La présente invention concerne la destruction de biofilms bactériens, en particulier dans le cadre d’infections chroniques bactériennes.

La résistance des bactéries aux antibiothérapies est largement attribuée à leur capacité à passer d’une forme de vie planctonique à une forme de vie communautaire, nommée biofilm, dans les tissus de l’hôte infecté. Le biofilm permet aux bactéries de se protéger contre les molécules antimicrobiennes et les défenses immunitaires de l’hôte, permettant ainsi aux pathogènes de survivre dans des environnements hostiles en leur conférant une résistance à diverses molécules antibactériennes. De plus, un faible pourcentage de cellules bactériennes qualifiées de « cellules persistantes » se maintiennent au sein d’un biofilm exposé aux antibiotiques devenant donc temporairement résistantes et responsables de la reprise d’infections récurrentes.

Le pathogène opportuniste Pseudomonas aeruginosa est une cause majeure de mortalité chez les patients immunodéprimés, en particulier chez les patients souffrant de mucoviscidose.

Le traitement des infections sévères à P. aeruginosa est réalisé au moyen de plusieurs antibiotiques présentant, pour les plus efficaces (la tobramycine, la colistine, la ciprofloxacine, la gentamicine, la nétilmicine et l’amikacine) un index thérapeutique étroit dû à l’existence d’une néphrotoxicité et d’une ototoxicité. Par ailleurs, ces traitements engendrent dans la durée l’apparition de souches résistantes aux antibiotiques.

C’est la raison pour laquelle P. aeruginosa a été classé dans le groupe de bactéries ESKAPE (Santajit et Indrawattana (2016) Biomed. Res. Int. 2016 :2475067), regroupant les pathogènes les plus critiques en termes de résistance aux antibiotiques et nécessitant la découverte de nouvelles molécules ou stratégies thérapeutiques. Plus récemment, l’OMS a classé P. aeruginosa dans le top 3 des priorités en terme de bactéries critiques pour leurs antibio-résistances (aux carbapénèmes en particulier).

La présente invention vise à répondre à ce besoin.

La présente invention résulte de la découverte inattendue, par les inventeurs, que l’hormone « Peptide Natriurétique Auriculaire » ou ANP (« Atrial Natriuretic Peptide » en anglais) est capable, à faible dose (dès 0.1 nM), et très rapidement (dès 30 min après administration), de détruire environ 80% des biofilms de P. aeruginosa pré-établis et ceci de manière dose-dépendante. Les inventeurs ont également démontré que d’autres peptides appartenant à la famille des peptides natriurétiques, plus particulièrement l’ostéocrine, la lébétine 2a et la lébétine 1b, étaient également capables à faible dose de détruire des biofilms de P. aeruginosa pré-établis.

Les peptides natriurétiques constituent une famille d’hormones initialement identifiées pour leurs activités cardiovasculaires, osmorégulatrices, de régulation de la pression artérielle et d’élimination de sodium par les reins (natriurèse, d’où leur nom). Les trois membres principaux de cette famille sont l’ANP, le peptide « Brain Natriuretic Peptide » ou BNP et le peptide « C-type Natriuretic Peptide » ou CNP. La longueur de ces peptides est comprise entre 22 et 38 acides aminés et leur structure est caractérisée, pour la plupart des membres, par un pont disulfure formant une boucle de 17 acides aminés conférant à cette molécule une forme dite « oméga ».

Il a été précédemment montré que GANR, le BNP et le CNP empêchaient la formation de biofilm de P. aeruginosa (Desriac et al. The natriuretic peptide hormones prevent Pseudomonas aeruginosa biofilm formation through a spécifie bacterial target. 16th international conférence on Pseudomonas, Sep 2017, Liverpool, United Kingdom; Rosay ét al. (2015) MBio 6 :6 ; Desriac ét al. (2018) Pathogens 7 :47).

Toutefois, aucune action de ces peptides sur des biofilms déjà établis n’a été montrée à ce jour.

Les inventeurs ont en outre ici montré que la capacité de GANR de disperser les biofilms déjà établis n’était pas associée ou due à une capacité de GANR à tuer les bactéries et est sans effet sur la virulence intrinsèque des bactéries. Ce mode d’action particulier permet d’éviter l’émergence de souches bactériennes résistantes à cette molécule.

Par ailleurs, les inventeurs ont montré que lorsque GANR, à faible dose, est utilisé en combinaison avec un antibiotique, tel que la tobramycine ou la ciprofloxacine, lui-même utilisé à faible dose, plus de 97% du biofilm établi est détruit.

Ainsi, GANR et les antibiotiques présentent une action synergique sur la destruction des biofilms bactériens.

La présente invention concerne donc un peptide natriurétique choisi dans le groupe constitué de (i) l’ostéocrine, un propeptide d’ostéocrine ou un dérivé de l’ostéocrine, (ii) une lébétine , un fragment de lébétine ou un dérivé de lébétine ou d’un fragment de lébétine, et (iii) un peptide ANP, propeptide d’ANP ou dérivé de peptide ANP, pour son utilisation dans une méthode de traitement thérapeutique d’une infection bactérienne, en particulier d’une infection bactérienne chronique, associée à un biofilm bactérien chez un sujet, dans laquelle ledit peptide natriurétique, en particulier ledit peptide ANP, propeptide d’ANP ou dérivé de peptide ANP, disperse ledit biofilm bactérien.

Dans un mode de réalisation particulier, ledit peptide natriurétique, en particulier ledit peptide ANP, propeptide d’ANP ou dérivé de peptide ANP, est utilisé en combinaison avec un antibiotique.

Un autre objet de l’invention concerne une composition pharmaceutique comprenant (A) un peptide natriurétique choisi dans le groupe constitué de (i) l’ostéocrine, un propeptide d’ostéocrine ou un dérivé de l’ostéocrine, (ii) une lébétine, un fragment de lébétine ou un dérivé de lébétine ou d’un fragment de lébétine, et (iii) un peptide ANP, propeptide d’ANP ou dérivé de peptide ANP, et (B) un antibiotique.

Un autre objet de l’invention concerne une composition pharmaceutique comprenant (A) un peptide natriurétique choisi dans le groupe constituté de (i) l’ostéocrine, un propeptide d’ostéocrine ou un dérivé de l’ostéocrine, (ii) une lébétine, un fragment de lébétine ou un dérivé de lébétine ou d’un fragment de lébétine, et (iii) un peptide ANP, propeptide d’ANP ou dérivé de peptide ANP, et (B) un antibiotique, pour son utilisation dans une méthode de traitement thérapeutique d’une infection bactérienne, en particulier d’une infection bactérienne chronique, associée à un biofilm bactérien chez un sujet.

Un autre objet de l’invention concerne une combinaison pharmaceutique antibactérienne comprenant (A) un peptide natriurétique choisi dans le groupe constitué de (i) l’ostéocrine, un propeptide d’ostéocrine ou un dérivé de l’ostéocrine, (ii) une lébétine , un fragment de lébétine ou un dérivé de lébétine ou d’un fragment de lébétine, et (iii) un peptide ANP, propeptide d’ANP ou dérivé de peptide ANP, et (B) un antibiotique pour une utilisation simultanée, séparée ou séquentielle dans le traitement thérapeutique d’une infection bactérienne, en particulier d’une infection bactérienne chronique, associée à un biofilm bactérien chez un sujet.

La présente invention concerne également l’utilisation in vitro ou ex vivo d’un peptide natriurétique choisi dans le groupe constitué d (i) l’ostéocrine, un propeptide d’ostéocrine ou un dérivé de l’ostérocrine, (ii) une lébétine , un fragment de lébétine ou un dérivé de lébétine ou d’un fragment de lébétine, et (iii) un peptide ANP, un propeptide d’ANP ou un dérivé de peptide ANP, pour disperser un biofilm bactérien. Description détaillée de l’invention

Peptides natriurétiques

Par“peptide natriurétique”, on entend ici un membre de la famille d’hormones et neurohormones eucaryotes composée de 3 principaux membres : le peptide natriurétique auriculaire (« Atrial Natriuretic Peptide ») ou ANP, le peptide natriurétique de type B (« Brain Natriuretic Peptide ») ou BNP et le peptide natriurétique de type C (« C-type Natriuretic Peptide ») ou CNP. Ces peptides sont principalement synthétisés et libérés par les cardiomyocytes et les cellules endothéliales. A côté de ces 3 principaux membres, la famille des peptides natriurétiques incluent également l’ostéocrine ainsi que des peptides « natriurétiques-like » tels que la lébétine.

Ces divers peptides natriurétiques présentent une certaine similarité en terme de séquence. Tous, exceptés l’ostéocrine et la lébétine 1 b, possèdent en effet une boucle de 17 acides aminés formée par un pont disulfure. Parmi les 17 acides aminés qui forment cette boucle, 1 1 sont communs à GANR et à la lébétine 2a. L’ostéocrine présente également une signature de séquence conservée dans cette région, avec 7 acides aminées communs avec GANR. Cette région conservée de la séquence des peptides natriurétiques permet leur liaison aux récepteurs humains aux peptides natriurétiques (NPR-A, NPR-B et NPR-C). De plus, il a été montré que GANR, l’ostéocrine et la lébétine 2a se lient avec une forte affinité sur le senseur AmiC de P. aeruginosa (Rosay et al. (2015) mBio 25 :e01033-15). En revanche, de nombreuses différences dans la séquence en acides aminés de leurs extrémités C et N terminales sont observées, expliquant leurs activités physiologiques différentes. Il est intéressant de noter qu'outre les produits finaux actifs présentés ci- dessous, la synthèse, la maturation et la dégradation partielle des peptides natriurétiques peuvent aboutir à la production de nombreux variants possédant une activité physiologique.

Il existe de nombreux membres de cette famille chez l'homme et dans le règne animal : l’urodilatine, décrite ci-dessous, l’uroguanyline, la guanyline, le VNP, le DNP et le KNP.

Le peptide natriurétique ventriculaire (VNP) a initialement été identifié chez l'anguille comme étant un peptide possédant des fonctions physiologiques semblables à celles de GANR et qui a, depuis, été identifié chez de nombreuses espèces de poissons (Kawakoshi ét al. (2004) J. Mol. Endocrinol. 32 :547-555).

Le dendroapsis natriuretic peptide (DNP) a été identifié dans le venin du serpent mamba vert (Schweitz et al. (1992) J. Biol. Chem. 267 :13928-13932) et le Krait natriuretic peptide (KNP) a été identifié dans le venin du serpent Bungarus flaviceps (Sridharan ét al. (2015) Biochem. J. 469 :255-266). De nombreux autres composés similaires aux peptides natriurétiques sont régulièrement identifiés dans les venins de vipères comme les lébétines isolées du venin de Macrovipera lebetina, de grands reptiles comme les dragons de Komodo (Natriuretic peptide toxin Var2) (Fry et al. (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106 :8969-8974) et, de même, dans le venin de scorpions (Alves et al. (2013) Toxicon 74 :19-26). Ils sont généralement appelés peptides à activités natriurétiques-like. Parmi ceux-ci, les peptides natriurétiques préférés sont les lébétines L2a (Gly1 -Gly38) et L1 b (Asp2-Gly13). Enfin, il est décrit chez la bactérie Escherichia coli la présence d’une entérotoxine dénommée ST (« heat-stable enterotoxin ») qui présente une structure peptidique proche de la guanyline et de l’uroguanyline humaines et qui présente une activité natriurétique-like.

Le peptide natriurétique utilisé dans le cadre de l’invention est sélectionné dans le groupe constitué de (i) l’ostéocrine, un propeptide d’ostéocrine ou un dérivé d’ostéocrine, (ii) une lébétine, un fragment de lébétine ou un dérivé de lébétine ou d’un fragment de lébétine, et (iii) un peptide ANP, un propeptide d’ANP ou un dérivé de peptide ANP.

Par“ANP”, on entend ici le peptide correspondant à la principale forme mature issue du clivage du fragment N-terminal de la pro-hormone proANP.

Typiquement l’ANP humaine est un peptide de 28 acides aminés issu du clivage du fragment N-terminal de la pro-hormone proANP de 126 acides aminés. L’ANP humaine est formée des acides aminés 99 à 126 de la pro-hormone proANP.

L’ANP est un peptide très conservé dans sa séquence en acides aminés puisque cette séquence est identique entre l’homme, les singes, les gorilles, le cochon, les chevaux et les moutons par exemple (Takei et al. (201 1 ) General and Comparative Endocrinology 171 :258-266). Toutefois, chez de nombreuses espèces animales qui l’expriment, quelques différences de séquence sont observées. Ainsi, le rat, la souris et le lapin ont un acide aminé différent en position 12 (Isoleucine à la place d’une Méthionine chez l’homme). De même, l’éléphant présente un ANP raccourci à 27 aminés et deux acides aminés différents par rapport à l’homme (Takei et al. (201 1 ) General and Comparative Endocrinology 171 :258-266).

Par « propeptide d’ANP », on entend ici tout peptide issu de l’expression du gène codant le preproANP, de la maturation et des clivages, éventuellement successifs, du preproANP, et comprenant la séquence peptidique de l’ANP.

Le terme « propeptide d’ANP » inclut ainsi la pro-hormone proANP (typiquement de 126 acides aminés chez l’homme) portant l’ANP dans sa partie C-terminale, la préprohormone preproANP (typiquement de 151 acides aminés chez l’homme), qui correspond à la protéine produite chez l’homme par le gène NPPA. Le preproANP porte un peptide signal qui est clivé pour former le proANP.

Dans le contexte de la présente invention, le terme « propeptide d’ANP » inclut également tout peptide issu de la maturation et des clivages du preproANP et du proANP.

L’ANP consiste typiquement en la séquence d’acides aminés SLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRY (SEQ ID NO : 1 ), avec un pont disulfure localisé entre les acides aminés 7 et 23.

Le proANP consiste typiquement en la séquence d’acides aminés NPMYNAVSNADLMDFKNLLDHLEEKMPLEDEVVPPQVLSEPNEEAGAALSPLPEVPPWT GEVSPAQRDGGALGRGPWDSSDRSALLKSKLRALLTAPRSLRRSSCFGGRMDRIGAQS GLGCNSFRY (SEQ ID NO : 3).

Le preproANP consiste typiquement en la séquence d’acides aminés MSSFSTTTVSFLLLLAFQLLGQTRANPMYNAVSNADLMDFKNLLDHLEEKMPLEDEVVPP QVLSEPNEEAGAALSPLPEVPPWTGEVSPAQRDGGALGRGPWDSSDRSALLKSKLRAL LTAPRSLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRY (SEQ ID NO : 4).

Par « dérivé d’ANP », on entend ici des dérivés naturels ou synthétiques de l’ANP.

Par « dérivé d’ANP », on entend ici un peptide ANP tel que défini ci-dessus dans lequel un ou plusieurs résidus d’acide aminé a été modifié chimiquement, par exemple par alkylation, acylation, amidation, méthoxylation, formation d’ester, formation d’amide, insertion d’un substituant lipophile, ajout de polyéthylène glycol (PEG), ajout d’une chaîne glucidique.

Par « dérivé d’ANP », on entend ici également des formes tronquées d’ANP correspondant aux acides aminés 4 ou 5 à 28 de la forme entière de l’ANP, des formes ayant une structure qui est un dimère antiparallèle de l’ANP, en particulier l’homodimère b- ANP, un polymère constitué de monomères d’ANP.

Par « dérivé d’ANP », on entend aussi des variants peptidiques d’ANP, c’est-à-dire des formes intermédiaires obtenues au cours de la synthèse, la maturation et la dégradation partielle de l’ANP tel que défini ci-dessus, ainsi que des peptides ANP dans lesquels 1 à 12, en particulier 1 à 10, en particulier 1 à 5, en particulier 1 à 4, en particulier 1 à 3, plus particulièrement 1 ou 2 acides aminés ont été supprimés, substitués ou ajoutés et conservant l’activité de l’ANP sauvage.

Dans un mode de réalisation particulier, le dérivé d’ANP est un peptide ANP dans lequel a été substitué l’acide aminé Phénylalanine (Phe) de la boucle en position 8 (et remplacé par un acide aminé Alanine par exemple).

Dans un autre mode de réalisation particulier, le dérivé d’ANP est un peptide ANP dans lequel a été substitué l’acide aminé Phénylalanine (Phe) en position 26 ou l’acide aminé Sérine en position 25, deux acides aminés responsables de la dégradation de GANR sauvage (Ichiki and Burnett (2017) Cire J. 81 :913-919).

Dans un mode de réalisation particulier, le dérivé d’ANP est une forme allongée de GANR, l’urodilatine, de séquence TAPRSLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRY (SEQ ID NO : 2), avec un pont disulfure entre les acides aminés 1 1 et 27. Ce peptide correspond à un ANP allongé de 4 acides aminés du coté N-terminal.

Dans un autre mode de réalisation particulier, le dérivé d’ANP est une forme allongée du peptide ANP de 12 acides aminés, tel que le fsANP qui est une forme allongée de GANR de 12 acides aminés du côté C-terminal et qui est présente chez les personnes portant une mutation dans le gène codant GANR (Dickey et al. (2009) J Biol Chem 284:19196-19202).

Dans un autre mode de réalisation particulier, le dérivé d’ANP est une version linéarisée de GANR, avec clivage du pont disulfure (initialement localisé entre les acides aminés 7 et 23).

Typiquement, les dérivés d’ANP pouvant être utilisés dans le cadre de la présente invention sont de préférence modifiés par rapport à GANR de manière à avoir une ½ vie plus longue que GANR et/ou d’avoir une affinité plus faible que GANR pour les récepteurs endogènes humains de GANR.

Par « ostéocrine », on entend ici une hormone agissant comme régulateur de la croissance dendritique dans le cortex cérébral en développement en réponse à une expérience sensorielle.

Typiquement l’ostéocrine humaine est un peptide de 50 acides aminés issu du clivage du fragment N-terminal de la pro-hormone pro-ostéocrine de 106 acides aminés. L’ostéocrine humaine est formée des acides aminés 83 à 132 de la pro-hormone pro- ostéocrine.

Par « propeptide d’ostéocrine », on entend ici la pro-hormone pro-ostéocrine de 106 acides aminés portant l’ostéocrine dans sa partie C-terminale et/ou la préprohormone prepro-osteocrine de 132 acides aminés, qui correspond à la protéine produite, chez l’homme par le gène OSTN. La prépro-ostéocrine porte un peptide signal qui est clivé pour former la pro-ostéocrine de 106 acides aminés.

L’ostéocrine consiste typiquement en la séquence d’acides aminés SFSGFGSPLDRLSAGSVDHKGKQRKVVDHPKRRFGIPMDRIGRNRLSNSR (SEQ ID NO : 5). La pro-ostéocrine consiste typiquement en la séquence d’acides aminés VDVTTTEAFDSGVIDVQSTPTVREEKSATDLTAKLLLLDELVSLENDVIETKKKRSFSGF G SPLDRLSAGSVDHKGKQRKVVDHPKRRFGIPMDRIGRNRLSNSRG (SEQ ID NO : 6).

La prépro-ostéocrine consiste typiquement en la séquence d’acides aminés MLDWRLASAHFILAVTLTLWSSGKVLSVDVTTTEAFDSGVIDVQSTPTVREEKSATDLTA KLLLLDELVSLENDVIETKKKRSFSGFGSPLDRLSAGSVDHKGKQRKVVDHPKRRFGIPM DRIGRNRLSNSRG (SEQ ID NO : 7).

Dans le contexte de la présente invention, le terme « propeptide d’ostéocrine » inclut également tout peptide issu de la maturation et des clivages de la prépro-ostéocrine et de la pro-ostéocrine.

Par « dérivé d’ostéocrine », on entend ici des dérivés naturels ou synthétiques de l’ostéocrine.

Par « dérivé d’ostéocrine », on entend ici une ostéocrine telle que définie ci-dessus dans laquelle un ou plusieurs résidus d’acide aminé a été modifié chimiquement, par exemple par alkylation, acylation, amidation, méthoxylation, formation d’ester, formation d’amide, insertion d’un substituant lipophile, ajout de polyéthylène glycol (PEG), ajout d’une chaîne glucidique.

Par « dérivé d’ostéocrine », on entend aussi des variants peptidiques d’ostéocrine, c’est-à-dire des formes intermédiaires obtenues au cours de la synthèse, la maturation et la dégradation partielle de l’ostéocrine telle que définie ci-dessus.

Par « lébétine », on entend ici un peptide issu du venin de vipère Macrovipera lebetina.

La lébétine telle que définie ci-dessus est de préférence la lébétine 2a ou la lébétine 1b.

Par « lébétine 2a », on entend ici un peptide produit par la vipère Macrovipera lebetina décrit dans Barbouche ét al. (1996) FEBS Lett. 392 :6-10.

Typiquement la lébétine 2a est un peptide de 38 acides aminés.

La lébétine 2a consiste typiquement en la séquence d’acides aminés

GDNKPPKKGPPNGCFGHKIDRIGSHSGLGCNKVDDNKG (SEQ ID NO : 8) avec un pont disulfure localisé entre les acides aminés 14 et 30.

Par « lébétine 1b », on entend ici un peptide produit par la vipère Macrovipera lebetina décrit dans Barbouche ét al. (1998) Toxicon 36(12):1939-47.

Typiquement la lébétine 1b est un peptide de 12 acides aminés.

La lébétine 1b consiste typiquement en la séquence d’acides aminés

DNKPPKKGPPNG (SEQ ID NO: 9). Par « fragment de lébétine », on désigne ici un fragment d’au moins 10 acides aminés de ladite lébétine, de préférence de la lébétine 2a telle que définie ci-dessus ou de la lébétine 1 b telle que définie ci-dessus.

Ledit fragment de lébétine comprend de préférence au moins 10 acides aminés, de préférence au moins 12 acides aminés, de préférence au moins 14 acides aminés, de préférence au moins 16 acides aminés et/ou au plus 30 acides aminés, de préférence au plus 25 acide aminés, de préférence au plus 20 acides aminés.

Un fragment de lébétine 2a comprend par exemple les acides aminés 4 à 10 de la séquence SEQ ID NO: 8, de préférence les acides aminés 2 à 13 de la séquence SEQ ID NO: 8.

Un fragment de lébétine 2a consiste par exemple en les acides aminés 1 à 13 de la séquence SEQ ID NO: 8.

La lébétine 1b de séquence SEQ ID NO: 9 est également un fragment de lébétine 2a consistant en les acides aminés 2 à 13 de la séquence SEQ ID NO: 8.

Par « dérivé de lébétine ou d’un fragment de lébétine », on entend ici des dérivés naturels ou synthétiques de la lébétine ou d’un fragment de lébétine.

Par « dérivé de lébétine ou d’un fragment de lébétine », on entend ici une lébétine telle que définie ci-dessus ou un fragment de lébétine tel que défini dans laquelle/lequel un ou plusieurs résidus d’acide aminé a été modifié chimiquement, par exemple par alkylation, acylation, amidation, méthoxylation, formation d’ester, formation d’amide, insertion d’un substituant lipophile, ajout de polyéthylène glycol (PEG), ajout d’une chaîne glucidique.

Par « dérivé de lébétine ou d’un fragment de lébétine », on entend aussi des variants peptidiques de lébétine ou d’un fragment de lébétine, c’est-à-dire des formes intermédiaires obtenues au cours de la synthèse, la maturation et la dégradation partielle de la lébétine ou d’un fragment de lébétine telle que définie ci-dessus.

Par « autre peptide natriurétique », on entend ici un peptide natriurétique qui n’est pas GANR, un propeptide d’ANP ou un dérivé d’ANP (tel que l’urodilatine).

Biofilm bactérien et infection bactérienne

Par « infection bactérienne », on entend ici une infection due à une ou plusieurs espèces de bactéries, en particulier des bactéries à Gram négatif et/ou à Gram positif.

Dans un mode de réalisation particulier, l’infection bactérienne est une infection bactérienne chronique. Dans un mode de réalisation particulier, l’infection bactérienne est une infection à une bactérie à Gram négatif.

Dans un mode de réalisation particulier, l’infection bactérienne est une infection à une bactérie du genre Pseudomonas, plus particulièrement de l’espèce Pseudomonas aeruginosa.

Dans un autre mode de réalisation particulier, l’infection bactérienne est une infection à une bactérie à Gram positif.

Dans un mode de réalisation particulier, l’infection bactérienne est une infection à une bactérie du genre Staphylococcus, plus particulièrement de l’espèce Staphylococcus aureus.

Par « biofilm bactérien », on entend ici une communauté de bactéries adhérant entre elles et à une surface. La production de biofilm est caractérisée par la sécrétion d'une matrice qui est susceptible d'adhérer à de nombreux types de surface, et permettre la cohésion et la protection des bactéries constituant cette structure.

Dans le cadre de l’invention, le biofilm bactérien comprend au moins la ou les espèces bactériennes responsables de l’infection à traiter.

Dans le cadre de l’invention, ledit peptide natriurétique, en particulier ledit peptide ANP, propeptide d’ANP ou dérivé de peptide ANP, disperse le biofilm bactérien.

Par « dispersion du biofilm bactérien » ou « destruction du biofilm bactérien », on entend ici que les bactéries formant la communauté constituant le biofilm bactérien se séparent les unes des autres et de la surface, de sorte que le biofilm diminue voire disparait, rendant typiquement les bactéries à nouveau accessibles aux antibiotiques.

Dans un mode de réalisation particulier, ledit biofilm bactérien est dispersé à au moins 50%, en particulier au moins 55%, en particulier au moins 60%, en particulier au moins 65%, en particulier à au moins 70%, au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, au moins 95% ou au moins 100%.

Avantageusement, ledit peptide natriurétique, en particulier ledit peptide ANP, propeptide d’ANP ou dérivé de peptide ANP, disperse le biofilm bactérien sans tuer les bactéries constituant ce biofilm.

Il est toutefois à noter que lorsque ledit peptide natriurétique, en particulier ledit peptide ANP, propeptide d’ANP ou dérivé de peptide ANP, est utilisé en combinaison avec un antibiotique, les bactéries constituant le biofilm peuvent être tuées par ledit antibiotique, notamment lorsqu’elles sont libérées suite à l’effet dispersif du peptide natriurétique, en particulier de l’ANP, d’un propeptide d’ANP ou d’un dérivé d’ANP.

Application thérapeutique

La présente invention concerne un peptide natriurétique choisi dans le groupe constitué de (i) l’ostéocrine, un propeptide d’ostéocrine ou dérivé d’ostéocrine, (ii) une lébétine (de préférence la lébétine 2a ou la lébétine 1 b), un fragment de lébétine ou un dérivé de lébétine ou d’un fragment de lébétine, et (iii) un peptide ANP, propeptide d’ANP ou dérivé de peptide ANP, tel que défini dans la section «Peptides natriurétiques » ci- dessus pour son utilisation dans une méthode de traitement thérapeutique d’une infection bactérienne associée à un biofilm bactérien, telle que définie dans la section « Biofilm bactérien et infection bactérienne » ci-dessus chez un sujet, dans laquelle ledit peptide natriurétique disperse ledit biofilm bactérien.

La présente invention concerne également l’utilisation d’un peptide natriurétique choisi dans le groupe constitué de (i) l’ostéocrine, un propeptide d’ostéocrine ou dérivé d’ostéocrine, (ii) la lébétine (de préférence la lébétine 2a ou la lébétine 1 b), un fragment de lébétine ou un dérivé de lébétine ou d’un fragment de lébétine, et (iii) un peptide ANP, propeptide d’ANP ou dérivé de peptide ANP, tel que défini dans la section « Peptides natriurétiques » ci-dessus pour la fabrication d’un médicament pour le traitement thérapeutique d’une infection bactérienne associée à un biofilm bactérien, telle que définie dans la section « Biofilm bactérien et infection bactérienne » ci-dessus chez un sujet, dans laquelle ledit peptide natriurétique disperse ledit biofilm bactérien.

La présente invention concerne également une méthode de traitement thérapeutique d’une infection bactérienne associée à un biofilm bactérien, telle que définie dans la section « Biofilm bactérien et infection bactérienne » ci-dessus chez un sujet souffrant d’une infection bactérienne, en particulier d’une infection chronique bactérienne, comprenant l’administration audit sujet d’une quantité thérapeutiquement efficace d’un peptide natriurétique choisi dans le groupe constitué de (i) l’ostéocrine, un propeptide d’ostéocrine ou dérivé d’ostéocrine, (ii) une lébétine (de préférence la lébétine 2a ou la lébétine 1 b), un fragment de lébétine ou un dérivé de lébétine ou d’un fragment de lébétine , et (iii) un peptide ANP, propeptide d’ANP ou dérivé de peptide ANP, tel que défini dans la section « Peptides natriurétiques » ci-dessus, dans laquelle ledit peptide natriurétique disperse ledit biofilm bactérien.

Par « sujet », on entend ici un humain ou un animal tel qu’un mammifère non humain, un oiseau ou un poisson. Dans un mode de réalisation particulier, le sujet souffre d’une pathologie respiratoire chronique, telle que la mucoviscidose, une bronchopneumopathie chronique obstructive ou une bronchectasie. De préférence, le sujet souffre de mucoviscidose.

Dans un autre mode de réalisation particulier, ledit sujet souffre de brûlures importantes (grand brûlé) ou d’une infection de surface.

Dans un autre mode de réalisation, ledit sujet porte un implant et/ou une prothèse.

Dans un mode de réalisation particulier, ledit peptide natriurétique, en particulier ledit peptide ANP, propeptide d’ANP ou dérivé de peptide ANP, est utilisé en combinaison avec un antibiotique.

Par « antibiotique », on entend ici une substance naturelle ou synthétique détruisant ou bloquant la croissance des bactéries.

Les antibiotiques incluent :

- les antibiotiques inhibiteurs de la synthèse des enveloppes bactériennes parmi lesquels :

o les beta-lactamines, en particulier :

^■ les pénicillines dont les pénicillines du groupe A telles que l’amoxicilline ; les pénicillines du groupe G et V telles que la benzathine benzylpénicilline, la benzathine pénicilline, la benzathine phenoxyméthylpénicilline, les pénicillines G et la pénicilline V ; les pénicillines du groupe M telles que la cloxacilline et l’oxacilline ; les carboxypénicillines telles que la ticarcilline ; les uréidopénicillines telles que la pipéracilline ; les aminidopénicillines telles que le pivmécillinam ; et la témocilline ;

^■ les carbapénèmes telles que l’ertapénem, l’imipénem et le méropénem ;

^■ les monobactames tels que l’aztréonam ;

^■ les céphalosporines dont les céphalosporines de 1 ^ère génération telles que le céfaclor, le céfadroxil, la céfalexine, la céfalotine, la céfazoline et la céfradine ; les céphalosporines de 2 ^ème génération telles que le céfamandole, la céfoxitine, le céfuroxime sodique et le céfuroxime axétil ; et les céphalosporines de 3 ^ème génération telles que le céfixime, le cefpodoxime proxétil, le céfodiam hexétil, le céfépime, le céfotaxime, le cefpirome, le ceftazidime et le ceftriaxone ;

o les fosfomycines telles que la fosfomycine et la fosfomycine trométamol ; o les glycopeptides tels que la teicoplanine et la vancomycine ;

o les lipopeptides tels que la daptomycine ; et

o les polymyxines telles que la polymyxine B et la polymyxine E ou colistine ;

- les antibiotiques inhibiteurs de la synthèse des protéines, parmi lesquels :

o les aminosides tels que l’amikacine sulfate, la gentamicine, la néomycine, la nétilmycine, la spectinomycine, la streptomycine et la tobramycine ;

o les macrolides et apparentés, en particulier :

^■ les macrolides vrais tels que l’amphotéricine B, l’azithromycine, la clarithromycine, l’érythromycine, la josamycine, la midécamycine la roxithromycine ;

^■ les lincosamides tels que la clindamycine et la lincomycine ;

^■ les kétolides tels que la télithromycine ; et

^■ les synergistines telles que la pristinamycine ;

o les phénicoles tels que le thiamphénicol ;

o les cyclines telles que la chlortétracycline, la doxycycline, la lymécycline, la méthylènecycline, la minocycline et la tigécycline ;

o les acides fusidiques tels que l’acide fusidique ; et

o les oxazolidinones tels que le linézolide et le tedizolid ;

- les antibiotiques inhibiteurs de la synthèse des acides nucléiques, parmi lesquels : o les quinolones telles que l’acide pipémidique, la fluméquine, l’énoxacine, la loméfloxacine, la norfloxacine, la ciprofloxacine, l’ofloxacine, la péfloxacine, la lévofloxacine et la moxifloxacine ;

o les quinoléines telles que l’hydroxyquinoléine ;

o la mupirocine ; et

o la rifamycine ;

- les antibiotiques inhibiteurs de la synthèse de l’acide folique parmi lesquels les sulfamides telles que la sulfadiazine, le sulfaméthizol, le sulfafueazole et le sulfaméthoxazole ; et

- les antibiotiques de mécanismes complexes ou méconnus parmi lesquels :

o les produits nitrés, en particulier :

^■ les nitrofuranes tels que le nitrofurantoïne et le nifuroxazide ; et

^■ les nitro-imidazoles tels que le métronidazole, l’omidazole et le tinidazole ; et

o l’éthambutol, l’isoniazide, la pyrazinamide, la rifabutine et la rifampicine. Dans un mode de réalisation particulier, ledit antibiotique est un antibiotique inhibiteur de la synthèse protéique, en particulier un aminoside tel que la tobramycine ; un antibiotique inhibiteur de la synthèse d’acide nucléique, en particulier une quinolone telle que la ciprofloxacine ; un antibiotique inhibiteur de la synthèse des enveloppes bactériennes, en particulier une béta-lactamine, plus particulièrement un carbapénème tel que l’imipénem, le doripenem ou le meropenem ou un antibiotique agissant sur la structure de l’enveloppe bactérienne en particulier une polymyxine telle que la polymyxine B ou la colistine.

Dans un mode de réalisation particulier, ledit antibiotique est un antibiotique aminoside, une quinolone, un carbapénème ou une polymyxine. Plus particulièrement, ledit antibiotique peut être un antibiotique aminoside ou une quinolone.

Dans un autre mode de réalisation particulier, ledit antibiotique est la tobramycine, la ciprofloxacine, l’imipénem et/ou la colistine.

Plus particulièrement, ledit antibiotique peut être la tobramycine et/ou la ciprofloxacine.

Les inventeurs ont montré que l’utilisation combinée du peptide ANP avec ces antibiotiques présente un effet synergique sur la destruction des biofilms. Sans être lié par la théorie, il est supposé que le peptide ANP, en dispersant les bactériens constituant le biofilm, les rend plus accessibles aux antibiotiques, qui sont ainsi plus efficaces.

Dans un autre mode de réalisation particulier, ledit peptide natriurétique est utilisé en combinaison avec au moins un autre peptide natriurétique tel que défini dans la section « Peptides natriurétiques » .

Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, lorsque ledit peptide natriurétique est GANR, un propeptide d’ANP ou dérivé de peptide ANP, il peut être utilisé en combinaison avec l’ostéocrine, propeptide d’ostéocrine ou dérivé d’ostéocrine, et/ou avec une lébétine (de préférence la lébétine 2a ou la lébétine 1 b), un fragment de lébétine ou un dérivé de lébétine ou d’un fragment de lébétine.

Alternativement, dans un autre mode de réalisation particulier, lorsque ledit peptide natriurétique est l’ostéocrine, un propeptide d’ostéocrine ou dérivé d’ostéocrine, il peut être utilisé en combinaison avec GANR, propeptide d’ANP ou dérivé de peptide ANP et/ou avec une lébétine (de préférence la lébétine 2a ou la lébétine 1 b), un fragment de lébétine ou un dérivé de lébétine ou d’un fragment de lébétine.

Alternativement, dans un autre mode de réalisation particulier, lorsque ledit peptide natriurétique est la lébétine (de préférence la lébétine 2a ou la lébétine 1 b), un fragment de lébétine ou un dérivé de lébétine ou d’un fragment de lébétine, il peut être utilisé en combinaison avec GANR, propeptide d’ANP ou dérivé de peptide ANP et/ou avec l’ostéocrine, propeptide d’ostéocrine ou dérivé d’ostéocrine.

L’utilisation combinée de plusieurs peptides natriurétiques a l’avantage de pouvoir utiliser des doses plus faibles de chacun des composés, limitant ainsi encore plus efficacement les éventuels effets secondaires.

Dans ce mode de réalisation particulier, ledit peptide natriurétique peut en outre est utilisé en combinaison avec un antibiotique comme décrit ci-dessus, éventuellement de façon séquentielle (le dit peptide natriurétique d’abord, puis l’antibiotique).

Dans un mode de réalisation particulier, ledit peptide natriurétique, en particulier ledit peptide ANP, propeptide d’ANP ou dérivé de peptide ANP, est utilisé en combinaison avec toute autre substance adaptée pour le traitement du sujet souffrant de l’infection bactérienne tel que décrit ci-dessus, éventuellement de façon séquentielle (le dit peptide natriurétique d’abord, puis la substance adaptée).

En particulier, lorsque le sujet souffre d’une pathologie respiratoire chronique, ledit peptide natriurétique, en particulier ledit peptide ANP, propeptide d’ANP ou dérivé de peptide ANP, est de préférence utilisé en combinaison avec une substance adaptée pour le traitement de cette pathologie respiratoire chronique, éventuellement de façon séquentielle (le dit peptide natriurétique d’abord, puis la substance adaptée).

Ainsi, dans le mode de réalisation dans lequel ledit sujet souffre de mucoviscidose, ledit peptide natriurétique, en particulier ledit peptide ANP, propeptide d’ANP ou dérivé de peptide ANP, est de préférence utilisé en combinaison avec une substance pour la clairance muco-ciliaire, telle que la Dnase (par exemple le Pulmozyme®), et/ou bronchodilatatrice, éventuellement de façon séquentielle (une substance pour la clairance muco-ciliaire d’abord, puis le dit peptide natriurétique).

Dans ces modes de réalisation particuliers, ledit peptide natriurétique peut en outre être utilisé en combinaison avec un antibiotique comme décrit ci-dessus et/ou avec un autre peptide natriurétique comme décrit ci-dessus, de préférence avec un antibiotique comme décrit ci-dessus.

Dans le contexte de l’invention, le terme « traitement » ou « traiter » signifie inverser, soulager ou inhiber le progrès de la maladie à laquelle ce terme s’applique, ou un ou plusieurs symptômes de cette maladie. Par « quantité thérapeutiquement efficace », on entend ici une quantité suffisante du composé d’intérêt pour disperser le biofilm bactérien dans le traitement de l’infection bactérienne, à un ratio risque/bénéfice raisonnable applicable à n’importe quel traitement médical. Il sera bien compris cependant que l’utilisation journalière totale des composés utilisés dans le cadre de l’invention sera décidée par le médecin traitant dans le cadre de son jugement médical. Le niveau de dose thérapeutiquement efficace spécifique à un sujet particulier dépendra d’un certain nombre de facteurs dont la maladie à traiter et la gravité de cette maladie, l’activité des composés spécifiquement employés, l’âge, le poids, l’état de santé général, le sexe et le régime alimentaire, le temps d’administration, la voie d’administration et le vitesse d’excrétion des composés spécifiques employés, la durée du traitement, les médicaments utilisés en combinaison ou de manière coïncidente avec les composés spécifiques employés, et des facteurs semblables bien connus dans le domaine médical. Par exemple, il est bien connu dans le domaine de commencer les doses de composés à des niveaux plus faibles que ceux requis pour atteindre l’effet thérapeutique désiré et d’augmenter graduellement le dosage jusqu’à ce que l’effet désiré soit obtenu.

Les composés utilisés dans le contexte de l’invention peuvent être administrés sous la forme d’une composition pharmaceutique comprenant des excipients pharmaceutiquement acceptables, et éventuellement des matrices à libération différée, telles que des polymères biodégradables, pour former des compositions thérapeutiques.

Par « pharmaceutique » ou « pharmaceutiquement acceptable », on entend ici des entités moléculaires et des compositions qui ne produisent pas de réactions secondaires, allergiques ou autrement fâcheuse quand elles sont administrées à un mammifère, en particulier à un humain. Un véhicule ou excipient pharmaceutiquement acceptable désigne une charge non-toxique solide, semi-solide ou liquide, un diluant, une matière d’encapsulation ou un auxiliaire de formulation de tout type.

La forme des compositions pharmaceutiques comprenant les composés utilisés dans le contexte de l’invention et la voie d’administration dépendront naturellement de la maladie à traiter, de la sévérité de la maladie, de l’âge, du poids et du genre du patient, etc...

Les composés utilisés dans le contexte de l’invention peuvent être formulés pour une administration par voie aérienne ou inhalation (en particulier par nébulisation), orale, parentéral, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, topique, sous-cutanée ou intraoculaire par exemple.

Dans un mode de réalisation particulier, les composés utilisés dans le contexte de l’invention sont administration par voie aérienne ou inhalation (en particulier par nébulisation). Dans un mode de réalisation particulier, le peptide natriurétique, en particulier le peptide ANP (ou propeptide ou dérivé), utilisé dans le contexte de l’invention est administré à une dose journalière de 0.3 ng/ml à 3.000 ng/ml.

Dans un autre mode de réalisation particulier, l’antibiotique utilisé en combinaison est administré à une dose journalière maximale de 600 mg (deux fois 300 mg par jour).

Composition pharmaceutique et combinaison pharmaceutique

La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant (A) un peptide natriurétique choisi dans le groupe constitué de (i) l’ostéocrine, propeptide d’ostéocrine ou dérivé d’ostéocrine, (ii) une lébétine (de préférence la lébétine 2a ou la lébétine 1 b), un fragment de lébétine ou un dérivé de lébétine ou d’un fragment de lébétine et (iii) un peptide ANP, propeptide d’ANP ou dérivé de peptide ANP, tel que défini dans la section « Peptides natriurétiques » ci-dessus et (B) un antibiotique tel que défini dans la section « Application thérapeutique » ci-dessus.

Dans un mode de réalisation particulier, la composition selon l’invention comprend en outre un véhicule ou excipient pharmaceutiquement acceptable tel que défini ci-dessus.

Dans un autre mode de réalisation particulier, la composition selon l’invention comprend en outre un autre peptide natriurétique tel que défini dans la section « Peptides natriurétiques » ci-dessus.

La présente invention concerne également une combinaison pharmaceutique antibactérienne comprenant (A) un peptide natriurétique choisi dans le groupe constitué de (i) l’ostéocrine, propeptide d’ostéocrine ou dérivé d’ostéocrine, (ii) une lébétine (de préférence la lébétine 2a ou la lébétine 1 b), un fragment de lébétine ou un dérivé de lébétine ou d’un fragment de lébétine et (iii) un peptide ANP, propeptide d’ANP ou dérivé de peptide ANP tel que défini dans la section « Peptides natriurétiques » ci-dessus et (B) un antibiotique tel que défini dans la section « Application thérapeutique » ci-dessus pour une utilisation simultanée, séparée ou séquentielle dans le traitement thérapeutique chez un sujet tel que défini ci-dessus d’une infection bactérienne associée à un biofilm bactérien telle que définie dans la section « Biofilm bactérien et infection bactérienne » ci-dessus.

La présente invention concerne également l’utilisation (A) d’un peptide natriurétique choisi dans le groupe constitué de (i) l’ostéocrine, propeptide d’ostéocrine ou dérivé d’ostéocrine, (ii) une lébétine (de préférence la lébétine 2a ou la lébétine 1 b), un fragment de lébétine ou un dérivé de lébétine ou d’un fragment de lébétine , et (iii) un peptide ANP, propeptide d’ANP ou dérivé de peptide ANP, tel que défini dans la section « Peptides natriurétiques » ci-dessus et (B) d’un antibiotique tel que défini dans la section « Application thérapeutique » ci-dessus pour la fabrication d’une combinaison pharmaceutique antibactérienne pour une administration simultanée, séparée ou séquentielle pour le traitement thérapeutique chez un sujet tel que défini ci-dessus d’une infection bactérienne associée à un biofilm bactérien telle que définie dans la section « Biofilm bactérien et infection bactérienne » ci-dessus.

La présente invention a également pour objet une méthode de traitement thérapeutique d’une infection bactérienne associée à un biofilm bactérien telle que définie dans la section « Biofilm bactérien et infection bactérienne » ci-dessus, comprenant l’administration simultanée, séparée ou séquentielle chez un sujet qui en a besoin d’une quantité thérapeutiquement efficace (A) d’un peptide natriurétique choisi dans le groupe constitué de (i) l’ostéocrine, propeptide d’ostéocrine ou dérivé d’ostéocrine, (ii) la lébétine (de préférence la lébétine 2a ou la lébétine 1 b), un fragment de lébétine ou un dérivé de lébétine ou d’un fragment de lébétine, et (iii) un peptide ANP, propeptide d’ANP ou dérivé de peptide ANP, tel que défini dans la section « Peptides natriurétiques » ci-dessus et (B) d’un antibiotique tel que défini dans la section « Application thérapeutique » ci-dessus.

Dans le contexte de l’invention, le terme « combinaison » ou « combinaison pharmaceutique » définit soit une combinaison fixée dans une seule forme d’unité de dosage, soit un kit pour administration combinée dans lequel le peptide natriurétique et l’antibiotique peuvent être administrés indépendamment au même moment ou séparément en des intervalles de temps qui permettent aux partenaires de la combinaison de montrer un effet synergique.

Les composés de la combinaison de l’invention peuvent donc être formulés en une ou deux combinaisons pharmaceutiques séparées, chaque composition étant pour la même voie d’administration ou pour des voies d’administration différentes.

Dans un mode de réalisation particulier, ladite combinaison pharmaceutique selon l’invention comprend en outre (C) un autre peptide natriurétique tel que défini dans la section « « Peptides natriurétiques », et/ou (D) une autre substance adaptée pour le traitement du sujet souffrant de l’infection bactérienne tel que défini dans la section « Application thérapeutique » ci-dessus.

Dans ce mode de réalisation particulier, la combinaison peut être une combinaison fixée dans une seule forme d’unité de dosage, ou un kit pour une administration combinée dans lequel le peptide natriurétique, l’antibiotique, l’autre peptide natriurétique et/ou l’autre substance adaptée pour le traitement du sujet, peuvent être administrée indépendamment au même moment ou séparément en des intervalles de temps qui permettent aux partenaires de la combinaison de montrer un effet synergique. Dans ce mode de réalisation, les composés de la combinaison peuvent donc être formulés en une, deux, trois ou quatre combinaisons pharmaceutiques séparées, chaque composition étant pour la même voie d’administration ou pour des voies d’administration différentes.

Pour préparer les composés pharmaceutiques utilisées dans le cadre de l’invention, une quantité efficace des composés utilisées dans le cadre de l’invention peut être dissoute ou dispersée dans un véhicule ou un milieu aqueux pharmaceutiquement acceptable.

Les formes pharmaceutiques adaptées à une utilisation injectable incluent les solutions ou dispersions aqueuses stériles et les poudres stériles pour une préparation extemporanée de solutions ou dispersions injectables stériles, par exemple sous forme micronisée. Dans tous les cas, la forme doit être stérile et doit être fluide de manière à ce que l’utilisation par seringue soit facile. Elle doit être stable sous les conditions de fabrication et de conservation et doit être préservée contre l’action contaminante de microorganismes tels que les bactéries, les virus ou les champignons.

Le véhicule peut être un solvant ou un milieu de dispersion comprenant, par exemple, de l’eau, de l’éthanol, un polyol (par exemple, du glycérol, du propylène glycol, du polyéthylène glycol liquide, ou autre), et mélanges appropriés de ceux-ci. Une fluidité appropriée peut être maintenue par exemple en utilisant un revêtement telle que de la lécithine, en maintenant une taille de particule requise dans le cas d’une dispersion, et en utilisant des tensioactifs, des agents stabilisants, des cryoprotecteurs ou des anti-oxydants. La prévention de l’action des microorganismes peut être apportée par des agents antibactériens et antifongiques. Dans de nombreux cas, il sera préférable d’inclure des agents isotoniques, par exemple des sucres ou du chlorure de sodium.

Les solutions injectables stériles peuvent être préparées en incorporant les composés actifs dans une quantité requise du solvant approprié avec plusieurs des autres ingrédients, suivi d’une stérilisation filtrée. En général, les dispersions sont préparées en incorporant les divers ingrédients actifs stérilisés dans un véhicule stérile qui contient le milieu de dispersion basique et les autres ingrédients requis. Dans le cas des poudres stériles pour la préparation de solutions injectables stériles, les méthodes préférées de préparation sont les techniques de séchage sous vide et de lyophilisation, qui produisent une poudre de l’ingrédient actif plus n’importe quel ingrédient additionnel désiré à partir d’une solution de ceux-ci préalablement stérilisée par filtration.

Pour une administration parentérale dans une solution aqueuse, par exemple, la solution sera de préférence tamponnée de manière appropriée si nécessaire et le diluent liquide rendu isotonique avec une solution saline ou de glucose suffisante. Ces solutions aqueuses particulières sont particulièrement appropriées pour une administration intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée et intrapéritonéale.

Les formulations de compositions pharmaceutiques pour une administration par inhalation sont bien connues de l’homme du métier. En général, les ingrédients actifs sont délivrés sous la forme d’un spray aérosol à partir d’un inhalateur pressurisé à dose mesurée en utilisant un gaz propulseur approprié, tel que le dichlorodifluorométhane, le trichlorofluorométhane, le dichloro-tétrafluoroéthane ou le dioxyde carbone, sous la forme de poudre administrée en utilisant un inhalateur à poudre sèche, ou, sous la forme d’un aérosol à liquide aqueux en utilisant un nébuliseur. Les nébuliseurs pour délivrance d’un aérosol liquide peuvent être catégorisés en nébuliseurs à jet mis en oeuvre par un flux pressurisé d’air en utilisant un compresseur portable ou un fournisseur d’air central à l’hôpital, les nébuliseurs à ultrason incorporant un piezo-cristal pour fournir l’énergie pour générer l’aérosol hors d’une fontaine ultrasonique, et des nébuliseurs électroniques basés sur le principe d’une membrane vibrante perforée.

Utilisations non-thérapeutiques

La présente invention concerne également l’utilisation in vitro ou ex vivo d’un peptide natriurétique choisi dans le groupe constitué de (i) l’ostéocrine, un propeptide d’ostéocrine ou dérivé d’ostéocrine, (ii) une lébétine (de préférence la lébétine 2a ou la lébétine 1 b), un fragment de lébétine ou un dérivé de lébétine ou d’un fragment de lébétine et (iii) un peptide ANP, un propeptide d’ANP ou un dérivé de peptide ANP, tel que défini dans la section « Peptides natriurétiques » ci-dessus pour disperser un biofilm bactérien.

Le peptide natriurétique, en particulier l’ANP, propeptide d’ANP ou dérivé de peptide ANP peut ainsi typiquement être utilisé dans des applications antisalissures (« antifouling »), par exemple sur les bateaux ou dans les canalisations.

La présente invention concerne ainsi également une méthode in vitro ou ex vivo de dispersion d’un biofilm bactérien sur une surface, comprenant l’application sur ladite surface d’une composition comprenant un peptide natriurétique choisi dans le groupe constitué de (i) l’ostéocine, propeptide d’ostéocrine ou dérivé d’ostéocrine, (ii) une lébétine (de préférence la lébétine 2a ou la lébétine 1 b), un fragment de lébétine ou un dérivé de lébétine ou d’un fragment de lébétine, et (iii) un peptide ANP, un propeptide d’ANP ou un dérivé de peptide ANP, tel que défini dans la section « Peptides natriurétiques » ci-dessus.

Ladite surface peut typiquement être la surface d’une canalisation, la surface d’un bateau, la surface d’un dispositif implantable avant implantation.

L’application de ladite composition sur ladite surface peut être mise en oeuvre par toute technique appropriée, dépendant de la formulation de la composition. La présente invention sera décrite plus en détail par les exemples ci-dessous et figures ci- dessous. Brève description des séquences

Brève description des figures

La Figure 1 montre des graphiques représentant la croissance de P. aeruginosa en présence de différentes concentrations d’ANP. Exemples

Exemple 1 : Effet de ANR seul (0,1 mM) sur les biofilms en formation, sur les biofilms préformés de P. aeruginosa et sur la croissance de P. aeruginosa.

Cet exemple montre l’action de GANR sur les biofilms préformés de P. aeruginosa.

Matériel et méthodes

Substances testées, souches bactériennes et cultures bactériennes

La souche de P. aeruginosa sauvage PA14 utilisée était de la Havard Medical School (Noston, MA) (Liberati ét al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 :2833-2838).

Les souches bactériennes ont été cultivées à 37°C dans du milieu Luria Bertani (LB) sous agitation.

Formation du biofilm de P. aeruginosa en conditions dynamiques

Après 3 h de pré-culture en milieu LB à 37°C, P. aeruginosa a été inoculée à une DOeoo = 0,08 dans du milieu LB et sous-cultivé pendant 2 h.

L’ANP (Calbiochem Merck) a été ajouté 2 h après le début de la culture, un moment correspondant au milieu de la phase exponentielle de croissance des bactéries. La densité finale bactérienne et l’absence de contamination ont été contrôlées par ensemencement Les biofilms ont été formés en conditions dynamiques à 37°C dans une chambre à flux à 3 canaux comme décrit dans Bazire et al. (2010) J. Bacteriol. 192 :3001 -3010. Brièvement, à partir d’une pré-culture de 18h, une suspension bactérienne à DC> ₆ oo=0,08 préparée dans le l’eau physiologique stérile a été injectée dans chaque canal de la chambre à flux. Les bactéries ont été laissées pendant 2h à 37°C en conditions statiques (sans flux) afin que celles-ci adhèrent à la lame de verre. L’étude de la formation de biofilm a ensuite été réalisée sous un flux de milieu LB (2,5 ml/h) pendant 24h à 37°C.

Destruction du biofilm de P. aeruginosa en conditions dynamiques

Pour étudier l’impact de l’ANP sur les biofilms préformés pendant 24 h, 300 mI d’ANP (0.1 mM) ou 300 mI d’eau ultra-pure stérile (condition contrôle) ont été injectés dans différents canaux de la chambre à flux. Le traitement du biofilm préformé a été réalisé pendant 2 h à 37°C en conditions statiques. Après les 2h, le flux de milieu a été de nouveau appliqué pendant 15 min afin d’éliminer les cellules qui se seraient détachées du biofilm sous l’action du traitement.

Les biofilms ont été observés en microscopie confocale à balayage laser (Zeiss LSM710 (Zeiss) après avoir été marqués pendant 15 min avec 5 mM de fluorochrome Syto9 green (Invitrogen). Des prises de vue ont été réalisées dans les différentes couches du biofilm permettant ainsi une reconstitution tridimensionnelle ; au minimum 3 prises de vue ont été réalisées en des points différents d’un même canal de la chambre à flux. Les fichiers de chaque prise de vue ont été ensuite analysés par le logiciel COMSTAT (Heydorn et al. (2000) Microbiology 146 :2395-2407), 3 prises de vue d’au moins 3 expériences indépendantes sont analysées, permettant de déterminer les épaisseurs moyennes et maximales des biofilms ainsi que le biovolume bactérien.

Culture cellulaire

La lignée de cellules épithéliales pulmonaires humaines de type II A549 (ATCC- CCL185TM, ATCC Manassas, VA) a été cultivée à 37°C dans une atmosphère à 5% CO2 dans un milieu DMEM (Lonza) complémenté avec 10% de sérum de veau foetal (Lonza) et 1 % de pénicilline et streptomycine (Penistrep, Lonza). En routine, les cellules ont été ensemencées dans une fiole de 25 ml et utilisées à 80% de confluence.

Pour les tests de cytotoxicité, les cellules ont été ensemencées dans des plaques 24 puits à une densité finale de 3x 10 ⁵ cellules par puits, et cultivées pendant 48 h avant utilisation. Un minimum de 24 h avant les tests d’infection, les cellules ont été déprivées en antibiotiques et en sérum de veau foetal par ajout d’un milieu sans sérum frais.

Mesure de la libération de lactate déshydrogénase cytosolique (LDH) par les cellules A549 La LDH est une enzyme cytosolique stable libérée dans le milieu de culture après lyse cellulaire et donc un marqueur de mort cellulaire. La quantité de LDH libérée par les cellules eucaryotes en présence de bactéries, exposées ou non à GANR (concentration de 1 mM à 10 nM), a été déterminée en utilisant le test enzymatique Cytotox 96 (Promega, Charbonnières, France). Les cellules A549 ont été incubées pendant 6 h avec un contrôle (sans traitement) ou avec P. aeruginosa PA14 (pré-traitées à GANR) à une multiplicité d’infection de 10. Un tampon de lyse, consistant en une solution de Triton X-100 (9% dans l’eau), a été employé pour déterminer le maximum de LDH potentiellement libéré par les cellules A549 dans les conditions expérimentales (100% de libération de LDH). Un niveau bruit de fond a été établi en utilisant le milieu de culture seul, et défini comme 0% de libération de LDH, pour éliminer la contribution du milieu de culture. Le pourcentage de libération de LDH dans la population cellulaire a ensuite a été calculé en utilisant l’équation :

DO échantillon

%LDH = X 100

DO 100%

Le test était suffisamment sensible pour mesurer une concentration de LDH équivalente à une lyse de 1 % de la population cellulaire. Résultats

Effet de GANR sur un biofilm préformé de P. aeruginosa

Les inventeurs ont étudié le potentiel d’activité anti-biofilm de IΆNR sur un biofilm établi de P. aeruginosa. Dans cette optique, après 24 h de formation d’un biofilm de P. aeruginosa dans un système d’écoulement dynamique, les inventeurs ont exposé pendant 2 h les bactéries à l’ANP à 0.1 mM. Dans ces conditions, les inventeurs ont observé une dispersion du biofilm qui a été perturbée par l’ANP, et les structures en forme de champignon, observées en condition contrôle et caractéristique d’un biofilm de P. aeruginosa, étaient absentes après exposition à l’ANP. La biomasse bactérienne a été réduite après exposition à l’ANP pendant 2 heures à 0,1 mM de 81 ,4 ± 4,1 % (P < 0.001 ) par rapport à la biomasse présente dans la condition contrôle. En parallèle, les inventeurs ont observé une réduction importante de l’épaisseur du biofilm après 2 h d’exposition à l’ANP.

Des résultats similaires ont été obtenus lorsqu’on expose le biofilm pré-formé à l’ANP pendant 30 minutes. Dans ces conditions les inventeurs ont observé que le biofilm était fortement dispersé par l’ANP, et les structures en forme de champignon, observées en condition contrôle et caractéristiques d’un biofilm de P. aeruginosa, étaient absentes après exposition à l’ANP. La biomasse bactérienne restante a été réduite après exposition à l’ANP (30 minutes) de 80,2 ± 2,0% (P < 0.05) par rapport à la biomasse présente dans les conditions contrôles.

Effet de l’ANP sur la croissance de P. aeruginosa

Afin de déterminer un potentiel effet direct de l’ANP sur la croissance de P. aeruginosa, les inventeurs ont étudié l’impact de l’ANP à 1 mM et 0,1 mM sur la croissance de P. aeruginosa P14 dans un milieu liquide. Aucune des concentrations testées d’ANP n’a affecté la croissance bactérienne comme le montre la Figure 1 .

Ainsi, l’effet de l’ANP sur les biofilms préformés ne peuvent pas être dus à une action sur la croissance de la bactérie

Effet de l’ANP sur la cytotoxicité bactérienne vis-à-vis de cellules pulmonaires humaines en culture

L’activité cytotoxique de P. aeruginosa exposée à différentes concentrations d’ANP (1 mM à 10 nM) a été étudiée en utilisant des cellules pulmonaires A549. Les inventeurs ont observé que l’ANP, à n’importe quelle concentration, n’avait pas d’impact sur l’activité cytotoxique de P. aeruginosa vis-à-vis des cellules pulmonaires, comme montré dans le tableau ci-dessous.

Conclusion

Les inventeurs ont ainsi montré dans cet exemple que IΆNR, utilisé à une concentration de 0,1 mM empêche totalement la formation du biofilm de P. aeruginosa et détruit fortement un biofilm préformé de P. aeruginosa.

Pendant longtemps, les études pour empêcher la formation des biofilms se sont concentrées sur les étapes initiales de la formation des biofilms, incluant l’adhésion et la maturation du biofilm. Les concentrations de drogues nécessaires pour inhiber la formation d’un biofilm sont généralement beaucoup plus faibles que celles nécessaires pour détruire ou perturber un biofilm préformé.

L’intérêt principal de l’ANP, ici mis en évidence par les inventeurs, est que son utilisation à 0,1 mM pendant 2 h voir 30 minutes, est suffisante pour disperser environ 80 % de la structure du biofilm. Cela est particulièrement intéressant, en particulier en vue d’une utilisation en synergie avec des antibiotiques.

Cet effet de l’ANP sur le biofilm de P. aeruginosa est plus important que l’effet d’inhibition de la formation observée précédemment avec le CNP et présente un intérêt supplémentaire car le CNP augmentait légèrement la virulence et la cytotoxicité bactérienne, en activant les systèmes du quorum-sensing bactériens.

Ici, les inventeurs ont démontré que l’ANP, malgré sa forte action anti-biofilm, ne tuait pas les bactéries et n’augmentait pas la cytotoxicité de P. aeruginosa vis-à-vis de cellules pulmonaires humaines en culture. Le fait de ne pas tuer les bactéries est particulièrement intéressant car cela évite l’émergence de souches résistantes.

Exemple 2 : Effet dose-dépendant de GANR sur les biofilms préformés de P. aeruginosa

Cet exemple montre l’action de l’ANP seul sur les biofilms préformés de P. aeruginosa dépend de la dose utilisée et est visible dès 0,3 ng/ml.

Matériel et méthodes

Le matériel et méthodes utilisé dans cet exemple est identique à celui décrit ci-dessus dans l’exemple 1 ( Destruction du biofilm de P. aeruginosa en conditions dynamiques). Résultats

Les inventeurs ont étudié le potentiel d’activité anti-biofilm de IΆNR sur un biofilm établi de P. aeruginosa à différentes concentrations d’ANP : 0,3 ng/ml, 3 ng/ml et 30 ng/ml et comparé avec celui présenté dans l’exemple 1 ([ANP] = 300 ng/ml ou 0,1 mM), après une exposition de 2 h ou 30 min.

Les inventeurs ont observé que le biofilm était fortement dispersé par l’ANP dès la concentration la plus faible de 0,3 ng/ml et dès une exposition de 30 min.

Les résultats obtenus sont décrits dans le tableau suivant.

non-traitées ; ^*** : p < 0.001 vs biofilms non-traitées.

Cet exemple confirme donc l’intérêt de l’ANP, actif à très faible concentration, et dès 30 min d’exposition.

Exemple 3 : Effet de l’ostéocrine sur les biofilms préformés de P. aeruginosa

Cet exemple montre l’action de l’ostéocrine seul sur les biofilms préformés de P. aeruginosa à la dose de 10 ⁸ M. Matériel et méthodes

Le matériel et méthodes utilisé dans cet exemple est identique à celui décrit ci-dessus dans l’exemple 1 ( Destruction du biofilm de P. aeruginosa en conditions dynamiques).

Résultats

Les inventeurs ont étudié le potentiel d’activité anti-biofilm de l’ostéocrine sur un biofilm établi de P. aeruginosa à la concentration de 10 ^-8 M et après une exposition de 2 h.

Les inventeurs ont observé que le biofilm était fortement et significativement dispersé par l’ostéocrine.

Exemple 4 : Effet du peptide Lébétine 2a sur les biofilms préformés de P. aeruginosa Cet exemple montre l’action du peptide lébétine L2 alpha seul sur les biofilms préformés de P. aeruginosa à la dose de 10 ⁸ M.

Matériel et méthodes

Le matériel et méthodes utilisé dans cet exemple est identique à celui décrit ci-dessus dans l’exemple 1 , ( Destruction du biofilm de P. aeruginosa en conditions dynamiques).

Résultats

Les inventeurs ont étudié le potentiel d’activité anti-biofilm du peptide lébétine L2 alpha sur un biofilm établi de P. aeruginosa à la concentration de 10 ^-8 M et après une exposition de 2 h.

Les inventeurs ont observé que le biofilm était fortement et significativement dispersé par le peptide lébétine L2 alpha.

Exemple 5 : Effet du peptide Lébétine 1 b sur les biofilms préformés de P. aeruginosa

Cet exemple montre l’action du peptide lébétine L1 bêta seul sur les biofilms préformés de P. aeruginosa à la dose de 10 ⁸ M.

Matériel et méthodes

Le matériel et méthodes utilisé dans cet exemple est identique à celui décrit ci-dessus dans l’exemple 1 , ( Destruction du biofilm de P. aeruginosa en conditions dynamiques). Résultats

Les inventeurs ont étudié le potentiel d’activité anti-biofilm du peptide lébétine L1 Bêta sur un biofilm établi de P. aeruginosa à la concentration de 10 ⁸ M et après une exposition de 2 h.

Les inventeurs ont observé que le biofilm était fortement dispersé par le peptide lébétine L1 Bêta.

Exemple 6 : Effet d’une combinaison d’ANP et de tobramycine sur les biofilms préformés de P. aeruginosa

Cet exemple montre l’action synergique la combinaison ANP + tobramycine sur les biofilms préformés de P. aeruginosa. Matériel et méthodes

Le matériel et méthodes utilisé dans cet exemple est identique à celui décrit ci- dessus dans l’exemple 1 , avec les précisions suivantes :

Pour étudier l’impact de l’ANP en combinaison avec la tobramycine sur des biofilms préformés de 24 h (comme décrit dans l’exemple 1 ), 300 mI d’un mélange d’ANP (à 1 nM) et de tobramycine (50 pg/ml) ou 300 mI de tobramycine seul (condition contrôle) ont été injectés dans différents canaux de la chambre à flux. Le traitement du biofilm préformé a été réalisé pendant 2 h à 37°C en conditions statiques. Après les 2 h, le flux de milieu a été de nouveau appliqué pendant 15 min afin d’éliminer les cellules qui se seraient détachées du biofilm sous l’action du traitement.

Les biofilms ont été observés en microscopie confocale à balayage laser comme décrit dans l’exemple 1 . Pour tester l’intégrité membranaire des bactéries, un mélange de 5 mM de SYTO 9 green et 0,3 mM d’iodure de propidium (IP) a été utilisé (Live/Dead BacLight Bacterial Viability Kit, Invitrogen). Résultats

Les inventeurs ont étudié le potentiel d’activité anti-biofilm de la combinaison ANP (à 10 ^-9 M ; 3 ng/ml) + tobramycine (à 50 pg/ml ou à 10 pg/ml) sur un biofilm établi de P. aeruginosa. Le biovolume du biofilm a été déterminé et les résultats sont décrits dans les tableaux ci-dessous.

Dans ces conditions, les inventeurs ont observé que le biofilm était fortement dispersé par la combinaison ANP (1 nM) + tobramycine (50 pg/ml), qui agit de manière synergique pour obtenir une destruction du biofilm à 96,3%. De même, la combinaison ANP (1 nM) + tobramycine (10 pg/ml), agit de manière synergique pour obtenir une destruction du biofilm à 94,8%.

Exemple 7 : Effet d’une combinaison d’ANP et de ciprofloxacine sur les biofilms préformés de P. aeruginosa

Cet exemple montre l’action synergique la combinaison ANP + ciprofloxacine sur les biofilms préformés de P. aeruginosa.

Matériel et méthodes

Pour étudier l’impact de l’ANP en combinaison avec la ciprofloxacine sur des biofilms préformés de 24h (comme décrit dans l’exemple 1 ), 300 mI d’un mélange d’ANP (à 10 nM) et de ciprofloxacine (0,01 pg/ml ou 0,04 pg/ml) ou 300 mI de ciprofloxacine seul

(condition contrôle) ont été injectés dans différents canaux de la chambre à flux. Le traitement du biofilm préformé a été réalisé pendant 2 h à 37°C en conditions statiques. Après les 2 h, le flux de milieu a été de nouveau appliqué pendant 15 min afin d’éliminer les cellules qui se seraient détachées du biofilm sous l’action du traitement.

Comme décrit dans l’exemple 1 , les biofilms ont été observés en microscopie confocale à balayage laser, après avoir été marqués pendant 15 min avec 5 mM de fluorochrome Syto9 green (Invitrogen). Résultats

Les inventeurs ont étudié le potentiel d’activité anti-biofilm de la combinaison ANP (à 10 ⁸ M ; 30 ng/ml) + ciprofloxacine (à 0,04 pg/ml ou 0,01 pg/ml) sur un biofilm établi de P. aeruginosa.

Le biovolume du biofilm a été déterminé et les résultats sont décrits dans les tableaux ci-dessous.

Dans ces conditions, les inventeurs ont observé que le biofilm était encore plus fortement dispersé par la combinaison ANP + ciprofloxacine, comparé au traitement avec l’antibiotique ciprofloxacine seul.

Ainsi, la combinaison avec l’ANP permet d’obtenir une destruction de 97% du biofilm en combinaison avec une concentration de 0,01 pg/ml de ciprofloxacine.

Exemple 8 : Effet d’une combinaison d’ANP et de la colistine sur les biofilms préformés de P. aeruginosa

Cet exemple montre l’action synergique la combinaison ANP + colistine sur les biofilms préformés de P. aeruginosa.

Matériel et méthodes

Pour étudier l’impact de l’ANP en combinaison avec la colistine sur des biofilms préformés de 24h (comme décrit dans l’exemple 1 ), 300 mI d’un mélange d’ANP (à 10 nM) et de colistine (1 pg/ml) ou 300 mI de colistine seule (condition contrôle) ont été injectés dans différents canaux de la chambre à flux. Le traitement du biofilm préformé a été réalisé pendant 2 h à 37°C en conditions statiques. Après les 2 h, le flux de milieu a été de nouveau appliqué pendant 15 min afin d’éliminer les cellules qui se seraient détachées du biofilm sous l’action du traitement. Comme décrit dans l’exemple 1 , les biofilms ont été observés en microscopie confocale à balayage laser, après avoir été marqués pendant 15 min avec 5 mM de fluorochrome Syto9 green (Invitrogen).

Résultats

Les inventeurs ont étudié le potentiel d’activité anti-biofilm de la combinaison ANP (à 10 ⁸ M ; 30 ng/ml) + colistine (à 1 pg/ml) sur un biofilm établi de P. aeruginosa.

Le biovolume du biofilm a été déterminé et les résultats sont décrits dans les tableaux ci-dessous.

Dans ces conditions, les inventeurs ont observé que le biofilm était encore plus fortement dispersé par la combinaison ANP + colistine (1 pg/ml), comparé au traitement avec l’antibiotique colistine seul ou au traitement à GANR seul.

Ainsi, la combinaison avec GANR permet d’obtenir une destruction de 97,3 % du biofilm en combinaison avec une concentration de 1 pg/ml de colistine.

Exemple 9 : Effet d’une combinaison d’ANP et de l’Imipenem sur les biofilms préformés de P. aeruginosa

Cet exemple montre l’action synergique la combinaison ANP + Imipenem sur les biofilms préformés de P. aeruginosa.

Matériel et méthodes

Pour étudier l’impact de GANR en combinaison avec l’Imipenem sur des biofilms préformés de 24h (comme décrit dans l’exemple 1 ), 300 mI d’un mélange d’ANP (à 10 nM) et d’Imipenem (0,5 pg/ml) ou 300 mI d’Imipenem seul (condition contrôle) ont été injectés dans différents canaux de la chambre à flux. Le traitement du biofilm préformé a été réalisé pendant 2 h à 37°C en conditions statiques. Après les 2 h, le flux de milieu a été de nouveau appliqué pendant 15 min afin d’éliminer les cellules qui se seraient détachées du biofilm sous l’action du traitement. Comme décrit dans l’exemple 1 , les biofilms ont été observés en microscopie confocale à balayage laser, après avoir été marqués pendant 15 min avec 5 mM de fluorochrome Syto9 green (Invitrogen).

Résultats

Les inventeurs ont étudié le potentiel d’activité anti-biofilm de la combinaison ANP (à 10 ⁸ M ; 30 ng/ml) + Imipenem (à 0,5 pg/ml) sur un biofilm établi de P. aeruginosa.

Le biovolume du biofilm a été déterminé et les résultats sont décrits dans les tableaux ci-dessous.

Dans ces conditions, les inventeurs ont observé que le biofilm était encore plus fortement dispersé par la combinaison ANP + Imipenem (0,5 pg/ml), comparé au traitement avec l’antibiotique Imipenem seul ou au traitement à GANR seul.

Ainsi, la combinaison avec GANR permet d’obtenir une destruction de 97,9 % du biofilm en combinaison avec une concentration de 0,5 pg/ml d’Imipenem.

Exemple 10 : Effet d’une combinaison d’ANP et de polymyxine B sur les biofilms préformés de P. aeruginosa

Cet exemple montre l’action synergique la combinaison ANP + Polymyxine B sur les biofilms préformés de P. aeruginosa.

Matériel et méthodes

Pour étudier l’impact de GANR en combinaison avec la polymyxine B sur des biofilms préformés de 24h (comme décrit dans l’exemple 1 ), 300 mI d’un mélange d’ANP (à 10 nM) et de Polymyxine B (4 pg/ml) ou 300 mI de Polymyxine B seul (condition contrôle) ont été injectés dans différents canaux de la chambre à flux. Le traitement du biofilm préformé a été réalisé pendant 2 h à 37°C en conditions statiques. Après les 2 h, le flux de milieu a été de nouveau appliqué pendant 15 min afin d’éliminer les cellules qui se seraient détachées du biofilm sous l’action du traitement. Comme décrit dans l’exemple 1 , les biofilms ont été observés en microscopie confocale à balayage laser, après avoir été marqués pendant 15 min avec 5 mM de fluorochrome Syto9 green (Invitrogen). Résultats

Les inventeurs ont étudié le potentiel d’activité anti-biofilm de la combinaison ANP (à 10 ⁸ M ; 30 ng/ml) + Polymyxine B (à 4 pg/ml) sur un biofilm établi de P. aeruginosa.

Le biovolume du biofilm a été déterminé et les résultats sont décrits dans les tableaux ci-dessous.

Dans ces conditions, les inventeurs ont observé que le biofilm était encore plus fortement dispersé par la combinaison ANP + Polymyxine B (4 pg/ml), comparé au traitement avec l’antibiotique Polymyxine B seul ou au traitement à GANR seul.

Ainsi, la combinaison avec GANR permet d’obtenir une destruction de 83,5 % du biofilm en combinaison avec une concentration de 4 pg/ml de Polymyxine B.

Exemple 11 : Effet d’un traitement séquentiel d’ANP puis de tobramycine sur les biofilms préformés de P. aeruginosa.

Cet exemple montre l’action séquentielle du traitement par GANR suivi d’un traitement à la tobramycine sur les biofilms préformés de P. aeruginosa.

Matériel et méthodes

Le matériel et méthodes utilisé dans cet exemple est identique à celui décrit ci- dessus dans l’exemple 1 , avec les précisions suivantes :

Pour étudier l’impact d’une exposition séquentielle à GANR puis à la tobramycine sur des biofilms préformés de 24 h (comme décrit dans l’exemple 1 ), 300 mI d’ANP (à 1 nM) (condition contrôle) ont été injectés dans deux canaux de la chambre à flux. Le traitement du biofilm préformé a été réalisé pendant 2 h à 37°C en conditions statiques. Après les 2 h, le flux de milieu a été de nouveau appliqué pendant 15 min afin d’éliminer les cellules qui se seraient détachées du biofilm sous l’action du traitement. Puis 300 mI de tobramycine (50 pg/ml) ou 300 mI d’eau milliQ stérile (condition contrôle) ont été injectés des deux canaux de la chambre à flux, pré-exposé à GANR. Le second traitement du biofilm préformé a été réalisé à nouveau pendant 2 h à 37°C en conditions statiques. Après les 2 h, le flux de milieu a été de nouveau appliqué pendant 15 min afin d’éliminer les cellules qui se seraient détachées du biofilm sous l’action du traitement.

Comme décrit dans l’exemple 1 , les biofilms ont été observés en microscopie confocale à balayage laser, après avoir été marqués pendant 15 min avec 5 mM de fluorochrome Syto9 green (Invitrogen).

Résultats

Les inventeurs ont étudié le potentiel d’activité anti-biofilm de l’exposition séquentielle d’ANP (à 10 ^-9 M ; 3 ng/ml) puis de tobramycine (à 50 pg/ml) sur un biofilm établi de P. aeruginosa.

Le biovolume du biofilm a été déterminé et les résultats sont décrits dans les tableaux ci-dessous.

Dans ces conditions, les inventeurs ont observé que le biofilm était encore plus fortement dispersé par un double traitement séquentiel ANP (10 ⁹ M) (2h) puis tobramycine (50 pg/ml) (2h) comparé au traitement avec l’ANP seul.

Ainsi, le traitement séquentiel ANP (2h) puis tobramycine (2h) permet d’obtenir une destruction de 94,7 % du biofilm.