Description

Titre : Détection de NPR1 pour l’évaluation de l’activation des mécanismes de défense des plantes

Domaine technique

[0001] L’invention concerne des anticorps dirigés spécifiquement contre la forme monomérique de la protéine NPR1, ainsi que leur utilisation dans des méthodes de détection de l’activation des défenses d’une plante par la détection ou quantification de la forme monomérique de la protéine NPR1.

Technique antérieure

[0002] La réduction de l’usage des produits phytosanitaires conventionnels, prévue dans le plan Ecophyto 2025, se traduit par le développement de nouvelles stratégies pour des pratiques agricoles plus durables et plus respectueuses de l’environnement. Dans ce contexte, de nouvelles variétés moins dépendantes d’intrants sont destinées à apparaître et de nouvelles pratiques associées à ces variétés sont à mettre au point. Le développement de SDP (molécules capables de stimuler les défenses naturelles des plantes) est une stratégie qui attire de plus en plus l’attention. Les SDP peuvent être d’origine naturelle ou de synthèse, mais sont soumis dans les deux cas à la règlementation en vigueur concernant la mise sur le marché des produits phytopharmaceutiques (Règlement CE n°1107/2009).

[0003] Cependant, bien qu'ils constituent une stratégie prometteuse en faveur d'une agriculture plus durable, l’efficacité des SDP sur le terrain reste aléatoire et il n'existe pas ou peu d'outils pour évaluer leur capacité d'activation. Ainsi, de nombreux projets de produits SDP développés en laboratoire ne peuvent aboutir à des autorisations de mise sur le marché (AMM), par manque de moyens d’analyses et/ou en raison des résultats inexploitables des expérimentations menées en conditions naturelles. En pratique, les traitements à l’aide de SDP sont généralement positionnés en préventif et renouvelés car leur persistance d’action est limitée. Il arrive également que les plantes ne soient pas réceptives au moment du traitement (variétés, stade végétatif...). De plus, au-delà d’une certaine pression parasitaire, un traitement chimique d’appoint est recommandé (en mélange ou dissocié). Plusieurs tests en conditions semi-contrôlées ont infirmé les résultats d’études obtenus en laboratoire et ainsi plusieurs produits et molécules ont été mises au ban. Ce phénomène de discordance entre les résultats d’efficacité obtenus en conditions plus ou moins contrôlées (phytotron vs serre) est encore plus flagrant lorsque les essais se font en conditions naturelles (plein champ). En effet, les aléas climatiques sont inévitables et la pression parasitaire est parfois très variable. Les résultats de ces essais sont alors aléatoires, difficilement exploitables et leur reproductibilité est faible. Certains produits ont néanmoins réussi à prouver leur efficacité, mais il existe une disparité importante dans les méthodes d’évaluation des produits.

[0004] L’identification de molécules SDP efficaces ainsi que de variétés hautement réceptives requiert des outils de criblage fiables, efficaces et utilisables en routine. La mise au point d’une méthode fiable de détection de l’activation des mécanismes de défense des plantes est un enjeu majeur pour évaluer ce type de produits sur le terrain dans les meilleures conditions. Cet outil s’avère indispensable à plusieurs niveaux, tant pour tester la réceptivité des plantes aux sites d’expérimentations retenus que pour le suivi de l’efficacité des produits au cours du temps.

[0005] A l’heure actuelle il existe différentes méthodes de détection de l’activation des défenses des plantes par les SDP :

[0006] Un émetteur / récepteur optique, développé par la société Force A et appelé Multiplex® permet le "dosage" de molécules, type anthocyanes, flavonols, etc. Cet outil portatif permet l’acquisition rapide de données, facilement utilisables. De plus, les mesures non destructives permettent la réalisation de plusieurs mesures sur le même organe, apportant ainsi des informations sur l’évolution temporelle des réponses. Cependant, les marqueurs dosés sont peu spécifiques. Il s’agit composés du métabolisme secondaire propres à chaque variété de plantes qui ont des rôles très divers au niveau de la physiologie et du développement de ces plantes.

[0007] Il existe également un outil de diagnostic moléculaire développé par l’INRA d’Angers, appelé "qPFD" (Puce à Faible Densité Quantitative : RT-PCR quantitative en microplaque / puce à ADN de faible densité) qui permet d’évaluer des gènes cibles dont l’expression, seule ou en combinaison, renseigne sur l’état de stimulation des défenses naturelles des plantes (WO 2011/161388)..

[0008] Une méthode de criblage de produits potentiellement éliciteurs (GUSTAVE pour GUS Technology for Analysis and Validate plant Elicitor), a aussi été développée et est commercialisée par la Demanderesse. Le principe de ce test est d’utiliser des plantes exprimant un gène rapporteur codant une b- glucuronidase, le gène GUS. Celui-ci a été fusionné au promoteur de gènes connu pour être des marqueurs des deux principales voies de défense. Des plantes d’Arabidopsis transgéniques possédant une construction promoteur gènes marqueurs:GUS sont donc utilisées. Lorsque le substrat X-Gluc (5-bromo-4- chloro-3-indolyl- -D-glucuronic acid, cyclohexylammonium) est apporté à la plante, l’enzyme GUS va cliver ce substrat et produire un précipité bleu insoluble). Une coloration bleue apparaît alors si le gène marqueur est exprimé, permettant ainsi une localisation spatiale de la mise en place des défenses. L’utilisation de ce test permet de manière rapide de cribler des SDP qui sont capables d’activer les défenses en visualisant facilement l’expression de gènes marqueur représentant l’une ou l’autre des deux principales voies de défenses connues. Il est ainsi facile de constater si le produit est capable d’activer les défenses des plantes mais aussi de savoir quel type de défense est activé.

[0009] Des tests de protection sont aussi proposés par de multiples entreprises. Ces tests permettent d’observer en condition contrôlée ou au terrain l’efficacité d’un SDP en terme de protection vis-à-vis de pathogènes. Ces tests permettent donc de montrer l’efficacité d’un SDP mais ne montrent aucunement l’activation des défenses par ce produit.

[0010] Il apparaît d’après la littérature, que la protéine NPR1 est une protéine clé de l’immunité de la plante. Elle est nécessaire à la mise en place de la résistance systémique acquise (SAR) impliquant la phytohormone acide salicylique (SA) et de la résistance systémique induite (ISR) impliquant le couple de phytohormones acide jasmonique/éthylène (JA/Et) qui sont des formes d’immunité qui peuvent durer jusqu’à plusieurs semaines voire plusieurs mois. [0011] La protéine NPR1 se trouve sous forme monomérique ou oligomérique dans la cellule végétale. La littérature indique que le niveau de concentration du monomère est corrélé avec son activité.

[0012] La demande de brevet WO9806748 décrit des polypeptides de résistance acquise tels que NPR1, capables de conférer à une plante exprimant ledit polypeptide une résistance à un agent phytopathogène. Les phénotypes des mutants NPR1 ont démontré l'importance biologique du gène NPR1 d'Arabidopsis thaliana dans le contrôle de la réponse de défense contre un large spectre d'agents pathogènes. [0013] Un anticorps anti-NPR1 est commercialisé par la Société AGRISERA

(Agrisera n°AS12 1854). Cet anticorps nécessite cependant un traitement préalable avec de l’acide salicylique et ne permet pas de détecter NPR1 chez d’autres plantes que chez Arabidopsis thaliana. Par ailleurs, cet anticorps n’est pas spécifique et détecte NPR1 sans discrimination de son activité. Il détecte en effet la forme inactivée et activée de la protéine NPR1 sans distinction.

[0014] Zhonglin Mou ET AL décrivent le rôle de NPRI dans la résistance systémique acquise (SAR) des plantes ainsi que les mécanismes permettant de conférer aux plantes une immunité à large spectre contre les agents pathogènes. Deux anticorps ont été utilisés. Le premier est un anticorps polyclonal dirigé contre la partie N-terminal de NPR1 chez Arabidopsis thaliana. Le deuxième est un anticorps monoclonal dirigé contre un peptide de 16 acides aminés de la partie C- terminale de NPR1 chez Arabidopsis thaliana. Cet anticorps se lie à la forme monomérique et oligomérique de NPR1 (« inducers of plant systemic acquired résistance regulate NPR1 function through redox changes gene expression through interaction with transcription », Cell, 27 juin 2003, pages 935-944).

[0015] Toutefois, ces anticorps ne permettent de détecter NPR1 que chez Arabidopsis thaliana et ne permettent pas de cibler la forme active de NPR1 dans différentes espèces de plantes. Problème technique

[0016] Or, il est nécessaire de mettre au point une technique immunologique de détection et de quantification qui puisse être utilisée chez différentes espèces de plantes afin de pouvoir largement être mise en œuvre sur différentes cultures. En effet, et à ce jour, aucune technique immunologique de détection et de quantification simple, spécifique, rapide, bon marché et pouvant être appliquée chez différentes espèces de plantes, pour l’expérimentation «terrain» n’est disponible au vu de la littérature scientifique et/ou connue des professionnels de l’expérimentation. [0017] Il est ainsi nécessaire de mettre au point une méthode permettant de détecter, de quantifier et d’évaluer, de manière simple, rapide, à coût modéré, et à large spectre, l’activation des mécanismes de défense de plantes, et ce afin de, notamment, cribler des molécules potentiellement SDP, de démontrer et/ou vérifier l’activation des défenses des plantes suite à l’application d’une substance et sélectionner des variétés hautement réceptives aux SDP.

Exposé de l’invention

[0018] Les inventeurs ont avantageusement mis au point deux peptides dégénérés consensus, fortement immunogènes, qui ont permis de générer des anticorps permettant de spécifiquement cibler la forme active de NPR1 dans différentes espèces végétales d’intérêt agronomique.

[0019] La présente invention concerne donc des anticorps anti-NPR1 dirigés spécifiquement contre la forme monomérique de la protéine NPR1, préférentiellement la présente invention concerne des anticorps anti-NPR1 dirigés spécifiquement à l’encontre de séquence consensus spécifiques. [0020] Les inventeurs ont en effet développé et utilisé une stratégie d’immunisation permettant l’obtention d’anticorps spécifiques d’une forme active de NPR1, i.e., la forme monomérique de la protéine NPR1. Cette approche présente l’avantage de montrer l’activation des défenses des plantes quelle que soit la voie hormonale mise en œuvre, et ce, sur différentes plantes. Aussi, et avantageusement, les anticorps selon l’invention ne sont pas limités à la détection de NPR1 chez Arabidopsis thaliana, mais permettent de cibler la forme monomérique de NPR1 dans différentes espèces végétales.

[0021] Ainsi, et au sens de la présente invention, NPR1 a été choisi comme marqueur de l’immunité permettant de détecter de manière multi-spécifique et à large spectre l’activation des défenses des plantes, sur la base de peptides consensus permettant d’être représentatif d’une grande partie du règne végétal.

[0022] La présente invention concerne également une méthode de détection de l’activation des défenses d’une plante par la détection ou quantification de la forme monomérique de la protéine NPR1 dans un échantillon de plante en utilisant un anticorps anti-NPR1 selon la présente invention.

[0023] Avantageusement, cette méthode va permettre le criblage de molécules, potentiellement SDP, sur toutes les plantes d’intérêt agronomique, pour l’émergence de nouvelles substances actives à activité SDP, de démontrer l’activation des défenses des plantes suite à l’application d’un produit, de vérifier in situ l’activation des défenses suite à l’application de SDP, de sélectionner des variétés hautement réceptives aux SDP, de mesurer l’activation des mécanismes de défense des plantes avant traitement, et de sélectionner une plante présentant un état de stimulation des défenses naturelles susceptible de conférer une résistance améliorée à au moins un stress biotique ou abiotique. [0024] Ainsi et avantageusement, l’utilisation des anticorps anti-NPR1 spécifiques selon la présente invention permet de détecter, quantifier et d’évaluer, de manière simple, rapide et à coût modéré, l’activation des mécanismes de défense d’une plante, sur la majorité des plantes d’intérêt agronomique.

Brève description des dessins [0025] D’autres caractéristiques, détails et avantages de l’invention apparaîtront à la lecture de la description détaillée ci-après, et à l’analyse des dessins annexés, sur lesquels :

Fig. 1 [0026] [Fig. 1] représente la position des deux peptides dégénérés consensus utilisés pour produire les anticorps selon la présente invention et dirigés contre la protéine NPR1 consensus de différentes espèces végétales. L’antipeptide 0 (antipepO) a été produit à l’aide du peptide 0 dégénéré de séquence consensus SEQ ID NO 1 par injection de peptides de séquences SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5 chez le lapin. L’antipeptide 1 (antipepl) a lui été produit à l’aide du peptide 1 dégénéré de séquence consensus SEQ ID NO 6, par injection de peptides de séquences SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14 chez le lapin.

Fig. 2

[0027] [Fig. 2] représente les protéines recombinantes (prot T, P et I) en fonction de leurs positions par rapport à la protéine NPR1 d’A. thaliana.

Fig. 3

[0028] [Fig. 3] est un western blot effectué à l’aide de l’antipeptideO sur des extraits de plante d’A. thaliana dont les défenses ont été activées à l’aide de Bion® (1) ou d’Acide salicylique SA (2) ou non activées en utilisant de l’eau (3). Une bande de 37kDa n’est détectée (1 et 2) que lorsque les défenses sont activées et cette bande n’est pas détectée lorsque les défenses ne sont pas activées (3).

Fig. 4

[0029] [Fig. 4] montre des westerns blots effectués par hybridation des différentes protéines recombinantes avec l’anticorps anti-étiquette histidine (1, 3 et 5) et avec l’antipeptideO (2, 4 et 6). Une bande correspondant à la prot T est détectée avec les deux anticorps (1 et 2). Des bandes de même taille correspondant à la prot P (3 et 4) ainsi qu’à la prot I (5 et 6) sont aussi hybridées par ces mêmes anticorps sur les extraits protéiques correspondants. Les mêmes bandes sont donc détectées avec ces deux anticorps lorsque différentes formes de protéines recombinantes possédant une étiquette histidine sont utilisées. Fig. 5

[0030] [Fig. 5] montre des westerns blots effectués par hybridation d’extraits d’A. thaliana, traités ou non avec différents activateurs de défense, avec l’anticorps anti-NPR1 commercial (1, 3 et 5) ainsi que par l’antipepO (2, 4 et 6). Les défenses impliquant la voie du JA/Et sont activées à l’aide de Methyl-Jasmonate (Me-JA), celles impliquant la voie du SA sont activées à l’aide de SA. Afin d’obtenir un témoin négatif de l’activation des défenses, des plantes traitées à l’eau sont utilisées. Il est montré que la même bande est retrouvée quel que soit l’anticorps utilisé et ce que les défenses soit activées à l’aide de Me-JA (3 et 4) ou à l’aide de SA (5 et 6). Cette bande n’est pas retrouvée (ou avec une très faible intensité lorsque les plantes ont été traitées avec de l’eau (1 et 2). Ces différences d’intensités ne sont pas due à la quantité de protéines chargées comme le montre les profils protéiques correspondants (7 et 8) obtenus par coloration au bleu de Coomassie. Fig. 6

[0031] [Fig.6] représente deux westerns blots effectués par hybridation d’extraits d’A. thaliana dont les défenses ont été activées à l’aide de SA, avec les antipeptides 0 et 1 (antipepO et antipepl). La même bande est retrouvée à 37kDa (1 et 2) quel que soit l’antipeptide utilisé. Fig. 7

[0032] [Fig. 7] montre les westerns blots effectués par hybridation des éluats d’immunoprécipitation (IP) avec l’antipeptideO. Les anticorps utilisés lors de l’IP (antipepO et anticorps commercial (« commercial »)) sont décrochés lors de l’élution et sont donc détectés (1, 2 et 3). Ces anticorps ont permis d’immuno- précipiter la protéine de 37kDa lorsque des extraits d’A.thaliana dont les défenses ont été activées à l’aide de SA sont utilisés (4 et 6). L’antipepO est aussi capable d’immunoprécipiter la protP (5), par contre l’anticorps commercial ne le permet pas comme le montre l’absence de bande à la taille attendue (7).

Fig. 8 [0033] [Fig. 8] montre le niveau d’expression d’un gène marqueur des défenses (PR5) de différents échantillons mesuré en qPCR (1 , 2, 3 et 4) ainsi que l’intensité de la bande de 37kDa détectée en western blot sur ces mêmes échantillons (5, 6, 7 et 8). La quantité de protéines déposée n’explique pas la différence d’intensité de ces bandes comme le montre la coloration au bleu de Coomassie effectuée sur la membrane (9). Le niveau d’activation des défenses mesuré en qPCR est corrélé à l’intensité de la bande retrouvée en western blot.

Fig. 9

[0034] [Fig. 9] montre un western blot effectué par hybridation d’extraits de tomate, dont les défenses ont été stimulées ou non par pulvérisation de SA, de Me-JA ou d’eau, avec l’antipepO. Une bande est détectée autour de 40kDa avec une plus forte intensité sur les extraits de plantes traitées à l’aide de SA (2) et de Me-JA (3) que sur les plantes traitées à l’eau (1). La quantité de protéine déposée n’explique pas la différence d’intensité de ces bandes comme le montre la coloration au bleu de Coomassie effectuée sur la membrane (4).

Description détaillée

[0035] La présente invention concerne donc un anticorps anti-NPR1 caractérisé en ce que ledit anticorps se lie spécifiquement à la forme monomérique de la protéine NPR1.

[0036] NPR1

La protéine NPR1 (Non expressor of Pathogenesis Related protein 1), également connue sous le nom nim1 et sai1, est une protéine impliquée dans diverses voies de signalisation immunitaire, dans la résistance systémique acquise (SAR), impliquant la phytohormone acide salicylique (SA), la résistance systémique induite (ISR) impliquant le couple de phytohormones acide jasmonique/éthylène (JA/Et) ainsi que la résistance acquise locale (LAR).

[0037] NPR1 est présent en équilibre dynamique entre des oligomères de poids moléculaire élevé (liés par l'intermédiaire de ponts disulfures intermoléculaires), qui sont inactifs, et des monomères qui sont la forme active de la protéine. Le statut de la protéine est étroitement contrôlé par des modifications rédox dans les cellules végétales qui sont déclenchées par une agression extérieure telle la température, les rayonnements UV, une infection, un agent pathogène ou un traitement par une substance telle que l’acide salicylique (SA), ou le Methyl- Jasmonate (Me-Ja) ou le Bion®. NPR1 sous forme d’oligomère, i.e. sous forme inactive est séquestrée dans le cytosol. NPR1 passe d’un état d’oligomère à un état de monomère par réduction des ponts disulfures intermoléculaires. La protéine NPR1 sous forme de monomère, i.e., sous forme active, passe ensuite dans le noyau pour contrôler l’expression génique liée à la SAR (Mou et al., Inducers of Plant Systemic Acquired Résistance Regulate NPR1 Function through Redox Changes, Cell, Volume 113, Issue 7, 27 June 2003, pages 935-944).

[0038] Ainsi, les anticorps selon la présente invention se lient spécifiquement à la forme monomérique, i.e., à la forme active de NPR1.

[0039] Spécificité

Les anticorps anti-NPR1 reconnaissent et se lient spécifiquement à la forme monomérique de la protéine NPR1 plutôt que la forme oligomérique. Ainsi, au sens de la présente invention, on entend par « anticorps anti-NPR1 qui se lie spécifiquement à la forme monomérique de la protéine NPR1 » un anticorps qui présente une grande affinité pour sa molécule cible, i.e., pour la forme monomérique de la protéine NPR1.

[0040] Les termes « se lie spécifiquement » ou « reconnaît spécifiquement » sont ici utilisés pour indiquer que l’anticorps a la capacité de reconnaître et d’interagir avec la forme monomérique de NPR1, tout en ayant relativement peu d’interactions détectables avec la forme oligomérique de NPR1. L’anticorps se lie spécifiquement à la forme monomérique de NPR1 si son affinité est significativement plus élevée pour la forme monomérique de NPR1 que pour la forme oligomérique de NPR1, préférentiellement, l’anticorps anti-NPR1 selon la présente invention ne se lie pas à la forme oligomérique de NPR1.

[0041] Anticorps

Les termes «anticorps» et «immunoglobuline» sont équivalents et peuvent être utilisés de façon interchangeable. Un anticorps ou immunoglobuline est une glycoprotéine synthétisée en réponse à un antigène, capable de reconnaître et de fixer l’antigène responsable de sa production.

[0042] Ainsi, le terme « anticorps » désigne des immunoglobulines ou des parties immunologiquement actives d’immunoglobuline, c'est-à-dire des molécules qui contiennent un site de liaison à l’antigène qui se lie de manière immunospécifique audit antigène. En tant que tel, le terme anticorps englobe non seulement des molécules d'anticorps entières, mais également des fragments d'anticorps ainsi que des variants (y compris des dérivés) d'anticorps. Classiquement, les molécules d’immunoglobuline ont une structure de base faite de quatre chaînes polypeptidiques reliées entre elles par des ponts disulfures. Chaque chaîne légère est constituée d’environ 220 acides aminés et possède une masse moléculaire d’environ 25 kilodaltons (kDa). Chaque chaîne lourde est constituée d’environ 400 acides aminés et possède une masse moléculaire de 50 à 70 kDa. Pour chaque classe, ou sous classe d’immunoglobulines, les chaînes lourdes sont structurellement distinctes. Les chaînes lourdes comme les chaînes légères contiennent deux régions différentes. Les régions constantes (CL et CH) ont des séquences d’acides aminés qui ne varient pas de façon significative entre les anticorps d’une même classe. Les régions variables (VL et VH) des anticorps possèdent des séquences différentes. Repliées ensemble, les régions variables (VL et VH) forment le site de fixation de l’anticorps (Microbiology, L. Prescott 2002).

[0043] Selon un mode de réalisation, l’anticorps anti-NPR1 est un anticorps polyclonal.

[0044] Les anticorps polyclonaux présentent l'avantage d'être générés rapidement (par exemple en quelques semaines), plus facilement et à moindre coût par rapport aux anticorps monoclonaux. De plus, comme ils reconnaissent plusieurs épitopes, les anticorps polyclonaux ont généralement un spectre d'activité plus large que les anticorps monoclonaux.

[0045] Les anticorps polyclonaux sont de préférence des anticorps polyclonaux non humains. [0046] Les anticorps polyclonaux peuvent être choisis dans le groupe constitué des anticorps polyclonaux de lapin, des anticorps polyclonaux de souris, des anticorps polyclonaux de rat, des anticorps polyclonaux de cobaye, des anticorps polyclonaux de poulet, des anticorps polyclonaux de chèvre, des anticorps polyclonaux de vache, des anticorps polyclonaux de mouton et leurs combinaisons.

[0047] Préférentiellement, les anticorps polyclonaux sont des anticorps polyclonaux de lapin.

[0048] L’homme du métier pourra utiliser toute technique pour mettre au point des anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés spécifiquement contre la forme monomérique de la protéine NPR1, afin que lesdits anticorps se lient spécifiquement à un antigène de NPR1.

[0049] Antigène

Le terme « antigène » s’entend de toutes substances telles que des protéines, des nucléoprotéines, des polysaccharides, des peptides et certains glycolipides qui induisent une réaction immunitaire et qui réagissent avec les produits de ces réponses. Chaque antigène peut avoir plusieurs déterminants antigéniques ou épitopes. Les épitopes sont les régions de l’anticorps qui se lient au site de fixation de l’antigène sur un antigène spécifique (selon Microbiology, L. Prescott 2002). [0050] Les inventeurs de la présente invention ont avantageusement réalisé un alignement des séquences de la protéine NPR1 provenant de plusieurs espèces végétales (betterave, luzerne, coton, cacao, tomate, pomme de terre, ricin, piment, peuplier, tabac, patate douce, papaye, vigne, moutarde brune, colza, pommier...) ainsi que celle d’Arabidopsis thaliana [0051] Par cet alignement multiple, une séquence consensus, de SEQ ID NO : 1 a alors été identifiée.

[0052] De plus, la partie « cachée » de la protéine, correspondant à une partie inaccessible sous sa forme oligomérique inactive, a également été identifiée (entre la cystéine 82 et la cystéine 216 pour la séquence d’A. thaliana) par bio- informatique, permettant de générer une deuxième séquence consensus de SEQ ID NO : 6.

[0053] Des peptides dégénérés consensus fondés sur l’alignement des différentes protéines NPR1, correspondant aux parties conservées de la partie cachée de NPR1,des principales espèces de plantes d’intérêt agronomique ont alors été synthétisés.

[0054] Ces peptides ont ensuite été injectés chez le lapin afin de produire des anticorps ou antipeptides.

[0055] Ces peptides sont dits dégénérés car deux ou trois acides aminés de leur séquence sont variables, et consensus car les différentes séquences ainsi créées correspondent aux séquences de NPR1 conservées chez différentes espèces végétales. Ces peptides synthétiques ont ainsi servi d’antigène afin d’immuniser des lapins et de produire les anticorps ou antipeptides.

[0056] Le terme « antipeptides » pourra alternativement être utilisé. Il est en effet utilisé afin de préciser qu’il s’agit d’anticorps créés en utilisant des peptides dégénérés consensus. Ces antipeptides sont de type polyclonaux mais la stratégie mise en œuvre pourrait aussi bien être réalisée à l’aide des anticorps monoclonaux.

[0057] Ainsi, deux séquences peptidiques consensus ciblant la forme active de la protéine NPR1 chez différentes espèces végétales ont ainsi pu être proposées, respectivement SEC ID NO : 1 et SEC ID NO : 6.

[0058] La séquence consensus de SEC ID NO : 1 comprend deux acides aminés dégénérés (X1 et X2) :

His Val His Arg Cys X1 Leu Ser Ala Arg Ser X2 Phe Phe, X1 pouvant être soit une Valine (Val) soit une Isoleucine (Ile), et X2 pouvant être une Sérine (Ser) ou une Proline (Pro).

[0059] 4 peptides de SEC ID NO : 2, 3, 4 et 5 ont été générés sur la base du peptide consensus de SEC ID NO : 1 et tels que ci-après reproduit :

[0060] [Tableau 1]

[0061] La séquence consensus de SEQ ID NO : 6 comprend trois acides aminés dégénérés (X3 et X4 et X5) :

His Ala Leu Gin Leu Leu Ser Asn Ser X3 Glu Ser X4 X5

X3 pouvant être soit une Valine (Val) soit une Isoleucine (Ile), X4 pouvant être une Serine (Ser) ou une Proline (Pro) et X5 pouvant être une Serine (Ser) ou une Proline (Pro).

[0062] 8 peptides de SEQ ID NO : 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14 ont été générés sur la base du peptide consensus de SEQ ID NO : 6 et tels que ci-après reproduit :

[0063] [Tableau 2] [0064] Ainsi, la présente invention concerne également un anticorps anti-NPR1 caractérisé en ce que ledit anticorps se lie à au moins un épitope de la forme monomérique de NPR1, de séquence choisie parmi SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5. [0065] Selon un mode de réalisation, l’anticorps anti-NPR1 est caractérisé en ce que ledit anticorps se lie à au moins deux épitopes de la forme monomérique de NPR1 de séquence choisie parmi les SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5. [0066] Selon un mode de réalisation, l’anticorps anti-NPR1 est caractérisé en ce que ledit anticorps se lie à au moins trois épitopes de la forme monomérique de NPR1 de séquence choisie parmi les SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5.

[0067] Selon un mode de réalisation, l’anticorps anti-NPR1 se lie à un épitope de séquence consensus SEQ ID NO :1 où X1 est une valine ou une isoleucine et X2 est une sérine ou une proline.

[0068] Selon un mode de réalisation, l’anticorps anti-NPR1 se lie aux séquences SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, et SEQ ID NO : 5 de la forme monomérique de la protéine NPR1. [0069] La présente invention concerne également un anticorps anti-NPR1 caractérisé en ce que ledit anticorps se lie à au moins un épitope de la forme monomérique de NPR1 de séquence choisie parmi les SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14. [0070] Selon un mode de réalisation, l’anticorps anti-NPR1 est caractérisé en ce que ledit anticorps se lie à au moins deux épitopes de la forme monomérique de NPR1 de séquence choisie parmi les SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14. [0071] Selon un mode de réalisation, l’anticorps anti-NPR1 est caractérisé en ce que ledit anticorps se lie à au moins trois épitopes de la forme monomérique de NPR1 de séquence choisie parmi les SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14. [0072] Selon un mode de réalisation, l’anticorps anti-NPR1 est caractérisé en ce que ledit anticorps se lie à au moins quatre épitopes de la forme monomérique de NPR1 de séquence choisie parmi les SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14.

[0073] Selon un mode de réalisation, l’anticorps anti-NPR1 est caractérisé en ce que ledit anticorps se lie à au moins cinq épitopes de la forme monomérique de NPR1 de séquence choisie parmi les SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14.

[0074] Selon un mode de réalisation, l’anticorps anti-NPR1 est caractérisé en ce que ledit anticorps se lie à au moins six épitopes de la forme monomérique de NPR1 de séquence choisie parmi les SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14.

[0075] Selon un mode de réalisation, l’anticorps anti-NPR1 est caractérisé en ce que ledit anticorps se lie à au moins sept épitopes de la forme monomérique de NPR1 de séquence choisie parmi les SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14.

[0076] Selon un mode de réalisation, l’anticorps anti-NPR1 se lie à un épitope de séquence consensus SEQ ID NO :6 où X3 est une valine ou une isoleucine, X4 est une serine ou une proline et X5 est une sérine ou une proline.

[0077] Selon un mode de réalisation, l’anticorps anti-NPR1 se lie aux séquences SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14 de la forme monomérique de la protéine NPR1.

[0078] Les anticorps polyclonaux sont de préférence obtenus ou peuvent être obtenus à partir d’au moins un échantillon biologique d’un animal immunisé avec au moins un antigène comprenant de préférence ou consistant en au moins une séquence de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5 et/ou de SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO :

11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14.

[0079] Dans un mode de réalisation, les anticorps polyclonaux peuvent être obtenus par immunisation d’un animal non humain avec une composition antigénique comprenant un mélange d’antigènes de séquences SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4 et SEQ ID NO : 5 et/ou un mélange d’antigènes de séquences SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14.

[0080] On entend par « antipeptide 0 » ou « antipep 0 » un anticorps polyclonal non humain obtenu par immunisation d’un animal non humain avec une composition antigène comprenant un mélange de peptides de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4 et SEQ ID NO : 5.

[0081] On entend par « antipeptide 1 » ou « antipep 1» un anticorps polyclonal non humain obtenu par immunisation d’un animal non humain avec une composition antigène comprenant un mélange de peptides de SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO :

12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14.

[0082] Un autre objet de l’invention est un procédé de production d’anticorps polyclonaux tels que définis ci-dessus, dans lequel ledit procédé comprend les étapes consistant à :

- fournir un échantillon biologique provenant d’un animal immunisé avec au moins un antigène comprenant de préférence ou consistant en au moins une séquence de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5 et/ou de SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10 SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14 ;

- collecter ou purifier les anticorps polyclonaux dudit échantillon biologique.

[0083] Méthode de détection de l’activation des défenses d’une plante

[0084] La présente invention concerne également une méthode de détection de l’activation des défenses d’une plante comprenant la détection de la forme monomérique de la protéine NPR1 dans un échantillon de ladite plante, en utilisant un anticorps anti-NPR1 selon la présente invention.

[0085] On peut également quantifier la forme monomérique de la protéine NPR1 dans un échantillon de ladite plante, en utilisant un anticorps anti-NPR1 selon la présente invention.

[0086] Avantageusement, l’utilisation des anticorps anti-NPR1 spécifiques selon la présente invention permettent de cibler la forme active de la protéine NPR1 de différentes espèces de plantes afin de détecter les défenses mises en place par les plantes, et ce pour la majorité des plantes d’intérêt agronomique.

[0087] Par « activation des mécanismes de défense des plantes » on entend le développement d’un ensemble de modifications biologiques qui confèrent à cette plante i) une résistance immédiate, notamment LAR (résistance acquise locale), ii) la résistance systémique induite (ISR) et/ou SAR (résistance acquise systémique) et/ou iii) une pré-sensibilisation du type potentialisation grâce à laquelle elle devient capable de réagir plus efficacement à un stress ultérieur biotique ou abiotique. L’activation des mécanismes de défense des plantes s’entend également de l’état activé ou non-activé des différentes voies moléculaires impliquées dans les mécanismes de défenses naturelles et notamment selon la voie impliquant l’acide salicylique mais aussi celles impliquant l’acide jasmonique. L’activation des mécanismes de défense des plantes s’entend également de la résistance au stress, c’est-à-dire de la faculté d’une plante à faire face aux stress biotiques et/ou abiotiques.

[0088] Un stress biotique est causé par un organisme vivant. On pourra citer tout organisme nuisible portant atteinte à l’état de santé d’une plante. Ce sont tous les organismes vivants capables d’agresser une plante cultivée. Il s’agit notamment des ravageurs (insectes, nématodes, araignées), des agents responsables de maladies (champignons, oomycètes, bactéries, virus, viroïdes) et toutes les mauvaises herbes (adventices). On pourra citer également les animaux tels que les rongeurs ou les ruminants.

[0089] Un stress abiotique est causé par les conditions environnementales (hors organismes vivants) tels que la sécheresse, le froid, les rayons ultraviolets... (Guide méthodologique d’évaluation de l’efficacité des Stimulateurs des Défenses des Plantes (SDP).

[0090] Par « plante », on entend par exemple un végétal à quelque stade de développement que ce soit, notamment embryon ou tout autre stade plantule ou de la plante adulte.

[0091] A titre illustratif, les plantes sont choisies parmi les arbres fruitiers, les cultures maraîchères, la vigne, les céréales et les oléagineux, les protéagineux, les oléo-protéagineux, le tabac, les plantes appartenant à la famille des Brassicaceae et les plantes ornementales. [0092] De manière préférée, les plantes seront choisies parmi Arabidopsis thaliana, la betterave, la luzerne, le coton, le cacao, la tomate, la pomme de terre, le ricin, le piment, le peuplier, le tabac, la patate douce, la papaye, la vigne, la moutarde brune, le colza, le pommier, le blé, la fraise, le chou, la salade.

[0093] De manière encore plus préférée, la plante sera la vigne. [0094] On entend par « échantillon », tout échantillon permettant de détecter et quantifier la forme monomérique de NPR1. L’échantillon peut être obtenu à partir de la plante entière (par exemple une semence ou un jeune plant), d’une partie de la plante, ou d’une pluralité de plantes ou de parties de plantes, tel qu’un lot de plantes ou de feuilles. L’homme du métier sait comment obtenir de tels échantillons pour la détection et la quantification d’une protéine.

[0095] Par partie de la plante, on entend par exemple le pollen, les ovules, les embryons, les parties aériennes (tiges et feuilles), les feuilles, les anthères, les tiges, les pétioles, les racines, les fruits, les graines, les fleurs, les bourgeons, les protoplastes, les cals, les cellules et tissus cellulaires. [0096] Préférentiellement, les parties aériennes seront utilisées.

[0097] L’homme du métier connaît les méthodes pour détecter et/ou quantifier la forme monomérique de la protéine NPR1 au moyen d’un anticorps donné à partir d’un échantillon donné. Ainsi, tout moyen pour détecter et/ou quantifier la forme monomérique de NPR1 dans un échantillon peut être utilisé. [0098] Typiquement, la forme monomérique de la protéine NPR1 pourra être détectée et/ou quantifiée dans la méthode selon la présente invention par Western blot, un test ELISA (Enzyme Link ImmunoSorbent Assay) ou un test bandelette de type LFD (Latéral Flow Device ou Latéral Flow Immunchromatograhic Assay).

[0099] Selon un mode de réalisation, la détection de la forme monomérique de NPR1 par les anticorps spécifiques selon la présente invention ₌ pemnet d’identifier une plante présentant une induction de l’activation de ses mécanismes de défense.

[0100] Selon un mode de réalisation, la forme monomérique de NPR1 sera quantifiée. La quantification de la forme monomérique de NPR1 peut être exprimée en une unité arbitraire afin de refléter la quantité de la forme monomérique de la protéine NPR1 dans l’échantillon.

[0101] Selon un mode de réalisation, la valeur peut consister en la concentration de la forme monomérique de la protéine NPR1, mesurée par toute méthode de quantification des protéines connues par l’Flomme du métier, telle que par Western blot.

[0102] Selon un mode de réalisation, la méthode de détection/quantification de l’activation des défenses d’une plante pourra comprendre une étape supplémentaire de comparaison avec un échantillon référence, afin de déterminer ou quantifier l’état d’activation des défenses de ladite plante.

[0103] On entend par « échantillon référence » un échantillon obtenu à partir d’une plante ou de parties de plante dont l’état d’activation des défenses est connu. Ainsi, les échantillons de référence peuvent être issus de plantes ou de parties de plantes qui sont non traitées ou non-stressées, ou qui sont soumises préalablement à un SDP ou à un stress biotique ou abiotique.

[0104] On entend par « substance active capable d’activer les défenses d’une plante » ou « Stimulateur des Défenses des Plantes » ou « SDP » ou « stimulateurs des défenses naturelles » ou « SDN » toute substance ou tout microorganisme vivant non pathogène, qui appliqué sur une plante, est capable de promouvoir un état de résistance significativement plus élevé par rapport à une plante non traitée face à des stress biotiques voire abiotiques. Un SDP n’agit généralement pas directement sur les bioagresseurs, il est perçu par la plante comme un message d’alerte. Celle-ci va réagir en préparant ou en mettant en place différents mécanismes de défense, ce qui va concourir à la rendre plus résistante aux attaques de bioagresseurs. On peut ainsi considérer comme SDP, un produit efficace sur un couple plante-pathogène, ne présentant pas d’effet direct notable sur le pathogène à la dose efficace sur la plante, et capable d’induire dans ces conditions des marqueurs de défense connus (protéines PR, lipoxygénase, phénylalanine ammonia-lyase,...).

[0105] Des SDP sont par exemple décrits dans la demande WO2011/161388 et peuvent être classés selon deux principales familles : i) les composés dits « stimulateurs directes », qui entraînent, une fois appliqués sur la plante, une activation complète des réactions de défense, qu’il y ait ou non présence de pathogènes, et ii) les composés dits « potentialisateurs », qui déclenchent, après application sur la plante, uniquement le phénomène de « potentialisation » précité (les réactions de défense ne s’activant qu’à la suite d’une attaque par un agent pathogène ou un stress).

La plupart de ces produits SDP sont encore connus sous l’appellation de « éliciteurs » ou encore de « inducteurs de résistance ». [0106] Typiquement, les SDP homologués en France sont tels que ci-après décrits :

[0107] [tableau 3]

[0108] A titre illustratif, pour obtenir un échantillon de référence représentatif d’un stress biotique, on peut pulvériser du Bion® sur les plantes ou parties de plantes, pour obtenir un échantillon référence représentatif d’un stress bactérien.

[0109] A titre illustratif, pour obtenir un échantillon de référence représentatif de l’activation de la voie du SA, on peut appliquer de l’acide salicylique (SA) sur la plante ou partie de plante.

[0110] A titre illustratif, pour obtenir un échantillon de référence représentatif de l’activation de la voie acide jasmonique (JA), on peut appliquer du Methyl- Jasmonate sur la plante ou partie de plante. [0111] A titre illustratif, pour obtenir un échantillon de référence représentatif d’un stress abiotique, on peut exposer la plante ou partie de plante à des rayonnements UV, à la chaleur, au froid, ...

[0112] Pour obtenir un échantillon référence non traité, on peut pulvériser de l’eau sur les plantes ou parties de plantes. [0113] Pour obtenir un échantillon référence non stressé, on peut isoler la plante ou partie de plante dans un environnement préservé et contrôlé.

[0114] A titre illustratif, pour obtenir un échantillon référence représentatif d’un traitement avec un SDP, on peut appliquer un SDP sur la plante ou partie de plante. [0115] Typiquement, la détection de la forme monomérique de la protéine NPR1, sera significative de l’activation des défenses d’une plante.

[0116] Typiquement, une augmentation significative de la concentration de la forme monomérique de la protéine NPR1, en comparaison à un échantillon référence non stressé permet d’identifier une plante présentant une induction de l’activation de ses mécanismes de défense. [0117] Ainsi, et de manière générale, la méthode selon la présente invention permet de détecter et/ou mesurer l’activation des mécanismes de défense des plantes par la détection et/ou la quantification de la forme monomérique de la protéine NPR1. Typiquement, la méthode permettra de détecter/mesurer l’activation des mécanismes de défenses des plantes au champ avant traitement pour faciliter l’aide à la décision et le positionnement des SDP en fonction de la réactivité des plantes ciblées.

[0118] La méthode selon l’invention permet également de démontrer avantageusement l’activation des défenses suite à l’application d’un produit comme demandé dans le cadre de la méthode de la Commission des essais biologiques (CEB) sur les « principes généraux d’expérimentation des stimulateurs des défenses des plantes » (méthode générale MG14), nécessaire au processus d’homologation et réglementant la mise sur le marché du produit.

[0119] Avantageusement, cette technique immunologique de détection et de quantification peut être utilisée chez différentes espèces de plantes afin de pouvoir largement être mise en œuvre sur différentes cultures d’intérêt agronomique.

[0120] Méthode de criblage de SDP

La présente invention concerne également une méthode de criblage de substances actives capables d’activer les défenses d’une plante comprenant : a) le traitement d’un échantillon de ladite plante avec au moins une substance ; b) la détection dans ledit échantillon de la forme monomérique de la protéine NPR1 selon la méthode de détection selon la présente invention.

[0121] La présente invention concerne également une méthode de criblage de substances actives capables d’activer les défenses d’une plante comprenant a) le traitement d’un échantillon de ladite plante avec au moins une substance ; b) la quantification dans ledit échantillon de la forme monomérique de la protéine NPR1 selon la méthode de détection selon la présente invention.

[0122] Avantageusement, la présente méthode de criblage permet de cribler des molécules potentiellement SDP au laboratoire afin de permettre l’émergence de nouvelles substances actives à activité SDP. La détection et/ou quantification de la forme monomérique de NPR1 par les anticorps selon la présente invention va permettre de déterminer l’efficacité d’une molécule en tant que SDP.

[0123] Ainsi, il est possible de réaliser une discrimination entre i) les produits SDP qui activent effectivement les défenses des plantes, et ii) les produits qui sont dépourvus d’effet.

[0124] On entend par « substance », toute substance ou tout microorganisme vivant non pathogène, dont les propriétés de promotion d’un état de résistance significativement plus élevé par rapport à une plante non traitée face à des stress biotiques voire abiotiques ne sont pas connues. La méthode selon la présente invention permet ainsi de cribler tout composé actif ou composition active, biologique ou chimique.

[0125] A titre illustratif, la détection de la forme monomérique de la protéine NPR1 sera significative de l’efficacité de la substance testée, et permettra de classifier ladite substance en tant que SDP.

[0126] Selon un mode de réalisation, la méthode de criblage pourra comprendre une étape supplémentaire de comparaison avec un échantillon référence, de la forme monomérique de la protéine NPR1 selon la méthode de détection selon la présente invention.

[0127] Typiquement, la quantité de la forme monomérique de la protéine NPR1 de l’échantillon de plante pourra être comparée à la quantité de la forme monomérique de la protéine NPR1 de l’échantillon référence. Généralement, une augmentation significative de la quantité de la forme monomérique de la protéine NPR1 dans l’échantillon de plante par rapport à l’échantillon de référence est synonyme de l’efficacité de la substance en tant que SDP et pourra permettre de la classifier ladite substance en tant que SDP, tandis que l’absence de variation significative peut être synonyme d’absence d’efficacité en tant que SDP.

[0128] Méthode d’évaluation de la sensibilité d’une plante à un SDP

[0129] L’invention concerne également une méthode d’évaluation de la sensibilité d’une plante à une molécule capable de stimuler les défenses d’une plante comprenant : a) le traitement d’un échantillon de ladite plante avec une molécule capable de stimuler les défenses des plantes ; b) la détection dans ledit échantillon de la forme monomérique de la protéine NPR1 selon la présente invention.

[0130] L’invention concerne également une méthode d’évaluation de la sensibilité d’une plante à une molécule capable de stimuler les défenses d’une plante comprenant : a) le traitement d’un échantillon de ladite plante avec une molécule capable de stimuler les défenses des plantes ; b) la quantification dans ledit échantillon de la forme monomérique de la protéine NPR1 selon la présente invention.

[0131] Typiquement, la détection de la forme monomérique de la protéine NPR1 permettra de conclure sur la sensibilité de la plante à la molécule capable de stimuler les défenses d’une plante.

[0132] Selon un mode de réalisation, la méthode d’évaluation de la sensibilité d’une plante à une molécule capable de stimuler les défenses d’une plante pourra comprendre une étape supplémentaire de comparaison avec un échantillon référence, afin de déterminer ou évaluer l’état d’activation de ladite plante à partir de la concentration de la forme monomérique de NPR1 obtenue à l’étape de quantification.

[0133] Typiquement, la quantité de la forme monomérique de la protéine NPR1 de l’échantillon de plante pourra être comparée à la quantité de la forme monomérique de la protéine NPR1 de l’échantillon référence. Généralement, une augmentation significative de la quantité de la forme monomérique de la protéine NPR1 dans l’échantillon de plante par rapport à l’échantillon de référence est synonyme de sensibilité de la plante à la molécule capable de stimuler les défenses d’une plante.

[0134] La présente méthode d’évaluation permet ainsi et avantageusement, de sélectionner des variétés hautement réceptives aux SDP, dans le cadre de la sélection variétale ou bien d’optimiser les couples variétés de plantes/SDP. [0135] Méthode de sélection d’une plante présentant une résistance améliorée

La présente invention a également trait à une méthode pour sélectionner une plante présentant un état d’activation des défenses susceptible de lui conférer une résistance améliorée à au moins un stress biotique et/ou abiotique comprenant : i) l’application dudit ou desdits stress à un échantillon de ladite plante, ii) la détection dans ledit échantillon de la forme monomérique de la protéine NPR1 selon la méthode de détection de la présente invention.

[0136] La présente invention a également trait à une méthode pour sélectionner une plante présentant un état d’activation des défenses susceptible de lui conférer une résistance améliorée à au moins un stress biotique et/ou abiotique comprenant : i) l’application dudit ou desdits stress à un échantillon de ladite plante, ii) la quantification dans ledit échantillon de la forme monomérique de la protéine NPR1 selon la méthode de détection de la présente invention.

[0137] Typiquement, la détection de la forme monomérique de la protéine NPR1 dans l’échantillon de plante sera synonyme d’une résistance améliorée à au moins un stress biotique et/ou abiotique et permettra de sélectionner la plante pour ses propriétés d’activation des défenses améliorées.

[0138] La méthode de sélection pourra comprendre en outre une étape de comparaison avec un échantillon de référence pour déterminer ou évaluer l’état de stimulation des défenses naturelles de la plante afin de sélectionner ladite plante si la plante possède un état d’activation des défenses susceptible de lui conférer une résistance améliorée à au moins un stress biotique ou abiotique.

[0139] Typiquement, une concentration significativement augmentée de la forme monomérique de la protéine NPR1, en comparaison avec un échantillon de référence non soumises à un stress et/ou un SDP permet d’identifier les plantes ou parties de plantes présentant un état d’activation des défenses et une résistance améliorée.

[0140] Kit pour la mise en œuyre des méthodes selon l’invention

La présente invention concerne également un kit pour la mise en œuvre des méthodes de détection, criblage et activation selon la présente invention comprenant un anticorps anti-NPR1 selon l’invention.

Exemples

[0141] Matériels et Méthodes

[0142] Dans les exemples qui suivent, les matériels et méthodes ci-après détaillés ont été utilisés.

[0143] Immunisation

La production des peptides dégénérés consensus et des anticorps selon la présente invention a été effectuée par l’entreprise GENEPEP. Pour cela ils ont, en premier lieu, synthétisé les deux peptides (pepO) et (pep1) tel que représenté à la Figure 1 sur la base des deux séquences consensus de SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 6. Les peptides de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14, ont été utilisés comme agent immunogène afin d’induire une réaction immunitaire dirigée contre ces peptides chez le lapin. Pour cela les peptides de séquences ci-avant définies ont été injectés dans 2 lapins chacun et ce à 5 reprises au cours de la vie des lapins. La totalité de leur sang a ensuite été prélevée afin d’en extraire le sérum contenant les anticorps reconnaissant les peptides injectés.

[0144] Purification et concentration des anticorps anti-NPR1 Le sérum de lapin obtenu est utilisé pour purifier les antipeptides (antipeptide 0 ou antipepO et antipeptide 1 ou antipepl) spécifiques de la forme active de NPR1, suivant la méthode suivante :

50mI de solution d’un mélange de peptides de séquence SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5 à 0.5mg/ml est déposé sur une membrane pour purifier l’antipeptideO et un mélange de peptide de séquence SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14, à 0.5mg/ml est déposé sur une autre membrane pour purifier l’antipeptidel . Pour chaque mélange de peptides, la membrane est une membrane de Polyvinylidene difluoride (PVFD) de 1.5 x5cm préalablement activée 10min dans l’éthanol absolu puis séchée. Cette membrane est ensuite transférée dans un tube à hémolyse puis saturée à l’aide de 1ml de tampon phosphate tween 0,1% (PBST) + 5% lait (lait en poudre Régilait® écrémé) en agitation durant 1h à 4°C. Un millilitre de sérum correspondant y est ajouté avant incubation en agitation sur la nuit à 4°C. La membrane est alors lavée 4 fois avec 2ml de PBST en agitation 15min à 4°C. Les antipeptides sont ensuite élués par choc acide (1ml de 50mM glycine, 500mM NaCI, 0.1%Tween 20, 1% BSA, pH 3) durant 1min en agitation à 4°C. L’éluat de 1ml est récupéré et neutralisé avec 100mI de Tris Base 1M. Cette élution est répétée 5 fois, et les éluats 2 et 3 (les plus concentrés en antipeptide) sont récupérés pour être concentrés.

Cette opération est effectuée sur 10 membranes en parallèle et chaque membrane est utilisée 2 fois. 10ml de solution d’antipeptides sont donc obtenus pour les deux éluats d’intérêt. Deux fois 4 ml de chaque solution sont concentrés par ultrafiltration à l’aide du système d’ultrafiltration amicon 10kDa (10 000 rpm, 10min, 4°C) Entre 500 et 600mI de solution d’antipeptide concentrés sont ainsi produits pour chaque éluat.

[0145] Extraction des protéines de plantes a) Extraction des protéines d’A. thaliana

Des plantes d’A. thaliana sont cultivées en terre durant 3 semaines en chambre de culture jour long (18h de lumières 60% d’hygrométrie, 21 °C le jour et 19°C la nuit) puis sont pulvérisées avec de l’eau (témoin négatif) du Bion® 0.015% ou de l’Acide salicylique (SA) 1mM (témoin d’activation de la voie du SA) ou bien à l’aide de Methyl-Jasmonate (Me-JA) 0.1 mM dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) 0.1% (témoin d’activation de la voie Acide Jasmonique (JA)). Les parties aériennes des plantes sont alors récoltées 48h après pulvérisation et broyées dans l’azote liquide. Les protéines totales de ces plantes sont alors extraites à raison de 1 mI de tampon d’extraction (Tris-HCI pH 7,5 50mM, NaCI 150mM, MgCI 10mM, EDTA 5mM, glycerol 10% lodoacétamide 4%, antiprotéase 1X (cOmpleteTM, Mini, EDTA-free Protease inhibitor Cocktail, ROCHE)) par mg de poudre congelée. Les échantillons sont décongelés dans le tampon en vortexant régulièrement puis centrifugés (10min, 14000g, 4°C). Le surnageant est de nouveau centrifugé dans les mêmes conditions. Les surnageants finaux sont récupérés et constituent les extraits protéiques de plante utilisés pour les différentes expérimentations b) Extraction des protéines d’autre plantes

Des plantes de tomate ont été cultivées en serre durant 4 semaines avant d’être pulvérisées avec du SA, du Me-JA ou de l’eau afin d’activer ou non leurs défenses. Les parties aériennes de ces plantes sont récoltées 48h après puis réduites en poudre dans l’azote liquide et utilisées pour en extraire les protéines.

Les protéines totales de ces plantes sont alors extraites à raison de 2mI de tampon d’extraction (Tris-Hcl pH7.550mM, NaCI 150mM, EDTA 0.5mM, Triton X1000.1%, nP40 0.2% antiprotéase 1X (cOmpleteTM, Mini, EDTA-free Protease inhibitor Cocktail, ROCHE)) par mg de poudre. Les échantillons sont resuspendus dans le tampon en vortexant régulièrement puis centrifugés (10min, 14 000g, 4°C). Le surnageant est de nouveau centrifugé dans les mêmes conditions. Les surnageants finaux sont récupérés et constituent les extraits protéiques de plante utilisés pour les différentes expérimentations.

[0146] Westerns blots (WB)

Des gels de SDS page à 10% d’acrylamides sont utilisés pour la migration des extraits protéiques. 30mI d’extrait de plante ou 25mI d’éluat d’immunoprécipitation sont incubés dan 15mI de Laemmli 2X 10min à 65°C en agitation puis déposés par puits. Les gels sont alors mis à migrer dans du tampon RB1X en voltage constant (100mV). Les protéines ayant été soumises à l’électrophorèse, sont alors transférées sur membranes de PVFD préalablement activées 10min dans l’éthanol absolu, à l’aide du trans-blot® turbo™ transfer System de Bio-rad. Les membranes sont alors rincées 3 fois dans du tampon Phosphate salin + 1% Tween (PBST) puis saturées en protéine de lait dans du PBST + lait 5% (1h en agitation 40rpm, température ambiante). Elles sont alors incubées pendant la durée de la nuit dans du PBST+ 5% lait sur la nuit à 4% en présence de l’anticorps primaire (1/5 000°). Les membranes sont alors lavées dans du PBST (4 x 10min + 1x 1 h, 40rpm, température ambiante) puis incubées avec l’anticorps secondaire (anti-rabbit HRP de sigma, 1/10000, 1h 40rpm température ambiante). Elles sont alors de nouveau lavées dans du PBST (4 x 10min + 1x 1 h, 40rpm, température ambiante) avant d’être séchées 2min sur papier absorbant. Les protéines hybridées par l’anticorps primaire sont alors détectées par chimioluminescence à l’aide du LAS 4000 (Fujifilm) et du substrat Amersham ECL™ Prime (luminol + peroxyde) de chez GE Healthcare.

Les membranes sont ensuite colorées à l’aide de bleu de Coomassie durant 1h à température ambiante en agitation à 35rpm. Les profils protéiques sont alors révélés en décolorant les membranes à l’aide d’une solution de décoloration d’acide acétique 10% et éthanol 10% pendant la nuit à température ambiante en agitation à 35rpm.

[0147] Immunoprécipitation (IP)

Des billes magnétiques couplées à des protéines A (Dynabeads™ Protein A, ThermoFisher n°10001D) sont utilisées afin d’effectuer une immunoprécipitation (IP) des protéines d’A. thaliana ou de protéines recombinantes à l’aide de l’antipeptide ou d’un anticorps commercial ciblant NPR1 uniquement chez cette espèce végétale (Agrisera n° AS12 1854).

Des billes sont préparées pour chaque IP. Pour cela, 4 aliquotes de 100mI de solution de billes sont déposés dans des tubes eppendorf 1,5ml puis placés sur portoir magnétique durant 2min. Le surnageant est jeté et les billes sont lavées 2 fois avec 500ml de PBST. Les tubes sont de nouveau placés sur le portoir magnétique pendant 2min, le surnageant est enlevé puis 90mI de PBST y sont déposés. Six microlitres d’anticorps commercial (6pg) et 0.5mI d’antipeptide (25pg) sont ajoutés par tube (qsp 100mI PBST) puis le tout est incubé 1h30 à température ambiante en agitation sur roue. Le surnageant est enlevé et les billes couplées aux anticorps sont lavées 3 fois avec 500mI de PBST en agitation (5min) sur roue. Le tout est ensuite repris dans 100mI de PBST. Les anticorps sont ensuite liés de manière covalente aux protéines A des billes en les lavant 2 fois 10min en agitation avec 1ml de tampon de crosslink (200mM triethanolamine pH 8,2). Les tubes sont de nouveau placés sur le support magnétique (2min) puis le surnagent est retiré. Un millilitre de tampon de cross-link + DMP (200mM triethanolamine pH 8,2 + dimethyl pimelimidate dihydrochloride 20mM) est ajouté par tube puis les tubes sont incubés 30min en agitation à température ambiante. La réaction de liaison covalente est stoppée en enlevant le surnageant (sur portoir magnétique), en ajoutant 1ml de Tris-HCI 50mM pH 7,5 (incubation 15min à TA en agitation sur roue) puis en lavant 3 fois 5min avec 500mI de PBST. Les billes liées de manière covalente aux anticorps sont alors reprises dans 10OmI de PBST et conservées à 4°C pour les IP.

Les tubes sont placés sur le portoir magnétique pour retirer le surnageant, 800mI de protéines totales d‘A. thaliana traitées au SA ou 150mI de protéine recombinante (1 pg pour chaque) sont déposés dans les 4 tubes contenant des billes magnétiques liées soit à l’anticorps commercial soit à l’antipeptide. Les 4 tubes sont incubés pendant la nuit à 4°C sur roue pour hybrider la, ou les, protéines reconnues par les anticorps à ceux-ci. Les billes couplées aux anticorps eux même hybridés aux protéines sont lavées 5 fois 5 min avec 500mI de PBST. Les protéines reconnues par les anticorps sont alors éluées à l’aide de 50mI laemmli + dithiothréitol (DTT) 100mM une première fois 15min à température ambiante (éluat 1) puis une deuxième fois toujours à l’aide de laemmli +DTT 100mM mais pendant 1h à 95°C (éluat2). Ces différent éluats sont ensuite utilisés en WB et SDSpage.

[0148] Production de protéines recombinantes Clonage

La phase codante de la protéine NPR1 d’A.thaliana, ainsi que des sous parties de celle-ci, ont été clonées dans la bactérie E. Coli par la technique de clonage Gateway®. Trois différentes constructions ont ainsi été effectuées. La première permet de produire la protéine NPR1 entière ou totale (prot T) soit une protéine de 560 acides aminés. La seconde permet de produire une protéine partielle (prot P) correspond aux 260 acides aminés en Nter de NPR1. La troisième permet de produire uniquement la parte inaccessible de NPR1 sous sa forme inactive soit les 140 acides aminés situés entre la cystéine 82 et la cystéine 216 de NPR1 (appelée prot I pour protéine d’intérêt) et ce tel que représenté à la Figure 2.

[0149] Des PCR ont été effectuées en utilisant comme matrice les ADNc d’A. thaliana à l’aide des amorces classiques et connues de l’homme du métier. Ces amorces permettent d’amplifier les séquences d’ADN codant pour les trois protéines suscitées en y intégrant en 5’ une séquence TEV permettant le clivage des protéines par la protéase TEV. Les séquences attB1 et attB2 ont aussi été ajoutées aux amorces afin de les intégrer respectivement en 5’ et en 3’ des produits de PCR afin de les assembler dans le vecteur pDONR207 par réaction de BP dans le cadre du clonage par la technique Gateway®. Les clones obtenus ont été validés par séquençage (GATC biotech) puis utilisés pour purifier les plasmides donneurs (pDONR207 + constructions) pour la suite du clonage. Les plasmides donneurs ont ensuite été utilisés pour la réaction de recombinaison (étape LR du protocole Gateway®) avec les plasmides d’expression (PetG10-A) permettant de rajouter une séquence codant pour une étiquette histidine en 5’ des différentes séquences d’intérêt et de traduire ces séquences en protéine de manière inductible (par ajout d’Isopropyl b-D-l-thiogalactopyranoside (IPTG)). Les plasmides d’expression obtenus ont ensuite été clonés dans la bactérie E. coli dH5a afin de les multiplier et de les purifier puis ils ont été clonés dans E. coli Rosetta afin de produire les protéines avec leur étiquette histidine.

Une séquence représentant la protéine NPR1 d’A. thaliana entière (Pro T) incluant en Nterminal une étiquette histidine suivit des acides aminés correspondant à la séquence attB1 nécessaire au clonage avec la méthode Gateway® ainsi que la séquence de clivage de la TEV protéase pour l’obtention de la protéine NPR1 entière ou totale (prot T).

[0150] Une séquence représentant la séquence de la protéine NPR1 d’A. thaliana partielle (Pro P) incluant en Nterminal une étiquette histidine suivit des acides aminés correspondant à la séquence attB1 nécessaire au clonage avec la méthode Gateway® ainsi que la séquence de clivage de la TEV protéase pour l’obtention de la protéine NPR1 partielle (prot P).

[0151] Une séquence représentant la séquence de la partie inaccessible sous la forme inactive de la protéine NPR1 d’A. thaliana partielle (Pro I) incluant en Nterminal une étiquette histidine suivit des acides aminés correspondant à la séquence attB1 nécessaire au clonage avec la méthode Gateway® ainsi que la séquence de clivage de la TEV protéase pour l’obtention de la protéine NPR1 d’intérêt (prot I). b) Production des protéines

Les différentes bactéries possédant les constructions d’intérêt ont été cultivées dans 2I de bouillon lysogène + Ampicilline 100pg/nnl + Chloramphénicol 34pg/ml, jusqu’à avoir une densité optique de 0,6 à 600nm, à 37°C. La production de protéine est alors déclenchée par ajout d’IPTG (0,5mM pour T et P et 1 mM pour I). Les bactéries sont prélevées 3h plus tard pour T et P et 4h plus tard pour I. Les cultures sont séparées en 6 fois 40ml chacune et centrifugées (12000g 15min à 4°C). Les culots sont congelés dans l’azote liquide pour les étapes suivantes.

Les culots sont re-suspendus dans un tampon de lyse dénaturant car les protéines recombinantes sont dans des corps d’inclusion (NaH2P04 100mM, tris 10mM pH8, NaCI 250mM, urée 8M, DTT 1 mM, imidazole 250mM, antiprotéase 1X (cOmpleteTM, Mini, EDTA-free Protease inhibitor Cocktail, ROCHE)) puis lysés par sonication (12 puises de 20 s à 50% d'amplitude entrecoupés de pause de 30 sec, sur glace 2°). Les extraits sont ensuite centrifugés (20 000g, 15min 4°C) pour culotter les débris cellulaires. Les surnageants sont récupérés et utilisés pour les différentes expérimentations comme protéine recombinante.

[0152] Analyse de l’expression de gènes par q-RT-PCR

Des plantes d’A. thaliana sont cultivées en terre durant 3 semaines en chambre de culture jour long puis sont pulvérisées avec de l’eau (témoin négatif) du Bion® 0.015% (témoin d’activation de la voie du SA). Les parties aériennes des plantes sont alors récoltées 48h après pulvérisation et broyées dans l’azote liquide.

Les ARNs sont ensuite extraits au trizol puis sont dosés afin de partir de 1 pg d’ARN pour les étapes de DNase et RT. L’ADN présent dans les échantillons est dégradé à l’aide de DNase (1 pg d’ARN, 1 pl de tampon 10X avec du MgCI2, 1 pl de DNase, complétés à 10pl avec de l’eau DEPC). Le tout est incubé 45 min à 37°C dans un bain Marie puis 1 pl d’EDTA à 50mM est rajouté avant incubation 10min à 65°C toujours dans un bain Marie afin d’inactiver la DNase. Ces ARNs traités à la DNase sont alors utilisés pour l’étape de rétro-transcription (RT). Cinq microlitres d’ARN sont incubés à 65°C pendant 5 min dans un bain Marie avec 1 pl d’amorces et 6.5pl d’eau traitée avec du diéthyl pyrocarbonate (DEPC). Puis 4pl de tampon de RT 5X, 0.5pl de Ribolock, 2pl de dNTPs à 10mM et 1 pl de transcriptase inverse M-MuLV sont ajoutés par tube avant incubation 1 h à 37°C dans un bain marie. La transcriptase inverse est ensuite inactivée durant 10min à 70°C. Les ADNc ainsi obtenus sont alors dilués par 10 (ajout de 180pl d’eau) pour être utilisés lors de l’étape de PCR quantitative. La réaction de qPCR se fait dans 10mI, à raison de 5mI de mix SybrGreen, 0.3mI de mélange d’amorces à 0.3mM, 2.4mI d’eau et 2.5mI d’ADNc.

Les qPCRs sont effectuées à l’aide d’un thermocycleur CFX-96 Real Time PCR System de chez Bio-Rad. Les données brutes obtenues sont traitées à l’aide du logiciel Bio-Rad CFX manager. La quantité de transcrits normalisée est ensuite obtenue en effectuant le rapport entre les données obtenues pour les gènes de défense d’intérêt et pour le gène constitutif utilisé (ici le gène codant pour la clathrine) en tenant compte de l’efficacité des amorces obtenues à l’aide de la gamme de dilution et de leur quantité exprimée en unité arbitraire

[0153] Exemple 1 : Détection de la forme active de NPR1 par les anticorps anti-NPR1 selon la présente invention

[0154] L’objectif du présent exemple est de montrer que les anticorps selon la présente invention, permettent de détecter une forme active de NPR1. Des western blots ont donc été réalisés à partir d’extraits d’A. Thaliana traitées avec du Bion®, du SA, ou de l’eau. Dans les western blots effectués avec ces extraits de plantes, une bande est détectée lorsque les plantes sont traitées par des activateurs de défense et n’est pas détectée lorsque les plantes sont traitées avec de l’eau. Cette bande est détectée à une taille de 37 kDa, et ce tel que représenté à la Figure 3.

[0155] Afin de montrer que la bande détectée correspond bien à la protéine NPR1, un séquençage a été effectué sur des bandes découpées sur un gel d’acrylamide réalisé en parallèle avec un Western blot, par séquençage peptidique effectuée par la plateforme PAPPSO (UMR MICALIS, PAPPSO, bâtiment 526, Domaine de Vilvert 78352, Jouy en Josas cedex). Entre 100 et 160 protéines sont alors identifiées au niveau de la bande détectée par Western blot dont la protéine NPR1 . NPR1 est donc bien présente au niveau de la bande détectée par Western blot (à la taille de 37 kDa).

[0156] De plus, des Western blots ont été effectués avec les mêmes extraits de plante en utilisant en parallèle l’antipeptide 0 (antipep 0) ainsi qu’anticorps commercial ciblant NPR1 uniquement chez A. thaliana (Agrisera n° AS12 1854). Une bande à la même taille que la bande observée en Western blot en utilisant les anticorps développés dans cette invention est détectée, lorsque l’anticorps commercial est utilisé, et ce tel que représenté à la Figure 5.

[0157] Afin de montrer que l’antipeptide développé est capable de s’hybrider à la protéine NPR1, les différentes formes de NPR1 recombinantes produites chez E.coli (incluant la partie active ciblée de la protéine) sont utilisées afin d’effectuer des westerns blots avec l’antipeptide (antipep 0) ou avec un anticorps spécifique de l’étiquette Histidine (His) utilisé chez ces mêmes protéines recombinantes (His- tag). Ces différentes formes de la protéine sont toutes les trois détectées avec chacun des anticorps, et ce à leur taille attendue (voir Figure 4).

[0158] De plus, les deux antipeptides (antipep 0 et antipepl) permettent de détecter une bande à la même taille en western blot sur des extraits protéiques d’A. thaliana élicités par un SDP, le SA, et ce tel que démontré sur la Figure 6.

[0159] Ainsi, et avantageusement, les anticorps selon la présente invention, permettent de détecter spécifiquement la forme active de la protéine NPR1, contrairement à l’anticorps commercial anti-NPR1 qui ne permet pas de discriminer la forme active de la forme inactive de NPR1. L’anticorps anti-NPR1 ne permet ainsi pas de déterminer si les mécanismes de défense des plantes sont activés, puisqu’il détecte indistinctement la forme active et la forme inactive de NPR1 .

[0160] De plus, l’immunisation avec différents peptides synthétiques, basés sur deux peptides dégénérés consensus différents, correspondants à des séquences consensus inter-espèces de NPR1 permet d’obtenir différents antipeptides détectant la même bande. De manière très avantageuse, ces anticorps permettent de cibler la forme active de NPR1 chez différentes espèces végétales, et ce contrairement à l’anticorps commercial anti-NPR1 qui ne cible que la protéine NPR1 d’A. thaliana.

[0161] Exemple 2 : Présence de la forme active de NPR1 lors de l’activation de différentes voies de défense

[0162] Afin de montrer que cette forme active de NPR1 est présente dans le deux voies hormonales de défense activées (voie impliquant le SA ou impliquant le couple JA/Et), des western blots ont été effectuées en utilisant des plantes d’A.thaliana traitées avec du SA, du Me-JA, ou de l’eau. La bande observée à 37kDa en western blot à l’aide des anticorps produits (antipepO) est détectée que l’on active les défenses à l’aide de SA ou à l’aide de Me-JA, et ce tel que représenté à la Figure 5. Ces résultats sont cohérents avec la littérature scientifique qui met en évidence l’implication de la protéine NPR1 dans les deux voies systémiques de défense des plantes que sont la résistance systémique acquise (SAR) et induite (ISR) (Pieterse et al. 1998).

[0163] Le même type de résultat est obtenu lorsque des extraits de tomates sont utilisés à la place des extraits d’A. thaliana et ce tel que représenté à la Figure 9.

[0164] Exemple 3 : Sensibilité de la méthode et avantage par rapport à l’anticorps commercial.

[0165] L’antipeptide 0 ainsi que l’anticorps commercial ont été utilisés pour effectuer une immunoprécipitation (IP) (Dynabeads™ Protein A, ThermoFisher n°10001D) sur extrait de protéines d’A. thaliana traitées à l’aide de SA. La bande de 37 kDa est observée sur l’électrophorèse de l’éluat d’IP obtenu avec des extraits de plante dont les défenses ont été activées Figure7.

[0166] Ces anticorps ont aussi été utilisés pour immunoprécipiter la protéine recombinante P de taille connue. Cette protéine est détectée en Western-blot sur l’éluât d’IP obtenu avec l’antipeptideO, mais pas avec celui obtenu en utilisant l’anticorps commercial, et ce tel que représenté à la Figure 7.

[0167] Ainsi, et avantageusement, les anticorps selon la présente invention présentent une sensibilité améliorée par rapport à un anticorps anti-NPR1 commercial et permettent de détecter NPR1 quand l’anticorps commercial ne le détecte pas.

[0168] Exemple 4 : Quantification de l’activation des défenses de plantes par l’anticorps selon la présente invention

[0169] Afin de montrer que les antipeptides peuvent permettre une quantification relative de l’activation des défenses, des extraits d’A. thaliana, connus pour avoir un niveau d’activation des défenses différentes (observé en qPCR sur des gènes rapporteurs des différentes voies de défense), ont été utilisés en western blot (WB). L’intensité de la bande détectée est corrélée avec le niveau d’activation des défenses observé en qPCR, et ce tel que représenté à la Figure 8.

[0170] Ainsi et avantageusement, la méthode selon la présente invention permet non seulement de détecter l’activation des défenses des plantes mais également de quantifier le niveau d’activation des défenses des plantes.

[0171] Exemple 5 : Détection de l’activation des défenses chez différentes espèces végétales par les anticorps selon la présente invention

[0172] Pour montrer que la stratégie d’utiliser des peptides dégénérés peut permettre d’obtenir des anticorps capables de détecter l’activation des défenses chez différentes espèces végétales, de extraits protéiques de plantes de tomates traitées avec du SA, du Me-JA ou de l’eau ont été analysés en western blot.

[0173] Une bande détectée se révèle beaucoup plus intense lorsque l’extrait protéique utilisé provient de plants de tomate traitées avec du SA ou du Me-JA comparé à l’extrait protéique issu du lot de plantes témoin traitées à l’eau et ce tel que représenté à la Figure 9.

[0174] Avantageusement, l’utilisation des anticorps anti-NPR1 spécifiques selon la présente invention permettent de cibler la forme active de la protéine NPR1 de différentes espèces de plantes et permettent de plus de détecter les défenses des plantes mises en place selon la voie impliquant l’acide salicylique mais aussi celles impliquant la voie du JA/Et..