技术领域

本发明涉及酶、 微生物或者核酸分子的检测领域。 具体地说， 本发明涉及可用于细胞迁 移、 细胞增值、 细胞分化、 细胞凋亡等功能基因筛选的核酸芯片、 其制备方法及用途。

背景技术

鍾干扰 ( RNA interfering, RNAi ) 是由双链 RNA ( double-stranded RNA, dsRNA) 诱 发引起同源 mRNA高效特异性降解的现象，是生物界一种古� �而且进化上高度保守的基因表达 调控机制。 1998年研究者发现在 C. We a/^或果蝇中注入 dsRNA可特异性抑制基因表达， 并 将这种由 dsRNA引发的抑制特定基因表达的现象成为 RNAi。 随后 RNAi的基础研究和应用迅 速成为生命科学的热点领域之一。 RNAi研究取得了突破性进展，被 iLScience、杂志评为 2001 年的十大科学进展之一， 并名列 2002年十大科学进展之首。 两位科学家也因此获得了 2006 年诺贝尔生理或医学奖。 由于使用 RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表� �， 所以该 技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病 及恶性肿瘤的基因治疗领域。

RNA干扰技术沉默基因具备简单、 高效、 快速等特点。 根据实验的要求， 实现特定基因 的沉默， 可以使用化学合成的 siRNA, 也可以使用 esiRNA, 或者 shRNA表达质粒， 或者表达 shRNA 的病毒等不同形式核酸分子。 因为绝大多数模式生物和人的全基因组序列完 全已知， 所以针对每一条基因， 都可以方便地合成几条对应的 siRNA或构建几个对应的 shRNA质粒。 近年来， 有不同规模和形式的 siRNA文库已建立起来。 Dharmacon, Arab ion以及 Sigma等公 司甚至提供人、 小鼠等生物的全基因组 siRNA文库， 这使得大规模使用 RNA干扰技术成为现 实。近年来， 利用 siRNA文库在全基因组筛选功能基因已经取得一� ��令人瞩目的结果。但是， 由于其昂贵的筛选成本和繁琐的操作过程， 大大限制了 RNA干扰技术的进一步推广和应用。

在研究如何降低 siRNA生产成本的同时， 科学家和企业家也致力于开发新的方法来降低 siRNA文库的使用成本。 例如， 几个课题组最近开发一种所谓的反向转染技术 （Wheeler, D. et al. Nature Genetics Supplement, 2005； Bai ley, S. et al. Nature Methods, 2006； Erf le. H. et al. Nature Protocols, 2007)。 简单讲， 这种方法就是将化学合成的 siRNA, 或者将 shRNA质粒， 或者将表达 shRNA的病毒通过点样的方式固定在玻片表面， 形成一个点阵列， 然后直接在玻片表面上铺长细胞。 由于阵列中每个 siRNA或者 shRNA只能特异地转染到一定 区域的细胞内， 不会形成相互污染。 这样使得在一个 10 厘米见方的玻璃片上制备出上千个 siRNA 点阵， 能同时进行研究， 因此大大降低地研究成本。 这些方法同样具有很多缺点。 比 如， 细胞在玻片或硅片上长成一片， 很难区分或辨别 siRNA的点阵位置， 对后期采集分析信 号造成极大的困难； siRNA 点阵之间的细胞也会对相邻点阵中的细胞造成 一定影响； 而且， 对一些细胞现象如迁移不适用。

发明内容

本发明的目的正是为了解决上述技术问题， 提供一种新型的核酸芯片及其制备方法以及 用途。

通过采用表面修饰手段和微纳米技术， 本发明不仅很好解决传统反向转染芯片的问题 ， 还大大拓展它们的应用范围， 比如对细胞迁移等功能基因的筛选。

本发明所称的 "非生物相容性材料"是指细胞不能在该材料表� ��进行正常生长、 增殖等 活动的材料， 若将细胞置于该材料表面培养， 则细胞会产生明显的凋亡或死亡。

"智能材料 ( intel l igent materials or smart materials ) "是指在温度、 pH值、 化 学、 压力、 电荷、 磁场等参数变化时， 材料的物理或化学性会发生变化的所有材料， 包括但 不限于聚 -N-异丙基丙烯酰胺 （P ₀ ly (N-i _SO pr ₀ pyl _aC ryl _am ide) )、 聚乙烯基己内酰胺

(Poly (N-vinylcaprolactam) ) 聚丙烯酸、 聚丙烯腈、 聚醚 (Polyethylene-polypropylene glycol , 如 BASF公司的 Pluronic® F-87、 Pluronic® F_88、 Pluronic® F-108或 Pluronic® F127 ) 聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物 (Polyoxypropylene-polyoxyethylene Block Copolymer)^ 聚乙二酉享 -聚丙二酉享共聚物 (Polyethylene glycol polypropylene glycol block copolymer)^ 壳聚糖、 海藻酸钠， 以及它们的衍生物或混合物。

"光刻胶材料 （photoresist ) "又称光致抗蚀剂， 由感光树脂、 增感剂和溶剂三种主要 成分组成的对光敏感的混合液体。 感光树脂经光照后， 在曝光区能很快地发生光固化反应， 使得这种材料的物理性能， 特别是溶解性、 亲合性等发生明显变化。 经适当的溶剂处理， 溶 去可溶性部分， 得到所需图像。根据其化学反应机理和显影原 理， 可分负性胶和正性胶两类。 包括但不限于 AZ®光刻胶系列 (Microchemicals ) , TI 35E光刻胶 (Microchemicals ), TI 35ES 光刻胶 (Microchemicals ), PMGI光刻胶 (MicroChem Corp. )， LOR光刻胶 (MicroChem Corp. )， SU-8 光刻胶 ( MicroChem Corp. )， KMPR® 1000 光刻胶 ( MicroChem Corp. )， P匪 A 光刻胶

(MicroChem Corp. ) 等。

"核酸"是指脱氧核糖核酸（DNA)或核糖核酸（RNA ), 或其衍生物组成的材料。 包括但 不限于 DNA、 siRNA, esiRNA, shRNA载体、 质粒载体、 或以病毒形式存在的载体等。

"核酸 -转染试剂脂质体" 是指当两性分子如磷脂、 鞘脂、 聚合物等分散于水相时， 分 子的疏水尾部倾向于聚集在一起， 避开水相， 而亲水头部暴露在水相， 形成具有单层或双分 子层结构的封闭囊泡， 核酸分子可以包封在这些囊泡内或吸附在这些 囊泡表面。 由于这种囊 泡膜层具有生物膜特征，可与细胞融合，能将 脂质体囊泡中的核酸或其他成份导入细胞中。 脂 质体大小直径 0. 02 毫米〜 5 毫米之间。 常用转染试剂包括但不限于 Lipofectamine 2000 ( Invitrogen), DharmaconFECT 转染试剂等。 本发明是通过如下的技术方案实现的。 第一步， 用去垢剂和超纯水清洗芯片。 该芯片可 以是任何形状的固态物质， 例如玻片、 硅片、 塑料片、 甚至纸片等。 第二步， 制备覆盖层材 料溶液。 该覆盖层材料可以为任何非生物相容性材料。 优选地， 覆盖材料为智能材料、 光刻 胶材料、 PH 敏感材料或温度敏感材料。 更为优选地， 覆盖材料为聚 -N-异丙基丙烯酰胺 (Poly (N-isopropylacrylamide) )或其衍生物或混合物。 比如， 制备成 6% (w/v)的 Poly (N- isopropylacrylamide) (Sigma) 乙醇溶液。 第三步， 在芯片表面铺覆一层覆盖材料， 并制备 出不同大小或形状的微结构图案。 根据覆盖材料的性能， 可使用等离子刻蚀技术、 光刻法、 压印技术等制备图案。 例如， 使用光敏材料时， 可利用光刻法工艺 （photol ithography) 制 备不同形状的微孔。优选地，利用氧气刻蚀机 和掩膜保护，刻蚀 Poly (N- isopropylacrylamide) 的图案。 例如， 刻蚀条件为 50pa氧压， 200W功率， 刻蚀时间约 3_5分钟。 刻蚀完毕， 将芯 片放入超净台中紫外照射消毒。

下一步是在有图案的芯片上点制核酸阵列。核 酸包括但不限于 DNA、 siRNA、 esiRNA, shRNA 载体、 质粒载体、 或以病毒形式存在的载体等。 优选地， 核酸为 siRNA分子。 将核酸-转染试 剂混合制备成脂质体， 然后将脂质体混合包裹在转染载体溶液中。 该转染载体溶液包含但不 限于明胶（ _ge latin)。转染载体的作用是在干燥条件下或 培养液中能稳定核酸-转染试剂脂质 体结构， 而且在培养液中可以缓释核酸 -转染试剂脂质体， 进入细胞中。 优选地， 制备核酸- 转染试剂脂质体， 并包裹在核酸转染载体溶液的方法如下： 1 ) 制备核酸 -转染试剂脂质体： 将 0. 1 M蔗糖的 3微升 OptiMEM (Invitrogen)以及 2. 5微升 Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 加入 200微升实验管中并且充分混匀； 然后加入 1微升 100 μ Μ 的 siRNA, 混匀后室温孵育 20 分钟； 2 ) 制备转染载体溶液： 配制 0. 1 % (w/v) 的明胶 (gelatin, Sigma, Type B) 水溶液， 其中包含有 0. 01 % (w/v) fibronectin (Invitrogen) ; 3 ) 将脂质体混合包裹在转 染载体溶液中： 在孵育 20分钟后的核酸-转染试剂脂质体的试管中， 加入 7. 5微升转染载体 溶液并充分混匀。 然后， 将包裹核酸的转染载体溶液点加在不同的图案 位置。 例如， 利用针 式或喷墨式点样仪， 同时将包含不同核酸分子的上千种转染载体溶 液点加在芯片对应的图案 位置上。 又例如， 也可使用液体分装仪器 （Wang, J. et al. Lap Chip, 2009) 来完成点阵制 备。

最后， 将核酸芯片固定在 3. 5 cm的培养皿中室温干燥保存以备使用。 使用时将培养皿置 于 37° C控温台上， 加入 2-3 ml包含 IX 10 ⁵ 至 5 X 10 ⁶ 个细胞的 37° C培养基。 细胞培养 完成后（约 48小时）， 将培养皿室温放置 5分钟使得聚合物完全溶解， 再加入 PBS清洗三次， 随时进行相应的实验， 并通过显微镜从事观察或记录。

与现有基于孔板 （如 96孔板或 384孔板或 1536孔板等） 筛选技术相比， 本发明提供的 核酸芯片具有成本低、 便于使用等优点。

与现有技术中已有的核酸芯片相比， 本发明提供的核酸芯片在至少以下三个方面具 有特 别优异的效果。 传统的核酸芯片仅简单地将核酸分子附着于基 底表面的特定部位 （一般这些 特定部位排列成点阵），在进行细胞培养的时 候，细胞会无任何区别地在基底的全部表面生 长， 这样会带来两个问题： 一是基底全部表面都被细胞覆盖， 使得对核酸分子位置的确定变得困 难， 不利于信号采集与分析； 二是核酸分子点阵中的细胞会受到点阵之间的 细胞的干扰， 从 而影响到观测结果的准确度和可靠性。 但是， 使用本发明提供的核酸芯片进行细胞功能基因 筛选研究的时候就不会遇到以上的问题。由于 点阵之间的基底表面被非生物相容性材料覆盖 ， 细胞只会在核酸分子点阵区域内生长，， 不会形成相互干扰。 因而， 通过观察细胞生长的部位 便能容易地确定核酸分子点阵的分布区域。 最后， 当上述非生物相容性材料去除， 细胞能从 点阵内向外的扩散便不会再受到其他细胞的干 扰， 因此本发明提供的芯片， 可以用于准确、 可靠地研究细胞迁移的相关试验。

本发明技术方案总结如下：

1. 一种核酸芯片， 包括基底， 该基底的一部分表面附着有核酸分子， 其特征在于所述基 底上未附着核酸分子的区域被可抑制细胞生长 的材料覆盖。

2. 根据第 1项所述的核酸芯片， 其特征在于该材料为非生物相容性材料。

3. 根据第 1或 2项所述的核酸芯片， 其特征在于该材料容易制备成微结构图案。

4. 根据 1-3的任意一项所述的核酸芯片， 其特征在于该材料为智能材料。

5. 根据 1-3的任意一项所述的核酸芯片， 其特征在于该材料为光刻胶、 温度敏感材料或 pH敏感材料。

6. 根据 1-5 的任意一项所述的核酸芯片， 其特征在于该材料为聚 -N-异丙基丙烯酰胺 (Poly (N-isopropylacrylamide) ) 聚乙烯基己内酰胺 (Poly (N-vinylcaprolactam) ) 聚丙 烯酸、 聚丙烯腈、 聚氨酯、 聚醚 （Polyethylene-polypropylene glycol )、 聚氧丙烯-聚氧乙 烯共聚物 ( Polyoxypropylene-polyoxyethylene block copolymer )^ 聚乙二酉享-聚丙二酉享共 聚物 (Polyethylene glycol polypropylene glycol block copolymer)^ 壳聚糖、 海藻酸钠， 以及它们的衍生物或混合物。 ₄ 7. 根据 1-6的任意一项所述的核酸芯片， 其特征在于该材料层的厚度为 1-500微米。

8. 根据 1-7的任意一项所述的核酸芯片， 其特征在于所述核酸分子分布在基底表面多个 彼此分立的区域内。

9. 根据第 8项所述的核酸芯片，其特征在于所述多个彼� �分立的区域排列成规则的点阵。

10. 根据第 8或 9项所述的核酸芯片， 其特征在于所述多个彼此分立的区域为圆形， 其 直径在 50微米 -1毫米之间， 彼此间距在 50微米 -10毫米之间。

11.根据 1-10的任意一项所述的核酸芯片， 其特征在于所述核酸分子被包裹在转染载体 中， 通过转染载体附着在基底表面。

12. 根据 1-11的任意一项所述的核酸芯片， 其特征在于所述核酸分子与转染试剂形成核 酸 -转染试剂脂质体被包裹在转染载体中， 通过转染载体附着在基底表面。

13. 根据第 11或 12项所述的核酸芯片， 其特征在于所述转染载体为在干燥条件下或培 养液中能保护核酸或核酸-转染试剂脂质体结� �不被破坏的材料或混合物。

14. 根据 11-13的任意一项所述的核酸芯片， 其特征在于所述转染载体为能在培养液中 使得核酸或核酸-转染试剂脂质体缓释进入细� �的材料或混合物。

15. 根据 11-14的任意一项所述的核酸芯片，其特征在于� ��述转染载体为明胶 ( _ge lat in)、 纤粘连蛋白（fibronect in)、 精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽 （RGD)、 透明质酸 (Hyaluronic acid , HA)、 琼脂糖、 水凝胶 ( hydrogel ) , 聚乳酸 ( polylact ide , PLA )、 聚乙二醇 (Polyglycol ide) 、 聚乳酸-羟基乙酸 ( Polylact ide- glycol ide, PLGA )、 聚烯烃

( polyolefins ) 聚酉旨 ( polyesters ) ^聚醜胺 ( polyamides ) 聚碳酸酉旨 ( polycarbonates ) 或 聚砜树脂 （polysulfones ) ， 或它们的衍生物或混合物。

16. 根据第 15 项所述的核酸芯片， 其特征在于所述明胶的溶液浓度范围为质量百 分比 0. 05%到 1%。

17. 根据第 16 项所述的核酸芯片， 其特征在于所述明胶中含有蔗糖或纤粘连蛋白 (fibronect in) , 其中蔗糖的摩尔浓度范围为 0. 05M到 1M， 纤粘连蛋白的浓度范围为质量百 分比 0. 005%到 0. 05%

18. 根据 1-17 的任意一项所述的核酸芯片， 其特征在于所述核酸分子为 DNA、 s iRNA, es雇、 质粒或以病毒形式存在的载体。

19. 根据 1-18的任意一项所述的核酸芯片， 其特征在于所述基底的材料为玻璃、 聚苯乙 烯、 聚乙烯、 塑料、 硅片、 陶瓷或纸张。 20.一种制备根据 1-19的任意一项所述的核酸芯片的方法，其特� �在于其包括如下步骤:

1 ) 将基底清洗干净， 干燥后在其表面制备可抑制细胞生长材料的图 案；

2 ) 将核酸分子或核酸-转染试剂脂质体包裹在转� �载体中；

3 ) 将包裹核酸分子或核酸 -转染试剂脂质体的转染载体固定到基底上未� �可抑制细胞生 长的材料覆盖的区域中。

21. 根据第 20项所述的制备核酸芯片的方法， 其特征在于步骤 1操作方法如下： 将基底 清洗干净晾干后， 将可抑制细胞生长的材料溶于水、 乙醇或其它溶剂中形成溶液， 将所述溶 液均匀覆盖基底表面并干燥，然后将预先准备 好的掩模覆盖在所述可抑制细胞生长的材料上 ， 将未被掩模遮盖的部分刻蚀除去， 露出基底。

22. 根据第 21项所述的制备核酸芯片的方法，其特征在于� ��述刻蚀为氧气等离子体刻蚀。

23. 根据第 20项所述的制备核酸芯片的方法， 其特征在于步骤 1操作方法如下： 将基底 清洗干净，干燥后，将可抑制细胞生长的材料 溶于乙醇或水中形成溶液，利用压印技术（sta mp fabrication) 直接在基底表面印出所需图案。

24. 根据第 20项所述的制备核酸芯片的方法， 其特征在于步骤 1操作方法如下： 将基底 清洗干净， 干燥后， 利用光刻胶在表面制备出相反的图案， 然后在基底涂镀或共价键连接一 种可抑制细胞生长的材料， 最后去除光刻胶， 保留可抑制细胞生长材料的图案。

25. 一种使用根据 1-19的任意一项所述的核酸芯片进行细胞功能� �因筛选的方法， 其特 征在于包括如下步骤：

1 )将细胞与核酸芯片上的转染载体接触， 使核酸或核酸 -转染试剂脂质体缓释进入细胞;

2 ) 观测核酸分子对细胞功能的影响。

26. 根据第 25项所述的使用核酸芯片进行细胞功能基因筛� ��的方法， 其特征在于步骤 1 所述核酸或核酸-转染试剂脂质体缓释进入细� �的过程为：在芯片上加入细胞和培养液后开� � 的 2小时， 核酸或核酸-转染试剂脂质体释放量少于 10%， 而在随后的 12至 24小时内， 逐渐 释放至少 40%。

27. 根据第 25或 26项所述的使用核酸芯片进行细胞功能基因筛� ��的方法， 其特征在于 步骤 2中所述的细胞功能为细胞增值、 细胞分化、 细胞凋亡、 细胞迁移或细胞自噬。

28. 根据第 27项所述的使用核酸芯片进行细胞功能基因筛� ��的方法， 其特征在于所述细 胞迁移可通过单位时间内细胞小岛面积变化来 评估。 附图说明

图 1本发明的核酸芯片制备以及细胞小岛阵列形� �示意图。 在干净的玻璃片表面上铺覆一层 聚 -N-异丙基丙烯酰胺 （Poly (N-isopropylacrylamide)， PNIAAm, Sigma)。 待干燥后利用等 离子刻蚀机， 刻蚀出上百个 500或 800微米直径的小孔。 因为图案的大小和形状完全由掩膜 上图案的大小和形状决定， 所以可以方便地设计、刻蚀出任何形状或大小 的聚 -N-异丙基丙烯 酰胺材料图案。然后， 含不同核酸分子转染载体溶液点加在对应的图 案位置， 制成核酸芯片。 加入细胞后培养两到三天， 将培养基温度降低至室温移去异 -N-丙基丙烯酰胺， 细胞自组装形 成小岛。 每个小岛对应一个核酸点阵， 点阵中的核酸将有效地转染到对应的小岛细胞 中。 观 察细胞的形态、 数目、 特定蛋白 （利用免疫荧光标记等办法）、 细胞核等参数， 可以达到筛选 或研究特定核酸功能的目的。

图 2 相差显微镜照片显示细胞小岛形状。 左图显示四个小岛， 右图显示一个小岛。

图 3利用荧光标记的 siRNA (如 FAM-siRNA， 上图）和 GFP质粒（下图）验证小岛之间没有明 显的交叉污染。 左图为相差显微镜照片， 右图为对应的荧光显微镜照片。 FAM-siRNA 或 GFP 质粒只点在左上角和右下角。

图 4通过细胞小岛面积随时间的变化， 来评估细胞的迁移速度。 上图为相差显微镜照片显示 0小时， 8小时， 15小时三个时间点细胞小岛面积变化。 下图为细胞小岛面积随时间按的变 化曲线。 每小时测量一次细胞小岛面积变化。

图 5 三种不同细胞， Hela细胞， ftepG2细胞， U2-0S细胞， 迁移速度的比较。 同一实验重复 五次， 求平均值。 结果表明： Hela细胞 〈 ftepG2细胞 〈 U2-0S细胞。

图 6 模拟传统划痕法 （Wound healing assay) 研究细胞迁移。 从左到右不同分别是 0小时， 6小时， 10小时拍得照片。

图 7研究三条基因 Pten， Rhog, Sgef分别抑制后对 Hela细胞迁移的影响。 左图为实时荧光 定量 PCR结果， 表明合成的三条基因的 siRNA能有效的抑制相应的基因。抑制 Pten基因能提 高 Hela细胞的迁移速度， 相反抑制 Rhog或 Sgef基因将降低 Hela细胞的迁移速度 （右图）。 NC为不相关 siRNA序列， 为对照实验使用。

图 8研究三条基因 Pten, Rhog, Sgef分别抑制后对 U2-0S细胞迁移的影响。 左图为实时荧光 定量 PCR结果， 表明合成的三条基因的 siRNA能有效的抑制相应的基因。抑制 Pten基因能提 高 U2-0S细胞的迁移速度，相反抑制 Rhog或 Sgef基因将降低 U2-0S细胞的迁移速度（右图）。 NC为不相关 siRNA序列， 为对照实验使用。 具体实施方式

以下将通过具体的实施例说明本发明， 但是这些具体的实施例不应当理解为对本发明 的 限制， 对某些细节进行修改将仍然落入本发明的保护 范围之内。

实例 1 细胞培养：

实验中用到的细胞包括 He la, HepG2 和 U2- 0S。 细胞培养基是 Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM, Invitrogen), 其中包含 10%胎牛血清和 1%双抗。 培养条件： 湿度 95%， 温度 37° C， 5% C0 ₂ 。 细胞传代时， 先用 PBS清洗一遍， 再加入包含 5 mM EDTA的 0. 25%胰酶， 观察细胞边缘浮起外观变圆时加入血清终止消 化。 使用移液器将贴壁细胞吹下来， 离心除去 上清液， 获得沉积的细胞。 加入适量的培养基稀释后使用细胞计数板计数 ， 然后培养。

实例 2 利用分配器制备核酸点阵

使用基于微流体技术的分配器 （Wang, et al. Lap Chip, 2009) 进行核酸点阵制备。 根 据不同的实验要求， 也可以使用其它点样仪。 分配器设计成带有六个独立的管道， 因此可以 同时分配六个不同的样品。 压縮空气产生的气压脉冲 （0. 04 兆帕， 15 毫秒） 可以驱动大约 110 纳升液体试剂填充在没有聚合物覆盖的一个孔 表面。 点样时芯片放置在 37° C控温台上 以免液体试剂溶解聚合物。 点样结束， 用超纯水清洗分配器管道并且用压縮空气吹干 以便下 次使用。

实例 3 细胞自组装小岛

用去垢剂和超纯水清洗实验室常用的玻片 (25 毫米 X 25 毫米)表面。 干燥后在其表面 滴一层聚合物薄膜， 使用 65 微升 6% (w/v)的 Poly (N- isopropylacrylamide) (Sigma 或 PolySciences) 乙醇溶液， 干燥后， 在室温中保存 12小时。 根据实验要求制备硅片掩模， 利 用微加工技术可在其上刻出不同大小或形状微 孔。 具体讲， 将硅片掩模盖在薄膜干燥后的玻 片上， 放入氧气等离子刻蚀机中刻蚀。刻蚀条件为 50pa氧压， 200W功率， 刻蚀时间约 3. 5分 钟。 刻蚀完毕， 将玻片放入超净台中紫外照射消毒， 然后使用分配器在其上加工出 siRNA微 阵列。 玻片可以用蜡固定在 3. 5 cm的培养皿中室温干燥保存以备使用。 使用时将培养皿置于 37° C控温台上， 加入 3 ml包含 1 X 10 ⁶ 个细胞的 37° C培养基。 细胞培养完成后 （约 48小 时）， 将培养皿室温放置 5分钟使得聚合物完全溶解， 再加入 PBS清洗三次， 随时进行相关实 验 （图 2)。

实例 4 核酸点阵间的交叉污染研究

我们利用荧光标记的 siRNA和 GFP质粒来研究核酸阵列是否会形成交叉污染。 例如， 在 两个对角 （如左上角和右下角） 点制 FAM-siRNA阵列， 另外两个对角 （如左下角和右上角） 点制两个没有标记 siRNA阵列， 点阵直径大小为 0. 8毫米， 点之间相隔距离为 2毫米。 加入 细胞培养两天后， 在 FAM-siRNA点的细胞中可检测到荧光信号； 相反， 在没有标记 siRNA的 细胞中， 没有检测任何荧光信号（图 3)。 同样， 我们利用 GFP质粒和普通质粒重复上述实验， 只在 GFP质粒阵列点中发现细胞有荧光信号。 这些结果说明， 核酸点阵没有形成交叉污染。 实例 5 细胞迁移 细胞迁移在生理学和病理学过程中扮演着非常 重要的角色， 包括胚胎发育， 伤口愈合， 炎症反应， 癌症细胞侵染和转移等过程。 在过去的这几年当中， 细胞迁移领域取得了极大的 研究进展。 细胞迁移是一个多步骤的循环过程， 以细胞极化为开端， 前端向外突出延展并且 紧密贴壁， 后端贴壁松脱并且向前端收縮。 然而， 这些步骤的分子机理还不是很清楚， 这使 得治疗癌症， 尤其是当癌细胞发生转移时， 仍然是一项棘手的任务。 系统性地鉴别调控细胞 迁移的新型分子， 可以帮助我们更好地了解细胞迁移相关的复杂 信号网络。 以此项技术为基 础， 就可以找到一些可行的靶点用于治疗和诊断。

传统的大规模■干扰筛选主要是在 96或 384孔板中完成的，并不适合细胞迁移的结果 分析。 传统检测细胞迁移的技术， 包括体外划线实验、 Boyden小室实验， 都需要额外的熟练 的操作或者特殊的器具，这就导致大规模筛选 时不够精确和低效率。利用本发明制备的 siRNA 细胞微阵列芯片， 可以用于高通量的筛选调控细胞迁移的功能基 因。 由于使用了一种热敏感 的聚合物——聚 N-异丙基丙烯酰胺， 我们可以轻易的制作出大小和形状标准化的图 形。 这些 填充了小■的图形被细胞所覆盖。 添加细胞培养 2到 3天后， 在室温下去除聚 N-异丙基丙 烯酰胺， 组成细胞小岛阵列 （图 3)。 不同时间测量细胞小岛面积的变化， 可以计算面积的变 化， 除以时间间隔来衡量细胞的迁移速度 （图 4)。 很明显， 在一定的时间段内 （如不超过 16 小时）， 细胞的速度为线性。 我们比较发现 Hela细胞的迁移速度小于 ftepG2细胞， 而 ftepG2 细胞迁移速度小于 U2-0S细胞 （图 5)。

实例 6 模拟划痕法 （wound healing assay) 研究细胞的迁移 如果掩膜上的图案是长方型， 本发明可以制备长方型细胞小岛 （图 6)。 当去除聚 N-异丙 基丙烯酰胺， 细胞开始向周边移动， 最终在中间会合。 这些实验能模拟传统的划痕法（wound healing assay), 用于细胞迁移的研究。 实例 7

为了考察 siRNA芯片研究细胞迁移的可能性， 我们合成三条基因 Pten, Rhog, Sgef 的 siRNA。 序列如下：

PTEN siRNA 5' -pGUUAGCAGAAACAAAAGGAGdTdT

5' - pCUCCUUUUGUUUCUGCUAACdTdT

RhoG siRNA

5' -pGCAACAGGAUGGUGUCAAGdTdT

5' - pUCGUCCAAGAUCGACAUCCdTdT

sGEF siRNA

5' - pCAAAUGGCCUUGCCGCUAAdTdT

antisense 5' - pUUAGCGGCAAGGCCAUUUGdTdT

我们选取两种细胞 Hela和 U2-0S细胞进行研究。首先，检测三条基因 siRNA的抑制效果。 利用实时荧光定量 PCR方法，定量检测了分别转染三条基因 siRNA后 48小时，各自基因 mRNA 表达水平的变化。图 7表明合成的三条基因的 siRNA能有效的抑制相应的基因（左图）。其次� �� 考察三条基因被抑制后细胞的迁移行为变化。 结果表明抑制 Pten后能提高 Hela细胞的迁移 速度， 相反抑制 Rhog或 Sgef将降低 Hela细胞的迁移速度 （右图）。 利用 U2-0S细胞， 重复 了上述实验，发现了同样的规律。这些结果与 先前其他研究小组的报道完全一致（Czauderna, F. et al. Nucleic Acids Research, 2003； El lerbroek, S. et al. Molecular Biology of the Cell, 2004 ; Katoh, H. et al. Journal of Cell Science, 2006)。 因此， 有力地证明 本发明提供的 siRNA芯片研究细胞迁移的有效性。