발명의명칭 : 11114/7발현조절인자를포함하는암예방또는 치료용약학적조성물

기술분야

[1] 본발명은 TUT4/7발현조절인자를포함하는암예방또는치료 용약학적

조성물에관한것으로,더욱상세하게는 TUT4/7발현을조절하는핵산서열을 포함하는암예방또는치료용약학적조성물에관 한것이다.

[2] 본발명은대한민국보건복지부의지원하에서과 제번호 1기 1079098에의해 이루어진것으로서,상기과제의연구관리전문� �관은기초과학연구원, 연구사업명은 "기초과학연구원연구운영비지원”,연구과제� ��은” RNA에의한 세포운명조절연구”,주관기관은기초과학연� �원,연구기간은 2018.01.01. ~ 2018.12.31.이다.

[3] 본특허출원은 2019년 2월 26일에대한민국특허청에제출된대한민국

특허출원제 10-2019-0022551호에대하여우선권을주장하며,상� �특허출원의 개시사항은본명세서에참조로서삽입된다.

배경기술

[4] 마이크로 RNA(micro RNA; miRNA)의생성과정은드로셔 (Drosha)와

다이서 (Dicer)에의한절단과정을통해이중나선 RNA를만들고,이를구성하는 두개의가닥 (5p와 3p)중에한가닥을선택하는과정을수반한다.두� �닥은 엄연히다른서열을가지고있어서로다른유전자 들의발현을조절할수있기 때문에어떤가닥이선택되는지를결정하는가닥 선택 (strand selection)과정은 생물학적으로중요하다.

[5] 한편,세포유형에따라서주로선택되는 miRNA가닥이바뀔수있는데,이를 대안적가닥 (alternative processing)선택 (또는 "암스위칭 (arm switching)”)이라 부른다.대안적가닥선택은조직분화와암발달� �영향을미칠수있다.하지만, 이러한대안적가닥선택이어떻게조절을받는지 등그의분자메커니즘및 생리적중요성은애매하게남아있다.

발명의상세한설명

기술적과제

[6] 본발명자들은 TUT4및 TUT7(TUT4/7)에의한유리딘화현상이 pre-mir-324의 다이서절단위치를조절함으로써기능이서로다 른 3가지마이크로 RNA(5p및 두 3p이형체 )를생성함을확인하고, TUT4/7의기능을억제시켜세포분열을 막고암발달을저해시킬수있으며, miR-324-5p의양을늘리고 miR-324-3p.l의 기능을억제시켜동일한효과를나타낼수있음을 규명하고,본발명을

완성하였다.

[刀 따라서,본발명의목적은서열번호 1및 2의염기서열을포함하는마이크로 2020/175898 1»（：1^1{2020/002709

RNA(micro RNA; miRNA);서열번호 4의염기서열로이루어진핵산;및서열번호 5내지 20으로이루어진군으로부터선택된 1개이상의염기서열을포함하는 짧은간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA);를포함하는암예방또는치료용 약학적조성물을제공하는것이다.

[8] 본발명의다른목적은서열번호 1및 2의염기서열을포함하는마이크로

RNA(micro RNA; miRNA);서열번호 4의염기서열로이루어진핵산;및서열번호 5내지 20으로이루어진군으로부터선택된 1개이상의염기서열을포함하는 짧은간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA);를이용한암치료방법을 제공하는것이다.

[9] 본발명의또다른목적은서열번호 1및 2의염기서열을포함하는마이크로 RNA(micro RNA; miRNA);서열번호 4의염기서열로이루어진핵산;및서열번호 5내지 20으로이루어진군으로부터선택된 1개이상의염기서열을포함하는 짧은간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA);의암치료용도를제공하는 것이다.

[1이 본발명의또다른목적은 miR-324-5p또는 miR-324-3p.l의 miRNA의발현

수준을측정하는제제를포함하는암진단용조성 물을제공하는것이다.

[11] 본발명의또다른목적은 miR-324-5p또는 miR-324-3p.l의 miRNA의발현

수준을측정하는제제를포함하는암진단용키트 를제공하는것이다.

[12] 본발명의또다른목적은 TUT4(Terminal uridylyl transferases 4)또는

TUT7 (Terminal uridylyl transferases 7)의유전자 mRNA또는이의단백질의 수준을측정하는제제를포함하는암진단용조성 물을제공하는것이다.

[13] 본발명의또다른목적은 TUT4또는 TUT7의유전자 mRNA또는이의

단백질의수준을측정하는제제를포함하는암진 단용키트를제공하는것이다. 과제해결수단

[14] 본발명자들은 TUT4및 TUT7(TUT4/7)에의한유리딘화현상이 pre-mir-324의 다이서절단위치를조절함으로써기능이서로다 른 3가지마이크로 RNA(5p및 두 3p이형체 )를생성함을확인하고, TUT4/7의기능을억제시켜세포분열을 막고암발달을저해시킬수있으며, miR-324-5p의양을늘리고 miR-324-3p.l의 기능을억제시켜동일한효과를나타낼수있음을 규명하였다.

[15] 이하,본발명을더욱자세히설명하고자한다.

[16]

[17] 본발명의일양태는서열번호 1및 2의염기서열을포함하는마이크로

RNA(micro RNA; miRNA);

[18] 서열번호 4의염기서열로이루어진핵산;및

[19] 서열번호 5내지 20으로이루어진군으로부터선택된 1개이상의염기서열을 포함하는짧은간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA);로이루어진군으로부터 선택된 1종이상을포함하는암예방또는치료용약학적� �성물에관한것이다. 2020/175898 1»（：1^1{2020/002709

[2이 상기암은뇌종양,결장암,대장암,폐암,간암,위� ��,식도암,췌장암,담낭암, 신장암,방광암,전립선암,고환암,자궁경부암,� ��궁내막암,융모암,난소암, 유방암,갑상선암,뇌암,두경부암및/또는악성� �색종일수있으나,이에

부위와의염기결합을통해전사후억제자역할을 하는대략 22 의비번역 RNA로유전자발현을조절하는역할을한다.

[22] 본발명의상기마이크로 RNA는서열번호 1및 2의염기서열을포함하는것일 수있다.

[23] 구체적으로,상기마이크로 열번호 1의

염기서열을포함하는마이크로 1 （111溫-324-51））및상기서열번호 2의 염기서열을포함하는마이크로 1^ 111溫-324-31）.2）가서로결합을이루고있는 하나의복합체（ 11¾^幻일수있다.

[24] 상기서열번호 1및 2의염기서열의 5’말단에는인산염（如08如 _£ ）（5如08）이 위치할수있다.

[25] 본발명에서,”핵산”은임의의 샘플에

존재하는염색체,미토콘드리아,바이러스및/또 는세균핵산을포함하는 의미이다.이중가닥핵산분자의하나또는두개� �두의가닥을포함하고, 무손상핵산분자의임의의단편또는일부를포함 한다.

[26] 본발명의핵산은화학적으로변형된 DNA또는 RNA를포함하는것으로

해석된다.당업자는당해기술분야에공지된방� �을이용하여원하는방식대로 상기핵산을합성하고변형시킬수있다.

의해절단되어생성되는 18~23뉴클레오티드크기의작은 RNA조각으로 상보적인서열을갖는 mRNA에특이적으로결합하여당해단백질의발현� � 억제하는역할을한다.

[29] 본발명의 siRNA는생체내핵산분해효소에의한빠른분해를� ��기위해

화학적으로변형된 _S iRNA를포함하는것으로해석된다.당업자는� ��해기술 분야에공지된방법을이용하여원하는방식대로 상기 1 ^4를합성하고 변형시킬수있다.

[3이 본발명의조성물은세포내로의도입효율을증강 시키기위해공지의핵산 전달체와함께세포내로도입될수있다.

[31] 본발명의상기짧은간섭 RNA는서열번호 5내지 20의염기서열을포함하는 것일수있다.

[32] 구체적으로,상기짧은간섭 1^사 11714）는상기서열번호 5내지 8중어느 하나의염기서열을포함하는짧은간섭 RNA및상기서열번호 9내지 12중어느 2020/175898 1»（：1^1{2020/002709 하나의 염기서열을포함하는짧은간섭 RNA가서로결합을이루고있는하나의 복합체일수있다.

[33] 또한,구체적으로,상기짧은간섭 RNA(siTUT7)는상기서열번호 13내지 16중 어느하나의 염기서열을포함하는짧은간섭 RNA및상기서열번호 17내지

20중어느하나의 염기서열을포함하는짧은간섭 RNA가서로결합을이루고 있는하나의복합체일수있다.

[34] 본발명에 있어서 ,상기 miRNA,핵산및/또는 siRNA의치료상유효량은암 치료효과를기대하기 위하여투여에요구되는양을의미한다.따라서 ,질환의 종류,질환의중증도,투여되는핵산의종류,제형 ,환자의 연령,체중,일반건강 상태，성별,식이 ,투여시간,투여경로및치료기간,동시에사용되 는화학항암제 등의 약물을포함하는다양한인자에 따라조절될수있다.

[35] 본발명의조성물은경구,경피 ,피하,정맥또는근육을포함한여러 경로를 통해투여될수있으며，이를위하여본발명에 의한 miRNA,핵산및/또는 siRNA에추가적으로다른첨가제를추가로포함할� ��있다.

[36] 본발명에 의한조성물의 제형은정제 ,환제 ,산제 ,새세이 ,엘릭서제 ,현탁제 , 유제，액제,시럽제 ,에어로졸,캅셀제 ,멸균주사제 ,멸균산제등의 형태일수 있으며 ,바람직하게는정맥주사,피하주사,내피주사,� �육주사등의주사제로 제제화된다.

[37] 본발명의 약학적조성물은당해발명이속하는기술분야에 서통상의지식을 가진자가용이하게실시할수있는방법에 따라,약제학적으로허용되는담체 및/또는부형제를이용하여 제제화함으로써 단위용량형태로제조되거나또는 다용량용기내에 내입시켜제조될수있다.이때제형은오일또는� �성 매질중의용액,현탁액또는유화액형태이거나� �스제,산제,좌제,분말제, 과립제,정제또는캅셀제 형태일수도있으며,분산제또는안정화제를 추가적으로포함할수있다.

[38] 본발명의 약학적조성물에포함될수있는약제학적으로허 용되는담체는 제제시에통상적으로이용되는것으로서,락토� �,덱스트로스,수크로스, 솔비톨,만니톨,전분,아카시아고무,인산칼슘,� ��기네이트,젤라틴,규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스,폴리비닐피롤리돈,셀룰로스,물,시� �,메틸셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트,프로필히드록시벤� �에이트,활석,스테아르산 마그네슘및미네랄오일등을포함하나,이에 한정되는것은아니다.본발명의 약제학적조성물은상기성분들이외에윤활제 ,습윤제 ,감미제 ,향미제 ,유화제 , 현탁제,보존제등을추가로포함할수있다.적합� ��약제학적으로허용되는 담체 및제제는 Remington’s Pharmaceutical Sciences( 19th ed., 1995)에상세히 기재되어 있다

[39] 본발명의 약학적조성물은경구및비경구로투여할수있고 ,예컨대정맥내 주입,피하주입,근육주입,복강주입,국소투여,� ��강내투여,폐내투여, 직장내투여,경막내투여,안구투여,피부투여 및경피투여등으로투여할수 2020/175898 1»（：1^1{2020/002709 있다.

[4이 본발명의 약학적조성물의 적합한투여량은제제화방법 ,투여 방식 ,환자의 연령,체중,성,병적상태,음식,투여시간,투여 경로,배설속도및반응 감응성과같은요인들에 의해다양하며,보통으로숙련된의사는소망하� �치료 또는예방에효과적인투여량을용이하게결정 및처방할수있다.

[41]

[42] 본발명의다른일양태는 miR-324-5p및 miR-324-3p.l로이루어진군으로부터 선택된 1종이상의 miRNA의 발현수준을측정하는제제를포함하는암진단용 조성물에 관한것이다.

[43] 상기마이크로 RNA(miR-324-5p)는서열번호 1의 염기서열을포함하는것일수 있고,상기마이크로 RNA(miR-324-3p.l)는서열번호

3(ACUGCCCCAGGUGCUGCUGG)의 염기서열을포함하는것일수있다.

[44] 구체적으로,상기마이크로 RNA(miR-324-3p. l)는상기서열번호 3의

염기서열을포함하되 3’말단에 1개또는그이상의우라실 (U)이추가로

포함되는것일수있다.

[45] 또한,상기마이크로 RNA는 MIR324유전자 (GenBank Number: 442898)에서

만들어진하나의 전사체 (transcript)로부터드로셔 및다이서에의해절단되어 만들어진것일수있다.

[46] 본명세서에서 "진단”은특정 질병또는질환에 대한한개체의

감수성 (susceptibility；^판정하는것,한개체가특정질병� ��는질환을현재 가지고있는지 여부를판정하는것,특정 질병또는질환에걸린한개체의 예후 (prognosis)를판정하는것,또는테라메트릭스 (therametrics) (예컨대,치료 효능에 대한정보를제공하기위하여 개체의상태를모니터링하는것)를 포함한다.

[47] 본명세서에서 ’’개체 ",’’대상”또는’’환자’’는인간,소,개 ,기니아피그,토끼 ,닭, 곤충등을포함하여치료가요구되는임의의단일 개체를의미한다.또한, 임의의 질병 임상소견을보이지 않는임상연구시험에 참여한임의의 대상 또는역학연구에 참여한대상또는대조군으로사용된대상이 대상에포함된다.

[48] 본명세서에서특별한언급이 없는한,본명세서에서사용되는표현

” miRNA의발현수준측정”은해당시료내에서 검출하고자하는대상을 검출하는것을의미한다.

[49] 본발명에서 검출하고자하는대상은시료내해당 miRNA이다.즉, miRNA를 검출함으로써상기 암의 발병 여부를확인할수있다.

[5이 예를들어 ,상기 miRNA의발현수준은암이 의심되는환자의 생물학적

시료로부터측정할수있다.

[51] 본발명은암인경우가그렇지 않은경우에비해 생체내 miR-324-5p의 발현 수준이유의적으로감소하고, miR-324-3p.l의 발현수준이유의적으로

증가한다는점을확인한것에기초하여, miR-324-5p및 miR-324-3p.l는암의 2020/175898 1»（：1^1{2020/002709 발병여부에대한진단마커로사용된다.

[52] 본발명의 miRNA의발현수준을측정하는제제는암이발병한� ��우대상의 생물학적시료의검체에서발현수준이감소되는 마커인 miRNA및추가적으로 발현수준이증가되는마커인 miRNA의발현수준을확인함으로써마커의 검출에사용될수있는분자를의미한다.

[53] 구체적으로,상기 miRNA의발현수준을측정하는제제는상기 miRNA에 특이적으로결합하는프라이머또는프로브일수 있다.

[54] 즉,핵산의검출은유전자를암호화하는핵산분� �또는상기핵산분자의 상보물에하이브리드화되는하나이상의올리고 뉴클레오타이드프라이머를 사용하는증폭반응에의해수행될수있다.

[55] 예컨대,프라이머를이용한 miRNA의검출은 PCR과같은증폭방법을

사용하여유전자서열을증폭한다음당분야에공 지된방법으로유전자의증폭 여부를확인함으로써수행될수있다.

[56] 프라이머는짧은자유 3말단수산화기 (free 3' hydroxyl group)를갖는핵산 서열로상보적인템늘레이트 (template)와염기쌍 (base pair)을형성할수있고 템플레이트가닥복사를위한시작지점으로기능 을하는짧은핵산서열을 의미한다.프라이머는적절한완충용액및온도� �서중합반응 (즉, DNA 폴리머레이즈또는역전사효소)을위한시약및� �이한 4가지뉴클레오사이드 트리포스페이트의존재하에서 DNA합성이개시될수있다.본발명에서는위 하나이상의 miRNA에특이적으로결합하는센스및안티센스프� ��이머를 이용하여 PCR증폭을실시하여발현수준을확인함으로써암 발병여부를 진단할수있다.모이조건,센스및안티센스프라� ��머의길이는당업계에 공지된것을기초로변형할수있다.

[57] 프로브는짧게는수염기내지길게는수십염기에 해당하는 RNA또는 DNA 등의핵산단편을의미하며라벨링되어 있다.프로브는

올리고뉴클로타이드 (oligonucleotide)프로브,단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브,이중쇄 DNA(double stranded DNA)프로브, RNA프로브등의형태로 제작될수있다.본발명에서는위하나이상의 miRNA와상보적인프로브를 이용하여혼성화를실시하여발현수준을확인함 으로써암발병여부를진단할 수있다.적당한프로브의선택및혼성화조건은� �업계에공지된것을기초로 변형할수있다.

[58] 이러한프라이머또는프로브는공지된서열을바 탕으로당업자가적절히 디자인할수있다.

[59] 예컨대,프라이머또는프로브는포스포르아미� �이트고체지지체방법,또는 기타널리공지된방법을사용하여화학적으로합 성할수있다.이러한핵산 서열은또한당해분야에공지된많은수단을이용 하여변형시킬수있다. 이러한변형의비-제한적인예로는메틸화,”캡� ��”,천연뉴클레오타이드하나 이상의동족체로의치환,및뉴클레오타이드간� �변형,예를들면,하전되지 2020/175898 1»（：1/10公020/002709 않은연결체 (예:메틸포스포네이트,포스포트리에스테르,� �스포로아미데이트, 카바메이트등)또는하전된연결체 (예:포스포로티오에이트,

포스포로디티오에이트등)로의 변형이 있다.

miRNA의발현수준은바이오키트분야에서통상사� ��되는방법에따라 측정될수있는데,예컨대 역전사효소중합효소반응 (RT-PCR),경쟁적

역전사효소중합효소반응 (Competitive RT-PCR),실시간역전사효소

중합효소반응 (Real-time RT-PCR), RNase보호분석법 (RPA; RNase protection assay),노던블롯팅 (Northern blotting)또는유전자칩등이포함되며 이들로 제한되는것은아니다.

[6

본발명의또다른일양태는상기 암진단용조성물을포함하는암진단용 키트에 관한것이다.

상기키트에는상기 miRNA의 발현수준을측정하는제제뿐만아니라,암의 진단키트로사용되기에 적합하도록사용되는당분야에서 일반적으로 사용되는도구,시약등이포함될수있다.

64] 상기도구또는시약의 일예로,적합한담체,검출가능한신호를생성할� �� 있는표지물질,발색단 (chromophores),용해제,세정제,완중제,안정화제등 이 포함되나이에제한되지 않는다.표지물질이효소인경우에는효소활성� � 측정할수있는기질및반응정지제를포함할수있 다.담체는가용성 담체, 불용성 담체가있고,가용성 담체의 일 예로당분야에서공지된생리학적으로 허용되는완충액,예를들어 PBS가있고,불용성 담체의 일 예로폴리스틸렌, 폴리에틸렌,폴리프로필렌,폴리에스테르,폴리 아크릴로니트릴,불소수지 ,가교 덱스트란,폴리사카라이드,라텍스에금속을도� ��한자성미립자와같은고분자,

] ] 기타종이,유리,금속,아가로오스및 이들의조합일수있다.

23

666 6051 예컨대본발명의진단키트는 RT-PCR을수행하기위해필요한필수요소를 포함하는키트일수있다. RT-PCR키트는마커 miRNA에 대한특이적인각각의 프라이머쌍외에도테스트튜브또는다른적절한 컨테이너 ,반응완충액 (pH및 마그네슘농도는다양),데옥시뉴클레오타이드 (dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와같은효소, DNase, RNAse억제제， DEPC-수 (DEPC-water),멸균수 등을포함할수있다.

[66] 본발명의 키트는상술한조성물을구성으로포함하므로,� �복된내용은본 명세서의과도한복잡성을피하기위하여그기재 를생략한다.

[67]

[68] 본발명의또다른일양태는 TUT4(Terminal uridylyl transferases 4) (GenBank Number: 23318)및 TUT7 (Terminal uridylyl transferases 7)(GenBank Number:

79670)로이루어진군으로부터선택된 1종이상의유전자 mRNA또는이의 단백질의수준을측정하는제제를포함하는암진 단용조성물에관한것이다.

[69] 상기 TUT4유전자의 염기서열은서열번호 21에 나타내었으며,상기 TUT7 2020/175898 1»（：1^1{2020/002709 유전자의 염기서열은서열번호 22에나타내었다.

이 본명세서에서 "진단”은특정 질병또는질환에 대한한개체의감수성을

판정하는것,한개체가특정질병또는질환을현� �가지고있는지 여부를 판정하는것,특정질병또는질환에 걸린한개체의 예후를판정하는것,또는 테라메트릭스（예컨대,치료효능에 대한정보를제공하기 위하여 개체의상태를 모니터링하는것）를포함한다.

[71] 본명세서에서 "개체’’, "대상’’또는 "환자’’는인간,소,개,기니아피그,토끼,닭, 곤충등을포함하여치료가요구되는임의의단일 개체를의미한다.또한, 임의의 질병 임상소견을보이지 않는임상연구시험에 참여한임의의 대상 또는역학연구에 참여한대상또는대조군으로사용된대상이 대상에포함된다.

[72] 본명세서에서특별한언급이 없는한,본명세서에서사용되는표현 "유전자 mRNA또는이의단백질의수준측정 "은해당시료내에서 검출하고자하는 대상을검출하는것을의미한다.

3] 본발명에서 검출하고자하는대상은시료내해당유전자 mRNA또는이의 단백질이다.즉, mRNA또는이의단백질을검출함으로써상기 암의발병 여부를 확인할수있다.

4] 예를들어,상기 mRNA또는이의 단백질의수준은암이의심되는환자의

생물학적시료로부터측정할수있다.

[75] 본발명은암인경우가그렇지 않은경우에비해 생체내 1X114및 1X117의발현 수준이유의적으로증가한다는점을확인한것에 기초하여, 1X114및 1X117은 암의 발병 여부에 대한진단마커로사용된다.

[76] 본명세서에서 "유전자”는단백질코딩또는전사시에또는다� �유전자

발현의조절시에기능적 역할을갖는임의의 핵산서열또는그의 일부를 의미한다.유전자는기능적단백질을코딩하는� �든핵산또는단백질을코딩 또는발현하는핵산의 일부만으로이루어질수있다.핵산서열은엑손,� ��트론, 개시또는종료영역,프로모터서열,다른조절서� ��또는유전자에 인접한 특유한서열내에유전자이상을포함할수있다.

7] 본발명의유전자 mRNA의발현수준을측정하는제제는암이 발병한경우

대상의 생물학적시료의 검체에서발현수준이증가되는마커인 mRNA의발현 수준을확인함으로써마커의 검출에사용될수있는분자를의미한다.

8] 구체적으로,상기 1111여쇼의발현수준을

특이적으로결합하는프라이머또는프로브일수 있다.

[79] 상술한 수준을측정하는제제를 포함하는암진단용조성물’’과중복된내용은 본명세서의과도한복잡성을 피하기 위하여그기재를생략한다.

[8이 본명세서에서 "단백질”은또한기준단백질과본질적으로동� �한생물활성 또는기능을보유하는,단백질의 단편,유사체및유도체를포함하는것이다.

[81] 본발명의 단백질수준을측정하는제제는암이발병한경우 대상의 생물학적 2020/175898 1»（：1^1{2020/002709 시료의검체에서수준이증가되는마커인단백질 의발현수준을확인함으로써 마커의검출에사용될수있는분자를의미한다.

[82] 구체적으로,상기단백질의수준을측정하는제� �는상기단백질에특이적으로 결합하는항체일수있다.

[83] 본발명에서 "항체 "는가장넓은의미로사용되고,구체적으로무손� ��

모노클로날 (단일클론)항체,폴리클로날항체,적어도 2개의무손상항체로부터 형성된다중특이적항체 (예를들어이중특이적항체)및목적하는생물학� �� 활성을보이는항체단편을포함한다.

[84]

[85] 본발명의또다른일양태는상기암진단용조성물 을포함하는암진단용 키트에관한것이다.

[86] 상기키트에는상기유전자 mRNA또는이의단백질의수준을측정하는

제제뿐만아니라,암의진단키트로사용되기에� �합하도록사용되는당 분야에서일반적으로사용되는도구,시약등이� �함될수있다.

[87] 상술한 "miR-324-5p및 miR-324-3p.l의 miRNA의발현수준을측정하는제제를 포함하는암진단용조성물;을포함하는암진단� �키트’’와중복된내용은본 명세서의과도한복잡성을피하기위하여그기재 를생략한다.

발명의효과

[88] 본발명은 TUT4/7발현조절인자를포함하는암예방또는치료 용약학적

조성물에관한것으로서，본발명의약학조성물 은 TUT4/7의기능을

억제시킴으로써세포분열을막고암발달을저해 시킬수있으며, miR-324-5p의 양을늘리고 miR-324-3p.l의기능을억제시킬수있으므로,이를� �과적으로암 예방,치료또는진단에이용할수있다.

도면의간단한설명

[89] 도 1은 mir-324암스위칭 (Arm switching)결과로,도 la는 miRNA에대한 5p 비율의중간절대편차의산점도 (풍부하고어디에나있는 miRNA (양

데이터세트에서 >100 median RPM,모든샘플에서 >0 RPM)가분석에포함),도 lb는 AQ-seq에의해측정된 HEK293T에서의 miR-324의 IsomiR프로파일 (RPM 정규화읽기횟수는왼쪽, 5p및 3p의참조시퀀스는회색음영으로표시),도 lc는 AQ-seq에의해측정된마우스조직의지시된패널에 대한 mir-324의가닥 비 (5p/3p.l),및도 Id는포유동물에서 miR-324의 5’-isomiR의보존을나타낸다.

[9이 도 2는 TUT4/7에의해조절되는 mir-324암스위칭결과로,도 2a는 9개의인간 세포주및 15개의마우스조직에서 miR-324-3p의유리딘화프리퀀시와 mir-324의 5p/3p.l비 (ratio)사이의음성연관성 (선형회귀는점선으로표시 스피어만상관계수 (Spearman correlation coefficient)),도 2b는마우스조직의 지시된패널에서의상대 TUT4/7수준및 mir-324의 5p/3p.l비 (ratio)(TUT4/7 mRNA수준및 5p/3p.l비는각각 RT-qPCR및 AQ-seq에의해정량화. r _s : 2020/175898 1»（：1^1{2020/002709 스피어만상관계수),도 2c는 HEK293T에서 TUT4/7의녹다운후 AQ-seq 결과 (왼쪽및중간:유리딘화생성빈도및 miRNA의 5p비율산포도.

siNC-형질주입된샘플에서풍부한 miRNA(> 100 RPM)가분석에포함.오른쪽:

3개의 5’-isomiR의상대적풍부도및 mir-324의 log ₂ -변형된 5p/3p.l비),도 2d는 HEK293T에서 miR-324-5p및 miR-324-3p의노던블롯 (합성 mir-324이중 복합체 (duplex)를크기기준으로사용),및도 2e는마우스에서 Tut4/7의이중 녹아웃후 sRNA-seq결과 (왼쪽:골수에서 TUT4/7열화 (depetion)에의한

5’-isomiR의풍부도변화.대조군샘플에서 10초과의 RPM을갖는 5’-isomiR가 분석에포함. two-sided Student's t test에의한 P-값.오른쪽: mir-324의 log ₂ -변형된 5p/3p.1비.막대는평균 ±s.d..골수 n=2;배아섬유아세포 n=2;배아줄기세포 n=3;간에서의대조군및 Tut4/7 dKO각각 n=4및 3. two-sided Student's t test에 의한 *p<0.05, ***p<0.001 RPM. RPM: reads per million)를나타낸다.

[91] 도 3은유리딘화 (Uridylation)에의해유도된 pre-mir-324의대안적다이서절단 결과로,도 3a는면역정제된다이서에의한 pre-mir-324의변형되지않은,모노- 또는다이-유리딘화된형태의시험관내 (切 vzYro)절단 (processing) (청색으로 표시된합성 miR-324-5p(23nt)를크기기준으로사용.주요절단산� ��및해당 절단부위는화살촉으로표시 . * :방사성표지된 5’포스페이트),도 3b는

HEK293T에서 miR-324-3p의 5’-isomiR조성물,및도 3c는마우스에서

miR-324-3p의 5'-isomiR조성물 (막대는평균.골수 n=2;배아섬유아세포 n=2; 배아줄기세포 n=3;간에서의대조군및 Tut4/7 dKO각각 n=4및 3)을나타낸다.

[92] 도 4는이중가닥 RNA결합도메인 (double stranded RNA-binding domain;

dsRBD)에의해촉진된대안적다이서절단의결과로 ,도 4a는면역정제된 다이서에의한야생형또는벌지가없는 (no-bulge)돌연변이체 pre-mir-324의 변형되지않은,모노-또는다이-유리딘화된형태 의시험관내 (切 Wiro)절단,도 4b및 4c는면역정제된포켓다이서돌연변이체 (4b)또는 dsRBD-삭제

돌연변이체 (4c)에의한 pre-mir-324의변형되지않은,모노-또는

다이-유리딘화된형태의시험관내 (in wYro)절단 (주요절단산물및해당절단 부위는화살촉으로표시 . *:방사성표지된 5’포스페이트.쩔: 3p위치 nicked 산물),및도 4d는 pre-mir-324의유리딘화-매개대안적다이서절단을 위한 제안된모델을나타낸다.

[93] 도 5는대안적다이서절단에의해유도된암스위칭� �과로,도 5a는변형되지 않은및유리딘화된 pre-mir-324로부터제조된 mir-324이중복합체의가닥 선택의개략도 (점선사각형은각이중복합체의가닥선택을지� �하는끝을 나타냄)및,도 5b는 2개의 mir-324이중복합체를사용한루시퍼라제리포터 분석 (왼쪽: miR-324-5p또는 3p.l의 3개의 8mer표적부위가있는

파이어플라이 (firefly)리포터 mRNA의그림.오른쪽: HEK293T에서 2개의 mir-324이중복합체에대한파이어플라이루시퍼� �제의상대리포터활성. 레닐라 (renilla)루시퍼라제의리포터활성을대조군으로 사용.막대는 2020/175898 1»（：1^1{2020/002709 평균土 s.d..（n=2, biological replicates） two-sided Student's t test에의한 **p<0.01）을 나타낸다.

[94] 도 6은 mir-324암스위칭에의해조절되는세포주기진행� �과로,도 6a는

교모세포종（glioblastoma）및정상뇌조직에서 miR-324-3p의 5'-isomiR조성물의 비율（정상뇌 n=3;교모세포종 n=6）,도 6b는 Oncopression데이터베이스의정상, 저등급교종（glioma）및교모세포종조직에서 TUT4/7의발현수준（정상 n=723; 1 등급 n=74; 2등급 n=133; 3등급 n=132;교모세포종 n=865.다중비교를위한 one-way ANOVA with Tukey's post hoc test에의한 ***p<0.001）,도 6c는

교모세포종（검은색）과일치하는정상뇌조직 （흰색）에서 TUT4/7발현수준과 miR-324-5p/3p비간의음의상관관계（선형회귀는� �선으로표시. r _s: 스피어만 상관계수）,도 6d는 A172세포에서 mir-324의합성 5p이중복합체（긴듀플렉스） 또는 3p.l이중복합체（짧은듀플렉스）를과발현한� �표시된사이클린단백질의 웨스턴블롯및세포주기프로파일,도 6e는 A172세포에서 locked핵산 안티센스올리고뉴클레오타이드에의해 miR-324를억제한후지시된사이클린 단백질의웨스턴블롯및세포주기프로파일,및� � 6f는 A172세포에서

TUT4/7을녹다운한후지시된단백질의웨스턴블롯 및세포주기프로파일（ 교차반응밴드. PI:요오드화프로피디움. BrdU:브로모데옥시유리딘）을 나타낸다.

[95] 도 7은 mir-324암스위칭메커니즘모델을모식화한도이� �.

발명의실시를위한형태

[96] 이하,본발명을하기의실시예에의하여더욱상� �히설명한다.그러나이들 실시예는본발명을예시하기위한것일뿐이며,� �발명의범위가이들 실시예에의하여한정되는것은아니다.

[97] 본명세서전체에걸쳐,특정물질의농도를나타� �기위하여사용되는

별도의언급이없는경우,고체/고체는（중량/중 량）%,고체/액체는（중량/부피）%, 그리고액체/액체는（부피/부피）%이다.

[98]

[99] [준비예]

[100] l. AQ-seq라이브러리

[101] AQ-seq（바이어스가최소화된 sRNA-seq）라이브러리는이전연구（Kim et al., 2019）에설명된대로 15개의마우스조직의전체 RNA를사용하여구성되었다.

[102] 구체적으로,총 RNA ^ig를 30개의등몰스파이크-인 RNA 10 fmole（바이어스 평가에사용되는 miRNA-유사비-인간/마우스/개구리/피쉬 RNA）과혼합하였다. Small RNA는 15%우레아-폴리아크릴아마이드겔전기영동을� �용한크기 분별에의해농축되었고 , 3’및 5’말단에서무작위화된어맵터에순차적으로 연결되었다.결찰된 RNA는 Superscript III역전사효소（Invitrogen）를사용하여 역전사되고, Phusion High-Fidelity DNA쓸리머라제（Thermo Scientific）를 2020/175898 1»（：1^1{2020/002709 사용하여증폭되었으며, MiSeq플랫폼 (Illumina)에서대용량

시퀀싱 (high-throughput sequencing; HTS)되었다.

[103]

[104] 2. miRNA의대용량시퀀싱 (high-throughput sequencing)분석

[105] 마우스에서의 sRNA-seq결과의판독값이마우스게놈 (mmlO)에매핑된것을 제외하고는,이전연구 (Kim et al., 2019)에설명된대로데이터를처리하였다.

[106] 구체적으로, cutadapt(Martin, 2011)를사용하여판독값 (reads)으로부터 3'

어맵터를클리핑하였다. AQ-seq데이터의경우 4-nt변성서열을 FNTX-Toolkit( http://hannonlab.cshl.edu/fastx toolkit/')#이용하여주가로제거하였다.

FASTX-Toolkit을사용하여짧고품질이낮은인공판� �값을필터링한후, AQ-seq데이터를먼저스파이크-인시퀀스에정렬� �고,정렬되지않은판독값을 다음게놈에맵핑하고,다른 sRNA-seq데이터는 BWA를사용하여게놈에 맵핑하였다 (Li and Durbin, 2010).그다음, 3’말단불일치만허용하는최상의 정렬점수를갖는정렬결과를선택하였다. miRNA annotation은

BEDTools(Cozomara and Griffiths-Jones, 2014; Quinlan and Hall, 2010)의교차 도구로 miRBase release 21을사용하여검색하였다.

[107] miRNA가닥비율 (strand ratio)의정량분석을위하여 ,먼저가장풍부하게

발현된세포주또는조직에서주어진성숙 miRNA에대해가장풍부한

5’-isomiR을확인하였다.그다음,모든세포주또� �조직에대해 5p및 3p로부터 top 5'-isomiR사이의비를계산하였다. miRBase release 21에서양쪽가닥이주석 처리된비 -반복 miRNA유전자가이분석에포함되었다.

[108]

[109] 3. Targetome분석

[110] 수정된버전의 AGO CLIP-seq(CLEAR-CLIP및 CLASH)의결과를분석하여 , miR-324표적 (target)을식별하였다 (Helwak et al., 2013; Moore et al., 2015).

[111] 먼저 CLEAR-CLIP의분석을위하여 , cutadapt를사용하여 3’및 5’어맵터를

클리핑한후 miR-324서열을포함하는판독값을추출하였다.그� ��음,표적 RNA 서열을마우스게놈 (mmlO)에맵핑하였다. Annotation은 BEDTools의교차 도구로 GENCODE release M19를사용하여검색하였다.

[112] 다음으로 CLASH의분석을위하여 ,프로토콜 E4에의해생성된 CLASH

데이터의보충파일이사용되었다. miR-324-3p의표적유전자는 miR-324-3p 서열의 5’말단에따라세분되었다.

[113]

[114] 4.플라스미드구축

[115] 야생형 (wild type), 5’포켓다이서돌연변이체및 3’포켓다이서돌연변이체의 발현을위한플라스미드를구축하기위하여 ,인간다이서레퍼런스 (RefSeq NM_030621)의코딩서열을이전연구에서도입된돌� �변이의존재또는 부재하에증폭시켰다 (Park et al. 2011).증폭된 DNA를 In-Fusion HD Cloning 2020/175898 1»（：1^1{2020/002709

Kit(Clontech)를사용하여 BamHI및 Xhol부위에서 pCK-FLAG벡터 (CMV 프로모터-구동벡터)로서브클로닝하였다.

[116] 이중가닥 RNA결합도메인 (double stranded RNA-binding domain; dsRBD)-삭제 다이서의경우, V1849-S1922아미노산에상응하는서열을제외한코� ��영역을 증폭시키고,동일한방식을이용하여 pCK-FLAG벡터내로서브클로닝하였다.

[117] TRBP의경우,인간 TRBP레퍼런스 (RefSeq NM_134323)의코딩서열을

증폭시키고, BamHI및 Xhol부위에서 pcDNA3-cMyc벡터 (Invitrogen)로서브 클로닝하였다.

[118] 끝으로,루시퍼라제 (luciferase)분석을위한플라스미드를구축하기위 하여, miR-l-3p, miR-324-5p또는 miR-324-3p.l의 3개의 8mer표적부위를포함하는 합성 DNA올리고를증폭시키고, Xhol및 Xbal부위에서 pmirGLO(Promega)에 삽입하였다.합성 DNA올리고및 PCR프라이머의서열은하기표 1에 나타내었다.

[119] [표 1]

2020/175898 1»（：1^1{2020/002709

[12이

[121] 5.세포배양및형질주입 (transfection)

[122] A172및 U87MG는한국세포주은행에서입수하였다. HEK293T, A172및

U87MG를 10%소태아혈청 (WELGENE)이보충된 DMEM(WELGENE)에서 유지시켰다.교모세포종 (glioblastoma)환자 (TS13-64)로부터유래된 1차종양 세포는연세대학교의과대학 (4-2012-0212, 4-2014-0649)의기관검토위원회에 의해승인된바와같이,신선한교모세포종조직� �본으로부터확립되었다.

[123] 종양구 (tumorsphere)배양을위하여 , TS 13-64세포를 IX B-27(Thermo

Scientific), 20ng/mL의 bFGF(R&D Systems)및 20ng/mL의 EGF(Sigma- Aldrich) 7]- 보충된 DMEM(WELGENE)에서성장시켰다 (Sigma- Aldrich)(Kong et al„ 2013).

[124] TUT4/7을녹다운시키기위하여 ,리포펙타민 (Lipofectamine) 3000(Thermo Scientific)을사용하여 20내지 22nM siRNA로두번에걸쳐세포에

형질주입시키고,제 1형질주입 4일후에수확하였다.

[125] 다이서의과발현을위하여,리포펙타민 3000을사용하여 HEK293T세포에 pCK-FLAG-DICER를형질주입시키고,형질주입 2일후에수확하였다.

[126] 합성 miRNA또는억제제를전달하기위하여 ,리포펙타민 3000을사용하여 20 nM의합성 miRNA듀플렉스또는 80 nM의 LNA miRNA억제제를세포에 형질주입시키고,형질주입 2일후에수확하였다.

[127] 대조군 siRNA(AccuTarget음성대조군 siRNA), siRNA,대조군 miRNA및합성 mir-324이중체는파이프로부터입수하였다.대조� �� miRNA억제제 (miRCURY LNA miRNA억제제음성대조군 A)및 miR-324억제제 (hsa-miR-324-5p및 hsa-miR-324-3p miRCURY LNA miRNA억제제 )를 QIAGEN으로부터

수득하였다.합성 siRNA및 miRNA의서열은하기표 2에나타내었다.

2020/175898 1»(：1/10公020/002709

[128] [표 2]

2020/175898 1»(：1^1{2020/002709

[129]

[13이 6.노던블롯 (Northern blot)

[131] TRIzol(Invitrogen)을사용하여종 RNA를분리하고, mirVana miRNA Isolation Kit(Ambion)로 small RNA(<200nt)를농축하였다.그다음, RNA를 15% 우레아-폴리아크릴아마이드겔에서분석하였� �.합성 mir-324이중복합체및 Decade Markers System(Ambion)을크기마커로사용하였다. RNA를 Hybond-NX 막 (Amersham)으로옮기고,

1-에틸- 3-(3 -다이메틸아미노프로필)카보다이이미드로막� ��가교시켰다.

안티센스프로브 5’말단은 T4폴리뉴클레오타이드 (Takara)에의해 [-32P] ATP로 방사성표지되었고, Performa Spin컬럼 (Edge BioSystems)을사용하여

정제되었다.막을 PerfectHyb Plus하이브리드화버퍼에서변성된 UltraPure Salmon Sperm DNA용액 (Thermo Scientific)과함께배양하고,안티센스프로브와 하이브리드화한후, mild세척버퍼 (0.05% SDS및 2X SSC)로세척하고 stringent 세척버퍼 (0.1% SDS및 0.1X SSC)로세척하였다.방사능신호는 Typhoon FLA 7000(GE Healthcare)에의해감지되었으며 , Multi Gauge소프트웨어 (FujiFilm)를 사용하여분석되었다.

[132] miR-324-3p가먼저검출되었고,프로브를벗겨낸다� ��에 miR-324-5p가

검출되었다.블롯으로부터프로브를제거하기� �하여,막을미리끓인 0.5% SDMI 15분동안침지시켰다.합성 mir-324이중복합체 (AccuTarget)는

Bioneer로부터입수하였다.프로브의서열은하기� �� 3에나타내었다.

[133] [표 3]

[134] 2020/175898 1»(：1^1{2020/002709

[135] 7.정략적실시간 PCR (RT-qPCR)

[136] 마우스조직에서 mRNA수준을측정하기위하여 , RevertAid First Strand cDNA 합성키트 (Thermo Scientific)를사용하여 Mouse Total RNA Master Panel (Takara)의 RNA를역전사하고 Power SYBR Green PCR Master Mix(Thermo Scientific)로 StepOnePlus Real-Time PCR시스템 (Thermo Scientific)에서정량적 실시간 PCR을수행하였다.내부제어에는 GAPDH가사용되었으며 , qPCR 프라이머의서열은하기표 4에나타내었다.

[137] [표 4]

[138]

[139] miR-324-5p/3p가닥비를정량화하기위하여 ,총 RNA를 TRIzol을사용하여 분리하였다.그다음, TaqMan miRNA역전사키트 (Applied Biosystems)를 사용하여 cDNA를합성하고 TaqMan유전자발현분석키트 (Applied

Biosystems)로 StepOnePlus Real-Time PCR시스템에서정량적실시간 PCR을 수행하였다.내부제어에는 U6 snRNA가사용되었다.

[14이

[141] 8.시험관내 (切 vitro)다이서절단분석

[142] pre-mir-324및그변이체는 T4폴리뉴클레오타이드에의해 [-32P] ATP로

방사성표지되었고,제조사의지시에따라 Oligo Clean & Concentrator(Zymo Research)를사용하여정제되었다.

[143] FLAG-DICER의면역침전을위하여,다이서단백질을� ��발현하는 HEK293T 세포를용해버퍼 (500 mM NaCl, 20 mM Tris(pH 8.0), 1 mM EDTA, 1 % Triton X-100)로용해시키고 Bioruptor Standard(Diagenode)를사용하여

초음파처리하였다.원심분리후,상층액을 1(VL의 ANTI-FLAG M2 Affinity Gel(Sigma-Aldrich)과함께배양하였다.비즈 (beads)를용해버퍼로 2회,고염 2020/175898 1»(：1^1{2020/002709 버퍼 (800mM NaCl및 50mM트리스 (pH 8.0))로 4회 ,버퍼 D(200mM KC1, 20mM 트리스 (pH 8.0), 0.2mM EDTA)로 4회세척하였다.

[144] 면역정제된다이서는총부피 3(VL(2mM MgCl ₂ , ImM DTT, SUPERase In RNase Inhibitor(Thermo Scientific) 60unit, 5'-방사성표지된 pre-mir-324포함)에서시험관 내 (zVz vitro)반응을거쳤다. RNA를페놀주줄물또는 Oligo Clean &

Concentrator로정제하고 15%우레아-폴리-아크릴아마이드겔에서분석하� ��다. 합성 miR-324-5p및 Decade Markers System을크기마커로사용하였다.합성 pre-mir-324단편은 IDT로부터수득되었다.합성 miR-324-5p는 Bioneer로부터 입수하였다.합성 pre-mir-324단편및 miR-324-5p의서열은하기표 5에 나타내었다.

[145] [표 5]

[146]

[147] 9.듀얼루시퍼라제리포터분석

[148] miR-l-3p, miR-324-5p또는 miR-324-3p.l의 3개의 8mer표적부위를함유하는 pmirGLO를대조 miRNA또는 mir-324이중복합체와함께리포펙타민 3000을 사용하여 HEK293T세포에공동형질주입 (co-transfected)되었다.형질주입 2일 후세포를수확하고리포터분석을수행하였다.� �포터활성은제조사의 지시 (Promega)에따라 Spark microplate reader(TEC AN)에서 Dual-Lucif erase Reporter Assay System을사용하여즉정되었다. miR-l-3p가 HEK293T에서거의 발현되지않았음을감안할때 (AQ-seq에서 ~8 RPM), miR-l-3p의 3개의 8mer표적 부위를갖는 pmirGLO가플라스미드대조군으로사용되었다.추� ��표준화를 위해대조군 miRNA가사용되었다.

[149]

[15이 10.교모세포종 (glioblastoma)환자데이터의유전자발현분석

[151] Oncopression(http:/八) ncopression.com)에서마이크로어레이를사용하여 2020/175898 1»（：1^1{2020/002709 전처리된유전자발현데이터를검색하였다 (Lee and Choi, 2017). REMBRANDT 유전자발현데이터세트 (E-MTAB-3073)는 ArrayExpress(Madhavan et al.,

2009)로부터입수하였다.

[152] mRNA및 miRNA의동시프로파일링을분석하기위하여 (Gulluoglu et al., 2018), 가공전마이크로어레이데이터를요의 limma패키지를사용하여 RMA(robust multi-array average)으로정규화한다음,유전자발현분석에사 용하였다.

[153]

[154] 11.생존분석 (Survival analysis)

[155] TCGA교모세포종환자에대한 level 3 miRNA유전자정량화데이터및임상 데이터는각각 GDC legacy archive및 GDC데이터포털로부터획득하였다.

환자들은 miR-324-5p/3p비에따라계층화되었으며,상위및하� �� 40%가분석에 포함되었다.환자의생존은 Kaplan-Meier방법으로추정하고, R의생존패키지를 사용하여 two-sided log-rank test로테스트하였다.

[156]

[157] 12.웨스턴블롯 (Western blot)

[158] 세포를 PBS로세척하고,프로테아제억제제칵테일세트 III(Merck Millipore) 및포스파타아제억제제칵테일 II(AG Scientific)가보충된 RIPA버퍼 (Thermo Scientific)에용해시켰다. BCA단백질분석키트 (Pierce Biotechnology)로단백질 농도를측정하고,동일한양의단백질을 4-12%트리스-글라이신겔 (Thermo Scientific)에서분리하여 Immobilon-P PVDF막 (Merck Millipore)으로옮겼다. 막을 5%탈지유가포함된 PBS-T(PBS(Amresco) + 0.1%트윈 20(Anatrace))와함께 배양한후일차항체로처리하였다. PBS-T로 3회세척한후,막을 HRP-접합이차 항체와함께배양하였다.단백질밴드는 SuperSignal West Pico PLUS

Chemiluminescent Substrate(Thermo Scientific)에의해검줄되었고, ChemiDoc XRS+시스템 (Bio-Rad)에의해스캔되었다.

[159] TUT4(18980-1-AP, RRID:AB_10598327, 1:500)및 TUT7(25196-1-AP, 1:500)에 대한래빗다클론항체는 Proteintech에서입수하였다. Cyclin E(sc-247,

RRID:AB_627357, 1:1, 000)에대한마우스단일클론항체및 Cyclin A(sc-751, RRID:AB_631329, 1:1,000), Cyclin Bl(sc-752, RRID:AB_2072134, 1:1,000)및 Cyclin Dl(sc-753, RRID:AB_2070433, 1:1, 000)에대한토끼다클론항체는 Santa Cruz Biotechnology에서입수하였다. HSP90(4874, RRID:AB_2121214, 1:1, 000)에 대한토끼다클론항체는 Cell Signaling에서입수하였다.토끼 IgG(m_035-144, RRID:AB_2307391, 1:10,000)및마우스 IgG(l 15-035-146, RRID:AB_2307392,

1 : W,000)에대한 HRP-접합염소다클론항체는 Jackson ImmunoResearch에서 입수하였다.

[16이

[161] 13.유세포분석 (Flow cytometry)

[162] 세포를 3-8시간동안 IO^IM BrdU와함께배양한후, ice-cold 70%에탄올로 2020/175898 1»（：1^1{2020/002709 고정하였다.고정된세포를 FITC-접합항- BrdU항체 (11-50기-42,

RRID:AB_11042627, Invitrogen)와함께배양하고, 10 _[ xg/mL RNase A(Thermo Scientific)의존재하에 20 _[ xg/mL요오드화프로피디움 (Sigma-Aldrich)으로주가 염색하였다.그다음, BD Accuri C6 Plus유세포분석기를사용하여검출하였다. 세포주기는 BD Accuri C6시스템소프트웨어에의해분석되었다.

[163]

[164] [실시예]

[165] 1. mir-324의대안적가닥선택 (또는암스위칭 (Arm switching))

[166] 먼저,가닥비율 (strand ratio)에큰변화를나타내는 miRNA를검색하였다.가닥 비율의정확한정량을위하여, AQ-seq라이브러리프로토콜을사용하였다.가닥 선택 (strand selection)의변이 (variation)는 15개의상이한마우스조직/발달단계에 따라추정되었다 (도 la x축).또한,인간의가닥사용을비교하기위하여, 9개의 인간세포주에서얻은 sRNA-seq데이터세트를사용하였다.

[167] 도 la에서확인할수있듯이,인간및마우스데이터세 트모두대부분의

miRNA가가닥비율 (~79%, 3%미만의중간분산)이변하지는않았다.그러나, mir-324, mir-362, mir-193a및 mir-140과같이변화를명확하게보여주는몇가지 사례를확인하였다.

[168] 특히, mir-324의암스위칭이세포운명결정에실질적인� �향을미칠수있을 것으로보아, mir-324의가닥변화에집중하였다.

[169] 도 lb내지 Id에서확인할수있듯이,단일 MIR324유전자좌에서생성된

5'-isomiRs(5p, 3p.l및 3p.2)의 3가지그룹이검출되었다 (도 lb). 5p가닥은마우스 배아및신경조직에서우세한반면,주요 (major) 3p이형체인 3p.l은간및 위에서우세하게나타났다 (도 lc).또한, 5'-isomiR그룹은포유류에서

발견되었으며,이는대안적가닥선택메커니즘� �진화적으로보존된다는것을 암시한다 (도 Id).

[17이

[171] 2. mir-324암스위칭은 TUT4및 TUT7에의해조절된다.

[172] 3p의유리딘화빈도 (uridylation frequency)는 5p/3p.l비 (ratio)와음의상관

관계가있음을확인하였다 (도 2a).이에따라,유리딘화가암스위칭에관여할수 있다는가설을세웠다.

[173] 한편,터미널유리딜릴트랜스퍼라제 (Terminal uridylyl transferases) ¾

TUT4(ZCCHC11및 TENT3A로도알려져있음)및 TUT7(ZCCHC6및

TENT3B로도알려져있음)은 pre-miRNA의특정세트 (예를들어, let-7전구체)를 포함하는다양한 RNA종의유리딘화를촉매하는것으로알려져있다 . TUT4및 TUT7(TUT4/7)은대부분의기질에서중복적으로작동 한다.

[174] 상기와같은사실에기초하여 ,마우스조직에서 TUT4/7수준을

정량화 (RT-qPCR)한결과, TUT4및 TUT7수준이비교적낮은세포유형에서 5p/3p.l비율이더높다는것을알수있었다 (도 2b). 2020/175898 1»（：1^1{2020/002709

[175] mir-324성숙（maturation）에서 TUT4/7의관여를확인하기위하여 , HEK293T 세포에서 TUT4/ ⁷ 을열화시키고（depleted） sRNA-seq（AQ-seq）를수행하였다.

[176] 도 2c에서확인할수있듯이, TUT4/7녹다운은 miR-324-3p를포함하여

miRNA의유리딘화를감소시켰다（왼쪽위패널）. 또한, TUT4/7녹다운은 3p.l의 감소,및 5p및보조（minor）이형체 3p.2의증가등 miR-324의이형체조성의 변화를초래하으며,결과적으로,주요이형체사� ��（5p/3p.l）의비가

증가하였다（오른쪽위및아래패널）.

[177] 이러한시퀀싱데이터는노던블롯결과（도 2d）와도일치하였고,이는 TUT4/7 녹다운시 miR-324이형체의양에변화가나타남을의미한다.

[178] 또한,도 2e에서확인할수있듯이, TUT4/7이중녹아웃마우스로부터공개된 sRNA-seq데이터의재분석결과, TUT4/7녹아웃시 3p.l수준은감소하는반면 5p수준은증가하였다（왼쪽패널）.결과적으로 ,검사된모든조직/세포 유형（골수,배아섬유아세포,배아줄기세포및� ��）에서 TUT4/7이중녹아웃에 의한가닥비율의변화가관찰되었다（오른쪽패 널）.

[179]

[18이 3.유리딘화는 pre-mir-324의대안적다이서절단을유도한다.

[181] TUT4/7은성숙 miRNA보다는 pre-miRNA를변형시키는것으로알려져있다. 이에, TUT4/7이 mir-324가닥선택을어떻게조절하는지확인하기� �하여,합성 pre-mir-324로시험관내（/n vitro）다이서절단분석을수행함으로써 pre-miRNA 절단에대한유리딘화의영향을확인하였다.

[182] 도 3a에서확인할수있듯이, pre-mir-324가 3’말단에 1개또는 2개의여분의 유리딘잔기를보유할때,다이서절단부위는 3-nt만큼이동되었다（도 3a의위치 A에서위치 B로이동）.변형되지않은 pre-mir-324는주로 5p및 3p.2를포함하는 더긴이중복합체（검은색화살표）를방출하는 반면,유리딘화된 pre-mir-324는 대체위치（위치피에서쪼개져더짧은 5p및 3p.l로구성된더짧은이중 복합체를생성하였다（흰색화살표）.따라서, pre-mir-324의 TUT4/7 -매개 유리딘화는대안적다이서절단으로이어짐을알 수있었다.

[183] 또한,도 3b및 3c에서확인할수있듯이, TUT4/7 -열화된인간및마우스

세포로부터의시퀀싱데이터는 3p isomiRs（3p.l vs. 3p.2）의상대적풍부도가 TUT4/7녹다운（도 3b）및녹아웃（도 3c）에따라변하고,이에따라유리딘화가 다이서절단부위선택을변경시킨다는결론을뒷 받침한다.

[184]

[185] 4.대안적다이서절단은이중가닥 RNA결합도메인（double stranded

RNA-binding domain）에의해촉진된다.

[186] 먼저, 3-nt이동을담당하는결정요인을확인하기위하� �, pre-mir-324에서 U 벌지（bulge）를제거하였다.

[187] 도 4a에서확인할수있듯이, "U벌지가없는（no-bulge）”돌연변이체의경우, 다이서의절단부위가유리딘화에의해더이상위 치 B로갑작스럽게이동하지 2020/175898 1»（：1^1{2020/002709 않고,유리딘개수에따라점차적으로이동하였� �（레인 10-12） .따라서, II벌지는 위치쇼와 6사이부위에서의절단에대한반- 111 1;）이고, 이에의해다이서의대안적절단을담당하는 요소로서 작용함을확인하였다.

[188] 다음으로, 5'-및 3’-카운팅규칙이 - ₁₁₁ 뇨-324절단과어떠한관련이있는지

확인하기위하여, 5’또는 3’포켓에서의다이서돌연변이체를활용하였� �.

[189] 도 에서확인할수있듯이, 5’포켓다이서돌연변이체는위치쇼에서

!）^- ₁₁₁ 뇨-324를절단하지못했으며 , 3’포켓돌연변이체는절단부위선택에 영향을미치지않으면서절단효율에약간영향을 미쳤다.이러한결과는,위치 쇼에서의절단에대한 5’포켓의중요성을시사한다.

[19이 나아가,다이서에서다른도메인의기여도를조� �하였다.시험관내（切 때

다이서（뇨1내0의역할을확인하기위하여,（ 에）-결실돌연변이체를

생성하였다.

[191] 도 에서확인할수있듯이, 결실은절단패턴에상당한변화를가져 왔다.즉,（ 에）가없으면다이서는주로위치쇼를절단하며 ,이는（뇨1내0가 위치： 8에서의절단을담당한다는것을시사한다.

[192] 종합해보면,도 4（1에서확인할수있듯이,변형되지않은 - ₁₁₁ ^-324는

다이서의플랫폼영역에존재하는 5’포켓에의존하여위치쇼가절단됨을알수 있다（왼쪽패널）.그러나,유리딘화되면,플랫 폼/모쇼 도메인에단단히고정되지 않기때문에최종구조（3-4 ₁₁₁ 3’돌출부）는（뇨1出0의도움으로 !） - ₁₁₁ 뇨-324가 다이서에서재배치되어，위치： 8에서대안적절단이가능해짐을알수

있다（오른쪽패널）.

[193]

[194] 5.대안적다이서절단은암스위칭을유도한다.

[195] 상기실시예들의결과에따르면,도 에서확인할수있듯이, !） - ₁₁₁ 뇨-324가

2가지대안적형태의이중복합체,즉긴이중복합� ��（위치 5?/3?.2）및짧은 이중복합체（위치 B, 를생성할수있음을알수있다.

[196] 이에,세포에서의가닥선택을확인하기위하여, ₁₁₁ -324-5 _? 또는

1 ₁₁ 溫-324-31）.1에상보적인 함유하는리포터를구성하고（도 ¾왼쪽 패널）,합성이중복합체（ !^!^）또는 ））를리포터와공동

형질주입（¥ - _{1 £} （此（1）시켰다.그결과,긴이중복합체는 3!）.1부위가아닌 5? 보완부위（¥ ₁₁₁ 1）1 _61116111 ） _/ 가있는리포터를선택적으로억제하였다.반면, 짧은이중복합체는 3p.l리포터를하향조절하였으나, 5?리포터는하향 조절하지않았다（도 오른쪽패널）.

[197] 이러한결과는, 5?및 3 1이실제로는긴이중복합체및짧은이중

복합체로부터각각다르게생성됨을시사한다.� �,긴이중복합체의경우 5!）의 5’ 말단이 3 2의 5’말단에비해열역학적으로불안정하기때문� � 5?가닥이 선택되는반면（도 ，청색점선사각형）,짧은이중복합체의경우 3 1은쇼（30에 2020/175898 1»（：1^1{2020/002709 의해선호되는 5’아데노신으로시작함을알수있었다 (도 5a,빨간색점선 사각형).

[198] 종합해보면,대안적다이서절단으로인해 mir-324의암스위칭이발생함을알 수있다.

[199]

[200] 6. mir-324암스위칭은세포주기진행을조절한다.

[201] 인간교모세포종 (GBM)에서 miR-324-3p의 5’말단변화가보고된바있으며,도 6a에서도확인할수있듯이,정상적인뇌조직 (Normal brain)보다종양 (GBM)에서 3p.l의비율이실질적으로더높게나타났다.

[202] 이에 , TUT4/7 -매개 mir-324성숙이 GBM에서다르게조절될가능성을

조사하기위하여, Oncopression을이용하여전사체데이터세트를분석 하였다.

[203] 도 6b에서확인할수있듯이, TUT4및 TUT7모두 GBM에서크게상향

조절되었다.

[204] 추가적으로, mRNA와 miRNA를모두프로파일링하는독립적인데이터세� ��를 사용하여정상샘플과비교하였을때, GBM에서 TUT4/7양이상향조절되고, miR-324-5p/3p비가감소함을확인하였다.

[205] 도 6c에서확인할수있듯이, TUT4/7레벨은 5p/3p비율과음의상관관계가 있음을알수있었다.이러한결과는, GBM에서 TUT4/7 -매개 mir-324조절이 생리학적으로관련될수있음을시사한다.

[206]

[207] 상기결과를기초로, mir-324암스위칭의기능을이해하기위하여 , GBM

세포주에서 mir-324대안적가닥선택에의해유도되는분자및� �포표현형을 조사하였다.

[208] 도 6d및 6e에서확인할수있듯이,합성긴이중복합체 (”5p duplex")또는 3p에 대한안티센스올리고 (” 3p inhibitor”)의형질주입은사이클린 D및 E의축적및 사이클린 A및 B의감소를초래하였다 (왼쪽패널).또한,세포주기

프로파일링에따르면,세포가이단계에서정지� �었음을알수있었다 (우측 패널).

[209] 도 6f에서확인할수있듯이, TUT4/7녹다운도마찬가지로사이클린조절이상 및 G1정지를야기하였다.

[210] 종합해보면, miR-324 isomiRs는 GBM세포증식에대해반대기능을가지고 있음을알수있다.

[211]

[212] [소결]

[213] 도 7에서확인할수있듯이,말단유리딘화효소인 TUT4/7은 pre-mir-324를

유리딘화함으로써 mir-324대안적가닥선택에주요플레이어로서기� �한다.즉, TUT4/7은 pre-mir-324를유리딘화시키고,유리딘화현상이 pre-mir-324의다이서 절단위치를조절함으로써기능이서로다른 3가지마이크로 RNA(5p및두 3p 2020/175898 1»（：1^1{2020/002709 이형체）간의비율을변화시킨다.따라서,유리� ��화에의한 11-324조절을 저해시키면세포분열관련유전자들의발현을억 제할수있고,교모세포종의 성장을억제할수있다.

[214] 본발명에따르면, 1X114/7에의한마이크로 1^쇼（111溫-324）의대안적가닥 선택을조절할수있으므로,이를효과적으로암� �뇌종양）의예방,치료에이용할 수있다.

산업상이용가능성

[215] 본발명은 1X114/7발현조절인자를포함하는암예방또는치� �용약학적 조성물에관한것으로,더욱상세하게는 1X714/7발현을조절하는핵산서열을 포함하는암예방또는치료용약학적조성물에관 한것이다.