CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se encuadra en el sector técnico de los biomateriales, más específicamente en el relativo a fosfatos calcicos que contribuyen positivamente a Ia regeneración ósea. Los materiales sintéticos a partir de monetita de Ia presente invención son de aplicación en múltiples tratamientos de regeneración ósea con aplicación médica y veterinaria en cirugía traumatológica, cirugía maxilofacial, cirugía dental, cirugía ortognática, endodoncia, oftalmología, neurocirugía y/o procesos osteoporóticos, y otras indicaciones en las que es necesaria Ia regeneración de hueso.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La pérdida de masa y calidad ósea es un grave problema de salud que resulta aún más acuciante en pacientes de edad avanzada. En tratamientos odontológicos es frecuente que, tras una intervención, se produzca una pérdida de masa ósea que resulte en complicaciones y patologías. Esto ocurre, por ejemplo, en Ia reabsorción alveolar posterior a una extracción dental y en Ia enfermedad periodontal. Por otro lado, tanto en traumatología como en otras intervenciones quirúrgicas, Ia perdida ósea es un problema serio de Ia salud que puede incluso ocasionar Ia muerte del paciente.

Desde hace casi un siglo se utilizan biomateriales para reparar o reemplazar segmentos óseos del sistema músculo-esquelético. El uso de injertos de hueso autólogo, es decir, del propio individuo, es un método muy utilizado para rellenar cavidades óseas y para reconstrucciones quirúrgicas. Sin embargo, existe un suministro limitado de hueso y además se somete al paciente a un trauma adicional para obtener el injerto. Otra opción Ia constituyen los aloinjertos de donantes. Sin embargo, estos presentan una velocidad de reabsorción y neoformación ósea más lenta, menor revascularización y capacidad osteogénica, y mayor respuesta inmunogénica y riesgo de transmisión de agentes patógenos. Una alternativa habitualmente utilizada la constituyen materiales a partir de hueso bovino como el BioOss ^® , GenOx Inorg ^® y Orthoss ^® de uso en odontología. Sin embargo, el uso de estos preparados a partir de material biológico representa problemas de posible contaminación con agentes infecciosos y exige un estricto control de calidad. Con el fin de evitar estos problemas se han desarrollado matrices sintéticas.

La investigación en nuevos biomateriales sintéticos para Ia reparación ósea trata de reducir al máximo Ia necesidad del injerto óseo, buscando un sucedáneo artificial que con el tiempo se reabsorba y/o integre con el hueso adyacente y, además, sirva de fijación en fracturas osteoporóticas. Las propiedades mecánicas del sucedáneo de mineral óseo deben ser tan cercanas a las del hueso esponjoso como sea posible. El material debe además contribuir a Ia estabilidad de Ia fractura y ser suficientemente resistente para disminuir el tiempo necesario de inmovilización o soporte externo. El material sucedáneo debe ser biodegradable, biocompatible y osteoinductor, es decir debe atraer células mesenquimales situadas cerca del implante y favorecer su diferenciación en osteoblastos, y también debe ser osteoconductor, es decir, actuar como guía o patrón para Ia formación de hueso nuevo.

Los fosfatos calcicos tienen especial interés en regeneración ya que se asemejan a Ia fase mineral del hueso natural y son susceptibles de remodelación ósea y de reabsorción. Los fosfatos calcicos más comúnmente utilizados incluyen las matrices de hidroxiapatita, fosfato tricálcico, y brushita. Estos materiales pueden administrarse en forma de pastas de cemento, sólidos implantables o formulaciones granulares o pulverulentas.

En el desarrollo de matrices de regeneración ósea destacan productos con los que se pretende favorecer Ia capacidad de regeneración ósea mediante Ia inducción de un cierto grado de porosidad. La introducción de porosidad en el sistema aumenta considerablemente Ia superficie de contacto del material en el lugar del implante, y Ia superficie susceptible de interaccionar con las células de los tejidos circundantes. Ejemplos de granulos de hidroxiapatita porosa de origen coralino incluyen Interpore ^® y ProOsteon ^® . Asimismo, ejemplos de granulos de hidroxiapatita sintética incluyen Apafill-G ^® o ENGIpore ^® . Otros ejemplos comerciales de matrices granulares sintéticas son chronOs o Cerasorb ^® de beta-fosfato tricálcico. Este último comercializado en forma de partículas de diferentes tamaños, entre 150 μm y 2000 μm según Ia necesidad, que se aplican para regeneración alveolar tras su mezcla con sangre del paciente. Otro producto similar, Bi-Ostetic™ esta formado por partículas de 1000 μm a 2000 μm de una mezcla de hidroxiapatita y fosfato tricálcico. Más aún, Collagraft ^® es otro granulado de hidroxiapatita y fosfato tricálcico que además incorpora colágeno. Otros materiales sintéticos osteoinductores incorporados en productos comerciales como CalMatrix™ incluyen el sulfato calcico.

En el ámbito de los materiales de creciente interés en Ia regeneración ósea se encuentra el hidrógeno fosfato de calcio dihidratado [CaHPO ₄ -2H ₂ O], de nombre mineralógico "brushita", que puede encontrarse en Ia naturaleza o producirse sintéticamente a partir de reacciones ácido-base de fosfatos calcicos (LeGeros et al. 1982 J. Dental Res. 61 :343; Brown WE y Chow LC. 1983 J. Dental Res. 62: 672).

En el ámbito de Ia utilización de Ia brushita recientemente se han descrito combinaciones de brushita con fosfato tricálcico resultantes de un proceso de fabricación con exceso de fosfato tricálcico. Se ha demostrado que un granulado compuesto por 87 % en masa de brushita y 17 % en masa de beta- fosfato tricálcico es más degradable y produce una mayor neo-formación ósea que el granulado comercial BioOss ^® de hidroxiapatita bovina (Tamimi F. et al. 2006 J. Clin. Periodontol 33:922-928).

El hidrogeno fosfato de calcio anhidro [CaHPO ₄ ], de nombre mineralógico "monetita", es un material significativamente distinto de Ia brushita, que puede encontrarse como mineral en Ia naturaleza, o sintetizarse directamente o mediante reacción de descomposición de Ia brushita. Existen algunos precedentes de uso de monetita en regeneración ósea como por ejemplo descripciones de uso de mineral de monetita natural mezclada con sangre del paciente (Getter L, et al. 1972 J. Oral Surg. 30:263-268) o su incorporación en soluciones de proteína (WO98/58602) o polímeros biodegradables (US2005209704). Mas recientemente Ia monetita, ha sido evaluada en modelos animales de regeneración ósea (Tamimi F. et al. 2008 J. Biomed. Mater. Res. 87A:980-988). Sin embargo el uso de Ia monetita en Ia regeneración ósea no ha sido explotado por considerarse un material no óptimo en Ia regeneración ósea por su rápida disolución y poca resistencia. Un ejemplo de esto está recogido en Ia formulación de granulos de brushita (Tamimi F. et al. 2007 J. Biomed. Mater. Res. 81A:93-102) donde intencionadamente se evitan temperaturas que resultan en Ia conversión de brushita a monetita.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

En Ia presente invención se describen matrices de monetita sintéticas mejoradas a partir de Ia introducción de otros compuestos de calcio bioactivos que modulan Ia velocidad de degradación del material resultante, promueven Ia regeneración ósea, mejoran sus propiedades osteinductoras, osteoconductoras y biomecánicas.

La presente invención incorpora nuevos materiales para regeneración ósea, su método de obtención, y aplicación en cirugía traumatológica, cirugía maxilofacial, cirugía dental, cirugía ortognática, endodoncia, oftalmología, neurocirugía y/o procesos osteoporóticos, y otras indicaciones en las que es necesaria Ia regeneración de hueso. Los materiales están basados en elementos biocompatibles, biodegradables, osteoconductores y osteoinductores. En particular, Ia presente invención incorpora materiales sintéticos con un 20 % a un 95 %, preferiblemente entre un 40 % y un 90 %, en masa de monetita [Cai _-x M _x HPθ4 , donde 0 < x < 0,05, y donde M puede ser un ion metálico divalente], que en su composición final incorporan entre un 5 % y un 80 %, preferiblemente entre un 10 % y un 60 %, en masa de compuestos de calcio bioactivos. La incorporación de estos compuestos de calcio bioactivos permite modular Ia velocidad de degradación y las propiedades osteoconductoras, osteoinductoras y biomecánicas de matrices que contienen monetita. Los compuestos de calcio bioactivos incluyen fosfatos y/o silicatos calcicos, y/o vidrios bioactivos de sílice. Asimismo, los materiales de Ia presente invención pueden incorporar agentes bioactivos y/o agentes biocompatibles en solución, o como partículas o granulos, o en forma de fibras, que favorecen Ia regeneración ósea, manifiestan determinada acción terapéutica, modulan Ia velocidad de degradación o confieren una mejora de las propiedades mecánicas. Estos materiales pueden fabricarse a partir de reacciones ácido-base que dan lugar a materiales conteniendo brushita, otros productos de Ia reacción y reaccionantes remanentes. La conversión de Ia fracción de brushita en monetita mediante tratamiento de calor origina los materiales deseados. Estos materiales pueden fabricarse en forma de polvos, granulos o como piezas con una forma predeterminada mediante un molde o métodos de conformado tridimensional, y su forma final puede ser modificada mediante tallado, esculpido o pulverizado para dar lugar a Ia forma final deseada. Los materiales pueden fabricarse para contener agentes biocompatibles y/o agentes bioactivos que favorezcan Ia regeneración ósea, y pueden obtenerse con distinta resistencia mecánica y grados de porosidad, interconectada o no, y distintos tamaño de poro.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención incorpora nuevos materiales para regeneración ósea, su método de obtención, y aplicación en cirugía traumatológica, cirugía maxilofacial, cirugía dental, cirugía ortognática, endodoncia, oftalmología, neurocirugía y/o procesos osteoporóticos, y otras indicaciones en las que es necesaria Ia regeneración de hueso. Los materiales están basados en elementos biocompatibles, bioactivos, biodegradables, osteoconductores y osteoinductores. En Ia presente invención los materiales descritos se refieren a las siguientes fórmulas químicas y definiciones:

Monetita: nombre mineralógico de hidrogeno fosfato de calcio anhidro [CaHPO ₄ ], también incorpora monetita parcialmente sustituida [Cai- xMχHPO ₄ , donde 0 < x ≤ 0,05, y donde M es un ion metálico divalente como Mg, Sr, Ba, Fe, Zn, entre otros].

Brushita: nombre mineralógico de hidrogeno fosfato de calcio dihidratado [CaHPO ₄ -2H ₂ O], también incorpora brushita parcialmente sustituida [Cai- xMχHPO ₄ -2H ₂ O, donde O < x < 0,05, y donde M es un ion metálico divalente como Mg, Sr, Ba, Fe, Zn, entre otros]. Dihidrógenofosfato de calcio anhidro: [Ca(H ₂ PO ₄ ) ₂ ].

Dihidrógenofosfato de calcio monohidratado: [Ca(H ₂ PO ₄ ) ₂ .H ₂ O].

Fosfato tricálcico: [Ca3(PO ₄ )2] indistintamente cualquiera de los polimorfos cristalinos estables, beta-fosfato tricálcico [β-Ca3(PO ₄ )2] o alfa-fosfato tricálcico [α-Ca3(PO ₄ )2], y fosfato tricálcico amorfo.

Fosfato octacálcico: [Ca8H ₂ (PO ₄ )6.5H ₂ O].

Hidroxiapatitas: Nombre mineralógico de familia de compuestos con fórmula química [Caio(PO ₄ ) ₆ (OH) ₂ ] donde el Ca puede ser sustituido parcialmente por Na, K, Sr, Mg, Zn, el PO ₄ puede ser sustituido parcialmente por HPO ₄ , CO3, SiO ₄ , y el OH puede ser sustituido parcialmente por F, Cl, CO3. Estas pueden ser tanto bien cristalizadas como poco cristalizadas.

Wollastonita: silicato de calcio [CaSiOs], indistintamente alfa-wollastonita [α-

CaSiOs] ó beta-wollastonita [β-CaSiθ3].

Silicato calcico mixto: [CaM(SiOs) ₂ ] donde M puede ser un ion metálico divalente como Mg, Sr, Ba, Fe, Zn.

Silicato dicálcico: [Ca ₂ SiO ₄ ], indistintamente alfa-silicato dicálcico [α-

Ca ₂ SiO ₄ ], beta-silicato dicálcico [β-Ca ₂ Si0 ₄ ], y gamma-silicato dicálcico [y-

Ca ₂ SiO ₄ ].

Silicato tricálcico: [Ca ₃ SiO ₅ ].

Vidrios bioactivos: Materiales vitreos, obtenidos tanto por métodos de fusión como por sol-gel, que incluyen en su composición Si y Ca, que además pueden contener P, Na, Mg, Sr, entre otros, en concentraciones tales que se permitan obtener un material bioactivo.

GeI de sílice hidratada: [-Si(OH) ₂ -O-] _n .

En particular, Ia presente invención incorpora materiales sintéticos que contienen entre 20 % y 95 %, preferiblemente entre 40 % y 90 %, en masa de monetita [Cai _-X M _X HPO ₄ , donde O ≤ x ≤ 0,05, y donde M es un ion metálico divalente como Mg, Sr, Ba, Fe, Zn, entre otros], que en su composición final incorporan entre 5 % y 80%, preferiblemente entre 10 % y 60 % en masa, de otros compuestos de calcio bioactivos. La monetita es un material osteocon ductor que por su poca resistencia mecánica y rápida disolución en el organismo o medios biológicos, no resulta favorable para aplicaciones de regeneración ósea. La incorporación de compuestos de calcio bioactivos de Ia presente invención permite modular Ia velocidad de degradación de los materiales resultantes y mejora sus propiedades osteoconductoras, osteoinductoras y biomecánicas.

Los "compuestos de calcio bioactivos" incorporados en las matrices de monetita incluyen fosfatos y/o silicatos calcicos, y/o vidrios bioactivos de sílice. En particular los fosfatos calcicos añadidos incluyen, entre otros, el fosfato tricálcico, hidroxiapatitas, y fosfato octacálcico, entre otros. En particular los silicatos calcicos incluyen wollastonita, silicatos calcicos mixtos, silicato dicálcico, silicato tricálcico, entre otros. Los vidrios bioactivos de sílice incluyen vidrios, obtenidos tanto por métodos de fusión como por métodos de sol-gel, que tienen en su composición Si y Ca, que además pueden contener P, Na, Mg, Sr, entre otros, en concentraciones tales que se obtenga un material bioactivo.

Tal y como queda ilustrado, sin limitación por los Ejemplos 1-12, estos compuestos de calcio bioactivos, pueden incorporarse a matrices de monetita generadas a partir de reacciones heterogéneas ácido-base que dan lugar a brushita que posteriormente es descompuesta en monetita.

En un primer paso en el proceso de síntesis de los materiales de Ia presente invención se lleva a cabo una reacción ácido-base en Ia que el componente ácido es una solución de ácido ortofosfórico [H ₃ PO ₄ ] o sus sales diácidas de metales alcalinos o alcalino térreos, preferiblemente de Ca o Mg, tales como el dihidrógenofosfato de calcio anhidro o dihidrógenofosfato de calcio monohidratado, y el componente básico es un compuesto de calcio bioactivo. La adición del componente básico en exceso a Ia mezcla de reacción resulta en una matriz de brushita, como producto de Ia reacción, conteniendo el exceso de compuesto de calcio bioactivo sin reaccionar. El resultado de Ia reacción ácido-base, con exceso del compuesto de calcio bioactivo actuando como el componente básico, origina sólidos conteniendo entre un 24 % y un 96 % en masa de brushita y entre un 4 % y un 74 % en masa de compuestos de calcio bioactivos sin reaccionar según Ia formulación inicial de Ia reacción ácido-base. En Ia formulación de Ia reacción ácido-base, los componentes sólidos generalmente tienen un tamaño de partícula comprendido entre 0,01 μm y 300 μm, preferiblemente entre 0,05 μm y 100 μm, y se encuentran en una proporción, líquido/sólido, entre 0,4 ml/g y 3 ml/g, preferiblemente entre 0,8 ml/g y 2 ml/g. La mezcla de los componentes de Ia reacción ácido-base origina una pasta que rápidamente solidifica, por precipitación de Ia brushita producto de Ia reacción, con Ia forma y tamaño del molde que Ia contiene. Para retardar Ia reacción ácido-base y permitir una mejor manipulación de Ia pasta, Ia solución acuosa preferiblemente incorpora un agente retardador que incluye, entre otros, sin limitación, ácido cítrico [CeHsOz] o sus sales alcalinas o amoniacales, ácido sulfúrico [H ₂ SO ₄ ] o sus sales alcalinas, amoniacales o de metales alcalino térreos, ácido glicólico [C ₂ H ₄ Os] o sus sales alcalinas o amoniacales, ácido acético [C ₂ H ₄ O ₂ ] o sus sales alcalinas o amoniacales, y ácido pirofosfórico [H ₄ P ₂ Oz], o sus sales alcalinas o amoniacales, entre otros.

En un segundo paso en el proceso de síntesis de los materiales de Ia presente invención, se lleva a cabo una descomposición de Ia fracción de brushita en monetita mediante tratamiento térmico a temperaturas entre 40 ⁰ C y 400 ⁰ C, preferiblemente entre 40 ⁰ C y 200 ⁰ C. Este tratamiento térmico puede llevarse a cabo en un segundo paso o realizarse simultáneamente a Ia formación de brushita a partir de Ia reacción ácido-base. La descomposición de Ia fracción de brushita da lugar a los materiales de Ia presente invención conteniendo entre un 20 % y un 95 %, preferiblemente entre un 40 % y un 90 %, en masa de monetita, y entre un 5 % y un 80 %, preferiblemente entre un 10 % y un 60 %, en masa de compuestos de calcio bioactivos.

Tal y como queda ilustrado, sin limitación por los Ejemplos 6 y 7, este método de síntesis también permite Ia fabricación de matrices de monetita que contienen más de un compuesto de calcio bioactivo, como por ejemplo el fosfato tricálcico; el fosfato octacálcico; hidroxiapatitas; Ia wollastonita y/o vidrios bioactivos. La incorporación en exceso a Ia reacción ácido-base de más de uno de estos compuestos de calcio bioactivos origina un producto final que incorpora distintas proporciones de estos compuestos de calcio bioactivos a las matrices de monetita.

Por tanto, una realización de Ia presente invención incorpora materiales conteniendo entre un 20 % y un 95 %, preferiblemente entre un 40 % y un 90 % en masa de monetita y entre un 5 % y un 80 %, preferiblemente entre un 10 % y un 60 % en masa de uno o más compuestos de calcio bioactivos, y su método de producción a partir de reacciones ácido-base en exceso de uno o más componentes básicos, y Ia transformación de Ia fracción de brushita obtenida en monetita.

Tal y como queda ilustrado, sin limitación, en el Ejemplo 8, las matrices de monetita de Ia presente invención pueden incorporar sustituciones con iones metálicos divalentes (M) como magnesio, estroncio, hierro o zinc, que estimulan Ia regeneración ósea o colonización y diferenciación celular. La incorporación de estas substituciones en Ia fracción de monetita puede llevarse a cabo mediante Ia incorporación de los iones metálicos a Ia reacción por adición de las correspondientes sales de dihidrógenofosfato como por ejemplo Mg(H ₂ PO ₄ ) ₂ , Zn(H ₂ PO ₄ ) ₂ , Sr(H ₂ PO ₄ ) ₂ , o de precursores de estas sales, tales como los correspondientes óxidos, hidróxidos, o carbonatos y las cantidades equivalentes de ácido orto-fosfórico. La reacción ácido-base de los dihidrógenofosfatos de calcio y uno o más fosfatos calcicos básicos en exceso, en presencia de iones metálicos, da lugar a Ia precipitación de brushita parcialmente sustituida. La posterior descomposición de Ia brushita parcialmente sustituida resulta en matrices de monetita parcialmente sustituida que contienen otros compuestos de calcio bioactivos. Los materiales pueden fabricarse con distintas proporciones de monetita, monetita parcialmente sustituida, y otros compuestos de calcio bioactivos. En una realización de Ia presente invención Ia monetita parcialmente sustituida puede suponer casi Ia totalidad del material final. En una realización de Ia invención Ia cantidad del ion divalente que sustituye a iones calcio es inferior al 5 %, preferiblemente entre 2 % y 4 %, atómico en Ia fracción de monetita. Estos materiales demuestran propiedades osteoinductoras y osteoconductoras significativamente mayores, y biodegradabilidad significativamente menor que las de monetita sin sustituir. Tal y como queda ilustrado, sin limitación, en los Ejemplos 9 y 10, los materiales de Ia presente invención pueden incorporar "agentes biocompatibles" que modulen Ia biodegradabilidad, favorezcan Ia formación de hueso y/o aumenten Ia resistencia del material, como por ejemplo, albúmina, ácido hialurónico, agarosa, alginato, caseína, colágeno, celulosas, elastina, fibrina, gelatina, quitosano, seda, o de origen sintético como ácido poliláctico, ácido poliglicólico, poliuretano, polipropileno, policaprolactona, polivinilpirrilidona, alcohol polivinilico, poliamidas, policarbonato, politetrafluoretileno, y los derivados de estos, entre otros. Algunos de estos agentes biocompatibles pueden incorporarse a las matrices de monetita durante el proceso de fabricación a partir de su disolución en Ia fase acuosa de Ia reacción ácido-base, tal y como queda ilustrado, sin limitación, por el Ejemplo 9. En este caso, los materiales en disolución se distribuyen homogéneamente en las matrices de monetita, confiriendo una mayor resistencia y/o mejoras en su capacidad de regenerar hueso y/o su biodegradabilidad. En una realización de Ia presente invención Ia concentración de materiales solubles es menor del 15 %, preferiblemente menor del 7 % y más aún inferior al 5 % en masa de los materiales conteniendo monetita.

En otra realización de Ia invención los agentes biocompatibles son poco solubles en un medio acuoso y se incorporan a Ia reacción ácido-base en forma de suspensiones, emulsiones, precipitados, polvos, granulados o fibras, tal y como queda ilustrado, sin limitación, por el Ejemplo 10. En el caso de Ia incorporación en forma de fibras, estas pueden tener unos diámetros que pueden variar entre 10 μm y 2000 μm, preferiblemente entre 50 μm y 1000 μm, y pueden constituir hasta un 70 % en volumen del material conteniendo monetita. Las fibras de rápida disolución in vivo favorecen Ia formación de poros interconectados y Ia colonización celular por invasión del material por células osteoprogenitoras.

La incorporación de estos agentes biocompatibles no solo confiere a las matrices de monetita una mayor resistencia, sino también mejora las propiedades reológicas de Ia pasta y contribuye a una mayor capacidad de regenerar hueso. Esto es de especial aplicación en Ia fabricación de piezas tanto por métodos de conformado tridimensional como a partir de un molde con Ia forma y tamaño según Ia aplicación deseada y/o las necesidades del paciente.

Los materiales de Ia presente invención pueden también formularse para que contengan "agentes bioactivos" que favorezcan los procesos de regeneración ósea, tal y como queda ilustrado, sin limitación en el Ejemplo 11. Estos agentes bioactivos incluyen, sin limitación, compuestos o macromoléculas sintéticas o biológicas que favorecen los procesos de regeneración ósea y/o ejercen alguna acción terapéutica. Estos agentes bioactivos incluyen antibióticos, antiinflamatorios, agentes antitumorales, bisfosfonatos, ácidos nucleicos, y factores de crecimiento celular tales como factor de crecimiento derivado de las plaquetas (platelet derived growth factor, PDGF), factor de crecimiento vascular endotelial (vascular endotelial growth factor, VEGF), proteína morfogenética ósea (bone morphogenic protein, BMP), factor de crecimiento transformador-β (transforming growth factor-β, TGF-β), hormona de crecimiento (growth hormone, GH), factor de crecimiento insulinario-1 (insuline like growth factor^ , IGF1 ); factor de crecimiento insulinario-2 (insuline like growth factor-2; IGF2), factor de crecimiento de fibroblastos (fibroblast growth factor, FGF).

Estos agentes bioactivos pueden incorporarse en solución o en forma de polvos o granulos a Ia reacción ácido-base. Asimismo, para mejorar Ia estabilidad de los agentes bioactivos se pueden añadir a Ia fase acuosa de Ia reacción ácido-base agentes estabilizadores y/o protectores como por ejemplo, y sin limitación, trehalosa, sacarosa, rafinosa, manitol, alcohol polivínílico, polivinilpirrolidona, albúmina, colágeno y/o gelatina. La adición de estos agentes estabilizadores y/o protectores evita Ia degradación del agente bioactivo durante el tratamiento térmico de conversión de Ia fracción de brushita en monetita y confiere estabilidad a largo plazo. De forma alternativa, los agentes bioactivos pueden incorporarse a los materiales de Ia presente invención por impregnación del producto final de Ia reacción ácido-base, o por impregnación del producto final tras el tratamiento térmico de conversión de brushita en monetita. La incorporación de agentes estabilizadores y/o protectores evita Ia degradación de los agentes biológicos durante el proceso de impregnación, tratamiento térmico, secado y/o almacenaje.

Tal y como queda ilustrado, sin limitación, por el Ejemplo 12, los materiales conteniendo monetita pueden formularse con diferentes grados de porosidad y con poros de distintos tamaños, aislados o comunicados entre sí. Esto puede llevarse a cabo mediante Ia incorporación de agentes que resultan en Ia liberación de gas durante el proceso de reacción ácido-base y endurecimiento de Ia pasta. Ejemplos de estos agentes porogénicos incluyen, sin restricción, carbonato calcico, bicarbonato calcico, bicarbonato sódico o peróxido de hidrógeno, entre otros compuestos. La liberación de gas origina que los materiales tras su endurecimiento tengan una porosidad inducida, esto es, adicional a Ia porosidad intrínseca del material, de hasta un 60 % en volumen, y diámetros de poro que pueden variar entre 1 μm y 1000 μm. Asimismo también puede aumentarse Ia porosidad de los materiales de Ia presente invención mediante Ia incorporación a Ia mezcla de reacción ácido- base de aditivos que tras el endurecimiento y posterior disolución originen Ia formación de poros. Ejemplos de estos aditivos incluyen, sin restricción, sales orgánicas e inorgánicas, azucares, alcoholes de azúcares, aminoácidos, proteínas, polisacáridos, o polímeros solubles. Asimismo, los materiales de Ia presente invención pueden fabricarse con una porosidad diseñada llevando a cabo Ia reacción ácido-base y endurecimiento de Ia pasta en un molde que una vez eliminado origina una macroporosidad definida como poros o canales típicamente con un diámetro superior a 200 μm.

Los materiales de Ia presente invención pueden fabricarse en forma de polvos, granulos, o en forma de piezas con forma, tamaño y macroporosidad predeterminadas por un molde. Los reaccionantes también pueden incorporarse a sistemas de conformación, como impresión tridimensional o extrusión, para Ia fabricación de piezas tridimensionales con Ia forma, tamaño y estructura de poro deseadas. Asimismo, una vez endurecida Ia pasta tras Ia reacción ácido-base, Ia forma y tamaño del sólido resultante puede modificarse mediante fragmentación, abrasión, raspado, triturado y/o pulverizado. Este procedimiento puede llevarse a cabo antes o después de Ia conversión de Ia fracción de brushita en monetita. Las piezas formadas a partir de los materiales de Ia presente invención son de aplicación en intervenciones quirúrgicas en las que es necesaria Ia reconstrucción, o fusión, de masa ósea con una forma y tamaño determinados.

En otra forma preferida de Ia presente invención el material se produce en forma de granulos. El tamaño de granulo puede ser de 50 μm a 4000 μm. Preferiblemente el tamaño de granulo está en un rango entre 200 μm y 2000 μm. Esta forma granular es de especial interés en Ia reconstrucción alveolar y otras indicaciones donde es necesaria Ia neoformación de hueso en una cavidad.

Los materiales conteniendo monetita y otros compuestos de calcio bioactivos descritas en Ia presente invención son biocompatibles, biodegradables, osteoinductores y osteoconductores, y tienen interés especial y aplicabilidad en Ia elaboración de materiales con aplicación médica y veterinaria en cirugía traumatológica, cirugía maxilofacial, cirugía dental, cirugía ortognática, endodoncia, oftalmología, neurocirugía y/o procesos osteoporóticos. Asimismo, tal y como queda ilustrado por el Ejemplo 5, los materiales de Ia presente invención son de utilidad en el cultivo in vitro de células autólogas que implantadas junto con los materiales de Ia presente invención aceleran el proceso de regeneración ósea.

La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes 12 Ejemplos, los cuales son ilustrativos y no pretenden ser limitativos de su alcance.

EJEMPLOS

EJEMPLO 1 : Material de monetita y fosfato tricálcico

Para obtener un material compuesto por monetita y fosfato tricálcico [Ca ₃ (P0 ₄ ) ₂ ] se mezclan íntimamente las cantidades de reaccionantes indicadas en Ia Tabla 1 de beta ó alfa-fosfato tricálcico y de dihidrógenofosfato de calcio anhidro [Ca(H ₂ PO ₄ ^]. A Ia mezcla de polvos se añaden 2,0 mL de una solución 0,8 M de ácido cítrico y Ia pasta resultante se mezcla rápidamente durante 1 min y se deja reposar durante 24 h en una cámara a 100 % de humedad relativa y temperatura de 50-60 ⁰ C para completar Ia reacción ácido-base y descomponer Ia brushita formada en monetita. Las pastas endurecidas se secan en Ia estufa a 100-110 ⁰ C y se trituran y clasifican por tamices para recolectar las fracciones con el tamaño de partículas deseado. La composición final de fases de los granulados obtenidos se determina mediante difracción de rayos X (cualitativa) y análisis termo-gravimétrico (cuantitativa) y se muestra en Ia Tabla 1.

Tabla 1

EJEMPLO 2: Material de monetita y fosfato octacálcico

Para obtener un material compuesto por un 80-85 % en masa de monetita y 15-20 % en masa de fosfato octacálcico [CaSH ₂ (PO ₄ )G-SH ₂ O], se mezclan íntimamente 0,60 g de dihidrógenofosfato de calcio anhidro y 1 ,62 g de fosfato octacálcico. A Ia mezcla de polvos se añaden 2,0 mL de una solución 0,8 M de ácido cítrico y Ia pasta resultante se mezcla rápidamente durante 1 min y se deja reposar durante 24 h en una cámara a 100 % de humedad relativa y temperatura de 50-60 ⁰ C para completar Ia reacción ácido-base y descomponer Ia brushita formada a monetita. La pasta endurecida se deja secar al aire y se tritura y clasifica por tamices para colectar las fracciones con el tamaño de partículas deseado. El granulado obtenido se esteriliza mediante una dosis de 25 kGy de radiación gamma.

EJEMPLO 3: Material de monetita e hidroxiapatita

Para obtener un material compuesto por un 80-85 % en masa de monetita y 15-20 % en masa de hidroxiapatita [Caio(Pθ4)6(OH) ₂ ], se mezclan íntimamente 0,88 g de dihidrógenofosfato de calcio anhidro y 1 ,34 g de hidroxiapatita. A Ia mezcla de polvos se añade 2,0 ml_ de una solución 0,8 M de ácido cítrico y Ia pasta resultante se mezcla rápidamente durante 1 min y se deja reposar durante 24 h en una cámara a 100 % de humedad relativa y temperatura de 50-60 ⁰ C para completar Ia reacción ácido base y descomponer Ia brushita formada a monetita. La pasta endurecida se deja secar al aire y se tritura y clasifica por tamices para colectar las fracciones con el tamaño de partículas deseado. El material resultante se esteriliza mediante una dosis de 25 kGy de radiación gamma.

EJEMPLO 4: Solubilidad de distintos materiales de monetita con compuestos de calcio bioactivos

Para determinar Ia velocidad de disolución de materiales con distintas proporciones de monetita y distintos compuestos de calcio bioactivos se toman 100 mg de cada una de ellas, previamente molidas hasta un tamaño de partícula inferior a 100 μm y se colocan en viales. A cada vial se añaden 100 ml_ de solución tamponada de pH 6,0 (100 mM KCOOCH ₃ ; ajustada con KOH y/o HCOOCH ₃ ). Los viales se tapan y se colocan en un agitador orbital a 36,5 ⁰ C durante 30 min. La solución sobrenadante se filtra a través de una membrana de teflón (0,45 μm) y se determina Ia concentración de calcio (Ca) en el filtrado mediante espectrofotometría de plasma inducido. Se realizan tres réplicas de cada formulación. La media de Ia concentración de Ca disuelta para cada material después de incubación en Ia solución tamponada se muestra en Ia Tabla 2. La cantidad de Ca disuelto, y por tanto Ia solubilidad del material, depende directamente de Ia razón monetita/fosfato calcico existente en el granulado para un mismo tipo de fosfato de calcio. Para materiales conteniendo monetita y diferentes fosfatos de calcio con Ia misma razón monetita/fosfato de calcio, Ia solubilidad depende del tipo de fosfato de calcio en el orden fosfato octacálcico > α-fosfato tricálcico > β-fosfato tricálcico > hidroxiapatita.

Tabla 2

EJEMPLO 5: Colonización celular y regeneración ósea de materiales de monetita con compuestos de calcio bioactivos

Para determinar Ia capacidad de regeneración ósea de las distintas matrices de monetita conteniendo compuestos de calcio bioactivos, estas se incuban en presencia de células madre de médula ósea de conejo. Brevemente, se recolectan células de médula ósea de conejo y suspenden en 10 ml_ de Medio Mínimo Esencial con sales de Earl, glutamina y aminoácidos no esenciales (E-MEM) y suplementado con 1 mM de piruvato sódico, 1 ,5 g/L bicarbonato sódico, 60 mg/mL de sulfato de kanamicina y 15% de suero fetal bovino. A pocilios conteniendo 0,5 g del material a evaluar en forma de granulos entre 200 μm y 2000 μm de diámetro, se añade una suspensión celular conteniendo 10 ⁵ células. La colonización celular de los materiales se determina al cabo de 7 días de incubación mediante método indirecto de tinción por MTT (según Mosman T 1983 J. Immunol. Meth. 65: 55-63). Asimismo para determinar Ia capacidad de formación de hueso se implantan los distintos materiales en un modelo de conejo a las que se practica un orificio de 1 cm de diámetro en Ia calota. La evaluación del material se lleva a cabo después de seis semanas tras el implante mediante sacrificio del animal y correspondiente autopsia. Asimismo, uno de los materiales colonizados por células se utiliza como implante en el modelo de regeneración ósea. La Tabla 3 recoge los datos del modelo de crecimiento celular y evaluación in vivo de distintos materiales de monetita conteniendo compuestos de calcio bioactivos. Los efectos observados se clasifican como "Muy abundante: +++++", "Abundante: ++++", "Moderado: +++", "Escaso: ++", "Ausente: +". La incorporación de compuestos de calcio bioactivos resulta en una mejora en Ia capacidad de soportar el crecimiento celular y su capacidad de regeneración ósea.

Tabla 3

EJEMPLO 6: Materiales de monetita β-fosfato tricálcico y wollastonita

Para obtener un material compuesto por un 38-43 % en masa de monetita, 35-40 % en masa de alfa- o beta-wollastonita [α- ó β-CaSiθ ₃ ] y 20-25 % en masa de gel de sílice hidratada [-Si(OH) ₂ -O-] _n , se añaden 2,66 ml_ de una disolución acuosa de ácido ortofosfórico (3,5 M) y ácido cítrico (0,8 M) a 2,22 g de alfa- o beta-wollastonita con tamaño de partícula inferior a 50 μm. Los componentes se mezclan rápidamente durante 1 min para obtener una pasta. Alternativamente, para obtener un material con un 35-40 % en masa de monetita, y cantidades sin determinar de beta-fosfato tricálcico y de alfa- ó beta-wollastonita cristalinos, y gel de sílice hidratada amorfo, se mezclan 1 ,11 g de alfa- ó beta-wollastonita y 1 ,11 g de beta-fosfato tricálcico, ambos con tamaño de partícula inferior a 50 μm, y se añaden 2,66 ml_ de una disolución acuosa de ácido orto-fosfórico (3,5 M) y ácido cítrico (0,8 M). Los componentes se mezclan rápidamente durante 1 min para obtener una pasta.

Las pastas resultantes de las distintas composiciones se vierten en moldes de silicona con forma de discos de 20 mm de diámetro y 5 mm de altura. Las piezas en forma de disco obtenidas por el endurecimiento de Ia pasta se dejan reposar durante 24 h en una cámara a 100 % de humedad relativa y temperatura de 20-30 ⁰ C para completar Ia reacción ácido-base. Los discos se secan en estufa a 100-110 ⁰ C para descomponer Ia brushita a monetita y eliminar el agua absorbida en el gel de sílice. Los sólidos obtenidos se caracterizan por difracción de rayos X, microscopía electrónica de barrido y microanálisis por espectroscopia de energía dispersada de rayos X.

La bioactividad in vitro del material en forma de disco compuesto por un 38-43 % en masa de monetita, beta-fosfato tricálcico y cantidades sin determinar de alfa- ó beta-wollastonita y gel de sílice hidratada amorfo, se compara con Ia de un material con Ia misma forma de disco compuesto por 35- 40 % en masa de monetita y 60-65 % en masa de beta-fosfato tricálcico. Para esto los discos se incuban durante diferentes períodos de tiempo en fluido fisiológico simulado (pH 7,3 a 36,5 ⁰ C) y se determinan los tiempos a los que aparecen los primeros signos y el recubrimiento total de Ia superficie por apatita globular (según Kokubo y Takadama 2006 Biomaterials 27:2907-29). La incorporación de alfa- ó beta-wollastonita a los materiales resulta en un aumento de Ia bioactividad in vitro de los materiales resultantes según muestra Ia Tabla 4.

Tabla 4

EJEMPLO 7: Material de monetita fosfato tricálcico y vidrio bioactivo

Para obtener un material compuesto por un 38-43 % en masa de monetita, vidrio bioactivo de composición 70Siθ2-30CaO y gel de sílice hidratada, se mezclan 2,22 g de vidrio bioactivo con tamaño de partícula inferior a 100 μm y 1 ,16 g de dihidróheno fosfato de calcio anhidro. A Ia mezcla de polvos se añaden 2,71 ml_ de una disolución acuosa de ácido glicólico 1 ,0 M y se mezcla rápidamente durante 1 min para obtener una pasta.

Alternativamente, para obtener un material compuesto por 40-45 % en masa de monetita y cantidades sin determinar de beta-fosfato tricálcico y biovidrio, y un gel de sílice hidratada amorfo, se mezclan 1 ,11 g de vidrio bioactivo de composición 70Siθ2-30CaO con tamaño de partícula inferior a 100 μm, 1 ,11 g de beta-fosfato tricálcico con tamaño de partícula inferior a 100 μm, y 1 ,16 g de dihidróheno fosfato de calcio anhidro. A Ia mezcla de polvos se añaden 2,71 ml_ de una disolución acuosa de ácido cítrico 0,8 M, y se mezcla rápidamente durante 1 min para obtener una pasta. Las pastas resultantes se introducen en moldes de silicona con cavidades de 20 mm de diámetro y 5 mm de altura. Se deja reposar en el molde durante 48 h en una cámara a 100 % de humedad relativa y temperatura de 50-60 ⁰ C para completar Ia reacción ácido-base y descomponer Ia brushita producida a monetita. Los discos endurecidos se extraen del molde y se secan en estufa a 100-110 ⁰ C para eliminar el agua absorbida en el gel de sílice. Los sólidos obtenidos se caracterizan por difracción de rayos, microscopía electrónica de barrido y microanálisis por espectroscopia de energía dispersada de rayos X. Los discos obtenidos de ambos materiales se incuban durante diferentes períodos de tiempo en fluido fisiológico simulado (pH 7,3 a 36,5 ⁰ C) y se determinan los tiempos a los que aparecen los primeros signos y el recubrimiento total de Ia superficie por apatita globular (según Kokubo y Takadama 2006 Biomaterials 27:2907-29). Tal y como demuestra Ia Tabla 5, Ia bioactividad in vitro es mayor para los materiales que contienen biovidrio.

Tabla 5

EJEMPLO 8: Material de monetita parcialmente substituida con iones metálicos y fosfato tricálcico

Para obtener materiales compuestos por un 85-80 % en masa de monetita parcialmente sustituida por magnesio ó por zinc, y por un 15-20 % en masa de β -fosfato tricálcico, se mezclan íntimamente 0,68 g de dihidróheno fosfato de calcio anhidro y 1 ,54 g de β-fosfato tricálcico con tamaño de partícula inferior a 100 μm. A esta mezcla de polvos se añaden 2,0 mL de una disolución de ácido glicólico 1 ,0 M y de Mg(H ₂ PO ₄ ) ₂ ó de Zn(H ₂ PO ₄ ) ₂ 0,4 M. La pasta resultante se mezcla rápidamente durante 1 min y se coloca en moldes de silicona de 15 mm de diámetro y 3 mm de profundidad para conformar discos de estas dimensiones. Los discos en los moldes se dejan reposar durante 24 h en una cámara a 100 % de humedad relativa y temperatura de 50-60 ⁰ C para completar Ia reacción ácido-base y descomponer Ia brushita producida a monetita. Los discos se extraen de los moldes y se dejan secar al aire. Los materiales resultantes, según análisis por difracción de rayos X, análisis termogravimétrico, microscopía electrónica de barrido y microanálisis por espectroscopia de energía dispersada de rayos X, están compuestas por 80-85 % en masa de monetita parcialmente sustituida por magnesio ó por zinc y 15- 20 % en masa de β-fosfato tricálcico. La sustitución del Mg y el Zn en los sitios de Ca del retículo de monetita, según micronálisis realizado sobre granos de esta fase, resultan en un 4 % atómico de sustitución Ca por Mg, y un 3 % atómico de sustitución de Ca por Zn, respectivamente.

La capacidad de los materiales sustituidos con Zn o con Mg de promover Ia adhesión celular se determina mediante ensayo Alamar Blue (según Nakayama et al. 1997 J. Immunol. Methods 204:205-208). Brevemente, para ello se colocan en los pozos de una placa de cultivo de 24 pocilios, 4 discos de cada una de los materiales (sustituidos con Mg o con Zn, o sin sustituir) y 4 discos de Thermanox™ (control) de igual diámetro, previamente esterilizados con radiación gamma (25 kGy). A cada pocilio se añade 1 mL de una suspensión de un cultivo primario de fibroblastos humanos, 1.4 x 10 ⁵ células/mL en medio MEM completo. Las placas se incuban a 37±1°C durante 1 día y se extrae el medio con las células que aún permanecen en suspensión. A los pocilios conteniendo los discos y células adheridas se añade 1 mL de una disolución de Alamar Blue (dilución 1 :10 de Alamar Blue, Serotec, BUFO12A, con MEM sin rojo fenol) y se incuban las placas durante 4 h a 37±1 ⁰ C. Se incluye para cada tiempo de lectura un blanco sin material alguno reemplazando Ia suspensión de células por 1 mL de Ia disolución del reactivo Alamar Blue. De cada pocilio se extraen 4 alícuotas de 100 μL que se traspasan a pocilios de una placa de 96 pocilios para lectura de densidad óptica a 570 nm y una referencia de 630 nm. Los pocilios con los materiales y células adheridas se lavan con una disolución salina tamponada con fosfato y se añade 1 ml_ de MEM completo para continuar Ia incubación a 37±1 ⁰ C hasta el próximo tiempo de lectura. Se realizan lecturas los días 1 , 4, 7, 14, y 21. La densidad óptica leída es directamente proporcional a Ia cantidad de células viables adheridas sobre Ia superficie del material ensayado. La Tabla 6 muestra las lecturas de densidad óptica para cada muestra y período de incubación. Los tres materiales ensayados presentaron una adhesión celular inicial no inferior al 60 % con respecto al control con Thermanox™, y considerable proliferación durante el tiempo de incubación. Las mayores poblaciones celulares estuvieron asociadas en todos los períodos al material con sustitución de Mg, seguida del sustituido con Zn, por último el no sustituido.

Tabla 6

EJEMPLO 9: Material conteniendo agentes biocompatibles incorporados en solución

Para obtener materiales que incorporan distintos agentes biocompatibles solubles se disuelve colágeno Tipo I, hialuronato sódico, o quitosano en concentraciones de 0,5 % en masa a una disolución 0,8 M de ácido cítrico. A estas disoluciones se añaden distintas proporciones, de dihidrógenofosfato de calcio anhidro [Ca(H ₂ PO ₄ ^] con beta-fosfato tricálcico [β-Ca3(PO ₄ ) ₂ ], hidroxiapatita [Caio(PO ₄ )6(OH) ₂ ], o fosfato octacálcico [Ca8H ₂ (PO ₄ )6.5H ₂ O]. Las pastas resultantes se mezclan rápidamente durante 1 min y se colocan en moldes de silicona de 5 mm de diámetro y 12 mm de profundidad, o de 15 mm de diámetro y 3 mm de profundidad, para conformar cilindros y discos de estas dimensiones. Los cilindros y discos en los moldes se dejan reposar durante 24 h en una cámara a 100 % de humedad relativa y temperatura de 20-30 ⁰ C para completar Ia reacción ácido-base. Se dejan secar al aire, se extraen de los moldes y para obtener los productos finales, Ia fracción de brushita del material obtenido se transforma en monetita mediante tratamiento de calor seco a 60 ⁰ C durante 2 horas.

La resistencia a Ia compresión se determina sobre los cilindros de 5 mm de diámetro en una máquina biaxial Instron™ 8511. Los ensayos se llevan a cabo a temperatura ambiente a una velocidad de desplazamiento de 1 mm/min hasta Ia rotura de Ia muestra.

La capacidad de soportar crecimiento celular se lleva a cabo mediante cultivo durante 7 días de Ia línea celular HOS (ECACC no. 87070202) similar a osteoblastos sobre los discos de 15 mm de diámetro y observación de Ia colonización celular mediante microscopía y ensayo de reducción del MTT (según Mosman T 1983 J. Immunol. Meth. 65: 55-63; y Slater T. F. et al. 1963 Biochim. Biophys. Acta 77:383-93). El estudio se realizó a diferentes tiempos durante 7 días.

La capacidad de regeneración ósea se lleva a cabo mediante implante en defectos óseos artificiales creados en tibia de rata y posterior evaluación citológica de los segmentos óseos conteniendo los lugares de implante tras el sacrificio de los animales a los 7, 30 y 120 días. Para Ia implantación se emplearon los fragmentos provenientes del ensayo de resistencia a Ia compresión, previamente triturados en forma de granulos con un tamaño entre 200 μm y 2000 μm y esterilizados con radiación gamma (25 kGy).

Los materiales resultantes, su resistencia a Ia compresión, su capacidad de soportar el crecimiento celular, y su capacidad de regeneración en un modelo animal de rata están recogidos en Ia Tabla 7. La incorporación de estos agentes biocompatibles a las matrices de monetita resulta en una mejora en Ia capacidad de soportar células en cultivo y su capacidad de regenerar hueso. Los efectos observados se clasifican como "Muy abundante: +++++", "Abundante: ++++", "Moderado: +++", "Escaso: ++", "Ausente: +". Tabla 7

EJEMPLO 10: Piezas conteniendo monetita y fibras de agentes biocompatibles

Para obtener materiales incorporando distintos agentes biocompatibles orgánicos en forma de hilos se fabrican hilos de colágeno Tipo I, y por separado también de poliláctido-poliglicólico (50:50), mediante técnicas de electrospinning a partir de soluciones acuosas para el colágeno o de una solución de dimetilformamida para el poliláctido-poliglicólico. El diámetro final de los hilos esta comprendido entre 10 μm y 1000 μm según los parámetros de fabricación utilizados. Los hilos se mezclan íntimamente con 0,88 g de dihidróheno fosfato de calcio anhidro [Ca(HhPO ₄ ^] y 1 ,34 g de hidroxiapatita [Caio(Pθ ₄ )e(OH) ₂ ] o alternativamente 1 ,42 g de beta-fosfato tricalcico [β- Ca3(P02)2], y a Ia mezcla resultante se añade 2,0 ml_ de una solución 0,8 M de ácido cítrico. Las pastas resultantes se mezclan rápidamente durante 1 min y se vierten en moldes de silicona a Ia medida de un hueso y se dejan reposar durante 24 h en una cámara a 100 % de humedad relativa y temperatura de 20- 30 ⁰ C. Una vez endurecidos los distintos materiales se dejan secar al aire. Para obtener los productos finales, Ia fracción de brushita del material obtenido se transforma en monetita mediante tratamiento de calor a 45 ⁰ C durante 2 horas. Los materiales resultantes contienen un 75-80 % en masa de monetita, un 10- 15 % en masa de hidroxiapatita o de beta-fosfato tricálcico y un 10 % en volumen aproximadamente de fibras de colágeno Tipo I o de polilactido- poliglicolico. La incorporación de fibras resulta en una mayor resistencia mecánica y favorece Ia colonización celular.

EJEMPLO 11 : Materiales de monetita y β-fosfato tricálcico con antibiótico

Para obtener materiales de monetita y beta-fosfato tricálcico con antibióticos se mezclan íntimamente 2,11 g de beta-fosfato tricálcico con un tamaño de partícula inferior a 100 μm y 0,11 g de ceftriaxona sódica y 25 mg de trehalosa. Se añaden 1 ,53 mL de disolución de ácido orto-fosfórico 2,0 M y Ia pasta resultante se mezcla rápidamente durante 1 min y se compacta en moldes de silicona de 15 mm de diámetro y 3 mm de profundidad para conformar discos de estas dimensiones. Los discos en los moldes se dejan reposar durante 24 h en una cámara a 100 % de humedad relativa y temperatura de 50-60 ⁰ C para completar Ia reacción ácido-base y descomponer Ia brushita producida a monetita. Los discos se extraen de los moldes y se esterilizan por rayos gamma.

Para el estudio de liberación de antibióticos se colocaron los discos en viales. A una mitad de los discos se les adiciona tampón de fosfato de pH 7,4 (8 mM K ₂ HPO ₄ , 2 mM KH ₂ PO ₄ , 2,7 mM KCI, 137 mM NaCI) y a Ia otra mitad tampón de fosfato de pH 4,0 (1 mM KH ₂ PO ₄ , 137 mM NaCI, 2,7 M KCI) en una relación volumétrica sólido/líquido de a 1 :10. Los viales se colocan en un agitador orbital regulado a 37 ⁰ C durante los 15 días del estudio. La determinación de Ia concentración de ceftriaxona liberada al medio se realiza mediante espectrofotometría UV y comparación con una curva de calibración previamente preparada. Durante las primeras siete horas del estudio las determinaciones se hacen cada hora y a partir del segundo y hasta el cuarto día se realizan cada 24 h, y en el período restante cada tres días como máximo. En cada determinación se extrae todo el líquido y se repone con tampón fresco. Los perfiles de liberación de ceftriaxona a pH 4,0 y 7,4 resultantes se presentan en Ia Tabla 8.

Tabla 8

EJEMPLO 12: Piezas con colágeno y porosidad inducida

Para obtener materiales con un 80-85 % en masa de monetita, un 15-20 % en masa de fosfato tricálcico, un 0,45 % en masa de colágeno, y con distintos grados de porosidad inducida se incorpora entre un 0,1 % y un 3 % en masa de carbonato calcico como agente porogénico a una mezcla de 1 ,42 g beta-fosfato tricálcico y 0,80 g de dihidrógenofosfato de calcio anhidro. A Ia mezcla de polvos se añaden 2,0 ml_ de una solución de ácido cítrico 0,8 M y 0,5 % masa/vol. de colágeno Tipo I. La pasta resultante se mezcla rápidamente durante 1 min, se vierte en un molde cilindrico de 3 mm de diámetro por 6 mm de altura y se deja reposar durante 12 h en una cámara a 100 % de humedad relativa y temperatura de 20-30 ⁰ C. Una vez endurecidos los distintos materiales se dejan secar al aire. Para obtener los productos finales, Ia fracción de brushita del material obtenido se transforma en monetita mediante tratamiento de calor a 45 ⁰ C durante 2 horas. Los materiales resultantes demuestran una porosidad inducida, adicional a Ia microporosidad natural del material, hasta un 50 % y un tamaño de poro entre 50 μm y 800 μm. La capacidad de los materiales resultantes de soportar crecimiento celular se lleva a cabo mediante cultivo durante 7 días de Ia línea celular HOS (ECACC no. 87070202) similar a osteoblastos y observación de Ia colonización celular mediante microscopía y ensayo de reducción del MTT (según Mosman T 1983 J. Immunol. Meth. 65: 55-63; y Slater T.F. et al. 1963 Biochim. Biophys. Acta 77:383-93). El estudio se realizó a diferentes tiempos durante 7 días.

Asimismo Ia eficacia de los materiales resultantes en Ia regeneración ósea se evalúa en defectos óseos artificiales creados en tibia de rata. Para ello se emplean 90 ratas sanas (Rattus norvegicus, Holtzman, ~ 20Og). Grupos de 30 animales se emplean para cada período de seguimiento (7, 30 y 120 días). Tres animales de cada grupo reciben implantes bilaterales de un mismo material experimental en defectos de 3 mm de diámetro creados en Ia región media de Ia diáfisis de Ia tibia. En tres animales de cada grupo se dejan los defectos artificiales creados vacíos como control. Los animales se sacrifican por inyección de tiopental después de 7, 30 y 120 días y se recobran los segmentos óseos conteniendo los lugares de implante y de control. Los bloques óseos se fijan en disolución de Bouin y posteriormente, se lavan, descalcifican, deshidratan, y se incluyen en parafina. Se hacen cortes seriados de 6 μm de grosor que se tiñen con hematoxilina y eosina para examen histológico. Se valora Ia magnitud de neoformación ósea en los sitios de implante. La magnitud de Ia neoformación ósea se clasifica como "Muy abundante: +++++", "Abundante: ++++", "Moderada: +++", "Escasa: ++", "Ausente: +". Los materiales resultantes obtenidos, su capacidad de permitir el crecimiento celular y Ia evaluación de su capacidad de regeneración en un modelo animal de rata se muestran en Ia Tabla 9. La incorporación de porosidad a los materiales resulta en una mayor capacidad de soportar el crecimiento celular y regeneración ósea.

Tabla 9