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Patent Searching and Data


Title:
NOVEL FLAVONE GLYCOSIDE DERIVATIVES FOR USE IN COSMETICS, PHARMACEUTICALS AND NUTRITION
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2001/079245
Kind Code:
A1
Abstract:
The invention relates to flavone and isoflavone glycoside derivatives of general formula (I): [A¿1?-C(=O)O]¿m?-[X-O-Z]-[O-C(=O)-A¿2?]¿n? (I), wherein [X-O-Z] represents a flavone or isoflavone glycoside structure, wherein X represents a flavone or isoflavone parent substance of formula (IIa) or (IIb), said (iso)flavone parent substance being mono- or multisubstituted and/or mono- or multireduced (hydrogenated), wherein Z (sugar) represents a mono-, di- or polysaccharide which is acetally bonded to the radical X and is ester-substituted with A¿2? n-times, [A¿1?-C(=O)] representing an acyl radical on the flavone or isoflavone parent substance, wherein A¿1? and A¿2?, independently of each other, represent a polyunsaturated C¿15?- C¿25?- alkenyl radical with at least 4 isolated and/or at least 2 conjugated double bonds or an arylaliphatic radical with 1-4 methylene groups between the ester group and the aromatic ring, wherein [C(=O)A¿2?] represents an acyl radical on the sugar Z, wherein n is a whole number (1, 2, 3, ...) but not 0, wherein m is a whole number including 0 (0, 1, 2, 3, ...) and wherein R1, R2 and R3 represent hydroxyl groups or hydrogen atoms.

Inventors:
OTTO RALF (DE)
GEERS BERNADETTE (DE)
WEISS ALBRECHT (DE)
PETERSOHN DIRK (DE)
SCHLOTMANN KORDULA (DE)
SCHROEDER KLAUS RUDOLF (DE)
Application Number:
PCT/EP2001/004151
Publication Date:
October 25, 2001
Filing Date:
April 11, 2001
Export Citation:
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Assignee:
HENKEL KGAA (DE)
COGNIS DEUTSCHLAND GMBH (DE)
OTTO RALF (DE)
GEERS BERNADETTE (DE)
WEISS ALBRECHT (DE)
PETERSOHN DIRK (DE)
SCHLOTMANN KORDULA (DE)
SCHROEDER KLAUS RUDOLF (DE)
International Classes:
A23K1/16; A23L33/105; A61K8/00; A61K8/60; A61K8/73; A61K8/96; A61K31/7048; A61P17/16; A61Q19/00; A61Q19/02; A61Q19/08; C07H17/07; C12P7/62; C12P17/06; C12P19/60; (IPC1-7): C07H17/07; A61K7/42; A61K31/7048; A23L3/3544; C12P7/62; C12P19/44
Foreign References:
DE19922287A11999-11-25
Other References:
NAKAJIMA NOBUYOSHI ET AL: "LIPASE-CATALYZED DIRECT AND REGIOSELECTIVE ACYLATION OF FLAVONOID GLUCOSIDE FOR MECHANISTIC INVESTIGATION OF STABLE PLANT PIGMENTS", JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGIEERING,ELSEVIER, AMSTERDAM,,NL, vol. 87, no. 1, 1999, pages 105 - 107, XP001015236, ISSN: 1389-1723
DANIELI ET AL: "Enzyme-mediated regioselective acylations of flavonoid disaccharide monoglycosides", HELVETICA CHIMICA ACTA,CH,VERLAG HELVETICA CHIMICA ACTA. BASEL, vol. 73, no. 7, 1990, pages 1837 - 1844, XP002090940, ISSN: 0018-019X
Attorney, Agent or Firm:
Henkel, Kommanditgesellschaft Auf Aktien (Patente Düsseldorf, VTP)
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Claims:
Patentansprüche
1. Flavonund IsoflavonglykosidDerivate der allgemeinen Formel (I) : [A1~C (=O) O] m [XOZ][OC(=O)A2]n (I), worin [XOZ] eine Flavonoder IsoflavonglykosidStruktur darstellt, worin X einen Flavonoder Isoflavongrundkörper der Formel (Ila) bzw. (lob) (IIa) (IIb) darstellt, wobei der (Iso) Flavongrundkörper einfach oder mehrfach substituiert und/oder einfach oder mehrfach reduziert (hydriert) ist, worin Z (Zucker) für ein Mono, Disaccharid oder Polysaccharid steht, das acetalisch an den Rest X gebunden und nfach esterartig mit A2 substituiert ist, worin [AC (=O)] einen Acylrest am Flavonoder Isoflavongrundkörper darstellt, worin Ar und A2 unabhängig voneinander einen mehrfach ungesättigten C, 5C25 Alkenylrest mit mindestens 4 isolierten und/oder mindestens zwei konjugierten Doppelbindungen oder einen arylaliphatischen Rest mit 14 Methylengruppen zwischen EsterGruppe und aromatischem Ring darstellen, worin [C (=O) A2] einen Acylrest am Zucker Z darstellt, worin n eine ganze Zahl (1, 2, 3,...), nicht aber 0 ist, worin m eine ganze Zahl einschließlich 0 (0, 1, 2, 3,...) ist, und worin R1, R2, R3 Hydroxylgruppen oder WasserstoffAtome darstellen.
2. Die Derivate von Anspruch 1, wobei Z ein Monosaccharid, insbesondere Rhamnose, Threose, Erythrose, Arabinose, Lyxose, Ribose, Xylose, Allose, Altrose, Galactose, Glucose, Gulose, Idose, Mannose, Talose und Fructose, oder ein Disaccharid, insbesondere ein Disaccharid, das aus den zuvor genannten Monosacchariden aufgebaut ist, in ihren jeweils natürlich vorkommenden stereoisomeren Formen, ist.
3. Die Derivate von Anspruch 1 oder 2, wobei der (Iso) FlavonglykosidGrundkörper X OZ in der allgemeinen Formel (I) Asparatin, Orientin (Lutexin), Cisorientin (Lutonaretin), Isoquercitin, Naringin, oder Rutin ist.
4. Die Derivate von einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der (Iso ) FlavonglykosidGrundkörper XOZ Naringin der Formel (III) (111) ist.
5. Die Derivate von einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei XOZ Naringin gemäß Formel (III) ist ; wobei A2 der Acylrest einer der folgenden Säuren ist : p Chlorphenylessig, Hydrozimt, Stearin, 12Hydroxystearin, Palmitin, Laurin, Öl, Coumar, Caprin, Zimt, 4Phenylbutter, 4Hydroxyphenylessig, 5 Phenylvaleriansäure oder eines der unter den Handelsnamen erhältlichen Gemische Edenor UKD 6010 und UKD 7505 ; und wobei n 1 oder 2 und m gleichzeitig 0 ist.
6. Die Derivate von Anspruch 5, wobei n 1, m 0 ist und A2 an die primäre OHGruppe des Zuckers in Formel (III) gebunden ist.
7. Die Derivate von einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei XOZ Naringin gemäß Formel (III) ist ; wobei As der Acylrest einer der folgenden Säuren ist : pChlorphenylessig, Hydrozimt, Stearin, 12Hydroxystearin, Palmitin, Laurin, Öl, Coumar, Caprin, Zimt, 4Phenylbutter, 4Hydroxyphenylessig, 5Phenylvaleriansaure oder eines der unter den Handelsnamen erhältlichen Gemische Edenor UKD 6010 und UKD 7505 ; und wobei n 1 oder 2 und m gleichzeitig 1 ist.
8. Die Derivate von Anspruch 7, wobei n und m 1 sind, A2 an die primäre OHGruppe des Zuckers in Formel (III) und Ai entweder an die 5OHGruppe des Benzopyran oder an die 4'HydroxyGruppe des Phenylrings gebunden sind.
9. Die Derivate von Anspruch 8, wobei n 2 und m 1 sind, ein A2 an die primäre OH Gruppe und das zweite A2 an eine der sekundären OHGruppen, insbesondere an eine der beiden sekundären OHGruppen am selben oder an eine der drei sekundären OHGruppen des zweiten Sechsrings, des Zuckers in Formel (III) und Ai entweder an die 5OHGruppe des Benzopyranoder an die 4HydroxyGruppe des Phenylrings gebunden sind.
10. Verfahren zur Herstellung der Derivate der Formel (I) von einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß ein Acetal XOZ aus Zucker und (Iso) FlavonGrundkörper, wobei diese (Iso) FlavonGrundkörper in Form der Reinsubstanz oder als Gemisch aus Pflanzenextrakten unterschiedlicher Herkunft vorliegen, mit einer polyungesättigten Fettsäure mit mindestens vier isolierten Doppelbindungen und/oder mit mindestens zwei konjugierten Doppelbindungen, mit einer arylaliphatischen Carbonsäure, mit einem Ester dieser Carbonsäuren oder mit einem aktivierten Fettsäurederivat unter katalytischer Einwirkung von einem oder mehreren Enzymen verestert oder umgeestert wird.
11. Das Verfahren von Anspruch 10, wobei die polyungesättigten Fettsäure eine konjugierte Linolsäure (Octadecadiensäure) ist.
12. Das Verfahren von Anspruch 10 oder 11, wobei das oder die Enzyme eine oder mehrere Hydrolasen ist bzw. sind.
13. Das Verfahren von Anspruch 12, wobei die Hydrolase (n) die Lipasen aus Candida rugosa (ehemals Candida cylindracea), Candida antarctica, Geotrichum candidum, Aspergillus niger, Penicillium roqueforfi, Rhizopus arrhizus und Mucor miehei, insbesondere die Lipase (Isoenzym B) aus Candida antarctica, ist (sind).
14. Das Verfahren von einem der Ansprüche 10 bis 13, wobei sich an die Veresterungsreaktion ein Schritt zur Aufreinigung der Verbindungen der Formel (I) anschließt, der entweder ein wäßriges ZweiphasenExtraktionsverfahren mit organischen Lösungsmitteln wie nHexan, Cyclohexan, THF oder Dieethylether oder ein chromatographisches Verfahren an Kieselgel, vorzugsweise mit Ethylacetat/Methanoloder Dichlormethan/MethanolGemischen mit geringen Anteilen Essigsäure und/oder Wasser, ist.
15. Kosmetische oder pharmazeutische Zusammensetzung oder Nahrungsbzw. FuttermittelZusammensetzung, enthaltend mindestens eines der Derivate von einem der Ansprüche 1 bis 9.
16. Verwendung eines Derivats nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur kosmetischen Behandlung der sonnenlichtinduzierten Alterung der menschlichen Haut.
17. Verwendung eines Derivats nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur kosmetischen Hautaufhellung.
Description:
Neue Flavonglykosid-Derivate für den Einsatz in Kosmetika, Pharmazeutika und Ernährung Die vorliegende Erfindung betrifft neue, biologisch aktive Flavon-und Isoflavonglykosid- Derivate der aligemeinen Formel (I) [A1~C (=O) 0- [X-0-Z]- [0-C (=0)-A2] n (') von aliphatischen und arylaliphatischen Carbonsäuren, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen enthaltende kosmetische und/oder pharmazeutische Zubereitungen, ebenso wie deren Einsatz als Zusatzstoffe in der Ernährung und in Futtermitteln.

In der Kosmetik wird die Anwendung von Wirkstoffen immer wichtiger. Bei den Wirkstoffen, die bisher bereits Anwendung in der Kosmetik finden, handelt es sich nicht immer um Naturstoffe. Die Optimierung bekannter Wirkstoffe und die Herstellung neuer Wirkstoffe sind Gegenstand vieler Forschungsarbeiten.

Im weitesten Sinne sind Wirkstoffe solche Stoffe, die-in relativ kleinen Mengen vorkommend oder zugeführt-große physiologische Wirkung entfalten können. Hier ist an Hormone, Vitamine, Enzyme, Spurenelemente etc. zu denken, aber auch an Pharmaka (Arzneistoffe), Futterzusätze, Düngemittel und Schädlingsbekämpfungsmittel. Nicht selten kann man auch Synergismus beobachten.

Flavone und Isoflavone/Flavonoide und Isoflavonoide bzw. Flavonqlvkoside und Isoflavon-qlvkoside Flavone sind 2-Phenyl-4H-1-benzopyran-4-one, bei denen an verschiedenen Positionen der Ringe Hydroxylgruppen vorliegen oder auch fehlen können. Ein Beispiel für ein Flavon ist Apigenin, dessen chemischer Name 2- (p-Hydroxyphenyl)-4H-1- (5, 7- dihydroxybenzopyran-4-on lautet (siehe Römpp Chemie-Lexikon, 9. Auflage, Band 2, S.

1373/4). Die zusätzlichen Hydroxylgruppen sitzen dabei, wie das genannte Beispiel zeigt, an dem Phenyl-und/oder dem Benzopyranring. Anders ausgedrückt : im Sinne der vorliegenden Erfindung sind unter Flavonen Stoffe zu verstehen, die Hydrierungs-,

Oxidations-oder Substitutionsprodukte des 2-Phenyl-4H-1-benzopyran-4-ons darstellen, wobei eine Hydrierung in der 2, 3-Stellung des Kohlenstoffgerüsts erfolgen kann, und wobei unter Substitution der Ersatz eines oder mehrerer Wasserstoffatome durch Hydroxy-oder Methoxy-Gruppen zu verstehen ist. Bei dieser Definition sind also Flavane, Flavan-3-ole (Catechine), Flavan-3, 4-diole (Leukoanthocyanidine), Flavone, Flavonole und Flavanone im herkömmlichen Sinn eingeschlossen. Zu den erfindungsgemäßen Flavonen zählen neben Apigenin beispielsweise Chrysin, Galangin, Fisetin, Luteolin, Kämpferol, Quercetin, Morin, Robinetin, Gossypetin, Taxifolin, Myricetin, Rhamnetin, Isorhamnetin, Naringenin, Eriodyctiol, Hesperetin, Liquiritigenin, Catechin und Epicatechin.

Unter Isoflavonen sind im Sinne der vorliegenden Erfindung hingegen solche Stoffe zu verstehen, die Hydrierungs-, Oxidations-oder Substitutionsprodukte des 3-Phenyl-4H- 1-benzopyran-4-ons darstellen, wobei eine Hydrierung in der 2, 3-Stellung des Kohlenstoffgerüsts erfolgen kann, und wobei unter Substitution der Ersatz eines oder mehrerer Wasserstoffatome durch Hydroxy-oder Methoxy-Gruppen zu verstehen ist.

Zu den erfindungsgemäßen Isoflavonen zählen beispielsweise Daidzein, Genistein, Prunetin, Biochanin, Orobol, Santal, Pratensein, Irigenin, Glycitein, Biochanin A und Formononetin.

Flavone und Flavonglykoside (Flavonoide) wie Asparatin, Orientin (Lutexin), Cisorientin (Lutonaretin), Isoquercitin, Rutin, Naringin und die oben genannten, aber auch Isoflavone und Isoflavonglykoside (Isoflavonoide) sind bekanntermaßen Fänger von Sauerstoffradikalen sowie Hemmer von Proteasen der Haut, wodurch sie aktiv der Alterung der Haut und Vernarbungen entgegenwirken können. Wegen ihrer färberischen Eigenschaften sind einige Flavone wie Quercetin als Lebensmittelfarbstoffe in Gebrauch. Gleichzeitig wirken sie auf Grund ihrer Fähigkeit, Sauerstoffradikale einzufangen, auch als Antioxidantien. Einige Flavonoide sind Inhibitoren der Aldose-Reduktase. Diese spielt bei der Entstehung von Diabetesschäden (Gefäßschäden, Grauer Star) eine entscheidende Rolle. Andere Flavonoide (wie Hesperidin und Rutin) finden therapeutische Verwendung insbesondere als gefäßerweiterende, kapillaraktive Mittel.

Die erfindungsgemäß durchgeführten Derivatisierungen erzielen eine verbesserte Wirkung sowie eine erhöhte Bioverfügbarkeit, wie es bereits früher am Beispiel von Salicinderivaten gezeigt wurde.

Viele natürlich vorkommende Alkyl-und Phenol-Glucoside zeigen antivirale, antimikrobielle und teilweise antiinflammatorische Wirkungen. Sie sind jedoch oft aufgrund ihrer Polarität wenig bioverfügbar bzw. ihre Selektivität ist zu gering.

Beispielsweise ist Salicin (ein glykosidischer Wirkstoff aus der Weidenrinde) ein nichtsteroidales antiinflammatorisches Agenz (NSAIA), das nach Derivatisierung (Veresterungen) deutlich verbesserte Wirksamkeit zeigt. Kürzlich gelang die Synthese neuer arylaliphatischer Salicinester wie Phenylacetoyl-Salicin oder Phenylbutyroyl- Salicin, wobei die Veresterung bevorzugt an den primären OH-Gruppen des Salicins (zunächst am Zucker, dann am Benzylrest) im Salicin erfolgte. Aufgrund des arylaliphatischen Restes wird der Stofftransport an den Wirkort verbessert und die Selektivität der Wirkung erhöht. So inhibieren diese Derivate im Gegensatz zu unmodifiziertem Salicin bevorzugt die Prostaglandinsynthase 2 (geringere Gefahr von Nebenwirkungen) (Ralf T. Otto, Biotechnologische Herstellung und Charakterisierung neuer pharmazeutisch aktiver Glykolipide, Dissertation (1999) ISBN 3-86186-258-1).

PUFAs und CLAs Die PUFAs (engl. polyunsaturated fatty acids) und CLAs (conjugated linoleic acids) gehören in der Ernährung zu der Gruppe der essentiellen Fettsäuren und zeigen zusätzlich eine positive Wirkung beim Einsatz in der Prophylaxe von Arteriosklerose.

Daneben sind auch pharmazeutische Effekte von Bedeutung : Sie können antiinflammatorische (Hemmung der Prostaglandin-bzw. Leukotriensynthese), aber auch eine thrombolytische und hypotensive Wirkung aufweisen.

Erfindungsgemäß wird PUFA definiert als eine mehrfach ungesättigte Fettsäure mit 16 bis 26 C-Atomen, wobei die Fettsäure mindestens vier isolierte und/oder mindestens zwei konjugierte Doppelbindungen aufweist. Beispiele für PUFAs sind die insgesamt zwölf zur Linolsäure (cis, cis, 9, 12-Octadecadiensäure) isomeren Octadecadiensäuren

(die in der Natur vorkommen), die über konjugierte Doppelbindungen an den C-Atomen 9 und 11, 10 und 12, oder 11 und 13 verfügen.

Diese Isomeren der Linolsäure (z. B. cis, trans, 9, 11-Octadecadiensäure, trans, cis, 10, 12-Octa-decadiensäure, cis, cis, 9, 11-Octadecadiensäure, trans, cis, 9, 11- Octadecadiensäure, trans, trans, 9, 11-Octadecadiensäure, cis, cis, 10, 12- Octadecadiensäure, cis, trans, 10, 12-Octadecadiensäure, trans, trans, 10, 12- Octadecadiensäure) lassen sich auf herkömmlichem Weg mittels chemischer Isomerisierung der Linolsäure herstellen, wobei diese Reaktionen in Abhängigkeit der Reaktionsbedingungen ausschließlich zu CLA-Gemischen unterschiedlichster Zusammensetzung führen (z. B. Edenor UKD 6010, Henkel KGaA).

Aufgrund ihrer konjugierten Doppelbindungen werden diese isomeren Octadecadiensäuren auch als"conjugated linoleic acids" (CLAs) bezeichnet.

Obwohl in der Literatur bereits zahlreiche pharmakologisch wirksame Stoffe beschrieben sind, die beispielsweise in die Entzündungskaskade eingreifen, besteht weiterhin ein Bedarf an besser wirksamen, an Nebenwirkungen armen Wirkstoffen.

Weiter besteht ein Bedarf an Wirkstoffen mit einer guten Resorbierbarkeit und einer schnellen Penetration in die Haut, die zudem gut in pharmazeutische oder kosmetische Formulierungen einarbeitbar sein müssen.

Weiterhin besteht ein besonderes Interesse an der Auffindung von Wirkstoffen, welche den Alterungsprozessen der menschlichen Haut vorbeugen können.

Die menschliche Haut ist das größte Organ des menschlichen Körpers. Sie ist ein sehr komplex aufgebautes Organ, welches aus einer Vielzahl verschiedener Zelltypen besteht und die Grenzfläche des Körpers zur Umwelt bildet. Diese Tatsache verdeutlicht, dass die Zellen der Haut in besonderem Maße exogenen Signalen der Umwelt, physikalischer und chemischer Natur ausgesetzt. Viele dieser exogenen Noxen tragen zum Alterungsprozeß der Haut bei.

Die makroskopischen Phänomene alternder Haut beruhen zum einen auf der intrinsischen oder chronologischen Alterung, zum anderen auf der extrinsischen Alterung durch Umweltstress. Die Fähigkeit lebender Hautzellen, auf Ihre Umwelt zu

reagieren, verändert sich mit der Zeit. Es finden Alterungsprozesse statt, die zur Seneszenz und letztendlich zum Zelltod führen. Die sichtbaren Zeichen gealterter Haut sind als Integral der intrinsischen und der extrinsischen Alterung (z. B. durch Sonnenlicht) zu verstehen, wobei die Ereignisse der extrinsischen Alterung über einen längeren Zeitraum in der Haut akkumulieren.

Exogene Signale werden von Zellen empfangen und führen, zum Teil über komplexe Signaltransduktionskaskaden, zu Veränderungen im Genexpressionsmuster. Auf diese Weise reagiert jede Zelle auf Signale aus ihrer Umgebung mit der Anpassung ihres Metabolismus. Z. B. bemerken die Zellen der Haut die energiereiche Strahlung der Sonne und reagieren darauf mit der Umstellung ihrer RNA-und Proteinsyntheseleistungen. Einige Moleküle werden nach einem Stressstimulus (z. B.

Sonnenlicht) vermehrt synthetisiert (z. B. die Kollagenase MMP-1), andere wiederum werden in einem geringerem Umfang produziert (z. B. Kollageno). Weiterhin wird bei einer Vielzahl der Syntheseprozesse keine signifikante Veränderung erfolgen (z. B.

TIMP-1).

Die Induktion der Kollagenase MMP-1 durch Sonnenlicht oder andere Stressfaktoren wird als Hauptursache für den Prozess der extrinsischen Hautalterung angesehen. Die Kollagenase MMP-1 zerstört den wichtigsten Bestandteil des Bindegewebes der Haut, das Kollagen, und führt dadurch unter anderem zu einer Reduktion der Hautelastizität und zur Ausbildung tiefer Falten. In der jungen und nicht gestressten Haut wird die Aktivität der Kollagenase durch einen natürlich vorkommenden Inhibitor TIMP-1 (Tissue Inhibitor of Matrix Metalloprotease-1) reguliert. Zwischen MMP-1 und TIMP-1 besteht ein äußerst sensibles Gleichgewicht, welches durch exogenen Stress empfindlich gestört wird. Die Expression von MMP-1 wird durch Hautstress, wie z. B. die Bestrahlung mit Sonnenlicht verstärkt. Demgegenüber wird die Synthese des Inhibitors TIMP-1 nicht signifikant verändert. Daher kommt es unter Einwirkung von exogenem Stress, wie z. B. Sonnenlicht, in der Haut zu einem übermäßigen Abbau von Kollagen.

Die Folge ist eine vorzeitige Alterung der Haut.

Bestrebungen zur kosmetischen Behandlung der Effekte einer stressinduzierten Hautalterung haben die Reduktion der MMP-1-Aktiviät oder die verstärkte Synthese von Kollagen zum Ziel. Durch die Verwendung von Retinsäure bzw. Retinol soll die MMP-1

Synthese in der Haut vermindert oder die Kot ! agensynthese verstärkt werden. Jedoch ist der Einsatz von Retinsäure für Kosmetika in Europa aufgrund teratogener Eigenschaften nicht gestattet. Zytotoxische Effekte, unzureichende Stabilität in Formulierungen, unerwünschte Nebenwirkungen oder auch die störende Eigenfarbe führen zur Limitierung der kosmetischen Verwendung von Wirkstoffen, wie z. B. bei alpha-Tocopherol, Propylgallat oder diversen Pflanzenextrakten.

Die Aufgabe, die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegt, bestand also darin, nebenwirkungsarme, gut wirkende und gut zu verarbeitende und zu applizierende Substanzen bereitzustellen.

Flavon-und lsoflavonglykoside sind z. B. aus der Natur bekannt. Nicht bekannt (weder aus Pflanzen, Mikroorganismen oder tierischen Zellen noch synthetisch hergestellt) sind hingegen Ester solcher Flavon-und Isoflavonglykoside, bei denen mindestens eine der Hydroxylgruppen des Zuckers mit einer (ungesättigten) Carbon-bzw. Fettsäure verestert ist, und bei denen weiterhin eventuell eine weitere Estergruppierung zwischen einer der Hydroxylgruppen des Flavon-oder Isoflavon-Anteils und einer weiteren ungesättigten Fettsäure vorliegt.

Überraschenderweise wurde von den Erfindern gefunden, daß bestimmte Flavon-und Isoflavonglykosid-Ester eine gegenüber den bekannten Einzelkomponenten (Fettsäure bzw. (Iso-) Flavonglykosid) verbesserte biologische Verfügbarkeit, verstärkte Wirkung und/oder ein verbreitertes Wirkspektrum aufweisen. Bei diesen (Iso-) Flavon-Glykosid- Derivaten sind die Flavone oder Isoflavone über mindestens eine Hydroxylgruppe mit mindestens einem Zucker glykosidisch verknüpft. Dabei kann der Zucker über eine OH- Gruppe am Benzopyran-Ring oder über eine OH-Gruppe am Phenylring des (Iso- ) Flavonrestes mit diesem verknüpft sein. Auch die Gruppierung [A,-C (=O)] kann über eine OH-Gruppe am Benzopyran-Ring oder über eine OH-Gruppe am Phenylring des (Iso-) Flavonrestes mit diesem verknüpft sein. Es ist bevorzugt, wenn der Zucker über den Benzopyran-Ring und die Fett-/Carbonsäure ebenfalls über den Benzopyran-Ring oder über den Phenylring des (Iso-) Flavonrestes mit diesem verknüpft ist.

Als Zucker kommen Mono-und Oligosaccharide, insbesondere D-Glucose, D- Galactose, D-Xylose, D-Apiose, L-Rhamnose, L-Arabinose und Rutinose in Betracht.

Beispiele für die Flavon-Glykosid-Reste in den erfindungsgemäßen Verbindungen sind Rutin, Hesperidin und Naringin. Bevorzugte Beispiele für die Isoflavon-Glykosid-Reste in den erfindungsgemäßen Verbindungen sind Daidzin und Genistin.

Durch die Bereitstellung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung konnten die Erfinder die gestellte Aufgabe losen.

Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind Flavon-und Isoflavonglykosid- Derivate der allgemeinen Formel (1) : [A1~C (=O) 0] - [X-0-Z]- [0-C (=0)-A2] n ('), worin [X-O-Z] eine Flavon-oder Isoflavonglykosid-Struktur darstellt, worin X einen Flavon-oder Isoflavongrundkörper der Formel (Ila) bzw. (IIb) (IIa) (IIb) darstellt, wobei der (Iso-) Fiavongrundkörper einfach oder mehrfach substituiert und/oder einfach oder mehrfach reduziert (hydriert) ist, worin Z (Zucker) für ein Mono-, Disaccharid oder Polysaccharid steht, das acetalisch an den Rest X gebunden und n-fach esterartig mit A2 substituiert ist. worin [Ar-C (=O)] einen Acylrest am Flavon-oder Isoflavongrundkörper darstellt, worin Ar und A2 unabhängig voneinander einen mehrfach ungesättigten C15-C25- Alkenylrest mit mindestens 4 isolierten und/oder mindestens zwei konjugierten Doppelbindungen oder einen arylaliphatischen Rest mit 1-4 Methylengruppen zwischen Ester-Gruppe und aromatischem Ring darstellen,

worin [C (=O) A2] einen Acylrest am Zucker Z darstellt, worin n eine ganze Zahl (1, 2, 3,...), nicht aber 0 ist, worin m eine ganze Zahl (1, 2, 3,...) einschließlich 0 ist, und worin R1, R2, R3 Hydroxylgruppen oder Wasserstoff-Atome darstellen.

Bevorzugte Zuckeranteile sind allgemein solche Z, die ein Monosaccharid bedeuten.

Insbesondere bevorzugt sind folgende Monosaccharide : Rhamnose, Threose, Erythrose, Arabinose, Lyxose, Ribose, Xylose, Allose, Altrose, Galactose, Glucose, Gulose, Idose, Mannose, Talose und Fructose, wobei die natürlich vorkommenden Stereoisomere der Zucker die jeweils bevorzugte Form ist. Ebenfalls bevorzugt sind Disaccharide, die aus den zuvor genannten Monosacchariden aufgebaut sind, wobei wiederum die natürlich vorkommenden Stereoisomere der Zucker die jeweils bevorzugte Form ist.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Bindung des (Iso- ) Flavongrundkörpers an den Zucker über eine primäre Alkoholgruppe des Zuckers (z. B. über OH an C6 der Glukose). Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist Z-O-X das Naringin-Gerüst mit der Formel (III) Weitere bevorzugte Flavone/Flavonoide (X bzw. X-O-Z) in der aligemeinen Formel (I) sind Asparatin, Orientin (Lutexin), Cisorientin (Lutonaretin), Isoquercitin, Naringin, Rutin, Kampferol und Quercetin handelt.

Bevorzugte Verbindungen der allgemeinen Formel (I) sind vor allem solche, bei denen X-O-Z Naringin gemäß Formel (III) ist, und A2 die Acylreste folgender Säuren sind : p-

Chlorphenylessig-, Hydrozimt-, Stearin-, 12-Hydroxystearin-, Palmitin-, Laurin-, Öl-, Coumar-, Caprin-, Zimt-, 4-Phenylbutter-, 4-Hydroxyphenylessig-, 5- Phenylvaleriansäure oder die unter den Handelsnamen erhältlichen Gemische Edenor UKD 6010 und UKD 7505. Edenor UKD 6010 und UKD 7505, p-Chlorphenylessig-und Hydrozimtsäure sind besonders bevorzugte Säuren. Besonders bevorzugt ist für alle diese Kombinationen aus Naringin und den genannten Fettsäuren, wenn n=1 oder n=2 und m gleichzeitig 0 ist. Wenn n=1 (und m=0), ist die bevorzugte Position von A2 die primäre OH-Gruppe am Zucker-Anteil in der Formel (III). Aber auch alle sekundären OH-Gruppen des Zuckers kommen als bevorzugte Ausführungsformen für die Veresterung in Betracht. Wenn n=2 (und m=0), ist es bevorzugt, wenn eine Veresterung an der primären OH-Gruppe und die zweite an einer der sekundären OH-Gruppen des Zuckers, =insbesondere an einer der beiden sekundären OH-Gruppen am selben oder an einer der drei sekundären OH-Gruppen des zweiten Sechsrings, erfolgt.

Weitere bevorzugte Verbindungen der allgemeinen Formel (I) sind solche, bei denen X- O-Z Naringin ist, A2 die Acylreste folgender Säuren sind : p-Chlorphenylessig-, Hydrozimt-, Stearin-, 12-Hydroxystearin-, Palmitin-, Laurin-, Öl-, Coumar-, Caprin-, Zimt-, 4-Phenylbutter-, 4-Hydroxyphenylessig-, 5-Phenylvaleriansäure oder die unter den Handelsnamen erhältlichen Gemische Edenor UKD 6010 und UKD 7505 ; n = 1 oder n=2 und m gleichzeitig 1 ist. Wenn n und m beide 1 sind, ist die bevorzugte Position von A2 die primäre OH-Gruppe im Zucker, die-von A, entweder die 5-OH- Gruppe des Benzopyran-oder die 4'-Hydroxy-Gruppe des Phenylrings. Aber wie im Fall, wenn m=0, kann A2 auch über alle sekundären OH-Gruppen des Zuckers verestert werden. Wenn n = 2 und m gleichzeitig 1 ist, ist es bevorzugt, wenn die eine Veresterung von As an der primären OH-Gruppe und die zweite an einer der sekundären OH-Gruppen des Zuckers, insbesondere an einer der beiden sekundären OH-Gruppen am selben oder an einer der drei sekundären OH-Gruppen des zweiten Sechsrings, und die Veresterung von Ai über den Benzopyran-oder den Phenylring erfolgt.

Die Erfinder haben herausgefunden, daß die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) überraschenderweise durch milde lipasekatalysierte Veresterungen gewonnen werden können.

Demnach ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (I). Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß ein Acetal (aus Zucker und Flavon-/Isoflavon-Grundkörper) mit einer polyungesättigten Fettsäure (mit mindestens vier isolierten Doppelbindungen oder mit mindestens zwei konjugierten Doppelbindungen) wie einer konjugierten Linolsäure (Octadecadiensäure), mit einer arylaliphatischen Carbonsäure, mit einem Ester dieser Carbonsäuren oder mit einem aktivierten Fettsäurederivat unter katalytischer Einwirkung von einem oder mehreren Enzymen verestert oder umgeestert wird. Die Veresterung an primären OH-Gruppen des Zuckers ist dabei bevorzugt, aber auch sekundäre Alkohol-Gruppen des Zuckers können verestert werden.

Zu den geeigneten enzymatischen Katalysatoren zur Veresterung der genannten Säuren und den Hydroxylgruppen enthaltenden Acetal-Komponenten zählen die Hydrolasen, speziell die Lipasen (Ester-Hydrolasen) wie die Lipasen aus Candida rugosa (ehemals Candida cylindracea), Candida antarctica, Geotrichum candidum, Aspergillus niger, Penicillium roqueforti, Rhizopus arrhizus und Mucor miehei.

Eine bevorzugte Lipase ist die Lipase (Isoenzym B) aus Candida antarctica, wofür es zwei Gründe gibt. Erstens zeigt sie eine besonders hohe Selektivität bei der Veresterung der Acetale mit den ungesättigten Fettsäuren, obwohl diese nicht zu ihren typischen Substraten zählen. Des weiteren zeigt sie keine Grenzflächenaktivierung (ein entscheidendes Merkmal zur Klassifizierung von Hydrolasen in die Gruppe der Lipasen), da ihr ein wichtiges Lipasestrukturmerkmal, eine bewegliche Peptidkette am aktiven Zentrum (sog. lid) fehlt.

Bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen nach den üblichen Methoden der chemischen Synthese kommt es wegen der Anwesenheit mehrerer freier Hydroxylgruppen des Zuckers und/oder Flavon-/Isoflavon-Grundkorpers in der Regel zur Bildung von Gemischen aus einfach und mehrfach veresterten Produkten, so daß die Einführung und Entfernung von Schutzgruppen notwendig ist, wenn man gezielt eine bestimmte Verbindung synthetisieren will.

Gerade die gezielte Veresterung ist aber für die biologische Verfügbarkeit und Verträglichkeit der erfindungsgemäßen Substanzen entscheidend. Die chemische Synthese führt jedoch aufgrund mangelnder Regioselektivität zu groben Produktgemischen. Daher ist die hier beschriebene enzymatische (siehe Beispiele) milde und regioselektive Synthese von Vorteil. Erfindungsgemäß bedeutet regiospezifisch, daß nur e i n e bestimmte OH-Gruppe eines Polyols verestert wird.

Entsprechend bedeutet regioselektiv, daß eine bestimmte OH-Gruppe eines Polyols bevorzugt, aber nicht ausschließlich, verestert wird.

Sind die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (I) erst einmal mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellt worden, muß in aller Regel ein Verfahren folgen, um die gewünsche (n) Verbindung (en) aufzureinigen. Somit besteht ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung darin, ein Verfahren zur Aufreinigung der Verbindungen der Formel (I) bereitzustellen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es sich um ein wäßriges Zweiphasen-Extraktionsverfahren mit organischen Lösungsmitteln handelt, mit dem die Zielverbindung selektiv von den nicht umgesetzten Fettsäuren getrennt werden kann. Vorzugsweise handelt es sich bei dem organischen Lösungsmittel um n-Hexan, Cyclohexan, THF, Dieethylether. Alternativ kann die Aufreinigung auch durch ein chromatographisches Verfahren an Kieselgel, vorzugsweise mit Ethylacetat/Methanol-oder Dichlormethan/Methanol-Gemischen mit geringen Anteilen Essigsäure und/oder Wasser erfolgen, das auch zusätzlich zu einem wäßrigen Zweiphasen-Extraktionsverfahren mit organischen Lösungsmittel durchgeführt werden kann.

Da die erfindungsgemäßen Flavon-/lsoflavonglykoside der Formel (I) eine gute biologische Verfügbarkeit und Wirkung haben, lassen sie sich in kosmetischen und pharmazeutischen Zubereitungen und/oder als Nahrungsmittel-Zusatzstoffe verwenden mit dem Ergebnis, daß die Qualität ebendieser Produkte deutlich verbessert wird.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (l) weisen eine Inhibition von Hautproteasen (anti-aging, anti-wrinkling), ein antioxidatives Potential, hautaufhellende Wirkung sowie eine Inhibition der Transkription auf. Überraschend ist vor allem die

hautaufheliende Wirkung (infolge einer Hemmung der Tyrosinase) dieser Verbindungen, insbesondere die gute hautaufhellende Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen, bei denen Z-O-X Naringin bedeutet und deren primäre OH-Gruppe entweder mit Phenylpropionsäure, mit Hydroxyphenylessigsäure oder mit p- Chlorphenylessigsäure verestert ist.

Weiterhin wurde gefunden, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (l), insbesondere diejenigen Verbindungen, bei denen Z-O-X Naringin bedeutet und deren primäre OH-Gruppe entweder mit Phenylpropionsäure, mit Hydroxyphenylessigsäure oder mit p-Chlorphenylessigsäure verestert ist, in der Lage sind, die sonnenlichtinduzierte Expression von MMP-1, TIMP und Cola, in kosmetisch erwünschter Weise zu beeinflussen und somit dem Verlust an Kollagen in der Dermis entgegenzuwirken. Dadurch eignen sich diese Verbindungen hervorragend für eine kosmetische Behandlung der Haut, durch welche einer sonnenlichtinduzierten Alterung der Haut vorgebeugt wird und/oder durch welche deren Folgen vermindert werden.

Die Bildung des Kollagens wird insbesondere durch das Ausmaß der Expression von MMP und TIMP beeinflusst. Zur Analyse der Faktoren, die am Prozeß der Homöostase sonnenlichtbestrahlter Hautzellen beteiligt sind, sind folgende Strategien möglich : a) MMP :-Quantifizierung der Enzymaktivität von MMP-1 -Quantifizierung des synthetisierten MMP-1-Proteins.

-Quantifizierung der synthetisierten MMP-1-mRNA.. b) TIMP-Quantifizierung des synthetisierten TIMP-Proteins.

-Quantifizierung der synthetisierten TIMP-mRNA.. c) Kollagen-Quantifizierung des synthetisierten Kollagen-Proteins.

-Quantifizierung der synthetisierten Cola1-mRNA Die Produktion der mRNA ist im Verlauf der Proteinsynthese der erste und damit wichtigste Schritt. Wirkstoffe, die einen Effekt auf die mRNA-Produktion zeigen, haben somit automatisch auch einen Effekt auf die Proteinmenge und die Enzymaktivität. In einem anschließenden Schritt können die Auswirkungen der Effekte auf die mRNA- Produktion durch den Nachweis des Proteins Kollagen im Hautmodell selbst nachgewiesen werden.

Im Rahmen der Erfindung konnte gezeigt werden, daß erfindungsgemäße Naringin- Derivate in der Lage sind, die Expression vom MMP zu reduzieren, die Expression von TIMP zu erhöhen, die Expression von Cola, zu erhöhen sowie die Bildung von Kollagen zu erhöhen.

In der fotogealterten Haut wird MMP-1 zwar zum überwiegenden Teil von Fibroblasten produziert, die Reaktionen der Haut auf Stress dürfen aber nicht als Reaktionen einzelner, isolierter Hautzellen betrachtet werden. Vielmehr ist jede Zelle in ein komplexes Kommunikationsnetzwerk eingebunden. Dieses Netzwerk bewirkt den Informationsaustausch direkt benachbarter Zellen, aber auch zwischen weiter voneinander entfernt lokalisierten Zellen, wie z. B. den Zellen der Epidermis und der Dermis. An den Kommunikationsmechanismen zwischen den Zellen der Haut sind Signalmoleküle wie z. B. Interleukine, Wachstumsfaktoren (z. B. KGF, EGF oder FGF) usw. beteiligt. Aus diesem Grund wurde die Analyse der Wirkstoffeffekte an Hautmodellen durchgeführt, die aus einem dermalen und einem epidermalen Kompartiment bestehen.

Weiterhin wurde gefunden, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen im Vergleich zu herkömmlichen Wirkstoffen gegen eine Lichtalterung der Haut erheblich weniger phototoxisch sind.

Darüber hinaus sind die erfindungsgemäßen Verbindungen besonders gut in lipophile Basisrezepturen einarbeitbar und lassen sich auf einfache Weise als stabile Emulsionen formulieren.

Dementsprechend werden die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (I) zur Herstellung von kosmetischen und/oder pharmazeutischen Zubereitungen und/oder Nahrungs-bzw. Futtermitteln verwendet. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in Form der Reinsubstanz oder als Gemisch aus Pflanzenextrakten unterschiedlicher Herkunft vorliegen bzw. verwendet werden.

Bevorzugterweise werden dabei die (Iso-) Flavone und deren Glykoside als Bestandteile eines aus einer Pflanze gewonnenen Substanzgemisches, insbesondere eines pflanzlichen Extraktes, in den Zubereitungen/Zusatzstoffen verwendet. Solche pflanzlichen Substanzgemische können in einer dem Fachmann geläufigen Weise, beispielsweise durch Auspressen oder Extrahieren aus Pflanzen wie Zitrusgewächsen (Familie der Rutaceae) oder Akazien gewonnen werden.

Weitere Gegenstände der Erfindung sind danach die Verwendung der Verbindungen der Formel (I) zur Herstellung von kosmetischen und/oder pharmazeutischen Zubereitungen ; die Verwendung als Nahrungsergänzungs-oder-zusatzstoffe in Nahrungszubereitungen und in Futtermitteln (z. B. für die Tierzucht) ; kosmetische und pharmazeutische Zubereitungen sowie Nahrungsmittel/-zubereitungen und Futtermittel, die (eine) Verbindung (en) der Formel (I) enthalten.

Die unter erfindungsgemäßer Verwendung der Verbindungen (I) erhältlichen kosmetischen Zubereitungen, wie Haarshampoos, Haarlotionen, Schaumbäder, Duschbäder, Cremes, Gele, Lotionen, alkoholische und wäßrig/alkoholische Lösungen, Emulsionen, Wachs/Fett-Massen, Stiftpräparate, Puder oder Salben, können ferner als Hilfs-und Zusatzstoffe milde Tenside, polkörper, Emulgatoren, Überfettungsmittel, Periglanzwachse, Konsistenzgeber, Verdickungsmittel, Polymere, Siliconverbindungen, Fette, Wachse, Stabilisatoren, biogene Wirkstoffe, Deowirkstoffe, Antischuppenmittel, Filmbildner, Quellmittel, UV-Lichtschutzfaktoren, Antioxidantien, Hydrotrope, <BR> <BR> <BR> <BR> Konservierungsmittel, Insektenrepellentien, Selbstbräuner, Solubilisatoren, Parfümöle, Farbstoffe, keimhemmende Mittel und dergleichen enthalten.

Die Einsatzmenge der erfindungsgemäßen Verbindungen in den kosmetischen (aber auch pharmazeutischen) Zubereitungen liegt üblicherweise im Bereich von 0, 01 bis 5 Gew.-%, vorzugsweise jedoch im Bereich von 0, 1 bis 1 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmasse der Zubereitungen.

Zur Herstellung pharmazeutischer oder auch kosmetischer Zubereitungen lassen sich die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel (I), gegebenenfalls in Kombination mit anderen Wirksubstanzen, zusammen mit einem oder mehreren inerten

üblichen Trägerstoffen und/oder Verdünnungsmitteln, z. B. mit Maisstärke, Milchzucker, Rohrzucker, mikrokristalliner Cellulose, Magnesiumstearat, Polyvinylpyrrolidon, Zitronensäure, Weinsäure, Wasser, Wasser/Ethanol, Wasser/Glycerin, Wasser/Sorbit, Wasser/Polyethylenglykol, Propylenglykol, Carboxymethylcellulose oder fetthaltigen Substanzen wie Hartfett oder deren geeigneten Gemischen, in übliche galenische Zubereitungen wie Tabletten, Dragees, Kapseln, Pulver, Suspensionen, Tropfen, Ampullen, Säfte oder Zäpfchen einarbeiten.

Die zur Erzielung einer entsprechenden Wirkung bei pharmazeutischen Anwendungen erforderliche tägliche Dosierung beträgt zweckmäßigerweise 0, 1 bis 10 mg/kg Körpergewicht, vorzugsweise 0, 5 bis 2 mg/kg Körpergewicht.

Die unter erfindungsgemäßer Verwendung der Verbindungen der Formel (I) erhältlichen Nahrungsersatz-und-zusatzstoffe wie Sportler-Drinks enthalten geeigneterweise die Verbindung (en) der Formel (I) in einer Menge, die bei einem üblichen Bedarf an Ftüssigkeitsaufnahme von 1 bis 5 Litern pro Tag zu einer Dosierung dieser Verbindungen von an 0. 1 bis 10 mg, vorzugsweise 0, 5 bis 5 mg, pro kg Körpergewicht führt. Eine beispielhafte Verwendung in der Nahrungsmittelindustrie besteht für die Verbindungen der Formel (I) als Färbe-und/oder Gewürzstoffe.

Beispiele Beispiel 1 : Herstellung von 6-O-cis-9, trans-11-Octadecadienoyl-Naringin 2 g D- (-)-Naringin 5 g, CLA (Edenor UKD 6010), 12 g Molekularsieb, 15 mi t-Butanol und 10 g immobilisierte Lipase B aus Candida antarctica wurden 40 Stunden bei 60°C und 100 rpm am Magnetrührer im 250 ml Erlenmeyerkolben inkubiert. Die Umsetzung wurde mittels Dünnschichtchromatographie (Kieselgel KG60-Platten mit Fluoreszenzindikator ; Laufmittel : Ethylacetat/Methanol 10 : 1 v/v ; Visualisierung : UV- Detektion sowie mittels Essigsäure/Schwefelsäure/Anisaldehyd (100 : 2 : 1 v/v/v) Tauchreagenz nachgewiesen. Das Produkt wurde mit 20 ml n-Hexan extrahiert und über Säulenchromatographie (Kieselgel F60 ; Laufmittel : Ethylacetat/Methanol 10/1 v/v) gereinigt.

Rf-Wert : 0. 47 (Ethylacetat/Methanol 10 : 1) Beispiel 2 : Herstellung von 6-O-Naringin- (3-phenyl-propionsaure) ester 5, 8 g Naringin, 1, 5 g 3-Phenylpropionsäure, 3, 7 g Molekularsieb, 15 ml t-Butanol und 11 g immobilisierte Lipase B aus Candida antartica wurden 24 Stunden bei 60°C und 100 rpm in einem 250 ml Kolben inkubiert. Die Umsetzung wurde mittels Dünnschichtchromatographie (Kieselgel 60 F254 ; Laufmittel EthylacetaVMethanol 10 : 1 v/v ; Visualisierung durch UV-Detektion) verfolgt. Bei Abbruch der Reaktion betrug der Umsatz bezogen auf Naringin 20%. Das Produkt wurde mit 20 mi n-Hexan extrahiert und über Säulenchromatographie (Kieselgel F60 ; Laufmittel : Ethylacetat/Methanol 10/1 v/v) gereinigt.

Ru-vert : 0, 16 (Ethylacetat/Methanol 10 : 1 v/v) Ausbeute : 0, 85 g Die säulenchromatographische Trennung wurde nicht optimiert. Neben Fraktionen mit dem reinen Produkt wurden weiterhin Mischfraktionen erhalten, die unumgesetztes Naringin enthielten. Zur Bestimmung der angegebenen Ausbeute wurden lediglich diejenigen Fraktionen aus der Säulenchromatographie verwendet, welche ausschließlich das gewünschte Produkt enthielten.

Beispiel 3 : Herstellung von 6-O-Naringin-(p-CI-phenylessigsäure) ester 5, 8 g Naringin, 1, 7 g p-Chlorphenylessigsaure, 3, 8 g Molekularsieb, 15 ml t-Butanol und 11 9 immobilisierte Lipase B aus Candida antartica wurden 24 Stunden bei 60°C und 100 rpm in einem 250 ml Kolben inkubiert. Die Umsetzung wurde mittels Dünnschichtchromatographie (Kieselgel 60 F254 ; Laufmittel Ethylacetat/Methanol 10 : 1 v/v ; Visualisierung durch UV-Detektion) verfolgt. Bei Abbruch der Reaktion betrug der Umsatz bezogen auf Naringin 20%. Das Produkt wurde mit 20 ml n-Hexan extrahiert und über Säulenchromatographie (Kieselgel F60 ; Laufmittel : Ethylacetat/Methanol 10/1 v/v) gereinigt.

Ru-vert : 0, 20 (Ethylacetat/Methanol 10 : 1 v/v) Ausbeute : 0, 50 g Die säulenchromatographische Trennung wurde nicht optimiert. Neben Fraktionen mit dem reinen Produkt wurden weiterhin Mischfraktionen erhalten, die unumgesetztes Naringin enthielten. Zur Bestimmung der angegebenen Ausbeute wurden lediglich diejenigen Fraktionen aus der Säulenchromatographie verwendet, welche ausschließlich das gewünschte Produkt enthielten.

Beispiel 4 : Herstellung weiterer Naringin-Derivate Naringin-Derivate, hergestellt wie unter Beispiel 1 beschrieben (Umsetzung mit Novozym SP435 für 48 h bei 65°C, Rührgeschwindigkeit 1200 Upm). Mittels Dünnschichtchromatographie wurde die Umsetzung kontrolliert sowie der Umsatz (bezogen auf das eingesetzte Naringin) bestimmt.

Umsatz 4. 1 Stearinsäure + 4. 2 Palmitinsäure ++

Umsatz 4. 3 Laurinsäure ++ 4. 4 Ölsäure + 4. 5 Coumarsäure + 4. 6 Caprinsäure + 4. 7 Zimtsäure + 4. 8 4-++ Hydroxyphenylessigsäure 4. 9 5-Phenylvaleriansäure ++ 4. 10 4-Phenylbuttersäure ++ 4. 11 12-Hydroxy-Stearinsäure + 4. 12 Edenor UKD6010 + + bedeutet bis 15 % Umsatz ++ bedeutet über 15 % Umsatz Beispiel 5 : Hemmung der Tyrosinaseaktivität Tyrosinasen katalysieren physiologisch einen wichtigen Schritt in der Melanin-Synthese (L-Dopa zu L-Dopaquinone, das weiter cyclisiert und erneut durch eine Tyrosinase zu Dopachrom umgesetzt wird). Eine Hemmung der Tyrosinase kann damit zu einer hautaufhellenden Wirkung führen.

Die Aktivität von Pilz-Tyrosinase (Sigma) wurde in Gegenwart unterschiedlicher Konzentrationen der erfindungsgemäßen Wirkstoffe anhand der enzymatischen Umsetzung von LDOPA zu Dopachrom bestimmt. Das Absorptionsmaximum des Dopachroms (rotbraun) liegt bei A=475nm. Der lineare Anstieg der Absorption (A) des

Dopachroms pro Zeiteinheit (t) ist ein Maß für die Aktivität der Tyrosinase (#A/#t). Die Aktivität der Tyrosinase in Abwesenheit der Wirkstoffe (#A1/#t1) diente als Referenz und wurde auf 100% gesetzt. Unter analogen Bedingungen wurde die Tyrosinase- Restaktivität in Gegenwart der Wirkstoffe (AA2/At2) bestimmt. Jede Messung wurde zweifach in parallelen Ansätzen durchgeführt. Die Schwankung der Ergebnisse der Methode liegt bei ca. 10%.

Verwendete Chemikalien : L-3, 4-Dihydroxyphenylalanin (L-DOPA) (Sigma) KH2PO4 (J. T. Baker) Tyrosinase, 50. 000 units (Sigma) KOH Benötigte Lösungen : 50 mM KH2PO4-Puffer in H20 bidest. (Einstellung auf pH = 6. 5 mit 1 M wäßriger KOH) 2. 5 mM L-DOPA in H20 bidest.

340 U/ml Tyrosinase Stammlösung in kaltem KH2PO4-Puffer, pH = 6. 5 Stammlösungen des zu prüfenden Wirkstoffs in bidest. Wasser bzw. Ethanol, worin die Konzentration des Wirkstoffs 10-fach höher war als in der Zeile, Wirkstoffkonzentration im Testsystem"unter"Ergebnisse"angegeben Reaktionscocktail : 10 ml KH2PO4-Puffer 10 ml L-DOPA 9 ml H20 bidest.

Der Reaktionscocktail wurde ebenso wie die Tyrosinase-Stammlösung erst vor Versuchsbeginn hergestellt. Die Tyrosinase-Stammlösung muß unbedingt kühl gelagert werden. Die L-DOPA-Lösungen sollten dunkel und in gut verschlossenen Gefäßen unter Sauerstoffausschluß aufbewahrt werden. Bei evtl. Grauverfarbung (Oxidation durch Luftsauerstoff) muß die Lösung frisch angesetzt werden.

Testsystem (Probenvolumen 1 ml) und Reaktionsdurchführunq : 33 pi Tyrosinase-Stammlösung 100 ul Wirkstoff-Stammiösung Ad 1000 NI Reaktionscocktail Die Aktivität der Tyrosinase in Abwesenheit der Wirkstoffe diente als Referenz und wurde auf 100% gesetzt. Sämtliche Proben wurden vor Meßbeginn am Vibrofix gut durchmischt. Der pH-Wert wurde kontrolliert und ggf. auf pH= 6. 5 eingestellt. Die Messung erfolgte mit einem Uvikon-860-Photometer der Fa. Kontron. Die Absorption des Dopachroms wurde am Absorptionsmaximum bei #=475nm über einen Zeitraum von 5 min. bei 25°C detektiert, wobei das Meßintervall 20-30 s betrug.

Ergebnisse : Wirkstoff : 6-O-Naringin-(3-phenyl-propionsäure) ester aus Beispiel 2 Wirkstoffkonzentration im Testsystem 0. 005% 0. 05% 0. 5% (w/v in H20 bidest.) Restaktivität der Tyrosinase in % 98. 9 69. 1 0. 7 (IC50= 0. 18%) Wirkstoff : 6-O-Naringin-(p-CI-phenylessigsäure) ester aus Beispiel 3 Wirkstoffkonzentration im Testsystem 0. 01% 0. 1% (w/v in 98% Ethanol) Restaktivität der Tyrosinase in % 45. 1 15. 4 Beispiel 6 : Phototoxizität Dermale Fibroblasten menschlicher Haut wurden mit steigenden Konzentrationen von Retinol (Tabelle 1), 6-O-Naringin-(p-CI-phenylessigsäure) ester (Tabelle 2) und 6-O- Naringin- (3-phenylpropionsäure) ester (Tabelle 3) kultiviert. Mit Hilfe eines MTT-Tests wurde die Phototoxizität der Substanzen gemessen. Für die Ermittlung der Phototoxizität wurden die behandelten Zellen mit simuliertem Sonnenlicht, entsprechend einer Dosis von 10 J UV-A/cm2 bestrahlt. Die Vitalität nicht behandelter Zellen wurde gleich 100 % gesetzt und alle anderen Werte darauf bezogen.

Die Bestrahlung der Zellen erfolgte mit einem Sonnenlichtsimulator, aus dessen Emissionsspektrum der UV-A Anteil der Strahlung zur Quantifizierung gemessen wurde.

Vorteil dieses experimentellen Designs ist die Tatsache, daß mit dem kompletten Spektrum des Sonnenlichts gearbeitet wird und somit die Alltagssituation hervorragend nachgestellt wird. Demgegenüber arbeiten viele andere Forschungslaboratorien mit reinen UV-A und/oder UV-B Strahlern.

Tabelle 1 : Phototoxizität von Retinol Konzentration Retinol (ppm) Vitalität (% ; in Klammern : SEM) 0, 0028 99 (7, 4) 0, 014 95 (19, 8) 0, 028 80 (25, 9) 0, 14 28 (11, 8) 0, 28 4 (2, 1) Tabelle 2 : Phototoxizität von 6-O-Naringin- (p-CI-phenylessigsäure) ester Konzentration des Naringinderivats (ppm) Vitalität (% ; in Klammern : SEM) 5 115 (15) 10 96 (17, 2) 50 81 (8, 3) 100 3 (1, 7) 500 3 (1, 8) Tabelle 3 : Phototoxizität von 6-O-Naringin-(3-phenyl-propionsäure) ester Konzentration des Naringinderivats (ppm) Vitalität (% ; in Klammern : SEM) 5 125 (5, 8) 10 103 (19, 8) 50 98 (15, 1) 100 101 (8, 3) 500 29 (4, 5) 1000 2 (0, 5)

Die Resultate zeigen, daß 6-O-Naringin-(3-phenyl-propionsäure) ester und 6-O- Naringin-(p-CI-phenylessigsäure) ester verglichen mit Retinol erst in höheren Konzentrationen toxische Effekte aufweisen. Retinol ist bereits in sehr niedrigen Konzentrationen toxisch. Die Verringerung der Vitalität um mehrere Zehnerpotenzen belegt die starke Phototoxizität von Retinol.

Beispiel 7 : Wirkungen auf die lichtinduzierte Expression von MMP-1-, TIMP-und Cola,-mRNA Die Wirkungen von 6-O-Naringin- (3-phenyl-propionsäure) ester (Tabelle 4) bzw. 6-O- Naringin- (p-CI-phenylessigsäure) ester (Tabelle 5) auf die lichtinduzierte Expression von MMP-1, TIMP und Cola, wurden bei subphototoxischen Konzentrationen gemessen.

Hierzu wurde die mRNA-Menge für MMP1, TIMP und Cola, quantifiziert. Hautmodelle wurden für 12 Stunden mit den Testsubstanzen behandelt und dann mit simuliertem Sonnenlicht, entsprechend einer Dosis von 10 J UV-A/cm2, bestrahlt. Nach weiteren 48 Stunden in Gegenwart der Wirkstoffe wurde die RNA der Zellen präpariert und durch Northern-Blots mit spezifischen Gensonden analysiert. Zur Kontrolle der in den Experimenten eingesetzten RNA-Menge wurden Northern-Blots mit einer 18S- spezifischen Gensonde durchgeführt. Zur Quantifizierung der Signalintensitäten wurden die Autoradiogramme densitometrisch vermessen und die Werte der Signale für MMP1, TIMP und Cola, auf die dazugehörigen Werte der 18S Signale bezogen. Die Zahlenwerte in den Tabellen stellen die densitometrische Quantifizierung der Signale eines Northern-Blots nach deren Normalisierung dar. Die lichtinduzierte Expression von MMP1, TIMP und Cotai bei nicht behandelten Zellen wurde jeweils auf 100 % gesetzt und alle anderen Werte darauf bezogen.

Tabelle 4 : Effekte von 6-O-Naringin-(p-CI-phenylessigsäure) ester auf die Expression von MMP1, TIMP und Collagen Konzentration des Naringinderivats (ppm) MMP1 TIMP Collagen 0, unbestrahit 100 100 100 0, bestrahlt 135 89 66 5, bestrahlt 129 62 56 50, bestrahlt 40 77 79

Tabelle 5 : Effekte von 6-O-Naringin-(3-phenyi-propionsäure) ester auf die Expression von MMP1, TIMP und Collagen Konzentration des Naringinderivats (ppm) MMP1 TIMP Collagen 0, unbestrahit 100 100 100 0, bestrahlt 135 89 66 10, bestrahit 167 104 74 100, bestrahit 87 134 99 Die Bestrahlung von Hautmodellen mit simuliertem Sonnenlicht führte zu einer starken Induktion der MMP1-mRNA-Synthese, während die Synthese von Kollagen herunterreguliert wurde. Die Produktion von TIMP blieb weitgehend unbeeinflußt.

Tabelle 4 zeigt, daß 50 ppm 6-O-Naringin-(p-CI-phenylessigsäure) ester die sonnenlichtinduzierte Expression von MMP-1 sehr effektiv reduzierten. Die Expression von TIMP wurde nur geringfügig beeinflußt, die Expression von Cola, ist gegenüber der bestrahlten, unbehandelten Probe deutlich gesteigert. Die Behandlung der Zellen mit 100 ppm 6-O-Naringin- (3-phenyl-propionsäure) ester reduzierte die sonnenlichtinduzierte Expression von MMP-1 auf das Niveau der unbestrahlten unbehandelten Probe (Tabelle 5). Demgegenüber stieg die Expression von TIMP um ca. 35% an. Die Expression von Cola, konnte auf das Niveau der unbestrahiten, unbehandelten Kultur gesteigert werden.

Die prozentuale Veränderung der Expression von MMP, TIMP und Cola, in Kulturen bestrahlter Fibroblasten nach Behandlung mit 50 bzw. 100 ppm der geprüften Naringinderivate im Vergleich zu bestrahlten, unbehandelten Kulturen ist in Tabelle 6 zusammengefaßt.

Tabelle 6 : Expression von 6-O-Naringin-6-O-Naringin- (3-phenyl- (p-CI-phenylessigsaure) ester propionsäure) ester (50 ppm) (100 ppm) MMP-70%-37% TIMP-15% 50% Cola, 27% 64%

Die jeweils in Tabelle 6 angegebene Konzentration führte für beide Naringinderivate zu einer deutlichen Hemmung der MMP-Expression und einer gesteigerten Cotai.

Produktion. Die 6-O-Naringin-(3-phenyl-propionsäure) ester steigerte die TIMP- Produktion erheblich, während 6-O-Naringin-(p-CI-phenylessigsäure) ester nur einen geringen Einfluß nahm.

Beispiel 8 : Wirkung auf die Kollagenproduktion Zum Nachweis der erhöhten Produktion von Kollagen auf Proteinebene wurden Fibroblasten in einem dreidimensionalen Kultursystem für 5 Tage mit den Prüfsubstanzen behandelt. Am sechsten Tag wurde die Menge des gebildeten Kollagens im Vergleich zu Nichtkollagenprotein über den Einbau tritiierten Proteins bestimmt. Tabelle 7 zeigt die prozentuale Steigerung des Kollagenanteils am Gesamtprotein, bestimmt aus behandelten Fibroblastenkulturen gegenüber unbehandelten Kulturen.

Tabelle 7 : 6-O-Naringin- (3-phenyl- 6-O-Naringin- (propionsäure) ester (p-CI-phenylessigsäure) ester Konzentration 1 ppm 1 Oppm 100ppm 5ppm 50ppm Steigerung der Kollagenproduktion 8% 8% 19%-3% 41%