本发明涉及一类 FXR拮抗剂， 具体而言， 涉及一类五环三萜类化合物， 及其制 备方法， 以及包含所述化合物的药物组合物， 在制备 FXR拮抗剂中的用途， 以及在制 备治疗胆汁淤积、 高血脂、 糖尿病药物方面的用途。 背景技术

法尼酯衍生物 X受体 （The farnesoid X receptor, FXR) 属于核受体超家族成员， 高表达于肝脏、 肠道、 肾脏、 肾上腺以及脂肪组织中。 作为内源性胆汁酸的主要调节 器， FXR受体在胆汁酸合成及其肝肠循环过程中发挥 着关键作用。 FXR可以通过肝肠 代谢轴的复杂调控网络， 调节体内甘油三酯、 低密度脂蛋白、 高密度脂蛋白以及血糖 的水平， 此外 FXR还参与到肝脏损伤和炎症、 肝癌以及调节肠道菌群等过程中。

因 FXR参与到众多代谢类疾病， 如胆汁酸代谢紊乱， 脂代谢紊乱和糖代谢异常等 过程中， FXR调节剂有望开发成为治疗胆汁淤积、 高血脂、 糖尿病等一系列代谢性疾 病的药物。 比如 FXR强效激动剂奥贝胆酸， 其在治疗原发性胆汁性肝硬化的三期临床 获得成功， 已被批准上市。 此外， 奥贝胆酸在糖尿病并伴随非酒精性肝 （NASH) 适 应症方面正在开展临床研究。 目前也有众多 FXR拮抗剂的报道， 而且部分化合物在体 内药效学实验中表现出一定的降血脂、 降血糖或者改善胆汁酸淤积的作用。 有研究表 明， 肠道特异性 FXR基因敲除小鼠不易患肥胖和胰岛素抵抗， 并且该课题组发现一个 可拮抗 FXR受体的胆酸衍生物 Τ-β-MCA, 它与一系列代谢功能改善具有相关性， 但 是该化合物可被肠道细菌分泌的胆酸盐水解酶 BSH快速降解。最近文献又报道了一种 胆汁酸衍生物 Gly-MCA， 它可以选择性关闭肠道内的 FXR受体， 能防止和逆转小鼠 的脂肪肝， 增加高脂饮食喂养小鼠对胰岛素和血糖的敏感 度， 并且不会被 BSH降解。 可见， 开发 FXR拮抗剂可能为治疗某些代谢性疾病， 如肥胖、 高血脂、 II型糖尿病和 脂肪肝等提供了新的思路。

现阶段报道的 FXR拮抗剂主要包括两大类，天然产物类拮抗剂 和合成类小分子拮 抗剂。 天然产物没药 酮 （GS ) 是首个被报道的 FXR拮抗剂， 但其选择性较差， 对 多种核受体均有作用。 2007年 Carter等发现的植物甾醇 Stigmasterol Acetate以及 Choi 在 2011年报道的一系列海洋天然产物 Tuberatolides都可以拮抗 FXR， 但因化合物天 然来源有限且全合成难度较大， 因此针对此类化合物的结构优化未见报道。 首个非甾 体类 FXR小分子结抗剂由 Kainuma小组在 2007年报道， 由 FXR激动剂 GW4064改 造而来。另一类代表性小分子拮抗剂是 2012年李剑课题组发现的吡唑酮类化合物， 该 化合物在胆固醇喂养小鼠的体内药效学实验中 可以剂量依赖地降低甘油三酯和总胆固 醇的水平。无论是天然产物类还是合成类小分 子 FXR拮抗剂， 普遍存在活性较弱的缺 陷， 且种类较少。 它们大部分都是天然产物， 结构复杂， 不利于后续开发。

目前， 五环三萜类化合物用作 FXR 拮抗剂鲜有报道， 首个被报道的五环三萜类 FXR拮抗剂为桔梗皂苷 D， 随后发现齐墩果酸也具有微弱的 FXR拮抗活性。最近方唯 硕课题组以齐墩果酸为改造起点， 合成了一类 3-beta-齐墩果酸衍生物， FXR拮抗活性 有所提升， 而至今尚未见白桦脂酸衍生物用于 FXR拮抗剂的报道。 发明内容

本发明的目的在于提供一种用作法尼酯衍生物 X受体 (FXR)拮抗剂的五环三萜类 化合物。 明的第一方面， 提供一种通式 I所示的化合物或其药学上可接受的盐:

Ri为氢、 羟基、 卤素或 Ci-C ₆ 垸基；

R2为氢、羟基、 卤素、 Ci-C ₆ 垸氧基、 3至 10元环垸氧基、 =0、 =N-OH、 R-C(=0)-0- _; 其中 R为取代或未取代的以下基团： d-C ₈ 垸基、 C ₃ -C ₁₍ )环垸基、 C ₆ -C ₁₍ )芳基、 5-7元杂 芳基、 RaNH-或 RaO-; 其中， 各 R _a 独立选自： Ci-C ₈ 垸基、 C ₃ -Cio环垸基、 C ₆ -Cio芳基、 5-7元杂芳基；

R ₃ 和 R ₄ 各自独立地为未取代或取代的^-^垸基；

0

R ₅ 选自氢、 羟基、 羟甲基、 甲酰基、 ^b _; 其中， X为 NH、 0或 S， R _b 为氢、 未取代或取代的^-^垸基；

R ₆ 、 R ₇ 、 1 ₈ 和 R ₉ 各自独立地为氢、 羟基或 Ci-C ₆ 垸基；

Z为 -(CH2)-n， n为 1、 2或 3 ;

^^表示单键或双键；

各 *独立地表示 R构型、 S构型或消旋；

所述取代是指被基团上的氢被选自下组的一个 或多个取代基取代： 羟基、 卤素、 Ci-C ₆ 垸基、 Ci-C ₆ 垸氧基、 羧基 (-COOH；)、 磺酸基 (-S0 ₂ OH；)。

在另一优选例中， Ri为氢或羟基。

在另一优选例中， Ri为氢。

在另一优选例中， R ₂ 为羟基、 R-C(=0)-0- _; 其中 R为取代或未取代的以下基团： Ci-C ₆ 垸基、。 ₃ -。 ₈ 环垸基、 C ₆ -C IQ芳基、 5-7元杂芳基、 RaNH-或 RaO-; 其中， 各 R _a 独立为 Ci-C ₆ 基； 所述取代是指被基团上的氢被选自下组的一个 或多个取代基取代： 卤素、 d-C ₆ 烧基、 Ci-C6烧氧基。

在另一优选例中， R ₂ 以 α构型与环连接。

在另一优选例中， R ₃ 和 R4各自独立地为 d-C4垸基。

在另一优选例中， R ₃ 和 R4同时为甲基。

0

Ϊ R

在另一优选例中， R ₅ 选自羟甲基、 甲酰基、 ^ X' ^b ; 其中， X为 NH或 0， R _b 为氢、 未取代或取代的 ^ ₄ 垸基；

所述取代是指被基团上的氢被选自下组的一个 或多个取代基取代： d-C ₄ 垸基、羧 基 (-COOH)、 磺酸基 (-S020H)。

0 0 ， 0

N COOH N COOH N COOH

在另一优 H 、 H 、 H 、

¾ O COOH ¾ 。 在另一优选例中， R ₆ 和 R ₇ 各自独立地为氢、 甲基或乙基；

和1 ₉ 各自独立地为氢、 甲基、 乙基、 正丙基、 异丙基、 正丁基、 叔丁基或异丁 基。

一优选例中， 所述化合物为：

位羧基上的苄基保护基， 然后在羧基上引入氨基酸基团获得第一方面所 述的化合物， 各取 代基的定义如第一方面所述。

一优选实施方式中， 所述化合物或其药学上可接受的盐通过以下路 线制备:

式 HI化合物与酰氯、 酸酐、 氯甲酸酯或异氰酸酯反应得到式 H2化合物； 式 H2化合物脱去苄基保护基得到式 H3化合物；

式 H3化合物与氨基酸或氯甲酸酯反应得到式 H4化合物，

其中 Rio为取代或未取代的以下基团： d-C ₈ 垸基、 C ₃ -C ₁₍ )环垸基、 C ₆ -C ₁₍ )芳基、 5-7元杂芳基、 R _a NH-或 RaO- ;其中，各 R _a 独立选自： Ci-C ₈ 垸基、 C ₃ -Cio环垸基、 C ₆ -Cio 芳基、 5-7元杂芳基； Ru选自氢、 未取代或取代的 d-C ₆ 垸基。

取代的定义同前。 本发明的第三方面， 提供一种药物组合物， 所述药物组合物包含第一方面所述的化合 物或其药学上可接受的盐； 和

药学上可接受的载体。 本发明的第四方面， 提供 10、 权利要求 1所述的化合物或其药学上可接受的盐， 或权 利要求 9所述的药物组合物的用途，其特征在于， (i) 用于制备法尼酯衍生物 X受体 (FXR) 拮抗剂； 或 (ii) 用于制备治疗代谢性疾病的药物。

在另一优选例中， 所述代谢性疾病选自： 高血脂、 胆汁酸淤积、 糖尿病、 肥胖、 非酒 精性脂肪肝、 胆汁性肝硬化。

一种治疗高血脂的方法， 其特征在于， 所述方法包括向有需要的对象施用权利要求 1 所述的化合物或其药学上可接受的盐， 或权利要求 9所述的药物组合物 本发明新型的五环三萜类化合物， 能有效拮抗 FXR受体， 可在微摩尔浓度下拮抗

FXR受体， 且对 TGR5受体无激动作用， 与现有的一些天然来源的 FXR拮抗剂相比， 具 有更丰富的天然来源和更简便的合成方法。 应理解， 在本发明范围内中， 本发明的上述各技术特征和在下文 (如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合， 从而构成新的或优选的技术方案。 说明书 中所揭示的各个特征， 可以被任何提供相同、 均等或相似目的的替代性特征取代。 限 于篇幅， 在此不再一一累述。 具体实施方式

本申请的发明人经过广泛而深入地研究， 首次研发出一类五环三萜类化合物， 其 主要特点是 3 位羟基反转并通过在其 17位羧基处引入甘氨酸或牛磺酸等基团， FXR 拮抗活性明显增加。 发明人首次研发这一结构对活性的影响规律， 并得到一系列性能 优异的化合物， 与已有的一些天然来源的 FXR拮抗剂相比， 不仅来源更加丰富， 而且 合成简便， 有望成为作用于该靶点的治疗代谢性疾病的新 型药物。 在此基础上， 完成 了本发明。 术语

在本文中， 所述的垸基优选为脂肪族垸基， 可以是直链垸基或支链垸基， 非限制 性地包括： 甲基、 乙基、 正丙基、 异丙基、 正丁基、 异丁基、 叔丁基等； 形如" C 1-C8" 的表述意在包括具有 1个、 2个、 3个、 4个、 5个、 6个、 7个或 8个碳原子的相应基 团， 例如， "C 1-C8垸基"指具有 1个、 2个、 3个、 4个、 5个、 6个、 7个或 8个碳原 子的垸基， "C2-C 10烯基"指具有 2个、 3个、 4个、 5个、 6个、 7个、 8个、 9个或 10个碳原子的烯基。

在本文中， 所述烯基优选为乙烯基、 丙烯基、 丁烯基、 苯乙烯基、 苯丙烯基， 或 类似基团。

本文中， 卤素优选是指氟、 氯、 溴或碘。

本文中， 垸氧基是指 -0-(垸基；)， 其中垸基的定义如上所述。 "d- ₆ 垸氧基 "指含 1-6 个碳的垸基氧基， 非限制性实施例包含甲氧基、 乙氧基、 丙氧基、 丁氧基等。

在本文中， 所述环垸基可以为饱和或者部分不饱和单环或 多环环状烃取代基， 其 中包括 3至 20个碳原子， 优选包括 3至 12个碳原子， 更优选环垸基包含 3至 10个碳 原子。 单环环垸基非限制实施例包含环丙基、 环丁基、 环戊烯基、 环己基、 环辛基等； 多环环垸基包括螺环、 稠环和桥环的环垸基。

本文中， 环垸氧基是指 -0-(环垸基；)， 其中环垸基的定义如上所述。

所述芳基指 6至 10元全碳单环或稠合多环 (也就是共享毗邻碳原子对的环)基团， 且所述的基团具有共轭的 π电子体系， 例如苯基和萘基。 所述芳基环可以与杂环基、 杂芳基或环垸基环稠合， 非限制性实施例含苯并咪唑、 苯并噻唑、 苯并恶唑、 苯并异 恶唑、 苯并吡唑、 喹啉、 苯并吲哚、 苯并二氢呋喃。

所述杂芳基指包含 1至 4个杂原子， 5至 14个环原子的杂芳族体系， 其中杂原子 包括氧、 硫和氮。 杂芳基优选为是 5元或 6元， 例如呋喃基、 噻吩基、 吡啶基、 吡咯 基、 Ν-垸基吡咯基、 嘧啶基、 吡嗪基、 咪唑基、 四唑基等。 所述的杂芳基可以稠合于 芳基、 杂环基或者环垸基环上， 其中与母体结构连接在一起的环为杂芳基环。 在本发明中除非另外指出， 表示连接位点。

除非特别说明， 本发明所描述的结构式意在包括所有的互变异 构、 光学异构和立 体异构形式 (如对映异构体、 非对映异构体， 几何异构体或构象异构体)： 例如含有不 对称中心的 R、 S构型， 双键的 (Z)、 （E)异构体和 (Z)、 （E)的构象异构体。 因此本发明 的化合物的单个立体化学异构体、 互变异构体或其对映异构体、 非对映异构体或几何 异构体或构象异构体或互变异构体的混合物都 属于本发明的范围。

术语"互变异构体"表示具有不同能量的结构同� ��异构体可以超过低能垒， 从而互 相转化。 比如， 质子互变异构体 (即质子移变；)包括通过质子迁移进行互变， 如 1H-吲唑 与 2H-吲唑、 1H-苯并 [d]咪唑与 3H-苯并 [d]咪唑， 化合价互变异构体包括通过一些成键 电子重组而进行互变。

在本文中， 所述的药学上可接受的盐没有特别的限制， 优选包括： 无机酸盐、 有 机酸盐、 垸基磺酸盐和芳基磺酸盐； 所述无机酸盐包括盐酸盐、 氢溴酸盐、 硝酸盐、 硫酸盐、 磷酸盐等； 所述有机酸盐包括甲酸盐、 乙酸盐、 丙酸盐、 苯甲酸盐、 马来酸 盐、 富马酸盐、 琥珀酸盐、 酒石酸盐、 柠檬酸盐等； 所述垸基磺酸盐包括甲基磺酸盐、 乙基磺酸盐等； 所述芳基磺酸盐包括苯磺酸盐、 对甲苯磺酸盐等。 制备方法

本发明的五环三萜类化合物， 能够采用以下路线进行制备。

路线一：

-8-

下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发 明而不用于限制本发明的范围。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照 常规条件 (；如 Sambrook等人， 分子克隆： 实验室手册 (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件)或按照制造厂商所建议的条 件。 除非另外说明， 否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

除非另行定义， 文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟 练人员所熟悉的意 义相同。此外， 任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆 可应用于本发明方法中。 文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用 。 下述制备实施例中， NMR用 Varian生产的 Mercury-Vx 300M仪器测定， NMR定 标： δ Η 7.26 ppm ( CDCh ) ， 2.50 ppm (DMSO-ώ) ； 质谱用 Agilent 1200 Quadrupole LC/MS液质联用仪或 SHIMADZU GCMS-QP5050A测定； 试剂主要由上海化学试剂公 司提供； TLC薄层层析硅胶板由山东烟台会友硅胶开发有 限公司生产，型号 HSGF 254； 化合物纯化使用的正相柱层析硅胶为山东青岛 海洋化工厂分厂生产， 型号 zcx-l l， 200-300目。

本文缩写所对应的的中文如下：

DMAP: 4-二甲氨基吡啶； DCM: 二氯甲垸； DMF: Ν,Ν-二甲基甲酰胺； TFA: 三 氟乙酸。

( 1 ) 室温下将原料白桦脂酸 SI ( 1.2 g, 2.63 mmol ) 溶于甲醇 （50 mL ) 中， 换氮 气后， 迅速加入 10%的 Pd/C， 再换氮气后换氢气， 室温下搅拌。 24小时后 TLC检测 反应完全。 换氮气后滤去 Pd/C， 反应液旋干后用石油醚 /乙酸乙酯为 10: 1 的洗脱剂体 系进行柱层析分离， 得到化合物 S2 1.04 g (2.27 mmol)， 为白色固体， 摩尔收率： 86%。 ¾ NMR (300 MHz, CDCh) δ 3.13 (t, 1H, J = 9.0, 6.9 Hz), 2.28-2.16 (m, 2H), 1.98-1.78 (m, 4H), 1.64-0.96 (m, 其它脂肪环质子）， 0.96 (s, 3H), 0.93 (s, 3H), 0.92 (s, 3H), 0.90 (s, 3H), 0.89 (s, 3H), 0.87 (s, 3H), 0.78 (s, 3H).

( 2 )室温下将上步产物 S2(1.04 g, 2.27 mmol)溶解在 DMF(20 mL)中， 加入无水碳 酸钾（0.626 g, 4.54 mmol), 搅拌下慢慢滴加氯化苄 （0.313 mL, 2.72 mmol ) 。 滴加完毕 后将反应液移至 50 °C搅拌 3h， TLC监测显示反应进行完全。将混合物冷却至室 温， 加 入去离子水 50 mL稀释， 用乙酸乙酯 （2x50 mL ) 萃取， 将合并的有机层分别用去离 子水和饱和食盐水洗涤， 经硫酸钠干燥后并减压蒸馏得到所需白色固体 化合物 S3 1.21g (2.20 mmol), 直接用于下一步反应， 摩尔收率： 97%。

( 3 ) 冰水浴下将 S3(1.21 g， 2.20 mmol)溶于二氯甲垸 （30mL ) ， 分批加入 Dess-Martin 氧化剂（1.87 g, 4.40 mmol)， 慢慢升至室温并搅拌 1小时。将反应混合物过 滤后旋干， 用石油醚 /乙酸乙酯为 10: 1 的洗脱剂体系进行柱层析分离， 得到化合物 S4 0.983 g (1.80 mmol), 为白色固体， 摩尔收率： 82%。 ¾ NMR (300 MHz, CDCh) δ 7.38-7.30 (m, 5H), 5.16-5.05 (m, 2H), 2.55-2.34 (m, 2H), 2.31-2.18 (m, 3H), 1.95-1.12 (m _: 其它脂肪环质子)， 1.06 (s, 3H), 1.01 (s, 3H), 0.93 (s, 3H), 0.91 (s, 3H), 0.86 (d, 3H, J = 6.9 Hz), 0.79-0.73 (m, 6H).

( 4 ) 上步产物 S4 ( 0.983 g, 1.80 mmol ) 和 S-(-)-2-甲基恶唑硼垸 ( 100 mg, 0.36 mmol ) 与 100 mL烘干的圆底烧瓶， 加入新鲜钠丝处理过的 THF ( 70 mL) 。 室温下 慢慢滴加 10M的硼垸-四氢呋喃溶液 （0.32mL ) ， 控制滴加速度在十分钟内加完， 室 温下搅拌十分钟， TLC监测显示反应已经进行完。 将反应瓶移至冰水浴， 慢慢滴加甲 醇淬灭反应， 待不再有气泡生成后旋干溶剂， 用石油醚 /乙酸乙酯为 10: 1的洗脱剂体系 进行柱层析分离， 得到化合物 S5 827 mg (1.51 mmol 为白色固体， 摩尔收率： 84%。 ¾ NMR (300 MHz, CDCh) δ 7.37-7.30 (m, 5H), 5.15-5.06 (m, 2H), 3.38 (t, 1H, J = 3.0 Hz), 2.55-2.34 (m, 2H), 2.31-2.18 (m, 3H), 1.95-1.12 (m, 其它脂肪环质子)， 0.94 (s, 3H), 0.93 (s, 3H), 0.91 (s, 3H), 0.85-0.82 (m, 9H), 0.75-0.73 (m, 6H).

( 5 ) 化合物 S5 (1 10 mg， 0.20 mmol ) 和催化量的 DMAP (2.4 mg, 0.02 mmol) 溶 于二氯甲垸 （5 mL) 中，加入三乙胺 （83 μί， 0.60 mmol),冰水浴下滴入丁酸酐（98 μί， 0.60 mmol ) ， 室温反应 12小时， TLC显示反应完成。 浓缩除去溶剂后， 加乙酸乙酯 稀释， 分别用水和饱和氯化钠水溶液洗涤有机相， 无水硫酸钠干燥浓缩， 用石油醚 / 乙酸乙酯为 10: 1的洗脱剂体系进行柱层析分离， 得产物 S9 111 mg (0.18 mmol ) ， 摩 尔收率： 90% o ¾ NMR (300 MHz, CDCh) δ 7.38-7.30 (m, 5Η), 5.15-5.06 (m, 2H), 4.62 (t, 1H, = 3.0 Hz), 2.34-2.16 (m, 4H), 1.93-1.04 (m, 其它脂肪环质子)， 0.97 (t, 6H, J = 7.2 Hz), 0.87-0.86 (m, 3H), 0.84-0.82 (m, 6H), 0.76-0.73 (m, 6H).

( 6) 将上步产物 S9 (1 11 mg, 0.18 mmol ) 溶于甲醇（10 mL)和少量乙酸乙酯中， 换氮气后， 迅速加入 10%的 Pd/C， 再换氮气后换氢气， 室温下搅拌。 1小时后 TLC检 测反应完全。 换氮气后滤去 Pd/C， 反应液旋干后用石油醚 /乙酸乙酯为 9: 1的洗脱剂体 系进行柱层析分离，得到化合物 S10 79 mg (0.15 mmol),为白色固体，摩尔收率： 83%。 ¾ NMR (300 MHz, CDCh) δ 4.61 (s, 1H), 2.30 (t, 2H, J = 7.5 Hz), 2.28-2.15 (m, 4H), 1.98-1.15 (m, 其它脂肪环质子）， 0.94 (s, 3H), 0.91 (s, 3H), 0.90 (t, 3H, J = 6.0 Hz), 0.85 (s, 3H), 0.83 (s, 3H), 0.82 (s, 3H), 0.75 (s, 3H), 0.73 (s, 3H).

( 7) 将上步产物 S10 (79 mg, 0.15 mmol)和催化量 DMF (2 μί, 0.02 mmol)溶于 2 mL 干燥的二氯甲垸中， 0°C下加入草酰氯 (125 μί, 1.5 mmol), 10 分钟后回至室温搅拌 3 小时。 直接旋出二氯甲垸并用油泵抽干后， 用于下一步反应。 将甘氨酸叔丁酯盐酸盐 (51 mg, 0.30 mmol), 催化量的 DMAP (3.7 mg, 0.03 mmol)溶于 1 mL二氯甲焼中， 0°C 下滴加三乙胺（103 μί, 0.75 mmol), 然后滴加现制酰氯的二氯甲垸溶液 1 mL， 10分钟 后回至室温， 室温反应 12小时， TLC显示反应完成。 浓缩除去溶剂后， 加乙酸乙酯稀 释， 分别用水和饱和氯化钠水溶液洗涤有机相， 无水硫酸钠干燥浓缩， 用石油醚 /乙酸 乙酯为 8: 1的洗脱剂体系进行柱层析分离，得产物 83 mg (0.13 mmol )，摩尔收率： 87%。 ¾ NMR (300 MHz, CDCh) δ 6.02 (t, 1H, = 5.1 Hz), 4.62 (t, 1H, J = 3.0 Hz), 3.91-3.88 (m, 2H), 2.48-2.38 (m, 1H), 2.31 (t, 2H, J = 7.5 Hz), 2.04-2.00 (m, 1H), 1.91-1.04 (m, 其 它脂肪环质子）， 1.47 (s, 9H), 1.04-0.95 (m, 6H), 0.92 (s, 3H), 0.86-0.82 (m, 12H), 0.74 (d, 3H, = 6.6 Hz).

( 8 )将上步产物 83 mg (0.13 mmol)溶于 3 mL二氯甲垸中， 加入 0.2 mL TFA， 室温 下搅拌 1小时， TLC显示反应完成。 直接旋干溶剂， 用二氯甲垸 /甲醇为 20: 1 的洗脱 剂体系进行柱层析分离，得产物 C4 (59 mg, 0.10 mmol), 摩尔收率： 77%. ¾ NMR (300 MHz, CDCh) δ 6.16 (s, 1H), 4.63 (t, 1H, J = 2.7 Hz), 4.07 (s, 2H), 2.41-2.21 (m, 4H), 2.05-1.04 (m, 其它脂肪环质子）， 1.00-0.95 (m, 6H), 0.92 (s, 3H), 0.87-0.83 (m, 12H), 0.75 (d, 3H, = 6.9 Hz).

用实施例一中同样的方法不同的酸酐或酰氯合 成以下化合物

¾ NMR (300 MHz, CDCh) δ 9.26 (s, 1H),

8.83-8.81 (m, 1H), 8.41-8.37 (m, 1H), 7.53-7.48 (m, 1H), 6.17-6.14 (m, 1H), 4.94-4.92 (m, 1H), 4.08-4.05 (m, 2H),

C16 2.45-2.38 (m, 1H), 2.32-2.25 (m, 1H),

2.06-1.97 (m, 2H), 1.84-1.16 (m, 其它脂肪 环质子)， 1.03 (s, 6H), 0.96 (s, 6H), 0.92 (s, 3H), 0.90 (s, 3H), 0.85 (d, 3H, J = 6.6 Hz), 0.75 (d, 3H, = 6.9 Hz).

¾ NMR (300 MHz, CDCh) δ 7.59 (s, 1H),

7.13 (d, 1H, J = 3.3 Hz), 6.52-6.50 (m, 1H),

6.14 (t, 1H, J = 5.4 Hz), 4.85 (s, 1H), 4.07-4.05 (m, 2H), 2.44-2.36 (m, 1H),

C17

2.32-2.24 (m, 1H), 2.06-1.15 (m, 其它脂肪 环质子)， 1.03 (s, 6H), 0.95 (s, 6H), 0.93 (s, 3H), 0.90-0.85 (m, 9H), 0.75 (d, 3H, = 6.6 Hz).

¾ NMR (300 MHz, CDCh) δ 6.69-6.66 (m, 1H), 5.48-5.46 (m, 1H), 4.65-4.63 (m, 1H), 4.09 (dd, J = 17.7, 5.4 Hz, 1H), 3.90 (dd, J

C24 = 17.7, 5.4 Hz, 1H), 2.60-2.56 (m, 1H),

2.31 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.10-1.06 (m, 其 它脂肪环质子)， 0.99-0.85 (m, 18H), 0.74 (s, 3H).

¾ NMR (300 MHz, CDCh) δ 6.67-6.65 (m, 1H), 5.42-5.40 (m, 1H), 4.65 (s, 1H), 4.06 (dd, J = 17.7, 5.1 Hz, 1H), 3.90 (dd, J =

C25 18.0, 4.2 Hz, 1H), 2.60-2.56 (m, 1H), 2.32

(t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.05-1.06 (m, 其它脂肪 环质子)， 0.99-0.89 (m, 15H), 0.85 (s, 3H), 0.74 (s, 3H).

得化合物 C4 (42 mg, 0.07 mmol)溶于甲醇和水 (4: 1)的混合溶剂中， 0°C下加入氢氧 化钠 (28 mg, 0.7 mmol)， 10分钟后回至室温， 搅拌 12小时。 TLC显示反应完成。 旋出 甲醇， 加稀盐酸调节 pH值至中性， 加乙酸乙酯稀释， 分别用水和饱和氯化钠水溶液 洗涤有机相， 无水硫酸钠干燥浓缩， 用二氯甲垸 /甲醇为 10: 1的洗脱剂体系进行柱层析 分离， 得产物 C1 21 mg (0.04 mmol ) ， 摩尔收率： 57%. ¾ NMR (300 MHz, CDCh) δ 6. 13-6. 10 (m, 1H), 4.04 (d, 2H, = 4.8 Hz), 3.40 (t, 1H, = 3.0 Hz), 2.43 - 1. 12 (m, 其它脂 肪环质子）， 0.97 (s, 3H), 0.93 (s, 3H), 0.92 (s, 3H), 0.87-0.82 (m, 9H), 0.75 (d, 3H, J = 6.9 Hz).

( 1 ) 化合物 S3 (148 mg， 0.27 mmol ) 和催化量的 DMAP (3.7 mg, 0.03 mmol) 溶 于二氯甲垸 （5 mL) 中， 加入三乙胺 （1 12 μί， 0.81 mmol), 冰水浴下滴入丁酸酐（132 μί， 0.81 mmol ) ， 室温反应 12小时， TLC显示反应完成。 浓缩除去溶剂后， 加乙酸 乙酯稀释， 分别用水和饱和氯化钠水溶液洗涤有机相， 无水硫酸钠干燥浓缩， 用石油 醚 /乙酸乙酯为 10 : 1的洗脱剂体系进行柱层析分离， 得产物 S6 142 mg (0.23 mmol ) ， 摩尔收率： 85% o ¾ NMR (300 MHz, CDCh) δ 7.37-7.30 (m, 5H), 5. 15-5.05 (m, 2H), 4.50-4.45 (m, 1H), 2.34-2.14 (m, 4H), 1.86- 1 .09 (m, 其它脂肪环质子)， 0.99-0.92 (m, 6H), 0.85-0.79 (m, 9H), 0.75-0.73 (m, 6H).

( 2 )将上步产物 S6 (142 mg, 0.23 mmol )溶于甲醇（15 mL)和少量乙酸乙酯中， 换 氮气后， 迅速加入 10%的 Pd/C, 再换氮气后换氢气， 室温下搅拌。 1小时后 TLC检测 反应完全。 换氮气后滤去 Pd/C， 反应液旋干后用石油醚 /乙酸乙酯为 8 : 1 的洗脱剂体 系进行柱层析分离，得到化合物 S7 101 mg (0.19 mmol) ,为白色固体，摩尔收率： 83%。 ¾ NMR (300 MHz, CDCh) δ 4.48 (t, 1H, J = 7.5 Hz), 2.28 (t, 2H, J = 7.5 Hz), 2.30-2.15 (m, 4H), 1.90- 1 .07 (m, other aliphatic ring protons), 0.94 (s, 3H), 0.91 (s, 3H), 0.90 (t, 3H, J = 6.0 Hz), 0.85 (s, 3H), 0.83 (s, 3H), 0.82 (s, 3H), 0.75 (s, 3H), 0.73 (s, 3H).

( 3 )将上步产物 S7 (101 mg, 0. 19 mmol) 和催化量 DMF (2 μί, 0.02 mmol)溶于 2 mL 干燥的二氯甲垸中， 0 °C下加入草酰氯 (158 μί, 1.9 mmol), 10 分钟后回至室温搅拌 3小 时。 直接旋出二氯甲垸并用油泵抽干后， 用于下一步反应。 将甘氨酸叔丁酯盐酸盐 (65 mg, 0.38 mmol), 催化量的 DMAP (3.7 mg, 0.03 mmol)溶于 1 mL二氯甲垸中， 0 °C下滴 加三乙胺（130 μί, 0.95 mmol),然后滴加现制酰氯的二氯甲垸溶液 1 mL， 10分钟后回至 室温， 室温反应 12小时， TLC显示反应完成。 浓缩除去溶剂后， 加乙酸乙酯稀释， 分 别用水和饱和氯化钠水溶液洗涤有机相， 无水硫酸钠干燥浓缩， 用石油醚 /乙酸乙酯为 8 : 1的洗脱剂体系进行柱层析分离， 得产物 S8 105 mg (0.17 mmol ) ， 摩尔收率： 89%. Ή NMR (300 MHz, CDCh) δ 6.01 (t, 1H, J = 5.1 Hz), 4.51-4.45 (m, 1H), 3.91-3.88 (m, 2H), 2.48-2.38 (m, 1H), 2.30-2.25 (m, 3H), 2.03-2.00 (m, 1H), 1.81-1.11 (m, 其它脂肪环 质子）， 1.47 (s, 9H), 0.97-0.91 (m, 9H), 0.86-0.83 (m, 12H), 0.74 (d, 3H, = 6.6 Hz).

(4) 将上步产物 S8105 mg (0.17 mmol)溶于 5 mL二氯甲垸中， 加入 0.2 mL TFA， 室温下搅拌 1小时， TLC显示反应完成。 直接旋干溶剂， 用二氯甲垸 /甲醇为 20:1 的 洗脱剂体系进行柱层析分离，得产物 C12 (82 mg, 0.14 mmol),摩尔收率： 82%. ¾ NMR (300 MHz, CDCh) δ 6.15-6.11 (m, 1H), 4.51-4.45 (m, 1H), 4.05 (t, 1H, J = 4.8 Hz), 2.38-2.25 (m, 4H), 2.02-1.12 (m, 其它脂肪环质子）， 0.97-0.90 (m, 9H), 0.86-0.83 (m, 12H), 0.75 (d, 3H, J = 6.6 Hz).

(1) 将上步产物 S10 (50 mg, 0.095 mmol) 和催化量 DMF (1 μί, 0.01 mmol)溶于 1 mL干燥的二氯甲垸中， 0°C下加入草酰氯 (125 μί, 0.95 mmol), 10分钟后回至室温搅拌 3 小时。 直接旋出二氯甲垸并用油泵抽干后， 用于下一步反应。 将甘氨酸叔丁酯盐酸 盐 (36 mg, 0.19 mmol), 催化量的 DMAP (2.4 mg, 0.02 mmol)溶于 1 mL二氯甲焼中， 0 °C下滴加三乙胺 (67 μί, 0.48 mmol),然后滴加现制酰氯的二氯甲垸溶液 1 mL， 10分钟 后回至室温， 室温反应 12小时， TLC显示反应完成。 浓缩除去溶剂后， 加乙酸乙酯稀 释， 分别用水和饱和氯化钠水溶液洗涤有机相， 无水硫酸钠干燥浓缩， 用石油醚 /乙酸 乙酯为 15:1的洗脱剂体系进行柱层析分离， 得产物 47 mg (0.072 mmol) ， 摩尔收率： 76%. ¾ NMR (300 MHz, CDCh) δ 6.18 (d, 1H, J = 7.2 Hz), 4.62 (t, 1H, = 3.0 Hz), 4.48-4.38 (m, 1H), 2.44-2.27 (m, 4H), 2.01-1.03 (m, 其它脂肪环质子)， 0.99-0.92 (m, 9H), 0.86-0.82 (m, 12H), 0.74 (d, 3H, J = 6.6 Hz).

(2) 将上步产物 47 mg (0.072 mmol)溶于 2 mL二氯甲垸中， 加入 0.2 mL TFA， 室 温下搅拌 1小时， TLC显示反应完成。 直接旋干溶剂， 用二氯甲垸 /甲醇为 20:1 的洗 脱剂体系进行柱层析分离， 得产物 C18 (36 mg, 0.060 mmol), 摩尔收率： 83%. ¾NMR (300 MHz, CDCh) δ 6.06 (d, 1Η, J = 6.6 Hz), 4.63 (s, 1H), 4.59-4.49 (m, 1H), 2.41-2.28 (m, 4H), 2.00-1.08 (m, 其它脂肪环质子）， 1.00-0.93 (m, 9H), 0.88-0.83 (m, 12H), 0.75 (d, 3H, = 6.6 Hz).

采用 D-丙氨酸盐酸盐合成化合物 C19。

Ή NMR (300 MHz, CDCh) δ 6.06 (d, 1H, J = 6.3 Hz), 4.63 (t, 1H, = 3.0 Hz) 4.55-4.46 (m, 1H), 2.43-2.24 (m, 4H), 2.03-1.05 (m, 其它脂肪环质子)， 1.00-0.92 (m, 9H) 0.87-0.83 (m, 12H), 0.75 (d, 3H, J = 6.6 Hz).

将化合物 S10 (50 mg, 0.095 mmol) 和催化量 DMF (1 μί, 0.01 mmol)溶于 2 mL干 燥的二氯甲垸中， 0°C下加入草酰氯 (80 μί, 0.95 mmol), 10 分钟后回至室温搅拌 3小 时。直接旋出二氯甲垸并用油泵抽干后，用于 下一步反应。将现制酰氯和三乙胺 (263 μί, 1.9 mmol)溶于二氧六环 (3 mL), 然后在 0°C下滴加牛磺酸 (36 mg, 0.285 mmol)和三乙胺 (263 μί, 1.9 mmol)水溶液 1 mL, 10分钟后回至室温， 室温反应 3小时， TLC显示反应 完成。 加稀盐酸调节 pH值至酸性， 加乙酸乙酯稀释， 分别用水和饱和氯化钠水溶液 洗涤有机相， 无水硫酸钠干燥浓缩， 用二氯甲垸 /甲醇为 10: 1的洗脱剂体系进行柱层析 分离， 得产物 C20 16 mg (0.025 mmol ) ， 摩尔收率： 27%. ¾ NMR (300 MHz, CDCh) δ 7.09 (br s, 1H), 4.61 (s, 1H), 3.20-3.03 (m, 4H), 2.33-2.28 (m, 2H), 1.72-1.60 (m, 4H), 1.44-1.07 (m, 其它脂肪环质子)， 0.99-0.89 (m, 9H), 0.87-0.81 (m, 12H), 0.73-0.72 (m, 3H).

( 1 )将化合物 S10 (100 mg, 0.189 mmol)溶于超干 DMF(3 mL),加入无水碳酸钾（65.3 mg, 0.473 mmol), 搅拌下慢慢滴加溴乙酸苄酯 （ 0.148 mL, 0.945 mmol ) ， 滴加完毕后 室温搅拌 3h，TLC监测显示反应进行完全。加入去离子水 30 mL稀释，用乙酸乙酯（2x30 mL) 萃取， 将合并的有机层分别用去离子水和饱和食盐水 洗涤， 经硫酸钠干燥浓缩， 用石油醚 /乙酸乙酯为 30: 1的洗脱剂体系进行柱层析分离， 得产物 S13 124 mg (0.183 mmol), 摩尔收率： 97% o ¾ NMR (300 MHz, CDCh) δ 7.38-7.34 (m, 5H), 5.24-5.13 (m, 2H), 4.63-4.62 (m, 3H), 2.32 (t, 2H, J = 7.5 Hz), 2.28-2.20 (m, 2H), 1.96-1.77 (m, 3H), 1.71-1.64 (m, 2H), 1.61-1.04 (m, 其它脂肪环质子)， 1.00-0.92 (m, 9H), 0.87-0.83 (m, 9H), 0.75 (d, 3H, = 6.9 Hz). ( 2 ) 将上步产物 S13 (124 mg, 0.183 mmol ) 溶于甲醇（15 mL)和少量乙酸乙酯中， 换氮气后， 迅速加入 10%的 Pd/C, 再换氮气后换氢气， 室温下搅拌。 1小时后 TLC检 测反应完全。 换氮气后滤去 Pd/C， 反应液旋干后用二氯甲垸 /甲醇为 20: 1的洗脱剂体 系进行柱层析分离，得到化合物 C21 80 mg (0.137 mmol)，为白色固体，摩尔收率： 75%。 ¾ NMR (300 MHz, CDCh) δ 4.66-4.58 (m, 3H), 2.32 (t, 2H, J = 7.5 Hz), 2.24-2.17 (m, 3H), 1.94-1.77 (m, 4H), 1.71-1.64 (m, 2H), 1.61-1.04 (m, 其它脂肪环质子)， 1.00-0.92 (m, 9H), 0.87-0.82 (m, 9H), 0.75 (d, 3H, = 6.6 Hz).

( 1 ) 将化合物 S5 (100 mg, 0.182 mmol), 异氰酸乙酯（150 μί, 1.82 mmol), 三乙胺 (505 μί, 3.64 mmol)以及 DMAP(1.22 mg, 0.01 mmol)溶于 3 mL甲苯中， 120 °C封管反应 两天， TLC监测显示反应进行完全。加入去离子水 30 mL稀释，用乙酸乙酯（2x30 mL) 萃取， 将合并的有机层分别用去离子水和饱和食盐水 洗涤， 经硫酸钠干燥浓缩， 用石 油醚 /乙酸乙酯为 15: 1的洗脱剂体系进行柱层析分离，得产物 S14 85 mg (0.137 mmol), 摩尔收率： 75%。 ¾ NMR (300 MHz, CDCh) δ 7.37-7.26 (m, 5Η), 5.15-5.06 (m, 2H), 4.64 (br s, 1H), 4.49 (s, 1H), 3.24-3.20 (m, 2H), 2.31-2.15 (m, 4H), 1.85-1.77 (m, 4H), 1.68-1.01 (m, 其它脂肪环质子)， 0.96 (s, 3H), 0.86-0.82 (m, 12H), 0.75-0.73 (m, 6H).

( 2 )将上步产物 S14 (85 mg, 0.137 mmol)溶于甲醇（15 mL)和少量乙酸乙酯中， 换 氮气后， 迅速加入 10%的 Pd(OH) ₂ /C, 再换氮气后换氢气， 室温下搅拌。 1小时后 TLC 检测反应完全。 换氮气后滤去 Pd(OH) ₂ /C， 反应液旋干后用石油醚 /乙酸乙酯为 8: 1的 洗脱剂体系进行柱层析分离， 得到化合物 S15 61 mg (0.115 mmol), 为白色固体， 摩尔 收率： 84% ¾ NMR (300 MHz, CDCh) δ 4.67 (br s, 1H), 4.50 (s, 1H), 3.27-3.17 (m, 2H), 2.29-2.16 (m, 4H), 1.91-1.78 (m, 4H), 1.68-1.06 (m, 其它脂肪环质子)， 0.99 (s, 3H), 0.93 (s, 3H), 0.86-0.85 (m, 12H), 0.75 (d, 3H, J = 6.9 Hz).

( 3 )将上步产物 S15 (61 mg, 0.1 15 mmol) 和催化量 DMF (1 μί, 0.01 mmol)溶于 2 mL干燥的二氯甲垸中， 0°C下加入草酰氯 (96 μί, 1.15 mmol), 10分钟后回至室温搅拌 3 小时。 直接旋出二氯甲垸并用油泵抽干后， 用于下一步反应。 将甘氨酸叔苄酯盐酸盐 (47 mg, 0.23 mmol), 催化量的 DMAP (2.4 mg, 0.02 mmol)溶于 1 mL二氯甲焼中， 0°C 下滴加三乙胺 (80 μί, 0.58 mmol),然后滴加现制酰氯的二氯甲垸溶液 1 mL， 10分钟后 回至室温， 室温反应 12小时， TLC显示反应完成。浓缩除去溶剂后，加乙酸乙 酯稀释， 分别用水和饱和氯化钠水溶液洗涤有机相， 无水硫酸钠干燥浓缩， 用石油醚 /乙酸乙酯 为 8: 1的洗脱剂体系进行柱层析分离， 得产物 S16 52 mg (0.077 mmol ) ， 摩尔收率： 67%. Ή NMR (300 MHz, CDCh) δ 7.37-7.34 (m, 5H), 6.07 (t, 1H, J = 5.4 Hz), 5.22-5.13 (m, 2H), 4.65 (br s, 1H), 4.49 (s, 1H), 4.08-3.97 (m, 2H), 3.26-3.17 (m, 2H), 2.46-2.23 (m, 3H), 2.03-1.04 (m, 其它脂肪环质子)， 0.97 (s, 3H), 0.90 (s, 1H), 0.85-0.83 (m, 9H), 0.74 (d, 3H, = 6.9 Hz)

( 4 ) 将上步产物 S16 52 mg (0.077 mmol) 溶于甲醇（10 mL)和少量乙酸乙酯中， 换氮气后， 迅速加入 10%的 Pd/C, 再换氮气后换氢气， 室温下搅拌。 1小时后 TLC检 测反应完全。 换氮气后滤去 Pd/C， 反应液旋干后用二氯甲垸 /甲醇为 20: 1的洗脱剂体 系进行柱层析分离， 得到化合物 C22 (38 mg, 0.065 mmol), 摩尔收率： 84%. ¾ NMR (300 MHz, CDCh) δ 6.17 (s, 1H), 4.66 (br s, 1H), 4.50 (s, 1H), 4.04-3.97 (m, 2H), 3.28-3.20 (m, 2H), 2.44-2.27 (m, 3H), 2.04-1.05 (m, 其它脂肪环质子)， 0.98 (s, 3H), 0.92 (s, 3H), 0.86-0.84 (m, 9H), 0.74 (d, 3H, = 6.6 Hz)

( 1 ) 将化合物 S5 (130 mg, 0.237 mmol)溶于 3 mL吡啶中， -20°C下加入氯甲酸乙 酯（1 13 μί, 1.19 mmol)， 10分钟后回至室温搅拌， 2小时后 TLC检测反应完全。 加入 去离子水 30 mL稀释， 用乙酸乙酯 （2x30 mL) 萃取， 将合并的有机层分别用稀盐酸， 去离子水和饱和食盐水洗涤，经硫酸钠干燥浓 缩， 用石油醚 /乙酸乙酯为 10: 1的洗脱剂 体系进行柱层析分离， 得产物 S17 97 mg (0.156 mmol)， 摩尔收率： 66%。 ¾ NMR (;300 MHz, CDCh) δ 7.38-7.30 (m, 5Η), 5.15-5.06 (m, 2H), 4.46 (t, 1H, = 2.7 Hz), 4.19 (q, 2H, J = 7.2 Hz), 2.30-2.14 (m, 4H), 1.96-1.02 (m, 其它脂肪环质子)， 0.95 (s, 3H), 0.90-0.83 (m, 15H), 0.75-0.73 (m, 6H).

( 2 ) 将化合物 S17 (97 mg, 0.156 mmol) 溶于甲醇 (20 mL)和少量乙酸乙酯中， 换 氮气后， 迅速加入 10%的 Pd(OH) ₂ /C, 再换氮气后换氢气， 室温下搅拌。 1小时后 TLC 检测反应完全。 换氮气后滤去 Pd(OH) ₂ /C， 反应液旋干后用石油醚 /乙酸乙酯为 8: 1的 洗脱剂体系进行柱层析分离， 得到化合物 S18 48 mg (0.091 mmol), 为白色固体， 摩尔 收率： 58%。 ¾ NMR (300 MHz, CDCh) δ 4.47 (t, 1H, J = 2.7 Hz), 4.20 (q, 2H, J = 7.2 Hz): 2.28-2.14 (m, 4H), 1.91-1.14 (m, 其它脂肪环质子)， 0.98 (s, 3H), 0.93 (s, 3H), 0.90 (s, 3H), 0.88-0.84 (m, 9H), 0.75 (d, 3H, J = 6.9 Hz).

( 3 ) 将上步产物 S18 (48 mg, 0.091 mmol) 和催化量 DMF (1 μί, 0.01 mmol)溶于 2 mL干燥的二氯甲垸中， 0°C下加入草酰氯 (76 μί, 0.91 mmol), 10分钟后回至室温搅拌 3 小时。 直接旋出二氯甲垸并用油泵抽干后， 用于下一步反应。 将甘氨酸叔苄酯盐酸盐 (37 mg, 0.18 mmol), 催化量的 DMAP (2.4 mg, 0.02 mmol)溶于 1 mL二氯甲焼中， 0°C 下滴加三乙胺 (64 μί, 0.46 mmol),然后滴加现制酰氯的二氯甲垸溶液 1 mL， 10分钟后 回至室温， 室温反应 12小时， TLC显示反应完成。浓缩除去溶剂后，加乙酸乙 酯稀释， 分别用水和饱和氯化钠水溶液洗涤有机相， 无水硫酸钠干燥浓缩， 用石油醚 /乙酸乙酯 为 8: 1的洗脱剂体系进行柱层析分离， 得产物 S19 49 mg (0.072 mmol ) ， 摩尔收率： 79%. ¾ NMR (300 MHz, CDCh) δ 7.37-7.35 (m, 5H), 6.04 (t, 1H, J = 5.4 Hz), 5.22-5.14 (m, 2H), 4.47 (t, 1H, J = 2.7 Hz), 4.19 (q, 2H, J = 7.2 Hz), 4.05 (d, 2H, J = 5.4 Hz), 2.46-2.37 (m, 1H), 2.31-2.23 (m, 1H), 2.02-1.10 (m, 其它脂肪环质子）， 0.97 (s, 3H), 0.90-0.83 (m, 15H), 0.74 (d, 3H, J = 6.9 Hz).

( 4) 将上步产物 S19 49 mg (0.072 mmol) 溶于甲醇（10 mL)和少量乙酸乙酯中， 换 氮气后， 迅速加入 10%的 Pd/C, 再换氮气后换氢气， 室温下搅拌。 1小时后 TLC检测 反应完全。 换氮气后滤去 Pd/C， 反应液旋干后用二氯甲垸 /甲醇为 20: 1 的洗脱剂体系 进行柱层析分离， 得到化合物 C23 (35 mg, 0.060 mmol), 摩尔收率： 83%. ¾ NMR (300 MHz, CDCh) δ 6.15 (t, 1H, J = 5.4 Hz), 4.46 (t, 1H, J = 2.7 Hz), 4.19 (q, 2H, J = 7.2 Hz), 4.05-4.03 (m, 2H), 2.42-2.32 (m, 1H), 2.29-2.21 (m, 1H), 2.02-1.12 (m, 其它脂肪环质子), 0.97 (s, 3H), 0.91-0.84 (m, 12H), 0.74 (d, 3H, J = 6.9 Hz). 实施例 9 FXR拮抗剂试验

1. 实验目的

用报告基因实验检测化合物对 FXR的拮抗活性。

2. 实验原理

FXR是一种由胆汁酸激活的核受体， 对体内糖代谢和脂代谢等有调控作用。 FXR 激活后， 可以启动一系列基因的表达， 对外界剌激产生应答。 Lucife se报告基因系统 是检测萤火虫荧光素酶 （Firefly Lucife se) 活性的一种报告体系。 荧光素酶可以催化 荧光底物 Luciferin氧化， 同时发出生物荧光，通过检测荧光强度推断荧 光素酶表达量。 本实验中， 待测化合物可能以 FXR为靶点， 而 GW4064则是已知的 FXR激动剂， 与 FXR配体结合域结合后启动一系列基因的表达。 因此，运用报告基因实验，在 HEK293 细胞中共转 LBD iFXR -pbind及 PGL4.31-Luc两种质粒， 使细胞表达 FXR配体结合 域。 分别给予两种待测化合物并设置空白对照组， 再加入激动剂， 若化合物对 FXR有 亲和力， 则会与激动剂竞争结合 FXR配体结合域， 影响 pGL4.31-Luc中荧光素酶的表 达。 利用 En _V isi _On 2101多功能微孔板酶标仪检测化学发光计� �值， 根据荧光强度判断 待测化合物对 FXR活性的影响。

3. 实验样品

试验前将化合物溶于 DMSO， 配制母液， 使用时用培养液稀释至所需浓度。

4. 实验方法

将 2 μg嵌合质粒 LBD(hFXR)-pbind与 2 Luciferase报告质粒共同转染 2χ 10 ⁶

ΗΕΚ293细胞， 种入白色不透明 96孔板中； 24 h后弃掉培养液， 加待测化合物 （用无 血清培液稀释， 含 1% DMSO ) 孵育 1 h， 然后加入 FXR激动剂 GW4064 ( 300 nM) IJ激 6 h， 最后加荧光素酶底物振荡裂解， 并且在 Envision 2104 多功能微孔板酉 检测发光数值。

5. 实验结果： （以 C 1等六个化合物为例， 但不局限于这些化合物）

表 1 化合物 FXR拮抗活性测试结果

注： IC ₅ Q为样品药物对 FXR拮抗活性的评价， 半数 50 %有效浓度。

6、 结果与讨论：

这些化合物在表达 FXR配体结合域的 HEK293细胞中能够与 FXR激动剂 GW4064 进行竞争， 并拮抗 GW4064对 FXR的激活作用， 其活性呈剂量依赖关系， IC ₅ Q值见表 1。 结果说明这些化合物是 FXR受体的拮抗剂。 实施例 10 TGR5激动试验实施例

1. 实验目的

利用瞬转 TGR5 的 HEK293 细胞用化合物进行剌激， 然后用均相时间分辨荧光 (Homogeneous Time-Resolved Fluorescence, HTRF)检测这些化合物是否可以激动 TGR5。

2. 实验原理

TGR5是胆汁酸膜受体， 也是 GPCR家族的一员， 对胆汁酸、 脂类及糖类的代谢具有 调控作用。 TGR5与 Gs蛋白偶联，活化后进一步激活腺苷酸环化酶� ��产生第二信使 cAMP。 HTRF是一种检测 cAMP含量的方法， 它结合了荧光共振 能量转移 （FRET fluorescence Resonance Energy Transfer) 和时间分辨荧光 （TRF, Time Resolved Fluorescence)两种技术。 含 Eu的穴状化合物作为荧光供体，其发射光谱与� ��光受体激发光谱有一定重叠，通过 FRET 诱导受体产生荧光， 而 Eu的荧光寿命长， 通过 TRF可以从荧光背景中区分受体发出的荧 光信号。 将荧光供体与 cAMP特异性抗体结合， 同时以荧光受体标记 cAMP, 二者通过抗 原抗体特异性识别反应相互靠近， 产生 FRET, 而细胞产生的 cAMP与标记的 cAMP竞争 抗体结合位点， 导致荧光强度降低。 本实验以 TGR5激动剂 INT777为阳性对照， 探究化 合物对 TGR5的作用。

3. 实验样品

试验前将化合物溶于 DMSO， 配制母液， 使用时用培养液稀释至所需浓度。

4. 实验方法

4.1、将待测化合物用 lxPBS配成终浓度的 2倍.其中终浓度为 100μΜ、10μΜ、1 μΜ、 100nM、 10nM、 lnM、 0.1nM、 DMSO (每个孔都含有 1%的 DMSO) 。

4.2、 细胞处理：

4.2.1、 用胰酶消化细胞， 然后用无血清培液悬浮。

4.2.2、 定细胞密度.并同时在无血清培液中加 IBMX (终浓度为 500μΜ) ， 细胞数 为 2000/5 μΐ/孔。

4.2.3、 加入 5 μΐ 待测化合物& 5μ1 含 ΙΒΜΧ的细胞悬液混合， 锡箔纸将 384孔板 封闭好， 室温避光反应不超过 30分钟。

4.3、 检测底物配置

4.3.1、 Ιμΐ cAMP-d2用 cAMP&cGMP conjugates&lysis buffer稀释到 20μ1

4.3.2、 Ι μΐ anti-cAMP-Cryptate 用 cAMP&cGMP conjugates&lysis buffer稀释至 20μ1

4.3.3、 30 分钟后， 加入 5μ1 ( 1.3.1 ) +5μ1 ( 1.3.2) ， 锡箔纸将 384孔板封闭好， 室温避光反应分钟。

4.4、 60 分钟后， Envision2101多功能微孔板酶标仪 （PerkinElmer) 读数。

5. 实验结果

(以 C1等六个化合物为例， 但不局限于这些化合物）

表 2 化合物 TGR5激动活性测试结果

注： IC ₅ Q为样品药物对 FXR拮抗活性的评价， 半数 50 %有效浓度。 NR表示在 100 μΜ的浓度下没有活性。

6、 结果与讨论：

这些化合物在表达 TGR5的 ΗΕΚ293细胞中不能够提高细胞内的 cAMP累积， 见 表 2， 说明化合物对 FXR的拮抗作用具有选择性。 实施例 11 CCK-8试验实施例

1. 实验目的

用 CCK-8实验评判化合物的细胞毒性。

2. 实验原理

CCK-8是一种氧化还原反应的指示剂，在电子载� �� 1-Methoxy PMS存在的条件下， 利用活细胞中的脱氢酶催化四唑盐 WST-8生成甲臜染料，而且甲臜染料的生成量与� ��