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Title:
PREGNANE GLYCOSIDE COMPOUNDS CONTAINING ORTHOESTER GROUPS AND USE THEREOF
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2012/079279
Kind Code:
A1
Abstract:
The present invention relates to pregnane glycoside compounds containing orthoester groups, pharmaceutical compositions containing the compounds, and use thereof in the preparation of an immunosuppressant. More particularly, disclosed are pregnane glycoside compounds containing orthoester groups extracted from Periploca plants, pharmaceutical compositions containing the compounds, and use thereof in the preparation of an immunosuppressant for prevention and/or treatment of immunological rejection reactions following cell/organ transplantation or autoimmune diseases, wherein the autoimmune diseases comprise rheumatoid arthritis, multiple sclerosis and autoimmune hepatitis and the like.

Inventors:
ZHAO WEIMIN (CN)
ZUO JIANPING (CN)
YANG YIFU (CN)
WANG LUOYI (CN)
YANG YANG (CN)
CHEN ZHENHUA (CN)
TANG WEI (CN)
Application Number:
PCT/CN2011/002023
Publication Date:
June 21, 2012
Filing Date:
December 02, 2011
Export Citation:
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Assignee:
SHANGHAI INST MATERIA MEDICA (CN)
ZHAO WEIMIN (CN)
ZUO JIANPING (CN)
YANG YIFU (CN)
WANG LUOYI (CN)
YANG YANG (CN)
CHEN ZHENHUA (CN)
TANG WEI (CN)
International Classes:
C07J5/00; A61K31/58; A61K36/27; A61P1/16; A61P19/02; A61P37/06
Foreign References:
CN1939324A2007-04-04
CN1593503A2005-03-16
Other References:
WANG, LUOYI ET AL.: "Structural revision of periplocosides and periperoxides, natural immunosuppressive agents from the genus Periploca", PHYTOCHEMISTRY, vol. 72, no. 17, 16 August 2011 (2011-08-16), pages 2230 - 2236
FENG, JIAQUAN ET AL.: "Immunosuppressive pregnane glycosides from Periploca sepium and Periploca forrestii", PHYTOCHEMISTRY, vol. 69, no. 15, 2008, pages 2716 - 2723, XP025611833, DOI: doi:10.1016/j.phytochem.2008.08.015
Attorney, Agent or Firm:
KINGSOUND&PARTNERS (CN)
北京金信立方知识产权代理有限公司 (CN)
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Claims:
权利要求 类含有原酸酯基团的孕甾烷糖苷类化合物, 其由如下通式 I表

产物通过醚键连接构成的糖链片段。

2、如权利要求 1所述的含有原酸酯基团的孕 烷糖苷类化合物,其特征 在于, 通式 I中:

加拿大麻糖 加拿大麻糖 加拿大麻糖 乙酰基洋地黄糖

加拿大麻糖 加拿大麻糖 加拿大麻糖 洋地黄糖

洋地黄毒糖 加拿大麻糖 加拿大麻糖 乙酰基洋地黄糖

加拿大麻糖 I 卡那糖 I 加拿大麻糖 11 加拿大麻糖 I (4-乙酰基)

II 卡那糖 I 加 I 夹竹桃糖 。

3、如权利要求 1所述的含有原酸酯基团的孕 烷糖苷类化合物,其选自 下列化合物中:

P-2: R, H, R2 加拿大麻糖 111 加拿大麻糖 11 加拿大麻糖 I 2-乙酰基洋地黄糖

P-3:R , R2为 加拿大麻糖 111 加拿大麻糖 11 加拿大麻糖 I 洋地黄糖

27 。 、 、 Y ."0H

P-9: Ri为 R2为 加拿大麻糖 卡那糖 加拿大麻糖 夹竹桃糖

P-10: Ri H, R2为 加拿大麻糖 卡那糖 加拿大麻糖 夹竹桃:

P-11: Ri为 H, R2

4、一种药物组合物,其包含治疗有效量的如权利要求 1至 3中任一项所 述的一种或多种含有原酸酯基团的孕 烷糖苷类化合物作为活性成分。

5、一种从杠柳属植物中提取如权利要求 3所述的含有原酸酯基团的孕甾 烷糖苷类化合物的方法, 其包括下列歩骤:

(一) 提取化合物 P-l、 P-2、 P-5、 P-6、 P-7、 P-3和 P-4

(1) 将香加皮药材用 95%乙醇回流提取三次, 减压浓缩提取液得到乙醇 浸膏, 加入水悬浮, 依次用氯仿和正丁醇萃取, 得到氯仿部位浸膏和正丁醇 部位浸膏, 氯仿部位浸膏经硅胶柱层析分离, 以石油醚 -丙酮体积比依次为 5:1、 2:1、 1:1、 0:1梯度洗脱得流分 Frl、 Fr2、 Fr3和 Fr4;

(2) 流分 Fr3经反相 C18柱层析,以甲醇-水梯度洗脱,体积比依次为 1:1、 2:1、 3:1、 4:1、 1:0, 得次流分 Fr3.1、 Fr3.2、 Fr3.3、 Fr3.4;

(3) 次流分 Fr3.4经反相 C18制备液相色谱, 以甲醇-水梯度洗脱, 体积比 依次为 2:3、 1:1、 2:1、 3:1、 4:1和 1:0, 得 P-l、 P-2、 P-5、 P-6; 流分 Fr4经 反相 C18制备液相色谱, 以甲醇-水梯度洗脱, 体积比依次为 3:7、 2:3、 1 : 1、 2: 1、 3:1和 4:1, 得 P-3、 P-4、 P-7;

(二) 提取化合物 P-8、 P-9、 P-10和 P-l l

(1) 将黑骨藤根用 95 %的乙醇室温浸提, 减压蒸馏浓缩成浸膏, 并用水 分散悬浮, 之后依次用石油醚、 乙酸乙酯和正丁醇萃取, 分别得到石油醚部 位浸膏、 乙酸乙酯部位浸膏和正丁醇部位浸膏;

(2) 将乙酸乙酯部位浸膏进行反相 C18柱层析, 用甲醇-水梯度洗脱, 体 积比依次为 1 :9、 2:8、 3:7、 4:6、 5:5、 6:4、 7:3、 8:2、 9:1和 1 :0, 得到 Frl-Fr6 六个流分;

(3) 流分 Fr5用 Sephadex LH-20除杂, 然后以氯仿 -丙酮体积比依次为 8: 1、 7:1、 6:1的洗脱剂进行硅胶柱层析得到 P-8、 P-9、 P-10和 P-l l。

6、如权利要求 1至 3中任一项所述的含有原酸酯基团的孕^烷糖苷类化 合物在制备免疫抑制剂中的用途。

7、 如权利要求 6所述的用途, 其中, 所述免疫抑制剂用于治疗和 /或预 防细胞 /器官移植后排斥反应或自身免疫性疾病。

8、如权利要求 7所述的用途, 其中, 所述自身免疫性疾病为多发性硬化 症、 类风湿关节炎和自身免疫性肝炎。

9、一种富含含有原酸酯基团的孕 烷糖苷的香加皮粗提物,其通过下述 方法得到:

将香加皮药材用 95%乙醇回流提取三次,减压浓缩提取液得到乙醇浸膏, 向乙醇浸膏加入水, 放置沉淀, 离心分离, 沉淀以石油醚洗涤, 再用乙醇溶 解、静置, 过滤, 取上清液, 配成 70%乙醇溶液, 进行大孔树脂柱色谱分离, 收集 90%乙醇的洗脱流分, 浓缩, 即得。

Description:
一类含有原酸酯基团的孕甾烷糖苷类化合物及 其用途

技术领域

本发明涉及一类含有原酸酯基团的孕 烷糖苷类化合物、 包含该类化合 物的药物组合物、 及其在制备免疫抑制剂中的用途, 更具体而言, 涉及一类 从杠柳属 (Periploca)植物中提取的含有原酸酯基团的孕 烷糖苷类化合物、包 含该类化合物的药物组合物、 及其在制备预防和 /或治疗细胞 /器官移植后免 疫排斥反应或自身免疫性疾病的免疫抑制剂中 的用途,自身免疫性疾病包括: 类风湿关节炎、 多发性硬化症和自身免疫性肝炎等。

背景技术

免疫抑制剂 (immunosuppressor) 是一类对免疫反应和免疫调节状态具 有抑制作用的药物, 不同的免疫抑制剂作用于免疫反应或免疫调节 过程的不 同环节。在临床上, 免疫抑制剂主要用于治疗和 /或预防自身免疫性疾病和细 胞 /器官移植后的排斥反应。免疫抑制剂主要分 以下几种:(1 )化学制剂类, 如烷化剂类的氮芥; (2 ) 激素类, 如糖皮质激素; (3 ) 真菌代谢产物, 如环 孢菌素 A (cyclosporin A, CsA); (4) 中药及其有效成分。

免疫抑制药物大多具有明显的毒副作用, 主要是骨髓抑制和肝、 肾毒性 等。 由于免疫抑制药物的作用是非特异的, 所以可导致整个机体免疫功能的 下降, 病原微生物感染增加, 长期应用可能提高肿瘤发病率。 因此, 寻找新 的高效低毒的免疫抑制剂具有重要意义。

杠柳属是萝摩科 (Asclepiadaceae)的一个小属,全世界约有 12种, 我国产 4种: 杠柳 (Periploca sepium Bunge)、 西南杠柳 (R forrestii Schltr)、 青蛇藤 [R calophylla (Wight) Falc.]和多花青蛇藤 (R floribunda Tsiang)。 杠柳, 又名狭叶 萝摩、 羊奶条等, 其根皮为传统中药香加皮 (北五加皮:), 能祛风湿、 壮筋骨、 强腰膝, 可用于治疗类风湿性关节炎、 筋骨痛等病症; 西南杠柳, 又名滇杠 柳, 黑骨藤 (黑骨头、 黑龙骨:)是植物西南杠柳的根或全株, 可舒筋活络、 祛 风湿, 治疗类风湿性关节炎、 跌打损伤、 胃痛、 消化不良、 闭经、 痢疾等。 发明内容

因此, 本发明的一个目的为提供由通式 I表示的含有原酸酯基团的孕甾 烷糖苷类化合物。

本发明的另一目的为提供包含治疗有效量的含 有原酸酯基团的孕 烷糖 苷类化合物的药物组合物。

本发明的又一目的为提供从杠柳属植物中提取 含有原酸酯基团的孕甾烷 糖苷类化合物的方法。

本发明的又一目的为提供含有原酸酯基团的孕 烷糖苷类化合物在制备 免疫抑制剂中的用途,

其中, 所述免疫抑制剂用于治疗和 /或预防细胞 /器官移植后排斥反应或 自身免疫性疾病, 所述自身免疫性疾病包括多发性硬化症、 类风湿关节炎和 自身免疫性肝炎等。

本发明通过生物活性跟踪分离, 从杠柳、 西南杠柳中分离出一系列含有 原酸酯基团的孕 烷糖苷类化合物, 该类化合物由如下通式 I表示:

通式 I 可为 H 或 4,6-二脱氧 -3-0-甲基 -Δ 3 -己酮糖基

(4,6-dideoxy-3-0-methyl-A 3 -hexosulosyl);

R 2 为由糖单元通过醚键连接构成的糖链片段 , 所述糖单元可选自但不限 大麻糖 (cymarose)、 卡那糖 ( canarose )、 竹桃糖 (oleandrose), 或上述单糖的酰化产物中 优选地, 通式 I中: 为11或 R 2

..、、、 ,、'、、" ,、、、。

、 、八。

洋地黄毒糖 加拿 Τ大麻糖 I 加拿大麻糖 I 2-乙酰基洋地黄糖

加拿大麻糖 II 卡那糖 I 加拿大麻糖 I 夹竹桃糖 更优选地, 本发明的含有原酸酯基团的孕 烷糖苷类化合物的具体化合 如下:

P-6: 为

P-7: Ri为

P-8: 为

P-9: Ri为 R 2 为 加拿大麻糖 卡那糖 加拿大麻糖 夹竹桃糖

P-10: Ri ¾ H, R 2 为 加拿大麻糖 卡那糖 加拿大麻糖 夹竹桃糖 ;

P-11 : Ri为 H, R 2

本发明的杠柳属植物中提取含有原酸酯基团 的孕 烷糖苷类化合物的方 法包括下列歩骤:

(一) 提取化合物 P-l、 P-2、 P-5、 P-6、 P-3、 P-4和 P-7

1、 香加皮药材用 95%乙醇回流提取三次, 减压浓缩提取液得到乙醇浸 膏, 加入水悬浮, 依次用氯仿和正丁醇萃取, 得到氯仿部位浸膏和正丁醇部 位浸膏,氯仿部位浸膏经硅胶 (200目:)柱层析分离,以石油醚-丙酮梯度洗脱 (体 积比为 5:1, 2:1, 1 :1, 0:1)得流分 Frl、 Fr2、 Fr3和 Fr4;

2、流分 Fr3经反相 C 18 柱层析分离, 以甲醇 -水梯度洗脱 (体积比为 1 : 1→ 1 :0)得次流分 Fr3.1、 Fr3.2、 Fr3.3、 Fr3.4;

3、次流分 Fr3.4经反相 C 18 制备液相, 以甲醇 -水梯度洗脱(体积比为 2:3 → 1 :0) 得 P-l、 P-2、 P-5、 P-6; 流分 Fr4经反相 C 18 制备液相色谱分离, 以 甲醇 -水梯度洗脱 (体积比为 3:7→4:1 ) 得 P-3、 P-4、 P-7 o

其中,反相 C 18 柱层析分离采用 Varian SD-1型号,配有 Merck NW25 C 18 色谱柱 ( 10 μιη, 20 mm 250 mm), 以及 ProStar 320 UV/Vis检测器。

(二) 提取化合物 P-8、 P-9、 P-10和 P-l l

1、 将黑骨藤根用 95 %的乙醇室温浸提, 减压蒸馏浓缩成浸膏, 并用水 分散悬浮, 之后依次用石油醚、 乙酸乙酯和正丁醇萃取, 分别得到石油醚部 位浸膏、 乙酸乙酯部位浸膏和正丁醇部位浸膏;

2、 将乙酸乙酯部位浸膏进行反相 C 18 柱层析, 用甲醇-水梯度洗脱, 体 积比依次为 1 :9、 2:8、 3:7、 4:6、 5:5、 6:4、 7:3、 8:2、 9:1 和 1 :0, 每个梯度 1L, 得到 Frl-Fr6六个流分;

3、 流分 Fr5用 Sephadex LH-20除杂 (即背景干扰物), 然后以氯仿-丙 酮 (体积比为 8: 1, 7:1, 6:1)为洗脱剂进行硅胶柱层析得到 P-8、 P-9、 P-10和 P-l l。 其中, 同一比例溶剂洗脱流分经过薄层色谱检测, 可以含有多个纯化 的化合物。

经多种体外、 动物体内试验确定, 本发明的含有原酸酯基团的孕甾烷糖 苷类化合物具有显著的体外免疫抑制活性, 并在多种自身免疫性疾病的动物 模型上表现出显著疗效, 例如, 其能够明显抑制 T细胞增殖; 显著抑制二硝 基氟苯 (DNFB)诱导的小鼠迟发型超敏反应 (DTH); 明显降低小鼠实验性自身 免疫性脑脊髓膜炎 (EAE) 的发病率、 减轻疾病的严重程度; 显著减轻牛 II 型胶原诱导的小鼠关节炎病变的严重程度及病 变关节组织各方面的病理改 变; 有效削弱伴刀豆蛋白 (ConA)引起的肝脏损伤, 降低血清中细胞因子水 平。

此外, 本发明提供了一种香加皮粗提物, 其通过下述方法得到: 将香加皮药材用 95%乙醇回流提取三次,减压浓缩提取液得到乙 醇浸膏, 向乙醇浸膏加入水离心, 沉淀以石油醚洗涤, 再用乙醇溶解、 静置, 过滤, 取上清液, 配成 70%乙醇溶液, 采用大孔树脂柱色谱分离, 收集 90%乙醇的 洗脱流分, 浓缩, 即得。

附图说明

图 1显示了化合物 P-1对小鼠实验性自身免疫性脑脊髓膜炎 (EAE) 的 影响(A:各组 EAE发病率; B:疾病评分; C:体重变化, *^<0.05 , **^<0.01 ) 0 图 2显示了化合物 P-2对小鼠实验性自身免疫性脑脊髓膜炎 (EAE) 症 状的影响 (A: 各组 EAE发病率; B: 疾病评分; C: 体重变化, *;?<0.05)。

图 3 显示了化合物 P-1 对小鼠关节炎病变严重程度的影响 (*/?<0.05, **;?<0·01 )。

图 4显示了化合物 P-1对小鼠关节炎病理改变的影响 (A: 正常组小鼠 踝关节组织切片 (400x ); B: 溶剂对照组小鼠踝关节组织切片 (400x ); C: P-1治疗组小鼠踝关节组织切片 (400x ) ; D: 正常组小鼠踝关节 CT断层扫 描图; E: 溶剂对照组小鼠踝关节 CT断层扫描图; F: P-1 治疗组小鼠踝关 节 CT断层扫描图)。 图 5显示了化合物 P-1对小鼠关节炎病理改变的影响 (A: 溶剂对照组 小鼠踝关节显微 CT; B: P-1治疗组小鼠踝关节踝关节显微 CT)。

图 6显示了化合物 P-1对 ConA引起的肝炎的保护作用 (A: 血清 ALT 水平; B: 小鼠生存率; C: 肝脏组织病理学检查; D: 病理学评分, *p<0.05, **ρ<0.01 , ***ρ<0·001 )。

图 7显示了化合物 P-1对肝炎小鼠血清细胞因子水平的影响 (A: 血清 中 IL-4的水平; B: 血清中 IFN-γ的水平, *p<0.05, **p<0.01 )。

图 8显示了香加皮粗提物 WJ-C对小鼠关节炎病变严重程度的影响。 具体实施方式

以下通过具体实施例来进一歩说明本发明。 应理解, 以下实施例仅用于 说明本发明而不用于限定本发明的范围。

实施例

实施例 1 含有原酸酯基团的孕 ^烷糖苷类化合物的制备

(一) 化合物 P-l、 P-2、 P-5、 P-6、 P-7、 P-3和 P-4的制备

粉碎、 干燥的香加皮药材 (15 kg)用 95%乙醇回流提取三次 (30 Lx3), 每 次 2小时, 减压浓缩提取液得到乙醇浸膏, 加入约 2 L的水悬浮, 依次用氯 仿和正丁醇萃取, 得到氯仿部位浸膏 (762.5 和正丁醇部位浸膏 (75.2 g)。 氯 仿部位经硅胶 (200目:)柱层析分离,以石油醚-丙酮梯度洗脱 (体积比依次为 5丄 2: 1, 1 :1, 0:1)得流分 Frl ( 601.3g)、 Fr2 ( 15.8g)、 Fr3 (48.2g) 和 Fr4 (3.6g)。 Fr3经反相 C 18 柱层析, 以甲醇 -水梯度洗脱 (体积比为依次为 1 :1, 2:1, 3:1, 4:1和 1 :0, 得次流分 Fr3.1、 Fr3.2、 Fr3.3、 Fr3.4, 其中 Fr3.4 (7.8g) 经反相 C 18 制备液相色谱, 以甲醇 -水梯度洗脱 (体积比依次为 2:3, 1 :1 , 2:1, 3:1, 4:1和 1 :0) 得 P-1 (2.0g) 、 P-2 ( 1.5g) 、 P-5 ( 18.7mg) 、 P-6 ( 14.6mg) 。 Fr4经反相 C 18 制备液相色谱, 以甲醇 -水梯度洗脱 (体积比依次为 3:7, 2:3 , 1 : 1, 2:1, 3:1和 4:1 ) 得 P-7 (33.0mg) 、 P-3 (40.1mg) 、 P-4 ( 13.0mg) 。 (其中, 取上述乙醇浸膏, 加入适量水搅匀放置, 离心分离沉淀, 沉淀以 石油醚洗涤, 再用乙醇溶解、 静置, 过滤, 取上清液, 配成 70%乙醇溶液, 采用大孔树脂柱色谱分离, 收集 90%乙醇的洗脱流分, 浓缩, 即为香加皮粗 提物 WJ-C, 用于实施例 6)。

(二) 化合物 P-8、 P-9、 P-10、 P-l l的制备

黑骨藤根 10 kg粉碎后, 用 95 %的工业乙醇室温浸提 (30 Lx3), 减压蒸 馏浓缩成浸膏, 用 2 L水分散悬浮后, 分别用石油醚、 乙酸乙酯和正丁醇依 次萃取, 得到石油醚部位浸膏 250 g, 乙酸乙酯部位浸膏 32.0 g, 正丁醇部位 浸膏约 200 g。 将乙酸乙酯部位浸膏 (32.0 g)进行反相 C 18 柱层析, 用甲醇-水 梯度洗脱 (体积比依次为 1 :9、 2:8、 3:7、 4:6、 5:5、 6:4、 7:3、 8:2、 9:1和 1 :0, 每个梯度 1L),得到六个流分 (Frl-Fr6)。 Fr5用 Sephadex LH-20除去背景干扰 物, 然后以氯仿 -丙酮 (体积比依次为 8:1, 7:1, 6:1)为洗脱剂进行硅胶柱层析得 到化合物 P-8 (14.1 mg), P-9 (29.4 mg), P-10 (54.0 mg) 和 P-l l (35.1 mg)。 其 中, 同一比例溶剂洗脱流分经过薄层色谱检测,可 以含有多个纯化的化合物。

P-1 : 分子式: C 72 H 114 0 27 , 分子量: 1411, 白色粉末, [a] D 24 -1.2 (c 1.4, CHC1 3 ); ¾ NMR (CDCI3) δ: 0.72 (3Η, s), 1.00 (3Η, s), 1.37 (3H, d, J= 6.5 Hz), 1.51 (3H, d, J = 6.8 Hz), 3.41, 3.42, 3.43, 3.44, 3.45 (均为 3H, s), 3.57 (3H, s), 3.67(1H, m), 3.70 (1H, q, J = 6.5 Hz ), 4.38 (1H, d, J = 8.0 Hz), 4.58 (1H, dd, J = 9.5, 1.5 Hz), 4.70 (1H, ddq, J = 6.8, 3.0, 0.5 Hz), 4.74 (1H, ά, J = 7.5 Hz), 4.76 (1H, dd, J = 10.0, 1.5 Hz), 4.92 (1H, άά, J = 10.0, 1.5 Hz), 4.94 (1H, ά, J = 0.5 Hz), 5.09 (1H, dd, J= 10.0, 8.0 Hz), 5.14 (1H, d, J= 7.5 Hz), 5.35 (1H, br s), 5.77 (1H, d, J= 3.0 Hz). 13 C NMR数据见表 1。

P-2: 分子式: C 65 H 106 O 24 , 分子量: 1271, 白色粉末, [a] D 24 -7.5 (c 0.08, CHCI3); ^ NMR (CDCI3) δ: 0.73 (3Η, s), 1.02 (3H, s), 1.31 (3H, d, J= 6.0 Hz), 1.37 (3H, d, J = 6.5 Hz), 2.07 (3H, s), 3.41, 3.42, 3.43, 3.44 (x 2) (均为 3H, s), 4.38 (IH, d, J = 6.5 Hz), 4.57 (IH, dd, J = 9.5, 1.5 Hz), 4.74 (IH, d, J = 7.5Hz), 4.76 (2H, dd, J= 10.0, 1.5 Hz), 4.92 (IH, dd, J= 10.0, 1.5 Hz), 5.08 (IH, dd, J = 8.0, 9.8 Hz), 5.13 (IH, d, J= 7.5 Hz), 5.40 (IH, br s). 13 C NMR数据见表 1。

P-3: 分子式: C 70 H 112 O 26 , 分子量: 1369, 白色粉末, [a] D 24 -3.08 (c 0.26, CHC1 3 ); l H NMR (CDCI3) δ: 0.72 (3H, s), 0.99 (3H, s), 1.36 (3H, d, J= 6.5 Hz), 1.50 (3H, d, J = 6.5 Hz), 3.43 (x 2), 3.44(x 2), 3.51 (均为 3H, s), 3.63 (3H, s), 4.27 (IH, d, J= 8.0 Hz), 4.57 (IH, dd, J= 9.5, 1.5 Hz), 4.70 (IH, ddq, J= 6.8, 3.0 Hz), 4.74 (IH, d, J = 7.6 Hz), 4.76 (2H, dd, J = 10.0, 1.5 Hz), 4.92 (IH, dd, J = 10.0, 1.5 Hz), 5.04 (IH, s), 5.13 (IH, d, J= 7.5 Hz), 5.36 (IH, br s), 5.77 (IH, d, J = 3.0 Hz). 13 C NMR数据见表 1。

P-4: 分子式: C 63 H 104 O 23 , 分子量: 1229, 白色粉末, [a] D 24 +8.1 (c 0.07, MeOH); l R NMR (CDC1 3 ) 3: 0.72 (3H, s), 1.00 (3H, s), 1.31 (3H, d, J= 6.0 Hz), 1.35 (3H, d, J= 6.5 Hz), 3.43 (x 2), 3.44 (x 2), 3.52 (均为 3H, s), 4.28 (IH, d, J = 7.7 Hz), 4.57 (IH, dd, J = 9.5, 1.4 Hz), 4.74 (IH, d, J = 7.5 Hz), 4.76 (x 2), 4.92 (均为 IH, dd, J = 9.6, 1.5 Hz), 5.10 (IH, άά, J = 10.0, 8.0 Hz), 5.13 (IH, ά, J = 7.5 Hz), 5.30 (IH, dd, J= 3.2, 1.2 Hz), 5.38 (IH, m). 13 C NMR数据见表 1。

P-5: 分子式: C 71 H 112 0 27 , 分子量: 1397, 白色粉末, [a] D 18 -9.9 (c 0.41, CHCI3); IR (KBr) v max 3454, 2935, 1749, 1716, 1637, 1454, 1375, 1313, 1238, 1157, 1095, 1066, 1003 cm" 1 ; ^ NMR (CDC1 3 ) 3: 0.72 (3H, s), 1.00 (3H, s), 1.33 (3H, d, J= 6.5 Hz), 1.46 (3H, d, J= 6.9 Hz), 2.02 (3H, s), 2.91 (t, 9.5 Hz), 3.36, 3.38 (x 2), 3.40, 3.58 (均为 3H, s), 4.34 (IH, d, J= 8.0 Hz), 4.45 (IH, d, J = 9.0 Hz), 4.53 (IH, d, J = 9.0 Hz), 4.69 (IH, d, 9.5 Hz), 4.88 (IH, d, J = 9.5 Hz), 5.09 (IH, d, J= 8.0 Hz), 5.31 (IH, br s), 5.72 (IH, d, 3.0 Hz). 13 C NMR数据见表 1。

P-6: 分子式: C 71 H 112 0 27 , 分子量: 1397, 白色粉末, [a] D 18 -3.0 (c 0.28, CHCI3); IR (KBr) v max 3448 , 2935 1751 1718 1637 1456 1375 1313 1238 1 157 1095 1059 1003 cm" 1 ; ^ NMR (CDC1 3 ) 3: 0.72 (3H, s), 1.00 (3H, s), 1.33 (3H, d, J= 5.8 Hz), 1.48 (3H, d, J = 6.6 Hz), 2.02 (3H, s), 3.38, 3.40 (x 2) : 3.42, 3.58 (均为 3H, s), 4.19 (IH, br s), 4.35 (IH, d, J = 8.0 Hz), 4.55 (IH, d, J = 9.0 Hz), 4.70 (IH, d, J = 9.5 Hz), 4.76 (IH, d, 9.5 Hz), 4.95 (IH, d, J = 9.2 Hz), 5.10 (IH, d, J= 7.6 Hz), 5.31 (IH, br s), 5.72 (IH, d, 3.0 Hz). 13 C NMR数据见表 1

P-7: 分子式: C 70 H 110 O 27 , 分子量: 1383, 白色粉末, [a] D 24 -14.0 (c 0.2, CHCI3); IR (KBr) v max 3489 , 2935 1745 1716 1637 1454 1375 1317 1240 1 157 1093 1058 1004 cm" 1 ; l R NMR (CDC1 3 ) 3: 0.70 (3H, s), 0.95 (3H, s), 1.33 (3H, d, J= 6.4 Hz), 1.49 (3H, d, J= 6.9 Hz), 2.05 (3H, s), 3.38, 3.42, 3.58 (均为 3H, s), 4.18 (IH, br s), 4.35 (IH, ά, J = 8.0 Hz), 4.50 (IH, d, J = 9.0 Hz), 4.55 (IH, d, J = 9.0 Hz), 4.95 (IH, d, J = 9.6 Hz), 5.10 (IH, d, J = 7.6 Hz), 5.31 (IH, br s), 5.72 (IH, ά, J = 3.0 Hz). 13 C NMR数据见表 1 HRESIMS mlz 1405.71 12 [M + Na] + (计算值: C 7 。H 11() 0 27 Na, 1405.7132)。

P-8 : 分子式: C 71 H 112 0 26 , 分子量: 1380, 白色粉末, [a] D 24 -6 (c 0.19, CHCI3); IR (KBr) v 3448, 2935, 1735, 1639, 1454, 1375, 1240, 1 163, 1059, 1005 cm" 1 ; ^ NMR (CDC1 3 ) 3: 0.70 (3H, s), 0.95 (3H, s), 1.29 (3H, d, J= 6.2 Hz) : 1.48 (3H, d, J = 6.8 Hz), 2.05 (3H, s), 3.37, 3.40 (x 2), 3.42, 3.60 (均为 3H, s), 4.50 (IH, d, J = 9.2 Hz), 4.55 (IH, d, J = 9.1 Hz), 4.70 (IH, d, J = 9.6 Hz), 4.75 (IH, d, J = 9.6 Hz), 4.90 (IH, d, J = 9.5 Hz), 5.10 (IH, d, J = 7.7 Hz), 5.31 (IH, br s), 5.75 (IH, s). 13 C NMR数据见表 1 HRESIMS mlz 1403.7330 [M + Na] + (计算值: C 71 H 112 0 26 Na, 1403.7340)。

P-9: 分子式: C 69 H 110 O 25 , 分子量: 1338, 白色粉末, [a] D 24 -17 (c 0.21, CHCI3); IR (KBr) v 3453, 2935, 1716, 1639, 1454, 1378, 1097, 1000, 1058, £1

°(9989Έ9

'ΒΝ εζ Ο H w 3 :潘鴛 4) + [ ¾ N + η\ S IS3¾H °ΐ 挲

W ¾WN D £l -(s Jq 'Ηΐ) Ζ£-ξ '(ZH L =f 'V 'Ηΐ) 0Γ5 ς·6 =f 'p ¾ΐ) 06 '(ΖΗ 9·6 = 'P 'Ηΐ) '(ZH 9·6 =f 'V 'Ηΐ) OL'P Γ6 = 'P 'Ηΐ) SS '(z H 6 =f 'V 'Ηΐ) 0S '(s ¾e ) 09Ύ 'ZV£ '(Z x) 0V£ 'ί£Ύ '(s ¾e) ^OT '(ZH

Γ9 =r'v ¾e) 6Π '(s ¾e) wo '(s ¾e) Ο Ό : ? ( ε ΐοαο) ¾ N H T 1110 ^ooi 0ΐ 'ΐ9ΐΐ '8d 'SAei 1 Ϊ 'ς£ί\ '££6Ζ '9ΡΡ£ 八 ¾I £ D D

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'm zz o ZM Z9 D :潘鴛 4) + i + n\ ZL^\ZZ\ S ISS^H °ΐ 翻

¾ N D £l "( s -iq 'Ηΐ) Ζί'ζ '( Ζ Η LL =f 'V 'Ηΐ) ΟΙ'ξ '( Ζ Η ξ'6 =f 'V 'Ηΐ) 06 X V6 =f 'V 'Ηΐ) 0 P '( Ζ Η 0·6 =f 'V 'Ηΐ) ξξ'Ρ X Ζ'6 =f 'V 'Ηΐ) Οζ'Ρ '( Ζ Η V6

=r'v Ήΐ) os '(s ¾e ) ζν Ϊ Χζ χ) ΟΡ '9£τ '(ΖΗ Ο·9 =Γ'Ρ Ήϋ ΐ£Ί '(ΖΗ

0·9 =Γ'Ρ 'Η£) 6ΖΊ '(s ¾e) P6V '(s 'Η£) Ο Ό : 9 ( £ \D D) ¾ N Η τ -^ ^οθΐ '660ΐ Ά^ΐΐ 'ΠΠ '9ί£\ '9ζ \ 'ζ ίΙ Ζ6Ζ '2ΡΡ£ 八 (JH¾) ¾Ι '( £ IDHD 'ee 3) Zl- α [ ] '86Π :畧 、 ' κ Ο ζ0ΐ Η ζ9 3 - - ^ 'Ol-d

°(1^ ·ΐ9Π '¾N S ¾ 0U H 69 D :潘鴛 4) + [ ¾ N + n\ PLZL-\9£\ S ISa^H °ΐ 挲 骈凝 ¾ N D £l '(s 'Ηΐ) 9 9 '(s Jq 'Ηΐ) I S '(ZH LL =f 'V 'Ηΐ) 0V '6 =f 'V 'Ηΐ) 06 '(z H V6 =f 'P 'Ηΐ) OL'P '(ZH 0·6 =f 'P 'Ηΐ) SS '(ζ Η 6 =f 'P 'Ηΐ) 0 'P V6 =f V 'Ηΐ) 0S '(s ¾e ) 09Ύ 'ZV£ '(Z x) 0V£ '9£Ύ 0·9 =f 'P ¾e) ΐ ΐ '(ZH ο·9 =r'v ¾e) 6Π '(s ¾e) S6 '(S ¾e) Ο Ό : 9 ( £ \D o) ¾ N H T -^ ^OOT

CZ0Z00/ll0ZN3/X3d 表 1 化合物 P-1~P-11的 13 C NMR数据 ( 100MHz, CDC1 3 )

Ρ^2 ? ? Ρ^5 Ρ^6 Ρ^7 Ρ^8 Ρ^9 Τ Ο Ρ

1 37.4 (t) 37.2 (t) 37.4 (t) 37.3 (t) 37.2 (t) 37.2 (t) 37.2 (t) 37.2 (t) 37.2 (t) 37.1 (t) 37.1

2 29.3 (t) 31.9 (t) 29.4 (t) 31.9 (t) 29.2 (t) 29.2 (t) 29.3 (t) 29.3 (t) 29.3 (t) 31.5 (t) 31.5

(d) 78.4 (d) 78.5 (d) 78.5 (d) 78.5 (d) 71.5 (d) 71.5 (

(t) 42.2 (s) 140.6 (d) 121.5 (t) 31.8 (d) 31.8 ( (d) 49.5 ( (s) 36.5 ( (t) 20.5 (t) 30.8 (s) 45.2 ( (d) 51.0 ( (t) 23.4 (t) 38.3 (s) 85.3 (

8 47-· (e

Si

∞ ^ S ^ ^ ¾ *> o o o

e a a a a ¾

CZ0Z00/ll0ZN3/X3d 加拿大麻 加拿大麻 加拿大麻 加拿大麻 卡那糖 I 加拿大麻 卡那糖 I 卡那糖 I 糖 II 糖 π 糖 π 糖 π 糖 π

1 99.8 (d) 99.8 (d) 99.7 (d) 99.7 (d) 101.3 (d) 98.5 (d) 100.3 (d) 101.5 (d)

2 35.6 (t) 35.6 (t) 35.6 (t) 35.6 (t) 38.3 (t) 35.6 (t) 38.3 (t) 38.5 (t)

3 77.6 (d) 77.6 (d) 77.6 (d) 77.7 (d) 69.4 (d) 76.7 (d) 69.3 (d) 69.5 (d)

4 82.5 (d) 82.5 (d) 82.5 (d) 82.5 (d) 87.7 (d) 83.4 (d) 87.6 (d) 88.0 (d)

5 68.5 (d) 68.5 (d) 68.5 (d) 68.5 (d) 70.3 (d) 68.0 (d) 70.3 (d) 70.4 (d)

6 18.2 (q) 18.3 (q) 18.2 (q) 18.2 (q) 17.7 (q) 18.0 (q) 17.7 (q) 17.8 (q)-OC 58.1 (q) 58.0 (q) 58.0 (q) 58.1 (q) 57.9 (q)

H Π3、

加拿大麻 加拿大麻 加拿大麻 加拿大麻 加拿大麻 洋地黄毒 洋地黄毒 加拿大麻 糖 III 糖 in 糖 in 糖 III 糖 π 糖 糖 糖 in

1 98.6 (d) 98.5 (d) 98.5 (d) 98.5 (d) 98.4 (d) 98.3 (d) 98.4 (d) 98.5 (d)

2 36.7 (t) 36.7 (t) 36.7 (t) 36.8 (t) 35.6 (t) 36.5 (t) 37.0 (t) 35.8 (t)

3 77.6 (d) 77.6 (d) 77.7 (d) 77.7 (d) 76.7 (d) 66.3 (d) 66.7 (d) 76.7 (d)

4 82.5 (d) 82.5 (d) 82.5 (d) 82.5 (d) 82.4 (d) 82.1 (d) 82.5 (d) 82.6 (d)

5 68.9 (d) 68.7 (d) 68.9 (d) 68.9 (d) 68.6 (d) 68.2 (d) 68.2 (d) 68.8 (d)

6 18.2 (q) 18.3 (q) 18.2 (q) 18.2 (q) 18.1 (q) 18.1 (q) 18.1 (q) 18.1 (q)-OC 58.0 (q) 58.0 (q) 58.0 (q) 58.1 (q) 58.1 (q) 58.4 (q) ri3

夹竹桃糖 夹竹桃糖 夹竹桃糖 夹竹桃糖 夹竹桃糖 夹竹桃糖 夹竹桃糖 夹竹桃糖

1 113.7 (s) 113.7 (s) 113.7 (s) 113.7 (s) 113.5 (s) 113.5 (s) 113.6 (s) 113.7 (s)

2 36.7 (t) 36.7 (t) 36.7 (t) 36.8 (t) 36.7 (t) 36.7 (t) 36.5 (t) 36.7 (t)

3 78.3 (d) 77.0 (d) 77.0 (d) 78.3 (d) 78.1 (d) 77.5 (d) 77.6 (d) 77.6 (d)

4 82.6 (d) 82.6 (d) 82.6 (d) 82.6 (d) 82.4 (d) 82.2 (d) 82.7 (d) 82.6 (d)

5 69.8 (d) 69.9 (d) 69.8 (d) 69.8 (d) 69.8 (d) 69.8 (d) 69.8 (d) 69.9 (d)

6 18.0 (q) 18.0 (q) 18.0 (q) 18.0 (q) 18.0 (q) 18.1 (q) 18.1 (q) 18.2 (q)-OC 57.7 (q) 57.7 (q) 57.7 (q) 57.7 (q) 57.4 (q) 57.5 (q) 57.5 (q) 57.6 (q)

H 3

卡那糖 卡那糖 卡那糖 卡那糖 卡那糖 II 卡那糖 卡那糖 II 卡那糖 II 卡那糖 II 卡那糖 II 卡那糖 II

1 100.8 (d) 100.8 (d) 100.8 (d) 100.8 (d) 100.7 (d) 100.7 (d) 100.8 (d) 100.8 (d) 100.8 (d) 100.8 (d) 100.8 (d)

2 38.4 (t) 38.4 (t) 38.4 (t) 38.4 (t) 36.7 (t) 36.8 (t) 36.8 (t) 36.9 (t) 36.9 (t) 36.9 (t) 36.9 (t)

3 77.0 (d) 78.3 (d) 78.3 (d) 77.0 (d) 77.0 (d) 78.1 (d) 78.2 (d) 78.3 (d) 78.2 (d) 78.2 (d) 78.3 (d)

4 79.2 (d) 79.2 (d) 79.2 (d) 79.2 (d) 79.1 (d) 79.0 (d) 79.1 (d) 79.2 (d) 79.1 (d) 79.1 (d) 79.2 (d)

5 70.0 (d) 70.0 (d) 70.0 (d) 70.0 (d) 69.8 (d) 69.6 (d) 69.7 (d) 69.8 (d) 69.7 (d) 69.7 (d) 69.8 (d)

6 17.0 (q) 17.0 (q) 17.1 (q) 17.1 (q) 17.9 (q) 17.9 (q) 17.9 (q) 18.0 (q) 18.0 (q) 18.0 (q) 18.0 (q)

3-OC 86.4 (t) 86.4 (t) 86.4 (t) 86.4 (t) 86.2 (t) 86.2 (t) 86.3 (t) 86.4 (t) 86.3 (t) 86.3 (t) 86.4 (t)

H 2 0

实施例 2 化合物 P-l至 P-l l的体外免疫抑制活性测试

淋巴细胞毒性评价: 脊椎法处死小鼠, 无菌取其脾脏, 磨碎制成单细胞 悬液, 用 MTT溶解液 (10 %SDS, 50 %DMF)去除红细胞后, 用含 10 %FBS 的 RPMI-1640培养液将细胞浓度调成 5xl0 5 个 /ml。96孔板中加入 5xl0 5 细胞 悬液、 200 μΐ RPMI-1640培养液和适当浓度的待测试样品, 放入 37°C、 5 % C0 2 培养箱中培养 48小时,在结束培养前 5小时,每孔加入 5 mg/ml MTT 18 μ1。 结束培养时, 每孔加入 90 μΐ MTT溶解液, 在培养箱中放置 6-7小时后, 用酶标仪于 570 nm处测定 OD 57() 值。

淋巴细胞增殖实验: 5xl0 5 个新鲜的脾脏细胞按照 37°C、 5 %C0 2 条件培 养 48小时, 培养液用 5 μ^ιηΐ的 ConA或者 LPS来诱导细胞的增殖, 加入适 当浓度的待测试样品以测试其对淋巴细胞增殖 的抑制活性。 以 3 H-TdR渗入 法定量测定细胞的增殖。在培养结束前 8个小时每孔加入 25 μα的 3 H-TdR, 培养结束, 用细胞收集仪收集细胞于玻璃纤维膜上, 加入闪烁液, 用液体闪 烁计数仪检测 DNA中 3 H-TdR渗入量来反映细胞增殖情况。

根据化合物对正常小鼠脾脏淋巴细胞的毒性数 据 OD 57Q 值计算 CC 5 。 ( 50 %细胞毒性浓度),根据化合物对正常小鼠脾 淋巴细胞增殖的抑制作用计算 IC 50 ( 50%抑制浓度)。 安全指数 (safety index,SI)=CC 5 o/IC 5 o, 是评价化合物安 全性的主要参数, SI值越大, 化合物越安全。

测试结果如表 2所示。

表 2本发明中化合物的体外免疫抑制活性测试结

Τ细胞增殖抑制

化合物编号 ( 50 (μΜ) -

Κ 50 (μΜ) SI (选择指数) 雷帕霉素 0.19 环孢霉素 0.27

P-1 18.7 0.51 36.7

P-2 10.1 0.64 15.8

P-3 15.7 0.82 19.1

P-4 4.0 1.13 3.5

P-5 7.78 2.71 2.9

P-6 3.51 0.46 7.6

P-7 9.4 1.01 9.3

P-8 48.2 1.32 36.5

P-9 6.9 0.52 13.3

P-10 15.7 0.82 19.1

P-11 12.3 1.97 6.2

结果表明, 本发明的化合物淋巴细胞毒性低, 对淋巴细胞的增殖具有显 著抑 。 并且, 从表 2中可以看出, 在本发明的化合物中, 无论 为11 或为 对相应化合物的免疫抑制活性均无明显影响。 实施例 3 化合物 P-1和 Ρ-2对自身免疫性脑脊髓膜炎动物模型的治疗 用

以 MOG 35 _ 5 J*段免疫 C57BL/6雌鼠以建立急性诱导实验性自身免疫性 脑脊髓膜炎 (EAE) 模型, 从免疫当天起给 C57BL/6小鼠 (10只 /组) 口服 等体积的 P-l ( 50mg/kg/天、 25mg/kg/天) 或 P-2 ( 10mg/kg/天) 、 阳性对照 药 选 择 一 种 新 型 免 疫 抑 制 剂 FTY720 ( 化 学 名 2-amino-2 [2-(4-octylphenyl)ethyl] -1,3- propanediol hydrochloride, 2 -氨基- 2 [2

- (4 -辛基苯基)乙基 -1]-1,3-丙二醇盐酸盐) (0.5mg/kg/天) 或溶剂对照。 每 天每只小鼠按照所定标准评分(0分: 没有发病迹象; 1分: 尾巴无力或后肢 无力; 2分: 尾巴无力和后肢无力; 3分: 后肢部分瘫痪; 4分: 后肢完全瘫 痪; 5分: 处于濒死状态或死亡) 和称重。

结果如图 1、 图 2所示 (A: 各组 EAE发病率; B: 疾病评分; C: 体重 变化, *;?<0.05, **^<0.01 ) , 研究结果显示, 模型组小鼠 100%发病, 疾病 症状严重。 相反, P-l 50mg/kg和 25mg/kg给药组, P-2 10 mg/kg给药组小鼠 发病率明显降低, 而且发病时间延迟 (图 1A、 IB; 图 2A、 2B )。 此外, EAE 发病的另外一个客观指标是体重减轻, P-l、 P-2口服给药能明显阻止小鼠体 重下降 (图 1C ; 2C), 实验重复 3次, 得到类似结果。 这些结果提示, P-1和 P-2能够明显降低 EAE的发病率, 减轻疾病的严重程度。 实施例 4 化合物 P-1对实验性类风湿性关节炎动物模型的治疗作 用 采用牛 II型胶原 (CII) 诱导 DBA/1小鼠关节炎模型。 CII溶于 0.1M醋 酸溶液, 于 4°C过夜。 实验当天将等体积的含结核分枝杆菌菌株 (Mycobacterium tuberculosis strain) H37Rv的 CFA与 CII胶原充分乳化混匀, 以 250μ 8 乳化剂于 DBA/1小鼠尾基部进行致敏, 3周后以同样剂量的乳化剂 于尾部进行攻击。 在攻击后一周确认模型小鼠发病, 开始每天口服灌胃给药 1次, 连续 2周, 给药剂量 20mg/kg。 P-l治疗组在以 CII第二次免疫攻击小 鼠后的第 7天开始到第 21天实验结束,每天观察溶剂对照组和 P-1治疗组中 的每只小鼠关节炎病变严重程度。关节病变的 严重程度通过评分标准(0分: 正常; 1分: 轻度红肿或足趾关节红肿; 2分: 中度红肿并延伸至整个足部; 3分: 较重红肿并延伸至踝关节; 4分: 趾、 足、 踝均严重红肿, 消退后关节 强直) 评定确定, 每一肢体关节炎评分指数在 0-4分之间, 结果以四肢评分 总和的平均值形式表示。 在第二次免疫攻击后 21天, P-1给药 2周后, 取各 组小鼠后肢, 固定于中性福尔马林溶液中, 石蜡包埋, 切片, 作苏木精 -伊红 Hematoxylin & eosin)染色, 光镜下观察病变关节组织的病理改变, 根据病变 组织的病变程度进行评分。 图 3为化合物 P-1对小鼠关节炎病变严重程度的 影响 (*;?<0.05, **^<0.01 ) 。 阳性对照药为氨甲喋吟 (MTX) 。 图 4、 图 5 为 P-1对小鼠关节炎病理改变的影响, 其中 4A为正常组小鼠踝关节组织切 片(400x ) ; 4B为溶剂对照组小鼠踝关节组织切片(400x ); 4C为化合物 P-1 治疗组小鼠踝关节组织切片 (400x ); 4D为正常组小鼠踝关节 CT断层扫描 图; 4E为溶剂对照组小鼠踝关节 CT断层扫描图; 4F为 P-1治疗组小鼠踝关 节 CT断层扫描图。 图 5A为溶剂对照组小鼠踝关节显微 CT; 图 5B为 P-1 治疗组小鼠踝关节显微 CT。

实验结果表明, P-1 口服能够显著减轻关节炎病变的严重程度 (图 3 ), 显著减轻病变关节组织各方面的病理改变 (图 4、 图 5), 溶剂对照组小鼠病 变部位骨关节破坏, 血管裔形成, 滑膜增生, 周围软组织中大量炎症细胞浸 润 (图 4B), 出现明显骨溶解现象, 后肢各部位骨骼骨密度下降, 踝关节骨 组织严重变形(图 4E)。 P-1能够显著减轻骨溶解现象, 无明显骨密度下降现 象, 关节部位无明显病理改变 (图 4C、 4F)。 实施例 5 化合物 P-1对 ConA诱导的自身免疫性肝炎模型的预防和治 疗作用

采用 ConA诱导的肝炎模型。 将 ConA溶解于生理盐水, 在小鼠肝损伤 实验中, 将 ConA配制成 15 mg/kg浓度; 在小鼠生存率实验中, 将 ConA配 制成 20 mg/kg浓度。 配制的 ConA生理盐水溶液过 0.45μιη滤膜。 小鼠肝损伤实验: 以生理盐水为对照, 化合物 P-1按 10 mg/kg的剂量以 腹腔注射的方式提前给药四次(即在 ConA注射前倒数 3, 2, 1天和 1小时)。 在小鼠尾静脉注射 0.2 ml的 15 mg/kg的 ConA后的不同时间点收集小鼠血清, 检测丙氨酸转氨酶 (ALT)水平。 结果如图 6A所示, 模型组小鼠的血清 ALT 水平在注射 ConA ( 15 mg/kg) 后 3小时开始升高, 12小时到达高峰, 然后 再下降; P-1治疗组在各时间点均可以显著降低 ALT水平, 特别是在 6, 12 和 24小时。

小鼠生存实验: 在小鼠尾静脉注射 0.2 ml 的致死剂量 (20 mg/kg) 的 ConA, 检测 P-1是否能够提高小鼠的生存率。 结果如图 6B所示, 在注射致 死剂量的 ConA (20 mg/kg) 后, 模型组小鼠在 9小时内全部死亡, 而此时 P-1治疗组小鼠生存率为 60%;在 48小时后, P-1治疗组小鼠生存率为 40%。

肝脏组织学检查结果显示出 P-1可以显著减缓 ConA引起的肝脏损伤。 如图 6C所示, 在溶剂治疗的肝炎小鼠中, 肝脏出现大面积坏死和炎性细胞 浸润; 10 mg/kg P-1预防给药明显缓解肝细胞坏死的症状。 病理学评分结果 也可以看出 P-1对肝脏坏死和炎性细胞浸润具有显著保护作 用 (图 6D)。

根据报道,小鼠在对 ConA的应答中, NKT细胞释放了大量的细胞因子, 包括 IL-4, IL-5 , IFN-γ以及 TNF-α, 各细胞因子出现和达到高峰的时间有所 不同。 IL-4和 IFN-γ被证明是在 ConA诱导的小鼠肝损伤的发生发展过程中 起着关键作用的细胞因子, 因此我们着重检测了 P-1是否能够影响这两种细 胞因子的水平。 如图 7所示, 在注射 ConA后, P-1预先给药治疗组在 2小 时和 6小时均能降低血清中 70%的 IL-4 水平; 在 6小时和 12小时能分别降 低血清中 60%和 80%的 IFN-γ水平。

实施例 6 香加皮粗提物 WJ-C对实验性类风湿性关节炎动物模型的治 疗作用

实验动物来源:购自中国科学院上海实验动物 中心,动物生产许可证号: SCXK (沪) 2007-0005

主要试剂: RPMI-1640培养基购自 GibcoBRL公司 ( Life Technologies, Grand Island, NY, USA) ; 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS )购自 Hyclone 公司(Logan, Utah, USA);牛 II型胶原购自 Collagen Research Center ( Tokyo, Japan) ;弗氏完全佐剂含 Mycobacterium tuberculosis strain H37Rv,购自 Wako Pure Chemical Industries Ltd ( Osaka, Japan)。 刀豆蛋白 A (concanavalin A, Con A) 购自 Sigma公司。 [甲基 -3H]胸腺嘧啶核苷 (TdR) 购自中国科学院上 海应用物理研究所 (原上海原子核研究所) 放药中心。

采用牛 II型胶原 (CII) 诱导 DBA/1小鼠关节炎模型。 CII溶于 0.1M醋酸溶 液, 于 4°C过夜。 实验当天将等体积的含结核分枝杆菌菌株 (Mycobacterium tuberculosis strain) H37Rv的 CFA与 CII胶原充分乳化混匀,以 25(^g乳化剂 于 DBA/1小鼠尾基部进行致敏,3周后以同样剂量的 乳化剂于尾部进行攻击。 在攻击后一周确认模型小鼠发病, 开始进行连续 2周的口服给药治疗 [WJ-C: 12.5mg/kg、 25mg/kg、 52mg/kg; 氨甲喋吟 (MTX): lmg/kg]。 WJ-C治疗组在 以 CII第二次免疫攻击小鼠后的第 7天开始到第 21天实验结束,每天观察溶 剂对照组和 WJ-C治疗组中的每只小鼠关节炎病变严重程度 关节病变的严 重程度通过评分标准 (0分: 正常; 1分: 轻度红肿或足趾关节红肿; 2分: 中度红肿并延伸至整个足部; 3分: 较重红肿并延伸至踝关节; 4分: 趾、足、 踝均严重红肿, 消退后关节强直)评定确定, 每一肢体关节炎评分指数在 0-4 分之间, 结果以四肢评分的总和表示。 图 8为 WJ-C对小鼠关节炎病变严重 程度的影响, 结果显示, WJ-C浓度依赖性抑制小鼠关节炎的发展。