GALOTTO LÓPEZ MARÍA JOSÉ ALICIA (CL)
GUARDA MORAGA ABEL (CL)
BRUNA BUGUEÑO JULIO ELÍAS (CL)
GARCÍA MENA VERÓNICA ALEJANDRA (CL)
| WO2006000032A1 | 2006-01-05 | |||
| WO2001049121A1 | 2001-07-12 | |||
| WO2017032516A1 | 2017-03-02 | |||
| WO2021068089A1 | 2021-04-15 |
| US20140154426A1 | 2014-06-05 |
PELTZER, M. ET AL.: "Migration study of carvacrol as a natural antioxidant in high-density polyethylene for active packaging (2009) Food Additives and Contaminants", FOOD ADDITIVES & CONTAMINANTS: PART A, vol. 26, no. 6, pages 938 - 946, XP055788315, DOI: 10.1080/02652030802712681
| REIVINDICACIONES 1 . Envase polimérico activo con propiedades antimicrobianas que permite extender la vida útil de productos cárnicos seleccionados de carne de pollo, pavo o cerdo, caracterizado porque comprende un sustrato seleccionado de poliestireno, poliácido láctico, polietilen- vinil-alcohol, poliamidas, poliolefinas, celulosas, ceras, parafinas o una combinación de los mismos, de monocapa o multicapa, con un recubrimiento interior que comprende un vehículo polimérico disuelto en un solvente orgánico volátil seleccionado de un barniz sintético o natural, que porta un agente activo volátil antimicrobiano natural, seleccionado de carvacrol 2. El envase de la reivindicación 1 caracterizado porque dicho sustrato se selecciona de polietileno de baja densidad (LDPE). 3. El envase de la reivindicación 1 caracterizado porque dicho vehículo polimérico disuelto en un solvente orgánico volátil se dispersa en las caras internas del sustrato o superficie que contacta al alimento. 4. El envase de la reivindicación 3 caracterizado porque dicho barniz sintético es una laca sellante al calor para producto lácteo. 5. El envase de la reivindicación 1 caracterizado porque dicho producto cárnico se selecciona de carne trozada o cortada de pollo, cerdo o pavo. 6. El envase de la reivindicación 1 caracterizado porque la relación porcentual del agente activo volátil al vehículo está en el rango de 2 a 10%. 7. El envase de la reivindicación 6 caracterizado porque la relación porcentual de dicho agente activo volátil a dicho vehículo polimérico disuelto en solvente orgánico volátil es 4%. |
CAMPO DE LA INVENCION
La presente invención se relaciona con la industria transformadora de envases poliméricos para alimentos. En particular, se refiere a una película flexible polimérica con propiedades antimicrobianas que permite extender la vida útil de productos cárnicos envasados, y comprende un sustrato seleccionado de poliestireno, poliácido láctico , polietilen-vinil-alcohol, poliamidas, poliolefinas, celulosas, ceras, parafinas o una combinación de los mismos, preferentemente, polietileno de baja densidad (LDPE), monocapa o multicapa, con un recubrimiento interior que comprende un vehículo polimérico disuelto en solvente orgánico volátil que porta un agente activo volátil antimicrobiano natural, donde dicho vehículo polimérico disuelto en solvente orgánico volátil es preferentemente seleccionado de un barniz sintético o natural, preferentemente seleccionado de una laca sellante al calor para producto lácteo, y donde dicho agente activo volátil antimicrobiano natural es un aceite esencial volátil, específicamente, es carvacrol, y donde dicho vehículo polimérico disuelto en solvente orgánico volátil se dispersa en las caras internas del sustrato o superficie que contacta al alimento, y dicho producto cárnico se selecciona de carne trozada o cortada de pollo, cerdo o pavo.
ANTECEDENTES
Un agente activo con capacidad antimicrobiana tiene la capacidad de controlar el crecimiento de microorganismos que generan el deterioro de productos alimenticios. El mecanismo que domina el proceso de preservación del alimento depende de las características fisicoquímica del agente activo (contacto superficie alimento y espacio cabeza envase). En los envases flexibles poliméricos de productos alimenticios, el principal mecanismo asociado a la acción de un agente activo volátil es el espacio de cabeza del envase.
Entre los documentos de patentes relacionados con la invención se puede mencionar W02015107089A1 (Instituto Tecnológico del Embalaje, Transporte y Logística ITENE) que revela una composición antimicrobiana para empacar producto orgánico, que comprende la combinación de carvacrol, timol y salicilaldehido y/u otros componentes y/o excipientes con actividad antimicrobiana; o timol y salicilaldehido y/u otros componentes y/o excipientes con actividad antimicrobiana; o carvacrol y salicilaldehido y/u otros componentes y/o excipientes con actividad antimicrobiana, siendo la concentración de cavacrol 5-50%; timol 3-20%; y salicilaldehido 28-90% en peso en base a la concentración total y siendo el producto orgánico un alimento. La formulación activa para empacar producto orgánico comprende una matriz polimérica y la composición antimicrobiana anterior, donde la matriz polimérica comprende poliestireno, poliácidco láctico, polietilen-vinil-alcohol, poliamidas, poliolefinas, celulosas, ceras, parafinas o una combinación de los mismos, estando la composición antimicrobiana entredispersa en la matriz polimérica o es una cubierta activa para el empaque de alimento, siendo el empaque de alimento una bandeja, película, bolsa, almohadilla, entre otros. También se revela un procedimiento de preparación de dicha composición que comprende disolver la matriz polimérica en al menos un solvente; incorporar opcionalmente, al menos un plastificante y/o un compuesto anti-fog ; e incorporar la composición antimicrobiana antes descrita, pudiendo ser el plastificante tert-butil citrato, poliadipato o glicerol , y compuesto anti-fog lauril pudiendo ser sulfato de sodio, glicerol o una etoxi-amina. La superficie del empaque del producto orgánico puede ser cubierto con la composición activa con un tratamiento de corona; o ser aplicada por recubrimiento, impresión, inmersión o rociado y secado, pudiendo el recubrimiento ser aplicado por impresión de rodillo, flexografía, impresión de inyección a tinta o rotograbado. La composición se deposita sobre la superficie del sustrato total o parcialmente, extiende la vida útil de producto susceptible de ser colonizado por microbios, pudiendo ser el producto, un producto basado en carne.
CL3698-2015 (Universidad de Santiago de Chile) divulga una película degradable para empaque de frutas y hortalizas que comprende una matriz polimérica en base a poliolef ina, la que incorpora un agente activo antimicrobiano (biocida o fungicida) de aceite esencial o dicho aceite esencial, y además incorpora agentes degradantes, y procedimiento de microencapsulación de dicho agente activo antimicrobiano de aceite esencial, y método de preparación de la película, donde dicho aceite esencial es seleccionado del grupo consistente de carvacrol, cinemaldehido, cineol, sabineno, th ujaplicin o una mezcla de los mismos o incorpora dicho aceite esencial seleccionado del grupo consistente de: aceite de canela, aceite de orégano, aceite de eucalipto, aceite de nuez moscada, aceite de honokitiol o una mezcla de los mismos, y donde dicha matriz polimérica basada en poliolefina se selecciona del grupo consistente de polietileno (PE), polipropileno (PP), poliestireno (PS) y etilvinilacetato (EVA), y donde dicha matriz polimérica incorpora además un agente degradante seleccionado de nanocarbonato de calcio, carbonato de calcio, almidón, celulosa o una mezcla de los mismos, y donde el nanocarbonato de calcio además es un agente de refuerzo, donde dicho agente activo microbiano de aceite esencial o dicho aceite esencial están microencapsulados; procedimiento para microencapsular un agente activo antimicrobiano de aceite esencial; y procedimiento para preparar película.
W02001049121A (Meat product packaging) divulga un envase de producto cárneo que comprende un sustrato de lámina con una sustancia benéfica adherida, donde el sustrato de lámina es una película plástica envolvente encogible o adherible, incluyendo el uso de un agente de unión. La sustancia benéfica es un agente antimicrobiano, preferentemente contra moho o bacterias. El agente antimicrobiano puede ser un agente antimicrobiano natural, preferentemente un aceite esencial, que puede ser seleccionado de linalool, tugineol, eugenol, timol, citral o carvacrol. El agente antimicrobiano también puede ser un ester de ácido 4-hidroxibenzoico o un compuesto capaz de liberar un gas antimicrobiano. El agente antimicrobiano puede ser una cubierta de la lámina. El agente de unión puede ser una laca, preferentemente una laca acrílica, o puede comprender un polímero, preferentemente un polímero hidrofílico o lipofílico, donde el polímero se hincha en contacto con un agente de liberación, y con ello, libera la sustancia benéfica. La lamina puede estar en contacto con el producto cárneo.
W02016140781A (Dow Global Technologies LLC) divulga un material para empaque, que comprende: un sustrato y una composición antimicrobiana que comprende un agente activo antimicrobiano y un vehículo, siendo dicha composición un hidrogel a temperaturas entre 2°C y 12°C, y el vehículo puede ser agua y al menos un polímero de eter de celulosa, gelatina, pectina, goma xantano, goma guar y combinaciones de las mismas, en particular puede ser agua y metilcelulosa o agua y gelatina. El agente antimicrobiano comprende al menos un derivado de amino ácido, un ácido orgánico, un péptido, una sal de amonio cuaternario, un derivado de amino ácido o combinaciones de los mismos, en particular, se selecciona de cloruro de cetilpiridinio, arginato láurico, y cloruro de dimetiloctadecil[3-(trimetoxisilil)propil]amonio. Dicho agente antimicrobiano también puede comprender un bacteriófago y al menos un agente antimicrobiano adicional, y además opcionalmente un antioxidante, un surfactante, un estabilizador, un tampón, un barredor y combinaciones de los mismos. El sustrato puede ser una película polimérica. La composición antimicrobiana se aplica a la superficie del sustrato previo a armar el empaque, preferentemente la superficie interior del sustrato. La composición antimicrobiana está en contacto con el producto, preferentemente un producto cárneo.
ES2639914T3 (Universidad de Santiago de Chile) divulga un proceso para la obtención de un film que comprende la incorporación de agentes antimicrobianos de origen natural en una estructura polimérica a través de un doble proceso de extrusión al material polimérico, útil en el desarrollo de envases destinados a incrementar la vida útil de carne refrigerada, preferentemente de salmón fresco refrigerado, donde dicho proceso comprende las siguientes etapas: (a) mezclar en una primera extrusión el agente activo antimicrobiano con polietileno de baja densidad en polvo, para obtener un pellet, (b) realizar una segunda extrusión para obtener un film incorporando el pellet obtenido en la etapa (a) en proporción de 10% sobre polietileno en pellet, (c) realizar una coextrusión de tres capas para el desarrollo del film sobre el cual se incorporó el agente antimicrobiano, en donde el agente activo antimicrobiano es incorporado en la capa del film que está en contacto directo con el salmón, en donde la capa intermedia y la capa exterior aportan requerimientos de estructura del film, sin la incorporación del agente activo.
CN109688834A (Univ, of Guelph) divulga una composición de liberación controlada de compuesto volátil que comprende al menos un polímero de poli(etilenglicol) (PEG) y al menos uno o más compuestos volátiles seleccionado de una combinación de antimicrobianos, y además opcionalmente comprende ácido poliláctico (PLA). El compuesto volátil puede estar presente en un porcentaje de alrededor de 0,01 % p/p a alrededor de 50% p/p, y se selecciona de alil isotiocianato (AITC), diacetilo, ácido cinámico, timol, carvacrol y sus combinaciones, preferentemente una mezcla diacetilo y AITC de 10:1 a 1 :1 , o una mezcla diacetilo, AITC y ácido cinámico en una proporción 1 : 4: 60. Los compuestos volátiles se disponen en un vehículo, que puede ser una fibra de hilado con electricidad. La composición comprende una mezcla de ácido poliláctico (PLA) y poli(alcano secundario epoxi) (PEO), en una proporción PLA a PEO de 7:3. La composición además incluye celulosa, que puede ser seleccionada de etilcelulosa y acetato de celulosa. La composición es útil para preservar alimentos almacenados seleccionados de aguas de fruta y verduras, panadería, panadería, pasta fresca y carne fresca.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
Figura 1 Actividad antimicrobiana de cada compuesto contra Escherichia coli después de 24 h de incubación a 35°C. Control A: sin compuestos, Control B: con etanol 95%, TX-18: alil isotiocianato, TX-09: carvacrol, TX-07: eugenol, TO-08: extracto de romero, TX-08: 2-nonanona, TX-14: cinalmaldehido, TX-06: timol, TO-07: extracto de clavo de olor.
Figura 2 Actividad antimicrobiana de cada compuesto contra Staphylococcus aureus después de 24 h de incubación a 35°C. TO-08: extracto de romero, TX-18: alil isotiocianato, TX-06: timol, TX-14: cinamaldehído, TO-07: : extracto de clavo de olor, TX-09: carvacrol, TX-08: 2-nonanona, TX-07: eugenol.
Figura 3 Análisis comparado de capacidad antimicrobiana in vitro de compuestos de origen natural para Escherichia coli y Staphylococcus aureus.
Figuras 4A-4G Imágenes MIC compuesto no volátil C-2 frente Escherichia coli y Staphylococcus aureus. Figura 4A (control, Escherichia coli), Figura 4B (control, Staphylococcus aureus), Figura 4C (10 ppm, Escherichia coli), Figura 4D (10 ppm, Staphylococcus aureus), Figura 4E (20 ppm, Escherichia coli), Figura 4F (20 ppm, Staphylococcus aureus), Figura 4G (30 ppm, Escherichia coli), Figura 4H (30 ppm, Staphylococcus aureus), Figura 4F (40 ppm, Escherichia coli) y Figura 4G (40 ppm, Staphylococcus aureus)
Figura 5 Resultados microbiológicos RAM expresados en UFC/g.
Figura 6 Gráfico seguimiento ensayo vida útil con modificaciones. Figura 7 M ¡orografía de corte transversal de película LDPE/laca sellante al calor de producto lácteo/TX-09 (carvacrol)
Figura 8 Análisis de evolución de calidad microbiológica de muestras de pollo envasadas en sistema activo en condiciones de refrigeración (4°C). Negro: Control LDPE; Gris oscuro: LDPE/BLSC y Gris claro: LDPE/BLSC/TX-09
Figura 9. Efecto antimicrobiano de películas activas basadas en BLSC y agente activo volátil. Figura 9A (4%, Escherichia coli), Figura 9B (4%, Staphylococcus aureus), Figura 8C (6%, Escherichia coli), Figura 9D (6%, Staphylococcus aureus), Figura 9E (8%, Escherichia coli), Figura 4F (8%, Staphylococcus aureus).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente película flexible polimérica con propiedades antimicrobianas que permite extender la vida útil de productos cárnicos envasados, y comprende un sustrato seleccionado de poliestireno, poliácido láctico, polietilen-vinil-alcohol , poliamidas, poliolefinas, celulosas, ceras, parafinas o una combinación de los mismos, preferentemente, polietileno de baja densidad (LDPE), monocapa o multicapa, con un recubrimiento interior que comprende un vehículo polimérico disuelto en solvente orgánico volátil que porta un agente activo volátil antimicrobiano natural, donde dicho vehículo polimérico disuelto en un solvente volátil es seleccionado de un barniz sintético o natural, preferentemente seleccionado de una laca sellante al calor para producto lácteo, y donde dicho agente activo volátil antimicrobiano natural se selecciona de un aceite esencial volátil, específicamente, carvacrol, y donde dicho vehículo polimérico diseulto en un solvente volátil se dispersa en las caras internas del sustrato o superficie que contacta al alimento, y dicho producto cárnico se selecciona de carne trozada o cortada de pollo, cerdo o pavo. De esta forma, dicho agente activo volátil antimicrobiano natural interactúa tanto con la superficie del alimento como en el entorno donde se mantiene beneficiosamente en el espacio de cabeza del envase. El recubrimiento se aplica mediante un método estándar de tratamiento superficial de sustrato (“coating”), preferentemete seleccionado de laminación o impresión superficial, y de este modo, no requiere implementaciones especiales por parte de la industria transformadora de envases puede aplicarlo sin modificar sus procesos industriales clásicos. El presente envase activo mostró, en pruebas in vivo, extender la vida útil de carne de pollo envasada, bajo condiciones de refrigeración tradicionales para este tipo de alimento, esto es, 4°C.
El agente activo (carvacrol) se encuentra en el barniz sintético (BLSC) en una concentración del 2% al 10% p/p, preferentemente en concentraciones de 2%, 4% y 6% p/p Se ensayaron agentes activos volátiles tanto de origen natural como agentes activos sintéticos reconocidos por su capacidad antimicrobiana. El agente TX-09 (carvacrol) demostró una mayor capacidad antibacteriana frente a bacterias de distinto tipo, en condiciones in vitro, y comparado con un conservante comercial de origen sintético (C-2, Etil lauril arginato, LAE).
Los agentes activos TX-09 y C-2 fueron empleados para funcionalizar una película comercial de polietileno de baja densidad (LDPE), que es el tipo de material que se usa preferentemente en el envasado de carne de pollo. La incorporación de los agentes activos se realizó a través de la técnica de recubrimiento, y usando un vehículo seleccionado de un barniz tipo laca sellante al calor (BLSC) para producto lácteo, preferentemente, y una resina acrílica (RA), preferentemente, para la dispersión y fijación del agente activo sobre el sustrato de LDPE, presentando cada barniz afinidad química particular por el agente activo que porta. Así, TX-09 fue empleado con barniz tipo laca, mientras que para C-2 se empleó la resina acrílica.
Las películas de BLSC/TX-09 y RA/C-2 presentaron actividad antibacteriana in vitro frente a los microorganismos modelos (E. coliy S. aeurus). La Figura 7 muestra un corte lateral de la película LDPE/BLSC/TX-09 en donde es posible apreciar la presencia del barniz sobre el sustrato de LDPE. Debido al excelente comportamiento antibacteriano, se procedió a evaluar su comportamiento en pruebas in vivo para ello, se envasaron muestras de pollo en envases recubiertos interiormente con ambas películas activas. Para la evaluación de la capacidad antimicrobiana en condiciones in vivo se consideró un límite de seguridad para un recuento de aerobios mesófilos (RAM) de 1 x10 7 UFC/g de alimento. Dicho indicador fue empleado para la determinación de vida útil microbiológica de muestras de pollo envasados. Todas las pruebas se realizaron en condiciones de refrigeración (4°C) durante al menos 10 días en envases fabricados a partir de los materiales desarrollados y los respectivos controles. Es preciso indicar que, en el caso del material activo, recubrimiento LDPE/RA/C-2, no fue posible detectar efecto sobre la vida útil del pollo envasado ya que el peso molecular del agente activo dificultó la migración desde la película hacia el alimento. Por el contrario, los envases elaborados con la película activa LDPE/BLSC/TX-09 mostraron un claro efecto del agente activo en la reducción del RAM durante el tiempo de almacenaje. La Figura 8 muestra la evolución del RAM durante 10 días para muestras de pollo almacenadas a 4°C en envases controles (LDPE y LDPE/BLSC) y en el envase activo fabricado con LDPE/BLSC/TX-09. Tal como muestra la figura 8 es posible establecer que el envase activo permite incrementar en 2 días la vida útil de las muestras envasadas, pasando de una vida útil de 6 días para el envasado control a 8 días para el envase activo. Sin limitarse a una teoría, la generación de la actividad antimicrobiana podría estar dada por la naturaleza del compuesto activo, el cual se caracteriza por volatilizarse, situación que favorecería su actuar en el espacio de cabeza del envase, podiendo con ello, actuar en gran parte de la superficie del producto.
Los resultados mostraron que la película de la invención aumenta un 33% en el tiempo de vida útil de pollo envasado y que la diferencia de las películas y envases antimicrobianos conocidos y muchas soluciones propuestas que muestran actividad antimicrobiana en pruebas in vitro pero que frente a un alimento no demuestran efectividad, tal como sucedió con la película LDPE/RA/C- 2.
Ejemplo 1 : Eficacia del agente activo antimicrobiano volátil natural
Se ensayó la actividad antimicrobiana de 8 agentes activos antimicrobianos volátiles naturales permitidos como sustancias o aditivos para ser utilizados en envases en contacto con alimentos. Se ensayó por triplicado, la inhibición radial in vitro contra Escherichia coli y Staphylococcus aureus mediante el método de difusión en agar (Elgayyar, M., Draughon, F., Goldem, D. y Mount, J. (2001 ). Antimicrobial Activity of Essential Oils from Plants against Selected Pathogenic and Saprophytic Microorganisms. Journal of Food Protection 64: 1019-1024). Específicamente, en la base de una placa Petri de 9 cm de diámetro, se vertieron 30 mL de agar Tripteina Soya (TSA) estéril. Una vez gelificado el agar se procedió a sembrar 100 pL de cultivo saturado de cada microorganismo, en concentraciones celulares que fluctúan entre 1 x 10 8 a 1 x 10 9 (UFC/mL). Posteriormente se homogeniza en toda la superficie del agar mediante rastrillado. Luego, se adhiere un disco de papel filtro de 6 mm de diámetro al que se le agregaron 5 pL de cada agente activo antimicrobiano volátil natural, con el fin de permitir su difusión en el agar. Todo este procedimiento fue realizado en una la campana de flujo laminar NuAire NU, modelo 425-400E, Massachusetts, USA. Finalmente, las placas fueron incubadas por 24 h a 35°C, condiciones consideradas como óptimas para el crecimiento de las bacterias. Cumpliendo el tiempo de incubación, se procedió a medir el halo de inhibición asociado a cada agente activo antimicrobiano volátil natural en que los halos se presentaron, se midieron los diámetros de estos por sextuplicado para calcular posteriormente, un área de inhibición final. De esta forma, se midió la capacidad de difusión que tiene el agente activo antimicrobiano volátil natural a través del agar, el efecto de liberación del mismo compuesto y la actividad contra el microrganismo (Figura 1 y 2).
Ejemplo 2: Concentración Mínima Inhibitoria del control Etil Lauril Arginato (LAE, C-2)
Se ensayó la concentración mínima inhibitoria (CMI) definida como la mínima concentración de compuesto activo a la que se observa inhibición en el crecimiento y la concentración mínima bactericida (CMB), donde no hay crecimiento alguno de los microorganismos. La CMI y CMB del compuesto no volátil, se determinó en medio líquido TSB frente a dos microrganismos: S. aureus como modelo de bacteria Gram positiva y E. coli como modelo de bacteria Gram negativa. Para ello, se preparó inicialmente una disolución stock de 1000 ppm en agua Milli-Q. Posteriormente, se hicieron diluciones seriadas en tubos estériles con 10 mL de TSB obteniéndose un rango de concentraciones comprendidas entre 10-40 ppm. Se empleó agua Milli Q estéril como control. Por otro lado, se tomaron 100 pL de un minicultivo y se inocularon en 10 mL de TSB previamente atemperado, se agitaron vigorosamente y se introdujo en un baño de 37°C en agitación para llevar al microorganismo a fase exponencial de crecimiento. Mediante un Espectrofotómetro UV visible se midió la absorbancia a 595 nm hasta alcanzar un valor de 0,2, correspondiente a la fase exponencial de crecimiento (10 5 UFC/mL). Una vez alcanzada la fase exponencial, se inoculan 100 pL de cada microorganismo en los tubos previamente preparados con las diferentes concentraciones de activo. Los tubos se incuban en una estufa a 37°C durante 24 h. La turbidez es un indicador del crecimiento microbiano y dependiendo de la misma se realizaron diferentes diluciones, se sembraron 100 pL del último tubo turbio y el primero transparente en placas Petri de TSA. Se incubaron durante 24 h a 37°C en estufa y se procedió al recuento de las unidades formadoras de colonia (UFC/mL). Todos los experimentos se realizan por triplicado. En la Tabla 1 y Tabla 2 se muestran los resultados obtenidos para E. coli y S. aureus.
Tabla 1 Inhibición del compuesto no volátil frente a S. aureus
Tabla 2 Inhibición del compuesto no volátil frente a E. coli
Los resultados dan cuenta de elevada acción antimicrobiana del compuesto activo comercial no volátil C-2, tanto para la bacteria Gram positiva como Gram Negativa. Así la concentración de 10 ppm es capaz de inhibir 5 ciclos logarítmicos de S. aureus con respecto al control, mientras que concentraciones mayores logran inhibir completamente su crecimiento. En el caso de E. coli se observa un poder un poco menor, pero bastante aceptable, ya que la mínima concentración reduce casi 5 ciclos logarítmicos respecto al control, logrando una inhibición total a 40 ppm. En la figura 4, se muestran imágenes de las pruebas in vitro de la determinación de la MIC del compuesto no volátil C-2 en sus diferentes concentraciones frente a E. coliy S. Aureus.
Ejemplo 3: Elaboración de Recubrimientos
Se prepararon disoluciones de BLSC para aplicarlo sobre polietileno (LDPE) sometido previamente a un tratamiento corona. Las disoluciones se aplicaron sobre films de LDPE comercial, siendo el más utilizado actualmente en la industria de envases de alimentos para envolver bandejas carne de pollo o elaborar envases en formato de bolsa. El tratamiento corona resultó en una energía superficial mínima de 40 dinas/cm, lo que mejoró la adherencia del recubrimiento. Los recubrimientos se prepararon utilizando un equipo de laboratorio RK Print K303. Se prepararon materiales con diferentes concentraciones (2%, 4%, 6% p/p) de agente activo volátil (carvacrol). El recubrimiento con BLSC fue preparado al 35% p/v. En cuanto al contenido del compuesto activo, éste se expresa en base al porcentaje en masa del polímero presente en el recubrimiento.
La Tabla 3 resume las propiedades de homogeneidad y adhesión del recubrimiento sobre la película base de LDPE. Para esos fines se utilizó una escala de evaluación donde el Valor 1 (+) corresponde al producto final con un recubrimiento opaco blanquecino y heterogéneo, mientras que el Valor 5 (+++++) corresponde a un recubrimiento uniforme, homogéneo y con transparencia total. Los resultados dan cuenta de una buena adhesión y homogeneidad para el recubrimiento con RA con y sin activo.
Tabla 3. Propiedades de los recubrimientos elaborados
Además, se realizó un ensayo con diferentes varillas para determinar el espesor de recubrimiento adecuado. En la Tabla 4 se puede observar el tipo de varilla utilizado y el espesor de recubrimiento obtenido. Tabla 4. Resultado del estudio de varilla y espesores
La varilla N°2 confiere un espesor adecuado, aumentando solo en 3,5 pm el espesor respecto al material base.
Ejemplo 4: Caracterización de los materiales
Capacidad antimicrobiana de los recubrimientos
Actividad antimicrobiana por contacto
El método utilizado permitió evaluar la actividad antimicrobiana en la superficie de diferentes materiales como productos textiles, plásticos, metálicos o cerámicos. Se usó E. coliy S. aureus como cepas modelo. El control y las muestras analizadas se cortaron en pequeños pedazos cuadrados (5 x 5 cm). Todas las muestras se inocularon por triplicado, con tres réplicas adicionales de las películas control, con una suspensión de microorganismos ca. 10 5 UFC/ml estandarizados por dilución en un caldo nutritivo. A continuación, el inoculo se cubrió con una película delgada y estéril de polipropileno (4 x 4 cm) para evitar la evaporación de la muestra y la pérdida de viabilidad de los microrganismos.
Las muestras se incubaron en un ambiente húmedo durante +24 horas. Después de la incubación, las superficies se transfirieron cuidadosamente a un stomacher, desde donde se realizaron diluciones seriadas y posterior sembrado en placas Peths las cuales se incubaron durante 24 horas. El efecto antimicrobiano se midió comparando la supervivencia de las bacterias en el material activo con la obtenida en un material control.
El valor de la actividad antimicrobiana de las muestras analizadas se determinó con la siguiente fórmula (Ecuación 1 ):
R = (Ut - U0) - (At - U0) = Ut - At (Ecuación 1 ) donde
R = es la actividad antibactehana;
U0 = es el promedio del logaritmo común del número de bacterias viables, en células/cm 2 , recuperado de las muestras de ensayo no tratadas inmediatamente después de la inoculación; Ut = es el promedio del logaritmo común del número de bacterias viables, en células/cm 2 , recuperadas de las muestras de ensayo no tratadas después de 24 h;
At = es el promedio del logaritmo común del número de bacterias viables, en células/cm 2 , recuperado de las muestras de prueba tratadas después de 24 h; cuando R > 2,0, se considera que la muestra presenta propiedades biocidas
La Tabla 5 muestra los resultados obtenidos tras el análisis. Es posible apreciar una elevada capacidad antimicrobiana frente a E. coliy S. aureus para las películas activas con distinto contenido de agente activo no volátil C-2.
Tabla 5. Efecto del contenido de agente activo comercial C-2 sobre el crecimiento de E. coliy S. aureus. Método por contacto.
Actividad antimicrobiana en fase vapor.
En primer lugar, se recuperaron las cepas bacterianas a utilizar. En este caso E. coliy S. aureus fueron seleccionadas como modelos de bacterias Gram negativas y Gram positivas respectivamente. Para ello, se prepara inicialmente un minicultivo, inoculando una pequeña muestra extraída con el asa de Henle del tubo de agar inclinado en un tubo con 10 mL de TSB y se incuba durante 18 h a 37 e C.
Posteriormente se inoculan 100 pL de microorganismos en una concentración de 10 5 UFC/mL sobre placas de TSA, a continuación, se coloca suavemente en la tapa de la placa Petñ los materiales activos desarrollados y se incuban a 37 e C durante 24 h. Transcurrido este tiempo se procedió a la analizar de forma visual el crecimiento de las bacterias.
La Tabla 6 muestra el efecto de las películas basadas en BLSC y el agente activo volátil sobre el crecimiento de las E. coliy S. aureus en fase vapor. Se observa un importante efecto del activo sobre concentraciones del 6% . Tabla 6. Efecto del contenido de agente activo volátil sobre el crecimiento de E. coliy S. aureus.
Método en fase vapor. Ver Fig. 9
Figura 9. muestra el efecto antimicrobiana de películas activas basadas en BLSC y agente activo volátil.
Actividad antimicrobiana en medio líquido
Se evaluó la actividad de los recubrimientos en medio líquido frente a las dos bacterias modelo E. coliy S. aureus. Para ello, se inocularon 100 pL de cada microrganismo en fase exponencial en los tubos previamente preparados con 10 mL de TSB, a los cuales se le añadieron 0,2 g de cada una de películas activas desarrolladas. Posteriormente, se incubaron a 37°C durante 24 h. En función de la turbidez de los tubos se realizaron diluciones señadas con agua de peptona. Un volumen de 100 pL de cada dilución se sembró en placas Petñ de aproximadamente 15 mL de medio de cultivo TSA, las cuales posteriormente se incubaron durante 24 h. Finalmente, se procedió al recuentro de las unidades formadoras de colonias (UFC/mL). Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado.
En la Tabla 7 resume los resultados obtenidos para las películas activas desarrolladas. A diferencia del ensayo realizado en el apartado anterior, las películas con un 2% de compuesto activo no presentaron actividad antimicrobiana en medio líquido frente a E. coli, lo que se podría deber a que la cantidad liberada al medio fue menor que la MIC, y en este asunto es preciso mencionar que para que exista efectividad de un antimicrobiano por esta metodología, es indispensable que exista migración del agente hacia el medio líquido de cultivo. A partir del 4% se observa un importante efecto en el crecimiento de E. coli con reducciones por sobre los 5 ciclos logarítmicos. Por otro lado, en el caso de S. aureus se evaluó solamente el porcentaje de 4%, concentración que mostró una reducción de más de 2 ciclos logarítmicos en el crecimiento de esta bacteria. Tabla 7. Efecto del contenido de agente activo comercial C-2 sobre el crecimiento de E. coliy S. aureus. Método en medio líquido
Los ensayos posteriores se realizan con la película con 4% de activo comercial (C-2) para las pruebas in vivo con pollo en condiciones de refrigeración.
Caracterización física de las películas activas
Propiedades mecánicas - tracción/deformación
Se realizaron ensayos utilizando una máquina universal de ensayo de tracción Zwick Roell modelo BDO-OC 5HT donde se determinaron los valores de Módulo de Young, Fuerza de Tensión, y Porcentaje de Elongación a la Rotura a través de un ensayo de tracción deformación. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 8. Estos resultados muestran que la incorporación del barniz sobre la película base de polietileno no afecta de forma significativa las propiedades mecánicas de éste.
Tabla 8. Propiedades mecánicas de films recubiertos y control.
Propiedades ópticas
Color
Se evaluó el posible cambio en la coloración tras la aplicación del recubrimiento con y sin el agente activo mediante un colorímetro modelo Konica minolta CR-410. A partir de las coordenadas CIELAB se midió L* correspondiente a la luminosidad (negro (0) - blanco (100)), a* (rojo (+) - verde (-)) y b* (amarillo (+) - azul (-)). Se cortaron probetas de 6 x 6 cm para ello.
La Tabla 9 muestra las coordenadas de color L*, a*, b*, del control sin barniz (LDPE), con recubrimiento con y sin activo C-2. Los valores de L* dan una ¡dea de la elevada transparencia de los materiales, mientras que los bajos valores de a* y b*, próximos a cero y muy similares a los blancos. Estos resultados son indicativos de que la aplicación de barniz no afecta la coloración del material base.
Tabla 9. Coordenadas colorimétricas de las películas desarrolladas.
Opacidad
Adicionalmente se evaluó la opacidad del material desarrollado mediante el cálculo del cociente de la absorbancia medida a 600 nm y el espesor del material. Los resultados de este análisis son presentados a continuación. Al igual que en el caso de la coloración, se evidencia que la aplicación del barniz ya sea con activo o sin él, sobre el polietileno no afecta esta propiedad óptica.
Tabla 10. Opacidad de las películas desarrolladas y control.
Gramaje
Se determinó el gramaje del envase recubierto con RA con y sin el compuesto activo comercial C-2. Para ello se cortaron 15 muestras de 6 cm 2 de cada condición. Posteriormente se calculó los gramos de material por metro cuadrado. Los resultados de este análisis se presentan en la Tabla 1 1 . Tabla 1 1 . Determinación de gramaje de control de LDPE y material de envase activo.
Se puede observar un aumento del gramaje en aproximadamente 4 g/m 2 debido a la aplicación del recubrimiento ya sea con o sin agente activo C-2 y de 9 g/m 2 en el caso con TX-09. Este resultado es concordante con el espesor obtenido para las películas recubiertas con el material VT7691 .
Termosellabilidad
La Tabla 12 reporta los resultados del ensayo de fuerza de sello del LDPE a un tiempo de sellado de 1 ,5 s. Este tiempo ha sido reportado como logrando un sellado apropiado de LDPE sin tratamiento corona. Por encima de este valor, la resistencia de sello no cambia significativamente cuando se realizan comparaciones a las mismas condiciones de presión y temperatura de sello. Se midió la Resistencia de sello promedio (Fav) como promedio de la fuerza aplicada durante la trayectoria de peladura del sello. Este valor tiene un significado representativo para los casos donde se tienen sellos convencionales anchos. También puede expresarse por unidad de ancho (b) de la probeta (Fav/b). Por otro lado, la Resistencia máxima de sello (Fmax) es la fuerza máxima que resiste el sello, y su valor fue significativamente mayor en los ensayos, donde se tiene un sello tipo hilo muy angosto producido con la envasadora al vacío MULTIVAC (Fmax). También puede expresarse por unidad de ancho (b) de la probeta (Fmax/b).
Tabla 12 Parámetros de sello
El polietileno es reconocido por ser un material termoplástico de excelentes características en cuanto a su termosellabilidad. Debido a lo anterior, en muchos materiales fabricados con estructura multicapa, este material es incluido para favorecer el sellado del envase. Entonces, es importante notar que la aplicación del barniz genera una pérdida importante en la termosellabilidad del material. Si bien esto podría indicar una desventaja en la aplicabilidad del material, el uso de impresión por registro resulta ser una opción para hacer factible la aplicación del barniz activo sobre el polietileno.
Permeabilidad al oxígeno
La determinación de la permeabilidad al oxígeno de las muestras de los films se llevó a cabo con un equipo OXTRAN 2/20 MOCON. Este equipo permite medir la velocidad a la que el oxígeno atraviesa un material polimérico a una presión de 760 mmHg y 0% HR. El parámetro es entregado por el equipo es el OTR (Oxigen Transmission Rate) o la Velocidad de transmisión de oxígeno. Los resultados de este análisis se presentan en la Tabla 13.
Tabla 13. Permeabilidad al oxígeno de las películas desarrolladas.
Ejemplo 4: Evaluación de la evolución microbiológica de filetillos de pollo envasados en bolsas fabricadas a partir de la película activa LDPE/BLSC/TX-09 y LDPE/RA/C-2. Fabricación de Bolsas
A partir de las películas LDPE/BLSC/TX-9 y LDPE/RA/C-2 se elaboraron bolsas de dimensiones 15 x 15 cm. Para la fabricación se procedió a termosellar las películas con una termoselladora Multivac. Es preciso destacar que en ambos casos el barniz con los agentes activos, quedaron en la cara interna de la bolsa para permitir el contacto con el alimento.
Se busca confirmar que se cumpla con el límite de seguridad de 1x10 7 UFC/g de alimento establecido en el título V de los criterios microbiológicos, párrafo III, 10.1 del Reglamento Sanitario de los Alimentos (RSA). Se tomo una muestra representativa que fue masada (10, 25 o 50 g) y diluida con agua peptonada (APT) al 0,1 % (90, 225 o 450 mL) dentro de una bolsa digestora que fue homogeneizada por máximo 1 minuto en Stomacher. Posteriormente se realizan diluciones seriadas en tubos estériles con 9 mL de APT 0,1 %. Se analizaron 2 muestras por condición y se sembraron por duplicado en cada dilución e incubadas a 37 e C por 48 h leyendo placas que estén entre 25-250 colonias. Se uso carne de pollo (filetes de pechuga de pollo) comercializada en condiciones de refrigeración, y posteriormente, congelado. Para la evaluación preliminar de carga microbiológica de muestras comerciales de carne de pollo, se realizó un recuento de aerobios mesófilos (-RAM-) de la carne de pollo refrigerada, desde 3 muestras distintas (M1 , M2 y M3), las que fueron analizadas el día de la compra (DO) y 2 días después de comprado o hasta que estuvieran fuera del rango límite de seguridad de 1x10 7 UFC/g de alimento. Las muestras fueron almacenadas en su envase original en refrigeración a 4°C. Los resultados de este estudio se muestran en la Tabla 14.
Tabla 14 Recuento de aerobios mesófilos (RAM) en muestras comerciales de carne de pollo.
Determinación de RAM
La eficacia antimicrobiana de las películas activas fue determinada en base al seguimiento del recuento de microorganismos aerobios mesófilos. El método propuesto se llevó a cabo dentro de una cámara de flujo marca LABCONCO modelo 3970421 analizando por separado los tres filetillos de pollo por bolsa con duplicado técnico para cada dilución. A su vez, las placas fueron incubadas en una estufa de incubación Arquimed modelo ZFD- 5090 a 35°C por 7 días o hasta que, desde un punto de vista microbiológico o sensorial, no fueran aceptables. Las concentraciones de microorganismos fueron expresadas en UFC/g a partir de la cuantificación de colonias en un contador SUNTEX modelo 570. La vida útil fue determinada por el límite de aceptabilidad para muestras de carne de ave crudas que es de 10 7 UFC/g.
Se realizó un estudio para evaluar la efectividad del recubrimiento desarrollado LDPE/BLSC/TX- 09. Para ello, fueron analizadas 4 sistemas, que incluyeron 3 bolsas de 15x15 cm correspondiente al control de LDPE, al control LDPE/BLSC (sin el compuesto activo) y bolsa activa LDPE/BLSC/TX-09. Adicionalmente fue guardada una bandeja sellada manteniendo las mismas condiciones que las otras muestras para ser analizadas el día de vencimiento que indica el envase. Los resultados expresados en unidades formadoras de colonia por gramo de alimentos (UFC/g) son resumidos en la Tabla 15. Tabla 15. Resultados microbiológicos de RAM en filetillos de pollo ensayo con bolsas (porcentaje activo volátil a vehículo, 8 % p/p)
Al graficar los resultados (Figura 5), es posible apreciar un leve efecto antimicrobiano de la bolsa activa desarrollada en comparación a las otras condiciones evaluadas. No obstante, la muestra desde el punto de vista sensorial es inaceptable, con un fuerte olor a descomposición, situación que da cuenta de que el producto no está apto para consumo. Tras múltiples repeticiones se obtuvieron resultados totalmente heterogéneos, donde no fue posible observar actividad antimicrobiana.
La variabilidad de resultados fue un problema que ya se anticipaba, la problemática de no conseguir carne de pollo fresco para realizar los ensayos, sumado con el desconocimiento de cómo ha sido tratado el alimento antes de la puesta en venta en los supermercados, entre otros aspectos, complico aún más la obtención de resultados aceptables y reproducibles con el tiempo. Debido a lo anterior, se tomaron distintas medidas con la finalidad de disminuir factores externos que podrían afectar el estudio, tal como, aplicación de radiación UV a las bolsas previo al envasado del pollo. No obstante, tal como se indicará a continuación, el iniciar el estudio con muestras de pollo congelado ayudó significativamente a la realización de los experimentos.
Evaluación de pollo congelado
En la Tabla 16 y Figura 6 se muestran los resultados obtenidos tras las modificaciones anteriormente mencionadas. Es posible apreciar como el envase activo logra, desde un punto de vista microbiológico, aumentar la vida útil de la carne de pollo, a lo menos 3 días más que las demás condiciones. Además, desde el punto de vista sensorial, las muestras se encontraban en condiciones de venta y consumo, no así las demás muestras analizadas. Tabla 16 Resultados microbiológicos RAM, ensayo modificado La Figura 9 muestra la evolución del RAM, expresada como UFC/g, durante 10 días para muestras de pollo almacenadas a 4 °C en envases controles (LDPE y LDPE/BLSC) y en el envase activo fabricado con LDPE/BLSC/TX-09. Tal como muestra la figura es posible establecer que el envase activo permite incrementar en 2 días la vida útil de las muestras envasadas, pasando de una vida útil de 6 días para el envasado control a 8 días para el envase activo. La generación de la actividad antimicrobiana estaría dada por la naturaleza del compuesto activo, el cual se caracteriza por volatilizarse, situación que favorecería su actuar en el espacio de cabeza del envase pudiendo con ello actuar en gran parte de la superficie del producto.