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Title:
ONION SKIN EXTRACT WITH PROPERTIES THAT PROTECT THE GASTROINTESTINAL MUCOSA AGAINST DAMAGE INDUCED BY NON-STEROIDAL ANTI-INFLAMMATORY DRUGS OR BY ALCHOL, PHARMACEUTICAL COMPOSITION OR FOOD COMPRISING IT, METHOD OF OBTAINMENT, AND USE TO PREVENT, TREAT AND/OR MITIGATE THE ADVERSE EFFECTS OF NSAIDS OR ALCOHOL
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2021/077236
Kind Code:
A1
Abstract:
An onion skin extract with properties that protect the gastrointestinal mucosa against damage induced by non-steroidal anti-inflammatory drugs or by alcohol, pharmaceutical composition or food comprising it, method of obtainment, and use to prevent, treat and/or mitigate the adverse effects of NSAIDS or alcohol.

Inventors:
SPEISKY COSOY HERNAN (CL)
ATALA RIFFO ELIAS (CL)
FUENTES GARCIA JOCELYN (CL)
ARIAS SANTE FERNANDA (CL)
Application Number:
PCT/CL2019/050103
Publication Date:
April 29, 2021
Filing Date:
October 22, 2019
Export Citation:
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Assignee:
UNIV CHILE (CL)
International Classes:
A61K36/8962; A23L19/00; A23L33/105; A61K31/343; A61P1/00; A61P1/04
Attorney, Agent or Firm:
ESTUDIO FEDERICO VILLASECA Y CIA. (CL)
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Claims:
REIVINDICACIONES

1. El extracto de cebolla enriquecido en benzofuranona, caracterizado porque es un extracto de piel de cebolla.

2. El extracto la reivindicación 1 caracterizado porque la piel de cebolla corresponde a las capas secas más externas.

3. El extracto acuoso de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque la cebolla es seleccionada de cebolla de guarda de la variedad Valenciana, cebolla amarilla, cebolla morada, chalota amarilla, chalota morada, o combinaciones de las mismas.

4. El extracto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque comprende benzofuranona y polifenoles.

5. El extracto de la reivindicación 4, caracterizado porque el polifenol es seleccionado de ácidos fenólicos, flavonoides, derivados de estos o combinaciones de ambos.

6. El extracto de la reivindicación 5, caracterizado porque dicho ácido fenólico se selecciona de ácido 2,4,6-trihidroxibenzoico, ácido 3,4-dihidroxibenzoico o ambos.

7. El extracto de la reivindicación 4, caracterizado porque dicho flavonoide se selecciona de quercetina, su glicósido en posiciones 3 o 4', derivados de estos, o combinaciones de los mismos.

8. El extracto de la reivindicación 4, caracterizado porque dicha benzofuranona y dichos polifenoles se encuentran presente en el extracto en una concentración entre el 92-98% del peso seco total del extracto.

9. El extracto de cualquiera de las reivindicaciones 4 y 8, caracterizado porque la proporción entre benzofuranona, ácidos fenólicos y flavonoides es de 78: 14 a 16: 6 a 7.

10. Composición farmacéutica caracterizada porque comprende el extracto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y excipientes farmacéuticamente aceptables.

11. La composición farmacéutica de la reivindicación 10 caracterizada por dicha composición farmacéutica se selecciona de tabletas convencionales, tabletas multicapas, tabletas recubiertas, tabletas masticables, cápsulas, gránulos, polvos, jarabes, supositorios, geles, sachets, pastas, emulsiones o suspensiones o soluciones para parches o inhaladores.

12. Composición alimenticia caracterizada porque comprende el extracto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y excipientes alimentarios aceptables.

13. La composición de la reivindicación 12, caracterizada porque dicha composición alimentaria se selecciona de un suplemento alimenticio, un alimento o bebida.

14. Método de obtención del extracto de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque comprende: a) proporcionar capas secas externas de cebolla y agregar dichas capas secas a una solución acuosa tamponada seleccionada de uno de acetato, fosfato o borato, a pH ácido en el rango de 2,7 a 4,0, bajo agitación; b) calentar la mezcla obtenida en a) a una temperatura entre 60-65QC bajo agitación hasta alcanzar la homogeneidad, y macerar y filtrar la mezcla homogeneizada para separar sólidos solubles, repitiendo la filtración al menos 2 veces; c) lavar con agua el filtrado resultante de la etapa b) y hacerlo pasar por una columna de extracción previamente acondicionada con el tampón de la etapa a) para retirar componentes no deseados, incluyendo sales, compuestos no fenólicos, amino ácidos, péptidos tiólicos, proteínas y azúcares simples; d) eluir la mezcla resultante de la etapa c) en un alcohol seleccionado de etanol o metanol, y concentrar a una presión reducida entre 5-10 milibar, y a una temperatura < 40QC; y opcionalmente e) secar, envasar y almacenar manteniendo la mezcla resultante en d) alejada de la luz y humedad.

15. El método de la reivindicación 14, caracterizado porque en la etapa a) dicho tampón es tampón acetato.

16. El método de la reivindicación 14, caracterizado porque en la etapa a) dicho pH es pH 3,5.

17. El método de la reivindicación 14, caracterizado porque en la etapa d) dicho alcohol es etanol.

18. El método de la reivindicación 14, caracterizado porque en la etapa d) dicha presión reducida es 7 mbar.

19. El método de la reivindicación 14, caracterizado porque en la etapa d) dicha concentración se realiza mediante liofilización, atomización, pulverización, aspersión, secado por en horno.

20. Uso del extracto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 caracterizado O porque es útil para prevenir, tratar, o mitigar los efectos adversos de fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) o alcohol, preferentemente etanol.

21. Uso del extracto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 caracterizado porque es útil en la prevención o tratamiento del daño de la mucosa gástrica, intestinal y/o colónica causado o asociado al uso de AINEs.

22. Uso del extracto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 caracterizado porque es útil en la prevención y/o el tratamiento de alteraciones de la mucosa gastrointestinal y/o colónica causadas y/o asociadas al uso o consumo de alcohol, preferentemente etanol.

23. Uso del extracto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 caracterizado porque es útil para preparar un medicamento útil para prevenir, tratar, o mitigar los efectos adversos de AINEs o alcohol, preferentemente etanol.

24. Uso del extracto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 caracterizado porque es útil para preparar un medicamento útil en la prevención o tratamiento del daño de la mucosa gástrica, intestinal y/o colónica causado o asociado al uso de AINEs.

25. Uso del extracto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 caracterizado porque es útil para preparar un medicamento útil en la prevención y/o el tratamiento de alteraciones de la mucosa gastrointestinal y/o colónica causadas y/o asociadas al uso o consumo de alcohol, preferentemente etanol.

Description:
EXTRACTO DE PIEL DE CEBOLLA CON PROPIEDADES PROTECTORAS DE LA MUCOSA GASTROINTESTINAL CONTRA EL DAÑO INDUCIDO POR FÁRMACOS ANTI-INFLAMATORIOS NO ESTEROIDALES O POR ALCOHOL, COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA O ALIMENTICIA QUE LO COMPRENDE, MÉTODO DE OBTENCIÓN Y USO PARA PREVENIR, TRATAR Y/O MITIGAR LOS EFECTOS ADVERSOS DE AINES O ALCOHOL.

Campo de la Invención

La presente invención se refiere a extractos, composición, método de obtención y su uso para prevenir, tratar y/o mitigar naturalmente, los efectos adversos de AINES o alcohol, específicamente etanol. En particular, se refiere a un extracto natural obtenido desde las capas exteriores de cebolla, en particular, de las capas secas más externas de la piel de cebolla de guarda de la variedad Valenciana (cebolla amarilla) y morada, y de la chalota tanto amarilla como morada. La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica o alimenticia que comprende dicho extracto, pudiendo estar, la composición alimenticia, en la forma de un suplemento alimenticio, alimento o bebida efectiva. El presente extracto es altamente efectivo e inocuo, teniendo propiedades antioxidantes y citoprotectoras, en particular, a baja dosificación, y está enriquecido naturalmente en benzofuranona (BZF) comprendiendo además ciertos polifenoles, incluyendo ácidos fenólicos y flavonoides que en su conjunto conforman entre el 92-98% del peso seco total del presente extracto. La presente invención también se refiere a un método estandarizado para la obtención de dicho extracto, y su uso para prevenir, tratar y/o mitigar los efectos adversos de AINES o alcohol.

Antecedentes

Los fármacos anti-inflamatorios no esteroidales (AINEs, por ejemplo, indometacina, ibuprofeno, diclofenaco, aspirina, metamizol) son la piedra angular del manejo de dolor en pacientes que tienen problemas inflamatorios, dolor agudo (por ejemplo, dolor de cabeza, dolor post- operatorio, y fracturas ortopédicas) y dolor crónico (por ejemplo, artritis reumatoide, osteoartritis, y gota). Mundialmente, sobre 30 millones de personas usan diariamente AINEs. Aproximadamente, 70% de las personas de 65 años o incluso mayores usan AINEs al menos una vez por semana, con la mitad de ellos tomando al menos 7 dosis a la semana. En el año 2010, más de 140 millones de prescripciones fueron escritas para AINEs en USA. Hoy el uso de AINEs es considerablemente mayor ya que la población de USA continúa envejeciendo y por ello las condiciones de experimentar dolor son más comunes en adultos mayores. Esta situación no es diferente la mayoría de los otros países del oeste. AINEs tradicionales ofrecen eficacia superior comparada con acetominofeno pero también portan significativos riesgos asociados al desarrollo de eventos adversos gastrointestinales (Gl) serios. De hecho, se ha encontrado que las úlceras gastroduodenales ocurren en 20-30% de los usuarios crónicos de AINEs. Una revisión sistemática de estudios observacionales prospectivos, indica que al menos 10% de las admisiones hospitalarias prevenibles relacionadas con fármacos son atribuidas a usuarios de AINEs. El riesgo Gl de eventos adversos asociados con AINEs son ambos dependientes del AINE empleado, de las dosis y del periodo de uso. Algunas estimaciones sugieren que solo en USA, cada año más de 100.000 pacientes son hospitalizados por complicaciones Gl relacionadas con AINEs solos. Además, se ha reportado que 16.500 personas mueren anualmente por estas complicaciones (casi tres veces la tasa de muerte más común de los pacientes de VIH).

Varias estrategias han sido empleadas ya sea para prevenir o ayudar a mitigar los riesgos derivados de AINEs en lo que respecta a sus efectos Gl adversos. Años atrás, los inhibidores COX-2 fueron inicialmente desarrollados como una alternativa más segura a los AINEs tradicionales. Sin embargo, rápidamente surgieron datos que unieron su uso a un riesgo elevado para serios eventos adversos cardiovasculares y relacionados con el estado renal. Una estrategia principal para manejar el daño gastrointestinal asociado con el uso de AINEs, también ha involucrado el uso de fármacos antiácidos, especialmente inhibidores de las bombas de protones (PPIs: por ejemplo, omeprazol, lansoprazol). Aunque estos agentes se han tornado en los últimos años en el tratamiento profiláctico pilar contra la toxicidad Gl inducida por AINEs, recientemente, los resultados de varios estudios en animales y de un considerable e incrementado número de estudios clínicos han mostrado una alta incidencia de daño, particularmente en intestino delgado (60-80%), en sujetos que toman selectivamente AINEs y PPIs simultáneamente.

Entre los productos protectores Gl naturales, recientemente Atala et al (Quercetin and related flavonoids conserve their antioxidant properties despite undergoing Chemical or enzymatic oxidation, Food Chem. 2017 234479-485 DOI: 10.1016/j.foodchem.2017.05.023) demostraron que tras la oxidación del flavonoide quercetina, se forman varios metabolitos entre los cuales solo uno muestra y se distingue por su extremadamente potente bioactividad antioxidante y citoprotectora (Fuentes et al., Quercetin oxidation paradoxically enhances its antioxidant and cytoprotective properties. J. Agrie. Food Chem. 2017 65 11002-11010 DOI:

10.1021/acs.jafc.7b06214). Aunque tal compuesto, identificado como 2-(3,4-dihidroxibenzoil)- 2,4,6-trihidroxi-3(2FI)-benzofuranona (BZF), ya era conocido como metabolito de la oxidación química de quercetina, los estudios de Fuentes et al (Fuentes et al., Quercetin oxidation paradoxically enhances its antioxidant and cytoprotective properties. J. Agrie. Food Chem. 2017 65 11002-11010 DOI: 10.1021/acs.jafc.7b06214) han sido los primeros en demostrar la bioactividad de este compuesto, especialmente, la gran capacidad antioxidante y citoprotectora en varios tipos de células (como líneas celulares intestinales humanas y fibroblastos de la piel humana) expuestas a AINEs.

Entre los documentos de patente relacionados con la presente invención, se encuentra la

US4918063A (Univ. Texas) que divulga composiciones compuestas de mezclas únicas de fosfolípidos y lípidos neutros y métodos para emplear tales composiciones para tratar el revestimiento luminal del tracto gastrointestinal en la prevención o tratamiento de procesos ulcerogénicos tales como enfermedad de úlcera péptica y enfermedad inflamatoria intestinal. Se ha demostrado que las composiciones que incluyen mezclas de fosfolípidos saturados o insaturados, junto con triglicéridos y/o esteróles saturados o insaturados, proporcionan una sorprendente eficacia protectora de la úlcera en modelos experimentales. Se encuentra una mejora adicional de la actividad tras la adición de un catión polivalente o antioxidante a las diversas mezclas de lípidos.

US2010173876A1 (Univ. Texas) proporciona una composición farmacéutica mediante la cual los medicamentos antiinflamatorios no esteroidales se agregan directamente al aceite que contiene fosfolípidos como los aceites de lecitina o a un aceite biocompatible al que se ha agregado un fosfolípido para hacer una formulación que contiene AINE poseen una baja toxicidad gastrointestinal (Gl) y una actividad terapéutica mejorada para tratar o prevenir inflamación, dolor, fiebre, agregación plaquetaria, úlceras tisulares y/u otros trastornos tisulares. La composición de la invención está en forma de una solución, pasta, suspensión, dispersión, suspensión coloidal no acuosa o en forma de una emulsión o microemulsión acuosa para administración interna, oral, directa o tópica.

CA1261274A (Efamol Ltd) se refiere a composición farmacéuticas y dietarias de ácido gamma- linolénico o ácido dihomo-gamma-linolénico para su uso en la reducción o prevención del sangrado gastrointestinal y otros efectos secundarios que muestran los AINE cuando se administran de forma continua, incluido el uso para permitir que dicha administración sea reemplazada mediante la administración de dicho ácido solo en artritis y otras afecciones sin exacerbar los síntomas. CA2613169A1 (Cardax Pharmaceuticals Inc.) se refiere a la administración de carotenoides, y en particular los carotenoides de xantofila, o análogos o derivados de astaxantina, luteína, zeaxantina, licoxantina o licopeno a un sujeto sometido a tratamiento con fármacos inhibidores de la COX-2 puede reducir al menos una parte de los efectos secundarios adversos asociados con la administración de fármacos inhibidores selectivos de COX-2. Los carotenoides, o análogos o derivados de los mismos pueden administrarse a un sujeto en forma previa, simultanea o posterior al comienzo de la terapia de inhibición selectiva de COX-2. Los carotenoides, o análogos o derivados de los mismos pueden incorporarse en la preparación farmacéutica en combinación con el fármaco inhibidor selectivo de COX-2 o pueden administrarse por separado. La administración de los análogos o derivados descritos puede reducir la peroxidación de LDL y otros lípidos en el suero y las membranas de las células plasmáticas de los sujetos que se someten a la terapia con fármacos inhibidores selectivos de COX-2. La administración de los análogos o derivados descritos puede reducir la incidencia de eventos cardiovasculares clínicos nocivos que se someten a la terapia con fármacos inhibidores selectivos de COX-2.

AU2007315980B2 (Univ Manchester) se refiere a composiciones que incluyen medicamentos y productos nutricionales, para su uso en la prevención o el tratamiento de enfermedades gastrointestinales. Dichas composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de una fracción soluble en alcohol derivable del jugo de patata.

Choi, YJ, Kim, N., Lee, JY et al. Dig Dis Sci (2014) 59: 2927. https://doi.org/10.1007/sl0620-014- 3370-5 se refiere a PMK-S005 (s-alil-l-cisteína sintética (SAC)), un aminoácido que contiene azufre, que se aisló inicialmente del ajo. Las actividades antioxidantes y antiinflamatorias de la SAC se demostraron en diversos modelos animales experimentales. En particular, se estudiaron los efectos gastroprotectores de PMK-S005 contra el daño gástrico agudo inducido por AINE en ratas. Las ratas SD de ocho semanas se pretrataron con PMK-S005 (1, 5 ó 10 mg/kg) o rebamipida (50 mg/kg) 1 h antes de la administración de AINE incluyendo aspirina (200 mg/kg), diclofenaco (80 mg/kg) e indometacina (40 mg/kg). Después de 4 h, se determinaron el índice de úlcera macroscópica, el índice histológico y el nivel de moco gástrico. Los niveles de mieloperoxidasa (MPO), TNF-a, IL-Ib, PGE 2 y LTB 4 se estimaron en el tejido de la mucosa gástrica mediante ELISA. Las expresiones de proteínas de cPLA 2, COX-1 y COX-2 se evaluaron mediante análisis de transferencia Western. El pretratamiento con PMK-S005 atenuó significativamente el daño gástrico inducido por los AINE y aumentó el nivel de moco gástrico. Además, PMK-S005 atenuó los aumentos en la producción de MPO, TNF-a e IL-Ib. Las expresiones de cPLA 2 y COX-2 inducidas por AINE disminuyeron con el pretratamiento con PMK-S005. PMK-S005 no causó la supresión de la síntesis de PGE 2 inducida por AINE, pero la producción de LTB 4 fue significativamente suprimida por PMK-S005. Los efectos de PMK-S005 se maximizaron consistentemente a una concentración de 5 mg/kg, que con frecuencia fueron superiores a los de rebamipida. Estos resultados sugieren fuertemente que el derivado aminoacidico PMK-S005 sería un agente gastroprotector útil contra el daño agudo de la mucosa gástrica al suprimir las citocinas proinflamatorias, disminuir la expresión de cPLA 2, COX-2 y LTB 4 y aumentar la síntesis de moco.

Deepak Singh, Khumanthem et al, 2015/09/23, 137, 142, Antiulcer and in vitro antioxidant activity of allium hookerii: An ethnomedicinal plant of Manipur, VL 8, Asían Journal of Pharmaceutical and Clinical Research, evaluó la actividad antiulcerosa y antioxidante del extracto metanólico de las hojas de Allium hookerii (MEAH), en ensayos in vivo a dos niveles de dosis de 200 mg/kg y 400 mg/kg de peso corporal en modelos de úlcera inducida por etanol (EtOH) e úlcera inducida por indometacina a través de la estimación de los contenidos gástricos, volumen gástrico, pH, acidez libre, acidez total, hexosas totales, hexosamina, fucosa y proteínas totales, y mediante el ensayo de 1, l-difen¡l-2-picrilh¡drazMhidrato (DPPH), la actividad de eliminación de radicales superóxido y el contenido total de flavonoides. La histopatología del estómago se estudió utilizando secciones teñidas con hematoxilina y eosina. Hubo una disminución significativa en el índice de úlcera y un aumento en el porcentaje de protección en ratas ulceradas. Después de 7 días de tratamiento, el pH, la acidez libre y la acidez total disminuyeron, aumentando así el contenido de hexosas totales, hexosamina, fucosa y proteína total en el contenido gástrico. MEAH mostró un efecto antioxidante significativo en DPPH, contenido total de flavonoides y eliminación de radicales superóxido, pero mostró un efecto muy bajo en la reducción del ensayo de potencia. Los estudios histopatológicos del estómago en úlceras y los grupos tratados corroboran la acción citoprotectora del extracto en animales con úlcera inducida por EtOH. Luego, A. hookerii se muestra como teniendo una potente actividad antiulcerosa y apoya el estado antioxidante in vitro. MEAH mostró un efecto antioxidante significativo en DPPH, contenido total de flavonoides y eliminación de radicales superóxido, pero mostró un efecto muy bajo en la reducción del ensayo de potencia. Los estudios histopatológicos del estómago en úlceras y los grupos tratados corroboran la acción citoprotectora del extracto en animales con úlcera inducida por EtOH.

Un trabajo publicado en Nutrition, Volume 32, edición 7-8, Julio-agosto de 2016, páginas 849- 854, se refiere al ajo, en su estado natural de planta, que tiene una gran historia en la medicina antigua como remedio para muchas enfermedades. Se investigó el efecto gastroprotector del extracto de ajo envejecido (AGE) y los posibles mecanismos subyacentes en un modelo experimental de úlcera gástrica inducida por indometacina. Ratas Wistar macho se dividieron en cuatro grupos: (control normal, n = 20), control de úlceras (grupo de indometacina, n = 20), (grupo de omeprazol, n = 30) y (grupo de ajo, n = 20). Cada dosis de ajo y omeprazol se administró a ratas por vía oral diariamente durante 10 días consecutivos antes de la inducción de úlcera por indometacina. La indometacina se administró como una dosis oral única (100 mg/kg). Cuatro horas después del tratamiento con indometacina, se sacrificaron las ratas y se obtuvo tejido gástrico para examen histopatológico, cálculo del índice de úlcera y medición de marcadores de estrés oxidativo, así como mediadores gastroprotectores. Los resultados mostraron que la úlcera gástrica inducida por indometacina (índice de úlcera = 2900) se asoció con un aumento significativo del factor de necrosis tumoral alfa y malondialdehído, y una disminución significativa de los mediadores gastroprotectores prostaglandina E2, glutatión (GSH) y óxido nítrico (NO) en comparación con el control normal. El pretratamiento con AGE produjo resultados comparables con los obtenidos en el grupo omeprazol. El índice preventivo en el grupo de AGE fue del 83,4% en comparación con el 94,5% en el grupo de omeprazol. El papel profiláctico de AGE en la úlcera inducida por indometacina estuvo, en parte, mediado por la disminución del estrés oxidativo y el aumento del nivel gástrico de PGE2, GSH y NO. AGE corrigió las anomalías histopatológicas en el tejido gástrico y demostró un papel gastroprotector prometedor en la úlcera gástrica.

El presente extracto natural se diferencia de cualquier extracto que pueda ser obtenido de la pulpa de la cebolla o de la pulpa de la chalota, parte comestible de la cebolla, ya que se obtiene exclusivamente a partir de las capas más externas de la cáscara seca, aquella que se desprende en forma natural de la cebolla de guarda, y de la chalota, y que, en ambos casos, se considera como desecho.

Breve Descripción de la Invención

La presente invención se refiere a un extracto de carácter natural, altamente efectivo, e inocuo, y útil en mitigar, prevenir o tratar los daños gastrointestinales adversos asociados al consumo agudo o crónico de AINEs. El presente extracto naturalmente enriquecido en benzofuranona comprende además ciertos polifenoles presentes en las capas más externas de la piel seca de la cebolla, especialmente, de la cebolla de guarda de la variedad valenciana (cebolla amarilla), cebolla morada o chalota amarilla o morada. En particular, el extracto comprende principalmente el compuesto 2-(3,4-dihidroxibenzoil)-2,4,6-trihidroxi-3(2H)-benzofuranon a (BZF), y además ácidos fenólicos y flavonoides que en conjunto se encuentran presentes en el extracto en una concentración entre el 92-98% del peso seco total del extracto. De todos los fenoles presentes en el extracto, la benzofuranona representa 78%, encontrándose el 22% restante representado por el ácido 2,4,6-trihidroxibenzoico (8-9%), el ácido 3,4- dihidroxibenzoico (protocatecuico, 6-7%), y un 6-7% restante representado por los flavonoides quercetina y su glicósido en posiciones 3 o 4'. Luego la proporción BZF: ácidos fenólicos: flavonoides es aprox. 78: 14 a 16: 6 a 7. El presente extracto tiene efecto antioxidante y citoprotector.

El presente extracto demostró mediante evidencia in vitro e in vivo, efecto protector contra el daño oxidativo y celular inducido por AINEs. Preferentemente, el presente extracto es útil en: (1) la prevención y/o tratamiento del daño de la mucosa gástrica, intestinal y/o colónica causada o asociado al uso de AINEs, (2) la prevención y/o el tratamiento de alteraciones de la mucosa gastrointestinal y/o colónica causadas y/o asociadas al uso o consumo de alcohol, en particular, etanol. Aún más preferentemente, el presente extracto sirve para preparar un medicamento útil en: (1) la prevención y/o tratamiento del daño de la mucosa gástrica, intestinal y/o colónica causada o asociado al uso de AINEs, (2) la prevención y/o el tratamiento de alteraciones de la mucosa gastrointestinal y/o colónica causadas y/o asociadas al uso o consumo de alcohol, en particular, etanol.

La presente invención también se refiere a un método estandarizado para la obtención del extracto, que incluye la liofilización del extracto basado en BZF altamente estandarizado, teniendo el extracto una combinación de moléculas bioactivas, principalmente, 2-(2,3- dihidroxibenzoil)-2,4,6-trihidroxi-3(2H)-benzofuranona (BZF) y complementada por el contenido preciso y proporción de varios flavonoides.

La presente invención también comprende una composición farmacéutica y/o alimenticia conteniendo el extracto, pudiendo estar, la composición alimenticia, en la forma de un suplemento alimenticio, alimento o bebida efectiva.

El presente extracto y composición farmacéutica y/o alimenticia por su carácter natural, por su composición originaria proveniente exclusivamente de un alimento, por ser su obtención a través de una química verde, esto es, empleando solo agua y etanol como solventes de extracción, ambos aceptados como sustancia GRAS (de sus siglas en inglés, Generally Regarded As Safe), y por la extremadamente baja dosificación necesaria, no presenta efectos adversos o riesgo alguno para la salud.

Breve Descripción de las Figuras Figura 1 Estructuras química de quercetina (3,5,7,3',4'-pentahidroxiflanona) (A) y la benzofuranona derivada de quercetina (2-(3,4-dihidroxibenzoil)-2,4-6-trihidroxi-3(2H)- benzofuranona (B).

Figura 2 Efectos comparativos antioxidantes de la pre-incubación versus co-incubación de células Caco2 con 10 mM de quercetina (Q), 3 ug/L del extracto acuoso de piel de cebolla amarilla (OAE) o 3 ug/L del extracto acuoso de piel de chalota amarilla (SAE).

Figuras 3A y 3B Cromatografía que resulta del análisis HPLC-DAD del extracto acuoso de las capas secas más externas de (Figura 3A) cebolla amarilla (OAE) y (Figura 3B) del extracto acuoso de las capas secas más externas de chalota amarilla (SAE). El análisis HPLC fue realizado en extractos preparados a una concentración de 3 ug/L En ambos casos Pico 1 corresponde a ácido 2,4,5-trihidroxibenzoico, Pico 2 corresponde a ácido 3,4-dihidroxibenzoico, Pico 3 corresponde a 2-(3,4-dihidroxibenzoil)-2,4,5-trihidroxi-3(2H)-benzofuranon a, Pico 4 corresponde a glicósido de quercetina y Pico 5 corresponde a quercetina.

Figuras 4A y 4B Comparación de los efectos antioxidantes de diferentes concentraciones de OAE y SAE contra el incremento del tono oxidativo celular inducido por indometacina (Figura 4A) o etanol (Figura 4B). Diferencias significativas ** con un p < 0,01 o *** con un p < 0,001 en relación a las células tratadas con indometacina.

Figuras 5A y 5B Capacidad de OAE (presente extracto) para proteger células contra el incremento en la liberación de la enzima Lactato Deshidrogenasa (LDH) inducido por indometacina (Figura 5A) y la capacidad del OAE (presente extracto) para proteger células contra la disminución de la reducción del reactivo Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazolio (MTT) inducida por indometacina (Figura 5B). Diferencias significativas ** con un p < 0,01 o *** con un p < 0,001 en relación a las células tratadas con indometacina.

Figura 6 Capacidad antioxidante de los picos cromatográficos aislados por FIPLC-DAD de OAE (presente extracto). La figura ilustra la capacidad antioxidante desplegada por ya sea cada pico aislado (Pico 1 = ácido 2,4,5-trihidroxibenzoico. Pico 2 = ácido 3,4-dihidroxibenzoico. Pico 3 = 2-(3,4-dihidroxibenzoil)-2,4,5-trihidroxi-3(2FI)-benzofurano na. Pico 4 = glicósido de quercetina. Pico 5 = quercetina), la mezcla de todos los picos 1 a 5 (todos los picos 1 a 5 agrupados), una mezcla de los picos 1, 2, 4 y 5 y OAE, contra el incremento de tono oxidativo intracelular inducida por indometacina (indo). Diferencias significativas *** con un p < 0,001 en relación a las células tratadas con indometacina. Figura 7 Protección de OAE contra la perdida de la función de barrera intestinal (FBI) inducida por indometacina en ratas. La figura muestra los niveles de FITC-Dextran (sonda) en suero y el porcentaje de permeabilidad intestinal en ratas a las cuales se les administro indometacina en ausencia o presencia de OAE. Figura 8 Comparación de los efectos antioxidantes de diferentes concentraciones de

OAE y un extracto de cáscara seca de ajo contra el incremento del tono oxidativo celular inducido por indometacina (A) (Indo) o etanol (B).

Descripción Detallada de la Invención La presente invención muestra que el metabolito BZF no solo puede ser generado en laboratorio a través de la oxidación controlada de quercetina pura, sino que, también está presente, y particularmente, en altas concentraciones, en la capa exterior seca de la cebolla comestible, en particular de cebolla valenciana, una cebolla amarilla producida en Chile, cebolla morada y chalota amarilla y morada. En efecto se estudiaron 20 fuentes diferentes de alimentos ricos en quercetina (ver Tabla 1), y ninguna de ellas, a excepción de la cebolla presentó BZF.

Tabla 1 *ND = No detectado

Se obtuvo el extracto de piel de cebolla conteniendo BZF naturalmente, y posteriormente, se demostró la alta capacidad particular de dicho extracto para proteger células gástricas e intestinales (Gl), incluyendo estudios in vitro e in vivo (en mucosa) contra el daño inducido por AINEs o por alcohol. Notablemente, la protección Gl ofrecida por el extracto es dependiente de la dosis y concentración, y se muestras concentraciones extremadamente bajas (nM a pM). El presente extracto puede ser liofilizado, es altamente estandarizado en términos en BZF y otros componentes activos (ácidos fenólicos y flavonoides), y se obtiene por medio de un procedimiento de extracción libre de solventes orgánicos.

El presente extracto promueve su efecto protector de la mucosa Gl fundamentalmente por la presencia de BZF junto a otros compuestos fenólicos. Los extractos preparados de pulpa de cebolla no contienen BZF detectable ni muestran efecto antioxidante o citoprotector ni siquiera aumentando 100 veces la concentración del extracto de pulpa de cebolla comparado con el presente extracto de cáscara seca de cebolla. Por otra parte, es importante notar que la BZF no se encuentra presente en los extractos de ajo, ya sea de pulpa o cáscara (ver Tabla 1). Lo mismo ocurre en otras especies de Allium tales como cebollín ( allium fistulosum), puerro ( Allium ampeloprasum var. Porrum) y ciboulette (Tabla 1). Por otra parte, al comparar la capacidad de protección de células de la mucosa Gl contra el daño producido por AINEs del presente extracto contra extractos de cáscara seca de ajo, se encontró que para que el extracto de ajo tuviera un grado similar protección al presente extracto fue necesario una concentración 1333 veces mayor que la requerida con el presente extracto, sin que haya sido del todo activo como protector (ver figura 8). Es importante notar que para proteger dichas células, la concentración de BZF en el presente extracto es del orden nanomolar (nM), es decir, aproximadamente 1000 veces inferior a la concentración requerida de quercetina (10 mM), precursora de BZF, que sí se encuentra abundantemente en la pulpa de la cebolla.

La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende dicho extracto y excipientes farmacéuticamente aceptables, donde la composición farmacéutica se selecciona de tabletas convencionales, tabletas multicapas, tabletas recubiertas, tabletas masticables, cápsulas, gránulos, polvos, jarabes, supositorios, geles, sachets, pastas, emulsiones o suspensiones o soluciones para parches o inhaladores. La presente invención asimismo se refiere a una composición alimenticia que comprende dicho extracto y excipientes alimentarios aceptables, donde dicha composición alimentaria se selecciona de un suplemento alimenticio, alimento o bebida.

El método de obtención del extracto comprende los siguientes pasos: a) proporcionar capas secas externas de cebolla y agregar dichas capas secas a una solución acuosa tamponada seleccionada de uno de acetato, fosfato o borato, preferentemente tampón acetato, a pH ácido en el rango de 2,7 a 4,0, preferentemente pH 3,5, bajo agitación; b) calentar la mezcla obtenida en a) a una temperatura entre 60-65 Q C bajo agitación hasta alcanzar la homogeneidad, preferentemente 30 a 60 minutos, y macerar y filtrar la mezcla homogenizada para separar sólidos solubles, repitiendo la filtración al menos 2 veces; c) lavar con agua el filtrado resultante de la etapa b) y hacerlo pasar por una columna de extracción previamente acondicionada con el tampón de la etapa a) para retirar componentes no deseados, incluyendo sales, compuestos no fenólicos, amino ácidos, péptidos tiolicos, proteínas y azúcares simples; d) eluir la mezcla resultante de la etapa c) en un alcohol seleccionado de etanol o metanol, preferentemente etanol, y concentrar a presión reducida (5-10 milibar, preferentemente 7 mbar), y a una temperatura < 40 Q C, el eluato; donde la concentración incluye concentración por liofilización, atomización, pulverización, aspersión, secado por aire, secado en horno; y opcionalmente e) secar, envasar y almacenar, donde dicho extracto concentrado obtenido de la etapa d) se puede envasar en bolsas resellables de plástico con recubrimiento aluminio, y se almacena manteniéndolo alejado de la luz y humedad, el polvo/liofilizado envasado. Un método para preparar una composición farmacéutica que comprende mezclar el presente extracto con excipientes farmacéuticamente aceptables.

Un método para preparar una composición alimenticia que comprende mezclar el presente extracto con excipientes alimentarios aceptables.

Uso del presente extracto en: (1) la prevención y/o tratamiento del daño de la mucosa gástrica, intestinal y/o colónica causada o asociado al uso de AINEs, (2) la prevención y/o el tratamiento de alteraciones de la mucosa gastrointestinal y/o colónica causadas y/o asociadas al uso o consumo de alcohol, en particular, etanol.

Uso del presente extracto en la preparación de un medicamento útil en: (1) la prevención y/o tratamiento del daño de la mucosa gástrica, intestinal y/o colónica causada o asociado al uso de AINEs, (2) la prevención y/o el tratamiento de alteraciones de la mucosa gastrointestinal y/o colónica causadas y/o asociadas al uso o consumo de alcohol, en particular, etanol.

Ejemplo 1: Obtención del Extracto

Las capas más externas (1 a 4, desde exterior a interior) de la piel seca de cebolla de guarda de variedad Valenciana fue recolectada y congelada a -80 Q C hasta el momento de su empleo. Para la extracción a escala de laboratorio, a 60 g se le agregaron 1000 mL de un tampón de acetato pH 3,5, preparado en agua a 80 Q C con agitación regular. Una vez alcanzados los 60-65 Q C, la mezcla fue homogenizada con Ultraturrax a 20.000 rpm. Luego de la etapa de homogenización, el extracto acuoso se obtuvo por maceración durante 30 minutos con posterior separación de los sólidos insolubles a través de una malla de acero inoxidable (tamiz de 50 pm). El proceso se repitió 2 veces más con igual cantidad de agua y los tres líquidos/filtrados resultantes de cada separación de sólidos insolubles, fueron reunidos y se le hizo pasar por una columna empacada con 400 g de resina granular (Sepabeads ® SP-850 de Sigma-Aldrich), previamente acondicionada con el tampón antes referido (tampón acetato). Luego, la columna fue lavada con 5 volúmenes de agua, hasta la eliminación completa de sales, metabolitos de naturaleza no fenólica, aminoácidos, péptidos tiólicos, proteínas y azúcares simples, entre otros. Finalmente, la benzofuranona y los compuestos polifenólicos fueron recuperados por elución con 200-400 mL de etanol absoluto. El eluato hidroalcohólico fue concentrado a presión reducida (7 milibar, < 40 Q C) para obtener un polvo seco de aspecto parduzco. El polvo se almacenó en desecador bajo vacío durante 24-48 horas para luego ser envasado en un recipiente ámbar y guardado a -80 Q C para su posterior análisis por HPLC-DAD y ESI-MS/MS.

Ejemplo 2: Efectos comparativos antioxidantes de la pre-incubación versus co-incubación de células Caco2 con OAE y SAE sobre el daño oxidativo inducido por indometacina

Para el ensayo de co-incubación las células (lxl0 5 /poc¡llo), estas fueron incubadas inicialmente con diclorodihidrofluoresceina diacetato (DCHF-DA) por 30 min, y posteriormente incubadas durante 40 minutos con buffer fosfato salino (PBS) en presencia de indometacina 275 mM, y en ausencia o presencia de OAE (3 pg/L) o SAE (3 pg/L). Transcurrido dicho tiempo, el tenor oxidativo de las células fue evaluado midiendo la fluorescencia del metabolito oxidado de la sonda antes mencionada. Para el ensayo de pre-incubación, células a las cuales se les pre adicionó e incubo por 30 min con DCFIF-DA, posteriormente se les adicionó OAE o SAE e incubó durante 40 minutos. Terminado dicho tiempo, se removió el medio extracelular y se reemplazó con PBS en células controles y por indometacina en células pre-tratadas con OAE y SAE. El tenor oxidativo de las células fue evaluado midiendo la fluorescencia del metabolito oxidado de la sonda antes mencionada.

En relación a los experimentos de pre-incubación, se observa que relativo al tono oxidativo de células que recibieron solo indometacina (Indo, 100% en la ordenada), aquellas que adicionalmente recibieron quercetina fueron protegidas tan solo en un 40%. En cambio el tono oxidativo de las células que recibieron OAE o SAE, alcanzan el nivel máximo de protección. Es decir, a pesar de haber removido los extractos del medio, la sola pre-incubación de las células con estos fue suficiente para protegerlas contra el posterior daño inducido por indometacina. En los experimentos de co-incubación (adición simultanea), los resultados con quercetina y aquellos obtenidos con los extractos fueron casi idénticos, es decir, en las tres condiciones se obtuvo máxima protección contra el daño oxidativo inducido por indometacina.

Ejemplo 3: Efecto de protección in vivo.

La protección de OAE se probó contra el daño a la mucosa gastro-intestinal inducido por indometacina en ratas Sprague Dawley de peso 180-200 g. Tras un ayuno de 18 horas las ratas recibieron por vía oral 40 mg/Kg de indometacina, y 30 minutos antes OAE en un rango de dosis de 8 a 160 mg/Kg de peso corporal. Transcurridas 3,5 horas todos los animales recibieron una dosis de 120 mg/Kg de FITC-Dextran. Este último compuesto es una sonda empleada tanto en animales de experimentación como en humanos para evaluar la permeabilidad intestinal la cual en animales controles (que no reciben indometacina ni OAE) da cuenta del no paso absoluto de la sonda desde el intestino a la sangre. En el caso de las ratas que recibieron indometacina una concentración de 1,5 pg/mL de FITC-Dextran da cuenta del 100% de permeabilidad intestinal. La sola administración de indometacina incrementa alrededor de 30 veces el paso del marcador fluorescente FITC-Dextran desde el intestino a la sangre, respecto a ratas control (sin daño). Dicho marcador es regularmente empleado en humanos para evaluar las alteraciones en la función de barrera intestinal inducida por AINEs, etanol u otros agentes. La figura 7 da cuenta que la administración de dosis crecientes del presente extracto a animales tratados con indometacina se traduce en una protección creciente contra el ingreso del marcador a la sangre, es decir, contra el daño a la función de barrera inducida por indometacina. Interesante y esencialmente, resultados similares de protección mediada por el presente extracto se obtuvieron en animales en los cuales se indujo un aumento de la permeabilidad intestinal con etanol al 5% per os (administración oral, resultados no se muestran).

Ejemplo 4: Protección de Caco2 contra el daño oxidativo, mitocondrial y celular inducido por indometacina

Se cultivaron células Caco2 (ATCC ® HTB-37™), entre los pases 10 y 15, a 37°C (5% C0 2 /95% aire) en DMEM (medio de Eagle modificado de Dulbecco) suplementado con 10% de suero fetal bovino (Biological Industries USA, Inc.). Las células se tripsinizaron cuando alcanzaron cerca del 90% de confluencia y se usaron para experimentos.

Experimentos de protección contra daño oxidativo: Las células se sembraron (1 x 10 5 /pocillo) en una microplaca de 96 pocilios, y después de cultivar durante 12 h (tiempo en el que se alcanzó un 90% de confluencia celular), se evaluó su estado oxidativo intracelular. Como se describió previamente en Fuentes et al. (Fuentes et al., Quercetin oxidation paradoxically enhances its antioxidant and cytoprotective properties. J. Agrie. Food Chem. 2017 65 11002- 11010 DOI: 10.1021/acs.jafc.7b06214), DCFH-DA se utilizó como sonda reactiva con ROS. Las células se cargaron con DCFH-DA (50 mM) durante 30 minutos, y después de lavarse con PBS, las células se expusieron durante 40 minutos a etanol (5%) o indometacina (275 uM) en ausencia o en presencia de OAE o SAE. Las células incubadas con los extractos se lavaron posteriormente con PBS y se lisaron mediante la adición de Tritón X-100 (0,03%). Después de 10 minutos, se midió la fluorescencia celular (excitación 495 nm/emisión 529 nm) usando un lector multimodo Synergy 2 (Biotek, Winooski, VT, EE. UU.). Se asignó un valor de daño oxidativo del 100% a las células tratadas con indometacina y corresponde a la diferencia que resulta de restar la fluorescencia emitida por las células expuestas a PBS (FLPBS) de la fluorescencia emitida por las células tratadas con indometacina (FLIndo). Para todas las otras condiciones tratadas con células, el porcentaje de tono oxidativo se estimó multiplicando la siguiente ecuación por 100: FLEXP - FLPBS/FLIndo - FLPBS. FLEXP corresponde a la fluorescencia emitida por las células tratadas con OAE o SAE, ya sea en ausencia o en presencia de indometacina o etanol.

Experimentos de protección contra daño mitocondrial: La reducción de MTT, que evalúa la actividad de la deshidrogenasa mitocondrial, se evaluó en las células adherentes resultantes de la exposición durante 40 minutos a PBS o indometacina (275 mM), en ausencia o presencia de OAE. Después de lavar con PBS, se agregaron 20 pL de 2,5 mg/mL de MTT y 80 pL de PBS a cada pocilio, y las células se incubaron adicionalmente durante 150 minutos a 37 Q C (5% C0 2 /95% aire). Se descartó el sobrenadante y se añadieron 100 pL de dimetilsulfóxido para disolver el formazán. Después de 10 minutos de incubación a 37 Q C, se midió la absorbancia a 540 nm. Los resultados se expresan como el porcentaje de reducción de MTT. Se estimó una reducción del 100% de MTT en las células tratadas con PBS.

Experimentos de protección contra daño celular: La liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) se usó como un marcador de toxicidad celular. LDH se evaluó en los sobrenadantes de células expuestas durante 40 minutos a PBS o indometacina (275 pM), en ausencia o presencia de OAE, utilizando el ensayo de integridad de membrana homogénea CytoTox-One™ (excitación 560 nm/emisión 590 nm) como se informó anteriormente (Fuentes et al., Quercetin oxidation paradoxically enhances its antioxidant and cytoprotective properties. J. Agrie. Food Chem. 2017 65 11002-11010 DOI: 10.1021/acs.jafc.7b06214). Los resultados se expresan como porcentaje de LDH filtrado en los medios extracelulares. Se estimó un valor basal del 6% en células tratadas con PBS. La figura 4 muestra que tanto OAE como SAE son eficaces en proteger células Caco2 contra el daño oxidativo inducido porindometacina (Figura 4A) o etanol (Figura 4B). Los efectos de OAE y de SAE son dependientes de la concentración. Como se muestra en las figuras 5A y 5B, ambos extractos son totalmente eficaces también en proteger contra el daño celular, medido como liberación de LDH al medio, y contra el daño mitocondrial, medido como reducción de MTT, ambos inducidos por indometacina. La protección ejercida por estos extractos, se confirmó (no se muestra) igualmente al exponer células Caco2 a concentraciones entre 5-10% de etanol.

Ejemplo 5: Cromatografía que resulta del análisis HPLC-DAD de OAE y SAE.

Se acompaña perfil o cromatograma de HPLC-DAD del extracto acuoso estandarizado de piel de cebolla amarilla (A) y piel de chalota amarilla (B). Como se puede observar, ambos extractos presentan casi idénticos perfiles y numero de picos mayoritarios (cinco en cada caso). Ácido 2,4,6-trihidroxibenzoico (1), ácido 3,4-dihidroxibenzoico (2), 2-(3,4-dihidroxibenzoil)-2,4,5- trihidroxi-3(2H)-benzofuranona (3), 3 ' -glucósido de quercetina (4) y quercetina (5). El contenido por gramo de peso seco del extracto acuoso liofilizado/estandarizado es para: 57 mg de compuesto (1); 55 mg de compuesto (2); 718 mg de compuesto (3); 46 mg de compuesto (4); 9 mg de compuesto (5). Los extractos OAE y SAE fueron analizaron cromatográficamente utilizando un equipo Agilent serie 1200, dotado de un inyector automático y un detector de matriz de fotodiodos (Santa Clara, CA, EE. UU.). El sistema HPLC fue controlado por una Agilent ChemStation (Agilent Technologies 2010). Los compuestos fenólicos, BZF y quercetina (la forma de aglicona) se separaron en condiciones ¡socráticas usando una mezcla de fase móvil de acetonitrilo (A) y agua/ácido fórmico (0,1%) (B), cuya composición (v/v) varió usando lo siguiente Programa de gradiente de HPLC: 10% de A y 90% de B (0-15 min), aumento lineal al 60% de A durante 35 min, y un retorno a las condiciones de inicio en 10 min (Fuentes et al., Quercetin oxidation paradoxically enhances its antioxidant and cytoprotective properties. J. Agrie. Food Chem. 2017 65 11002-11010 DOI:

10.1021/acs.jafc.7b06214). Otras condiciones cromatográficas fueron las siguientes: velocidad de flujo de 0,8 ml/min, columna (250 x 4,6 mm i.d., 5 pm, RP-18e Purospher ® Star, Merck, Darmstadt, Alemania) y temperatura del horno de columna de 25°C. La absorbancia del eluato se controló a 294 nm para BZF y 370 nm para quercetina (Quercetin and related flavonoids conserve their antioxidant properties despite undergoing Chemical or enzymatic oxidation, Food Chem. 2017 234 479-485 DOI: 10.1016/j.foodchem.2017.05.023). Los límites de detección fueron 2,0 mg/100 g de peso seco para BZF y 0,05 mg/100 g de peso seco para quercetina. Ejemplo 6: Capacidad antioxidante de los picos cromatográficos aislados por HPLC-DAD del presente extracto OAE

Para recolectar cada uno de los picos cromatográficos eluidos durante el análisis HPLC-DAD de OAE. Se utilizó un equipo colector de fracciones automatizado Agilent 1260 Infinity acoplado al sistema HPLC. Las fracciones de elución se recogieron de la siguiente manera: pico 1 de 9,5 a 11,0 min, pico 2 de 11,1 a 12,5 min, pico 3 de 27,3 a 27,8 min, pico 4 de 33,3 a 34,5 min, y pico

5 de 38,0 a 39,6 min. Inmediatamente después de la recolección, las fracciones se secaron bajo una corriente de nitrógeno a 40°C y se reconstituyeron en un pequeño volumen de una mezcla de una fase móvil cuya composición era Acetonitrilo/Agua acidificada (1:4 v/v). La identidad química de la(s) molécula(s) que se esperaba que estuviera presente en los picos reconstituidos se confirmó realizando un nuevo análisis ESI-MS/MS. Después de reconstituir cada pico en un pequeño volumen de tampón de fosfato de sodio-solución salina (PBS) y antes de evaluarlos como antioxidantes, los picos se sometieron a análisis HPLC-DAD, usando las condiciones experimentales idénticas a las descritas anteriormente en el ejemplo 5. La figura 6 muestra que los picos 1, 2, 4 y 5, cada uno ensayado de manera aislada, no presentan capacidad antioxidante para proteger células Caco2 contra el daño oxidativo inducido por indometacina, solo el pico 3, correspondiente a la BZF, es capaz de proteger en un 30%. La concentración de BZF contenida en el pico 3 fue de 0,03 nM, concentración a la cual se encuentra en OAE 3 ug/L. Luego de aislar BZF del extracto y ensayar su capacidad antioxidante, la concentración de BZF necesaria para alcanzar protección es 0,3 nM, es decir, 10 veces mayor que aquella necesaria cuando BZF es parte del presente extracto (0,03 nM).

Ejemplo 7: Identificación de BZF en las capas secas más externas de cebolla amarilla y morada, y chalota amarilla y morada. La presencia de BZF en las capas de cascara seca más externa de cebolla amarilla y morada, y en chalota amarilla y morada se identificó mediante el análisis por HPLC-DAD (según metodología descrita en ejemplo 5) de extractos preparados en base a metodología descrita en ejemplo 1. Los resultados en Tabla 2 indican la identificación y cuantificación de BZF solo en las cáscaras de cebollas y chalotas pero no en sus pulpas. Por ello la preparación de los extractos es en base a dicha parte del vegetal.

Tabla 2

1 mg/lQQ g de peso seco

2 ND = No detectado

Ejemplo 8: Determinación de la presencia de BZF en 20 fuentes diferentes de alimentos ricos en quercetina

En la Tabla 1 se muestra que de un total de 20 extractos de hortalizas ricas en quercetina (preparación descrita en ejemplo 1) que fueron analizados por HPLC-DAD (igual metodología que en ejemplo 5), se encontró BZF solamente en la piel de la cebolla amarilla y no en su pulpa.

Ejemplo 9: Comparación de la apacidad antioxidante de OAE y un extracto de cascara seca de ajo contra el daño inducido por indometacina.

Células Caco2 (ATCC ® HTB-37 ™), entre los pases 10 y 15, se cultivaron a 37°C (5% C0 2 /95% aire) en DMEM (medio de Eagle modificado de Dulbecco) suplementado con 10% de suero fetal bovino (Biological Industries USA, Inc.). Las células se tripsinizaron cuando alcanzaron cerca del 90% de confluencia y se usaron para experimentos. Se sembraron (1 x 10 5 /pocillo) en una microplaca de 96 pocilios, y después de cultivar durante 12 h (tiempo en el que se alcanzó un 90% de confluencia celular), se evaluó su estado oxidativo intracelular. Como se describió previamente en Fuentes et al. (Food Chem. 2017), DCFFI-DA se utilizó como sonda reactiva con ROS. Las células se cargaron con DCFH-DA (50 mM) durante 30 minutos, y después de lavarse con PBS, las células se expusieron durante 40 minutos a indometacina (275 uM) o etanol (5%) en ausencia o en presencia de los extractos acuosos de piel de cebollas amarillas o ajo. Las células incubadas con los extractos se lavaron posteriormente con PBS y se lisaron mediante la adición de Tritón X-100 (0,03%). Después de 10 minutos, se midió la fluorescencia celular (excitación 495 nm/emisión 529 nm) usando un lector multimodo Synergy 2 (Biotek, Winooski, VT, EE. UU.). Se asignó un valor de daño oxidativo del 100% a las células tratadas con indometacina y corresponde a la diferencia que resulta de restar la fluorescencia emitida por las células expuestas a PBS (FLPBS) de la fluorescencia emitida por las células tratadas con indometacina (FLIndo).

La figura 8A muestra que para proteger células Caco2 eficazmente contra el daño oxidativo inducido por indometacina se requieren 1333 veces mayor concentración de extracto de pulpa de ajo (4 mg/L) que de OAE (presente extracto, 3 ug/L). Del mismo modo, para proteger contra el daño oxidativo inducido por etanol se requieren también concentraciones a lo menos 3 órdenes de magnitud superior (4 mg/L) que el presente extracto (3 ug/L; figura 8B).