Protein wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durch den 4fachen Überschuß kalten Acetons gefällt und ge¬ trocknet. Danach wurde der Rückstand in Phosphat-gepufferter Saline, pH 7,5, aufgenommen (Proteinkonzentration 20 mg/ml) und auf eine mit dem gleichen Puffer äüquilibrierte Mono-Q-Säule (Säulenvolumen 1 ml) gegeben (ca. 0,1 mg). Die Säule wurde bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/min gewaschen und dann mit einem Gradienten von 150 mM NaCl nach 350 M NaCl (je 2,5 ml) und dann von 350 mM NaCl nach 450 mM NaCl (je 2,5 ml), gefolgt von 450 mM NaCl nach 550 mM NaCl (je 10 ml) und schließ- lieh auf 800 mM NaCl eluiert. Das Protein erschien zwischen 350 mM NaCl und 550 mM NaCl. Jedoch war Aktivität (gemessen als Thrombininhibitor- wirkung) nur mit einem Absorptionsmaximum bei 450 mM NaCl verbunden. In der Sequenzanalyse aller eluierten Proteine zeigte sich jedoch, daß alle die gleiche aminoterminale Sequenz haben, somit hinsichtlich ihrer Primärstruktur identisch sind.

Beispiel 3

Renaturierung der inaktiven Thrombininhibitormoleküle

Die in 2 erhaltene, inaktive Thrombininibitorfraktion wurde wie in Bei¬ spiel 1 beschrieben gefällt und in einem Renaturierungspuffer aufgenommen, der 8 M Harnstoff und 200 mM Dithiothreitol (DTT) enthielt. Nach 1 h bei 37°C wurde das Protein gegen das lOOfache Volumen Phosphat-gepufferte Saline dialysiert (Ausschlußvolumen des Dialyseschlauchs 10 kDa). Nach 2 h Dialyse bei 4°C war das Protein aktiv und zeigte auf der Mono-Q-Säule nach Elution durch einen Salzgradienten das gleiche Verhalten wie die aktive Fraktion in Beispiel 2.