OBJETO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se relaciona con compuestos que comprenden una estructura central de benzopirano prenilado. Dichos compuestos presentan actividad como agonistas de PPARa, PPARY, O actividad dual agonista de PPARa y PPARY. La invención se refiere por tanto compuestos con dicha estructura benzopirano prenilado de fórmula I, sus composiciones farmacéuticas, primer uso médico, así como el uso de compuestos de estructura benzopirano prenilado en el tratamiento de enfermedades que responden a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARY. Dichas enfermedades son desórdenes tales como diabetes tipo 2 (DT2), obesidad, síndrome metabólico, desórdenes cardiovasculares, dislipidemias, tales como hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia familiar (grave y moderada), quilomicronemia primaria, la disbetalipoproteinemia familiar o la hiperlipoproteinemia, inflamación y enfermedades neurodegenerativas, tales como el Parkinson, Alzheimer o la esclerosis lateral amiotrófica (ALS).

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los receptores activadores de la proliferación de peroxisomas (PPAR) pertenecen a la familia de receptores hormonales nucleares. Existen tres tipos de PPAR: PPARa (NR1C1), PPARb/d (NUC1 ; NR1C2), y PPARY (NR1 C3). Todos actúan como heterodímeros con receptores del ácido 9-cis-retinoico (receptor X retinoide; RXR) y ejercen un papel fundamental en la regulación de diversas vías metabólicas, incluyendo la biosíntesis de lípidos y metabolismo de la glucosa, así como en la diferenciación y proliferación celular y apoptosis (Cheang et ai, 2015, Ahmadian et ai, 2013 y Tan et al., 2017).

Los PPAR se consideran potentes herramientas terapéuticas en el control de diferentes patologías, tales como la diabetes tipo 2 (DT2), obesidad, hiperlipidemia, desórdenes cardiovasculares, inflamación y enfermedades neurodegenerativas. Además, los PPAR tienen una importancia adicional ya que están implicados en el control de procesos inflamatorios, por lo que pueden regular la inflamación, función vascular, y el remodelado vascular (Cheang et al., 2015, Ahmadian et al., 2013 y Tan et al., 2017).

Los PPARa se encuentran principalmente en hígado, riñones, corazón, músculo y tejido adiposo, y juegan un papel fundamental en la oxidación de ácidos grasos y el metabolismo de las lipoproteínas. PPARy predomina fundamentalmente en tejido adiposo, macrófagos, monocitos, células intestinales, músculo esquelético y endotelio. Están relacionados con el metabolismo lipídico, adipogénesis, homeostasis de la glucosa, y sensibilización a la insulina.

Los ligandos PPAR y en particular los agonistas PPARa y PPARy, inhiben la activación de la expresión de genes de la inflamación y pueden interferir negativamente con vías de señalización de factores de transcripción proinflamatorios en células vasculares e inflamatorias.

Los PPARa son activados por los compuestos de estructura fibrato: fenofibrato, clorfibrato, benzafibrato, y compuestos similares tales como WY-14643:

Fenofibrato (agonista PPARa) WY- 14643 (agonista PPARα)

Los agonistas de PPARa son capaces de disminuir los niveles de triglicéridos y aumentar HDL-c, siendo muy efectivos en el tratamiento de hipertrigliceridemia. ¹

Entre los ligandos de PPARy conocidos de estos receptores destacan los agonistas de tipo tiazolidinedionas (TZD), entre los que se encuentra rosiglitazona y pioglitazona, que se han utilizado en clínica para el tratamiento de DT2 debido a su capacidad de disminuir los niveles de glucosa en sangre y mejorar la sensibilidad a la insulina (Ahmadian et al., 2013).

Rosiglitazona (agonista PMRy)

El desarrollo de agonistas de PPARa o de PPARy, o de agonistas duales de PPARa/PPARy, ha llevado a la síntesis de una nueva clase de candidatos con potencial terapéutico (Cheang et al., 2015 y Tan et al., 2017). De hecho, los agonistas duales PPARa/g se consideran compuestos más potentes para corregir la homeostasis de lípidos y de glucosa en DT2 y síndrome metabólico, que los agonistas selectivos (Tan et al., 2017). A pesar de la eficacia clínica de los agonistas PPARa y PPARy en el tratamiento de las dislipemias y DT2, respectivamente, la aparición de numerosos efectos adversos ha limitado el uso de estos agonistas selectivos, obligando la retirada de numerosos fármacos. En particular, los agonistas PPARa pueden producir un aumento en los niveles de creatinina y transaminasas, y más raramente miopatía, mientras que los agonistas PPARy están relacionados con aumento de peso, edema e infarto de miocardio (Cheang et al., 2015). La posibilidad de encontrar un único compuesto capaz de activar los dos receptores PPARa y PPARy, agonista dual, se presenta como una alternativa potencial en el tratamiento de la DT2 y el síndrome metabólico, con menores efectos secundarios (Cheang et al., 2015 y Tan et al., 2017). Recientemente se ha aprobado el uso de dos agonistas duales PPARa/g pertenecientes al grupo de los glitazares, saroglitazar en la India (Lipaglyn™, por el centro de investigación Zydus Cadila) y lobeglitazona en Corea (Duvie™, por Chong Kun Dang), para el control lipídico y glucémico (Tan et al., 2017).

Saroglitazar (agosista dual PPARα/γ)

Sin embargo, otros agonistas duales como farglitazar y muraglitazar se han retirado del mercado debido a sus efectos secundarios de edema, infarto de miocardio, ictus y fallo cardiaco, así como aleglitazar (en fase clínica II), ragaglitazar y tesaglitazar ya que han mostrado carcinogeneicidad en modelos de roedores y un aumento de la creatinina en plasma (Tan et al., 2017).

El desarrollo de agonistas duales hPPARa y hPPARy permite combinar las propiedades de los agonistas del PPARa (fibratos) sobre la regulación del metabolismo lipídico incluyendo disminución de triglicéridos (TG), con el efecto adicional de mejorar la sensibilidad a la insulina que producen los agonistas del PPARy (TZD). Generalmente, estos ligandos duales hPPARa/g han mostrado en modelos animales mayor eficacia y menor toxicidad en el tratamiento de disfunciones del metabolismo, que la utilización de compuestos selectivos para cada uno de los receptores. De hecho, estudios clínicos muestran que agonistas duales PPARa/g disminuyen la resistencia a la insulina en diabetes tipo 2, los valores de glucemia y TG en plasma, y participan en el control de la inflamación vascular. Por lo tanto, la búsqueda de agonistas duales PPARa/g es importante para el tratamiento de diversas disfunciones metabólicas como es síndrome metabólico, DT2 y enfermedades cardiovasculares. Por todo ello, existe la necesidad de desarrollar agonistas de PPARa y/o g que muestren mayor eficacia que los actuales, y/o que además muestren menor toxicidad.

DESCRIPCIÓN

La presente invención describe compuestos agonistas de PPARa y/o PPARy y composiciones farmacéuticas que los comprenden. Dichos compuestos, y las composiciones que los comprenden son útiles, en el tratamiento de enfermedades que responden a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy. Dichos compuestos son, por tanto, útiles en el tratamiento de desórdenes cardiovasculares, diabetes tipo 2 (DT2), obesidad, síndrome metabólico, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, quilomicronemia primaria, hiperlipoproteinemia, disbetalipoproteinemia familiar, inflamación y enfermedades neurodegenerativas, tales como el Parkinson, Alzheimer o la esclerosis lateral amiotrófica (ALS). La presente invención describe, asimismo, los usos de dichos compuestos agonistas de PPARa y/o PPARy y de las composiciones farmacéuticas que los comprenden, en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy.

Una realización de los compuestos agonistas de PPARa y/o PPARy descritos se refiere a un compuesto de formula general I, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo:

donde

R ₁ se selecciona independientemente entre H o un grupo protector de un fenol;

R ₂ se selecciona independientemente entre un grupo alquil-éster de estructura:

un derivado de un grupo prenilo de estructura:

o un grupo acilo -C(0)0R ^b , donde R ^b es un grupo C _1-6 alquilo,

en donde

A se selecciona independientemente entre un átomo de O, un átomo de S o un grupo NR ₇ , donde R ₇ se selecciona independientemente entre H, ORs o un grupo C _1-6 alquilo, y donde R ₃ es un grupo H o un grupo C _1-6 alquilo;

R ₅ se selecciona independientemente entre H o un grupo protector de ácido carboxílico;

R ₆ es C _1-6 alquilo o OR ₉ donde R ₉ es C _1-6 alquilo;

y donde

- R ₃ es H o un grupo C _1-6 alquilo;

- R ₄ es un grupo C _1-6 alquilo o un alcóxido.;

- R ₁₀ se selecciona independientemente entre un grupo C _1-6 alquilo, alilo, alquilamina, alquilamida, alquilarilo, alquiléter, haloalquilo, sililo, carbamato, alquilsulfona o haloalquilsulfona.

En una realización de la presente invención cuando R ₁ es H y R ₃ es metilo, R ₅ es distinto de H o metilo, y cuando R ₁ es metilo y R ₃ es metilo, R ₅ es distinto de H o metilo.

Una realización se refiere a un compuesto de formula general I, descrito anteriormente, a sus enantiómeros, isómeros E,Z y sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

A efectos de la presente invención se define el término“grupo protector de un fenol” como grupos que sustituyen al H del grupo fenol OH para evitar que éste sea reactivo o bien grupos que favorecen la farmacodinamia y farmacocinética de la molécula. Son ejemplos no limitantes de grupos protectores de fenol, entre otros: C _1-6 alquilo (p.ej. metilo, etilo, propilo, etc.); alilo; alquilamina (ej. metil- isoquinoleína); alquilamida (p.ej. acetamida); alquilarilo (p.ej. bencilo, p-fluorobencilo, p-metoxibencilo); alquil-éter (p.ej. 2-metoxietoximetil); halo-alquilo (p. ej. trifluorometilo, fluoroetilo, cloroetilo); sililo (p.ej. alquiltrimetilsilano, aliltrimetilsilano); carbamato C(0)NR _m R , donde R _m y/o R _p son cada uno e independientemente H, C _1-6 alquilo o arilo; un grupo acilo (p.ej. benzoílo), una alquilsulfona o una halo-alquilsulfona (p.ej. trifluorometilsulfona).

En una realización de la presente invención el grupo R ₁ es un grupo protector de un fenol que se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H; C _1-6 alquilo; alilo; alquilamida; alquilamina; alquilarilo; alquil-éter; halo-alquilo; sililo; C(0)NR _m R _P , donde R _m y/o R _p son cada uno e independientemente H, C _1-6 alquilo o arilo; acilo C(0)R ^a , donde R ^a es un grupo arilo; alquilsulfona o halo-alquilsulfona.

En una realización R ₁ se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, C _1-6 alquilo, alilo, alquilamida, alquilarilo, alquil-éter, alquilbenzoilo, halo-alquilo, sililo, halo- alquilsulfona o un grupo acilo -C(0)R ^a , donde R ^a es un grupo arilo.

En otra realización R ₁ se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, C _1-6 alquilo, alquilamida, alquilarilo, o un grupo acilo -C(O)R ^a , donde R ^a es un grupo arilo.

El término “grupo protector de un ácido carboxílico” se define, a efectos de la presente invención, como grupos que sustituyen al H del grupo ácido carboxílico -COOH para evitar que éste sea reactivo o bien grupos que favorecen la farmacodinamia y farmacocinética de la molécula. Son ejemplos no limitantes de grupos protectores de ácido carboxílico, entre otros: C _1-6 alquilo, alilo, alquilamida, alquilamina, alquilarilo, alquil-éter, alquil-éster, halo-alquilo, sililo, carbamato C(0)NR _m R _P , donde R _m y/o R _p son cada uno e independientemente H, C _1-6 alquilo o arilo, acilo C(0)R ^a , donde R ^a es un grupo arilo, alquilsulfona o halo-alquilsulfona.

En una realización R ₅ se selecciona independientemente entre H; C _1-6 alquilo; alilo; alquilamida; alquilamina; alquilarilo; alquil-éter; halo-alquilo; sililo; C(0)NR _m R _P , donde R _m y/o R _p son cada uno e independientemente H, C _1-6 alquilo o arilo; acilo; alquilsulfona o halo- alquilsulfona.

En una realización R ₅ se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, C _1-6 alquilo, alquilarilo o alquil-éster.

En otra realización R ₅ se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, C _1-6 alquilo, arilo, alquilarilo, alquil-éter, alquil-éster, alquilsulfona, halo-alquilo, sililo, halo- alquilsulfona.

Una realización de la invención se refiere a un compuesto de formula general I, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo:

donde

- R ₁ se selecciona independientemente entre H; C _1-6 alquilo; alilo; alquila ida; alquila ina; alquilarilo; alquil-éter; halo-alquilo; sililo; C(0)NR _m R , donde R _m y/o R _p son cada uno e independientemente H, C _1-6 alquilo o arilo; acilo C(0)R ^a , donde R ^a es un grupo arilo; alquilsulfona o halo-alquilsulfona;

- R ₂ se selecciona independientemente entre un grupo alquil-éster de estructura:

un derivado de un grupo prenilo de estructura:

o un grupo acilo -C(0)0R ^b , donde R ^b es un grupo C _1-6 alquilo, en donde

A se selecciona independientemente entre un átomo de O, un átomo de S o un grupo NR ₇ , donde R ₇ se selecciona independientemente entre H, ORs o un grupo C alquilo; y donde Rs es un grupo H o un grupo C _1-6 alquilo;

R ₅ se selecciona independientemente entre H; C _1-6 alquilo; alilo; alquilamida; alquilamina; alquilarilo; alquil-éter; halo-alquilo; sililo; C(0)NR _m R _p , donde R _m y/o R _p son cada uno e independientemente H, C _1-6 alquilo o arilo; acilo; alquilsulfona o halo-alquilsulfona;

R ₆ es C _1-6 alquilo o OR ₉ donde R ₉ es C _1-6 alquilo;

y donde

- R ₃ es H o un grupo C _1-6 alquilo;

- R ₄ es un grupo C _1-6 alquilo o un alcóxido.;

- R ₁₀ se selecciona independientemente entre un grupo C _1-6 alquilo, alilo, alquila ina, alquila ida, alquilarilo, alquiléter, haloalquilo, sililo, carba ato, alquilsulfona o haloalquilsulfona.

En una realización de la presente invención cuando R ₁ es H y R ₃ es metilo, R ₅ es distinto de H o metilo, y cuando R ₁ es metilo y R ₃ es metilo, R ₅ es distinto de H o metilo.

A efectos de la presente invención, un compuesto de fórmula I incluye todos los estereoisómeros de dicha fórmula I.

El término“estereoisómero” se refiere, a efectos de la presente invención a moléculas que tienen la misma fórmula molecular y la misma secuencia de átomos unidos (misma constitución), con los mismos enlaces entre sus átomos, pero que difieren en la orientación tridimensional de sus átomos en el espacio. Enantiómeros y diasterómeros son dos tipos diferentes de estereoisómeros.

El término“enantiómero” se refiere, a efectos de la presente invención, a dos estereoisómeros que son imágenes especulares y no superponibles entre sí.

En particular, una realización de la presente invención comprende los enantiómeros R y S de los compuestos de fórmula I, en los que dichos enantiómeros son los 2 enantiómeros posibles respecto a la posición C-2 del núcleo benzopirano, incluyendo, por tanto, la configuración R y S del radical R ₁₀ .

El término“diasterómero” se refiere, a efectos de la presente invención, a dos estereoisómeros que no son imágenes especulares. Los diasterómeros incluyen compuestos meso, isómeros E/Z e isómeros ópticos no enantioméricos.

Los isómeros E/Z se refieren a compuestos que comprenden enlaces doble C=C, es decir alquenos o cicloalquenos. Si en un enlace doble C=C los dos sustituyentes de mayor prioridad, de acuerdo con las reglas de la IUPAC (Unión Internacional de Química Pura y Aplicada), están en el mismo lado, la disposición es Z. En cambio, si están en lados opuestos la disposición es E. Una realización se refiere a un compuesto de formula general I, descrito anteriormente, a sus enantiómeros, isómeros E,Z y sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

Una realización comprende el enantiómero R respecto a la posición C-2 del núcleo benzopirano.

Otra realización comprende el enantiómero S respecto a la posición C-2 del núcleo benzopirano.

Una realización comprende el isómero E respecto al doble enlace de la posición C-‘3 de la cadena lateral prenilada.

Una realización comprende el isómero Z respecto al doble enlace de la posición C-‘3 de la cadena lateral prenilada.

El término sales farmacéuticamente aceptables, a efectos de la presente invención, se refiere a cualquier sal que administrada a un paciente es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el compuesto en cuestión. Dichas sales son preferentemente sales de adición de ácidos orgánicos o inorgánicos, o de bases orgánicas o inorgánicas. Ejemplos de sales de adición de ácidos incluyen, pero no se limitan a, sales de adición de ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, cloruro, bromuro, yoduro, sulfato, nitrato, fosfato, o sales de adición de ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, acetato, trifluoroacetato, maleato, fumarato, citrato, oxalato, succinato o tartrato. Ejemplos de sales de adición de bases incluyen, pero no se limitan a, sales de adición de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, sodio, potasio, calcio o amonio, o sales de adición de bases orgánicas tales como, por ejemplo, etilendiamina, etanolamina, N,N-dialquiletanolamina, trietanolamina y sales básicas de aminoácidos. Los procedimientos de formación de sales son procedimientos convencionales en el estado del arte.

El término “C _1-6 alquilo” se refiere, a efectos de la presente invención, a una cadena hidrocarbonada de 1 a 6 átomos de carbono, completamente saturada, que puede ser lineal o ramificada.

El término “halo-alquilo” se refiere, a efectos de la presente invención, a una cadena hidrocarbonada, que puede ser lineal o ramificada, en la que al menos un H se encuentra sustituido por un átomo de un halógeno.

El término“alilo” se refiere, a efectos de la presente invención, a una cadena hidrocarbonada, que puede ser lineal o ramificada, que comprende al menos un grupo -CH=CH-CH2-.

El término “alquilamida” se refiere, a efectos de la presente invención, a una cadena hidrocarbonada, que puede ser lineal o ramificada, sustituida con un grupo amida. El término “alquilamina” se refiere a efectos de la presente invención, a una cadena hidrocarbonada, que puede ser lineal o ramificada, sustituida con un grupo amino.

El término“arilo” se refiere, a efectos de la presente invención, a grupo derivado de un hidrocarburo aromático que se forma al extraer un átomo de hidrógeno de un anillo aromático en dicho hidrocarburo aromático. A efectos de la presente invención dichos grupos arilo pueden encontrarse opcionalmente sustituidos. Ejemplos de sustituciones no limitantes son OH, alcóxido, alquilo, halógeno, alquilo halogenado, ciano, tiol, amina o alquilamina.

El término “alquilarilo” se refiere, a efectos de la presente invención, a una cadena hidrocarbonada sustituida con un grupo arilo, que a su vez se define tal como se describe anteriormente.

El término“alcóxido” se refiere, a efectos de la presente invención, a un átomo de oxígeno unido a una cadena hidrocarbonada, donde dicha cadena hidrocarbonada puede comprender un grupo alquilo y/o un grupo arilo, tal como se definen anteriormente.

El término “alquil-éter” se refiere, a efectos de la presente invención, a una cadena hidrocarbonada saturada sustituida con un grupo alcóxido, tal como se define anteriormente.

El término“acilo” se refiere, a efectos de la presente invención, a un grupo carbonilo unido a una cadena hidrocarbonada, donde dicha cadena hidrocarbonada puede comprender un grupo alquilo y/o un grupo arilo, tal como se definen anteriormente.

El término“éster”, a efectos de la presente invención, se refiere a un grupo derivado de un ácido carboxílico -COOH, en el que el grupo hidroxilo -OH se encuentra sustituido por un grupo alcóxido, tal como se define de acuerdo con la presente invención.

El término “alquil-éster” se refiere, a efectos de la presente invención, a una cadena hidrocarbonada saturada sustituida con un grupo éster, tal como se define anteriormente.

En una realización preferente A es un átomo de O.

En otra realización preferente A es un átomo de S.

En otra realización preferente A es un grupo un grupo NR ₇ , donde R ₇ se selecciona independientemente entre H, -ORs o un grupo C _1-6 alquilo, y donde Rs es un grupo H o un grupo C _1-6 alquilo. Más preferentemente R ₇ es H, -OH o -OCH _3.

En una realización preferente R es H.

En otra realización preferente R es un grupo C alquilo. Más preferentemente R es un grupo metilo o propilo.

En otra realización preferente R es un grupo alquilarilo. Más preferentemente R es un grupo bencilo o 4-fluorobencilo. En otra realización preferente R _i es un grupo alquilamida. Más preferentemente R ₁ es un grupo acetamida.

En otra realización preferente R ₁ es un grupo acilo -C(0)R ^a . Más preferentemente R1 es un grupo acilo -C(0)R ^a , donde R ^a es un grupo arilo. Aún más preferentemente R ^a es un grupo fenilo.

En una realización preferente R ₃ es H.

En otra realización preferente R ₃ es metilo.

En una realización preferente R ₄ es C _1-6 alquilo o un grupo alcóxido. En una realización preferente el grupo alcóxido es un grupo alcóxido halogenado.

En una realización más preferente R ₄ es metilo.

En una realización más preferente R ₄ es -OCH ₂ CF ₃ .

En una realización preferente R ₅ es H.

En otra realización preferente R ₅ es C _1-6 alquilo. Más preferentemente R ₅ es metilo, etilo, propilo, butilo o tert-butilo. Aún más preferentemente R ₅ es metilo, etilo o propilo.

En otra realización preferente R ₅ es alquilarilo. Más preferentemente R ₅ es bencilo.

En otra realización preferente R ₅ es alquil éster. Más preferentemente R ₅ es -CH ₂ COOCH ₃ o -CH(COOCH ₃ )2.

En una realización preferente R ₆ es metilo.

En otra realización preferente R ₆ es OR ₉ donde R ₉ es C _1-6 alquilo. Más preferentemente R ₉ es etilo.

En una realización preferente R ₁₀ es C _1-6 alquilo. Más preferentemente R ₁₀ es metilo.

Una realización preferente de la invención se refiere a un compuesto de fórmula I, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo, seleccionado independientemente entre el grupo que consiste en 3, 4, 4a, 4b, 4c, 6, 8, 9,10, 11 , 12 y 13:

Una realización comprende el enantiómero R de los compuestos 3, 4, 4a, 4b, 4c, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12 y 13, respecto a la posición C-2 del núcleo benzopirano.

Otra realización comprende el enantiómero S de los compuestos 3, 4, 4a, 4b, 4c, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12 y 13, respecto a la posición C-2 del núcleo benzopirano.

Una realización comprende el isómero ( E,Z) de los compuestos 3, 4, 4a, 4b, 4c, 6, 7, 8, 10, 11 y 12, respecto a las posiciones C-‘3 y C-'7 de la cadena lateral prenilada.

Otra realización comprende el isómero ( E,E) de los compuestos 3, 4, 4a, 4b, 4c, 6, 7, 8,10, 11 y 12, respecto a las posiciones C-‘3 y C-'7 de la cadena lateral prenilada.

Una realización comprende el isómero (Z ,Z) de los compuestos 3, 4, 4a, 4b, 4c, 6, 7, 8, 10, 11 y 12, respecto a las posiciones C-‘3 y C-'7 de la cadena lateral prenilada.

Otra realización comprende el isómero (Z ,E) de los compuestos 3, 4, 4a, 4b, 4c, 6, 7, 8, 10, 11 y 12, respecto a las posiciones C-‘3 y C-'7 de la cadena lateral prenilada.

Una realización comprende el isómero E de los compuestos 9 y 13, respecto a la posición C- ‘3 de la cadena lateral prenilada.

Otra realización comprende el isómero Z de los compuestos 9 y 13, respecto a la posición C- ‘3 de la cadena lateral prenilada. Los compuestos de fórmula I, sus estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables, con actividad agonista PPAR comprenden una estructura común derivada de los benzopiranos prenilados naturales policerasoidol y policerasoidin (González et al., 1995 y 1996), isómeros naturales de los compuestos 1 y 2 aquí descritos: El isómero (3 E, 7Z) del compuesto 1 se corresponde al compuesto natural policerasoidol, mientras que el isómero (3 EJE) es el compuesto natural isopolicerasoidol, y el policerasoidin se corresponde al isómero (3E,7Z) del compuesto 2:

Dichos documentos de González et al (1995 y 1996) describen el aislamiento de los compuestos naturales policerasoidol y policerasoidin de la corteza de árboles del género Polyalthia, indicando que alguno de los compuestos de la familia de las hidroquinonas preniladas, a la que pertenecen, son conocidos por tener propiedades citotóxicas o antioxidantes, sin referirse o dar pistas sobre una posible actividad como agonistas de PPAR. En el mismo sentido, otros documentos divulgan dichos compuestos, o compuestos de estructura similar, si bien dichos compuestos tampoco presentan actividad como agonistas de PPAR. En particular, el documento Taha et al, 2015 y Karimian et al. (2015) describe el uso de policerasoidol, de su éster metílico, y de policerasoidin como inductores de apoptosis en células tumorales de cáncer de mama. Zhao et al. (2010) analiza diferentes metabolitos derivados de tocoferol y tocotrienoles detectados en orina, suero o hígado en muestras humanas y de ratones, entre los cuales se describe el policerasoidol. Zafra-Polo et al. (1996) describe el polyalthidin, relacionado con la estructura básica de los compuestos de la invención, pero que sin embargo se describe solamente con relación a su actividad como inhibidor de la cadena respiratoria mitocondrial. Finalmente, el documento EP0421419A describe compuestos de núcleo benzopirano con tres cadenas preniladas haciendo referencia a su uso para disminuir los niveles séricos del colesterol. Ninguno de estos documentos describe, o da pistas sobre la posible utilidad de compuestos similares, con un núcleo benzopirano prenilado, como agonistas de PPAR.

Una realización comprende el enantiómero R de los compuestos 1 y 2, respecto a la posición C-2 del núcleo benzopirano.

Otra realización comprende el enantiómero S de los compuestos 1 y 2, respecto a la posición C-2 del núcleo benzopirano.

Una realización comprende el isómero ( E,E) de los compuestos 1 y 2, respecto a las posiciones C-‘3 y C-'7 de la cadena lateral prenilada.

Otra realización comprende el isómero ( E,Z) de los compuestos 1 y 2, respecto a las posiciones C-‘3 y C-'7 de la cadena lateral prenilada.

Una realización comprende el isómero ( Z,Z) de los compuestos 1 y 2, respecto a las posiciones C-‘3 y C-'7 de la cadena lateral prenilada.

Otra realización comprende el isómero ( Z,E) de los compuestos 1 y 2, respecto a las posiciones C-‘3 y C-'7 de la cadena lateral prenilada.

Una realización preferente se refiere a un compuesto de fórmula I, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo:

en el que R3, R10 y R ₄ son metilo y R ₂ es un derivado de un grupo prenilo de estructura:

, donde A es un átomo de O, y R ₆ es metilo,

y donde dicho compuesto de fórmula I es un compuesto de fórmula II, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo: en donde R ₁ y R ₅ se definen de acuerdo a las realizaciones de la presente invención descritas anteriormente.

Dichos compuestos de fórmula II incluyen, por tanto, los compuestos 1 , 2 y compuestos derivados con diferentes grupos R ₁ y R ₅ .

En una realización preferente, cuando R ₁ es H, R ₅ es distinto de H o metilo, y cuando R ₁ es Me, R ₅ es distinto de H o metilo.

Una realización comprende el enantiómero R de los compuestos de fórmula II, respecto a la posición C-2 del núcleo benzopirano.

Otra realización comprende el enantiómero R de los compuestos de fórmula II, respecto a la posición C-2 del núcleo benzopirano.

Una realización comprende el isómero ( E,Z) de los compuestos de fórmula II, respecto a las posiciones C-‘3 y C-'7 de la cadena lateral prenilada.

Otra realización comprende el isómero ( E,E) de los compuestos de fórmula II, respecto a las posiciones C-‘3 y C-'7 de la cadena lateral prenilada.

Una realización comprende el isómero (Z ,Z) de los compuestos de fórmula II, respecto a las posiciones C-‘3 y C-'7 de la cadena lateral prenilada.

Otra realización comprende el isómero (Z ,E) de los compuestos de fórmula II, respecto a las posiciones C-‘3 y C-'7 de la cadena lateral prenilada.

En una realización preferente, R ₁ es H y R ₅ es H.

En otra realización preferente, R ₁ es C _1-6 alquilo y R ₅ es H. Más preferentemente R ₁ es metilo y R ₅ es H.

En otra realización preferente, R ₁ es H y R5 es C _1-6 alquilo. Más preferentemente R ₁ es H y R5 es metilo o propilo.

En una realización preferente, R ₁ es H y R5 es alquilarilo. Más preferentemente R ₁ es H y R5 es bencilo. En otra realización preferente, R ₁ es alquilamida y R ₅ es alquilarilo. Más preferentemente R ₁ es acetamida, y R ₅ es bencilo.

En otra realización preferente, R ₁ y R ₅ son alquilarilo. Más preferentemente R ₁ y R ₅ son bencilo.

En otra realización preferente, R ₁ es C _1-6 alquilo y R ₅ es H. Más preferentemente R ₁ es propilo es R ₅ es H.

En otra realización preferente, R ₁ es un grupo acilo -C(0)R ^a , donde R ^a es un grupo arilo, y R ₅ es un grupo alquil éster. Más preferentemente R ₁ es un grupo benzoilo y R ₅ es un grupo - CH2COOCH3.

En otra realización preferente, R ₁ es un grupo C _1-6 alquilo y R ₅ es un grupo alquil éster. Más preferentemente R ₁ es un grupo metilo y R ₅ es un grupo -CH ₂ COOCH ₃ o un grupo - CH(COOCH ₃ ) ₂ .

Ambos compuestos 1 y 2 muestran una estructura similar y solo difieren en el grupo funcional de la posición C-6, un hidroxilo en el compuesto 1 y un metoxilo en el compuesto 2. A partir de los compuestos 1 y 2 se pueden sintetizar los compuestos 3, 4, 4a, 4b, 4c, 6, 7 u 8 de fórmula I, mediante sustitución de las posiciones C-9’ y C-6, tal como se describe en el Ejemplo 1 , más adelante.

Una realización del compuesto de fórmula II, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo, tal como se describe anteriormente, es un compuesto que se selecciona independientemente entre compuesto 1 , 2, 3, 4, 4a, 4, b, 4c, 6, 7 u 8.

Una realización preferente de la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula II, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo, seleccionado independientemente entre el grupo que consiste en 3, 4, 4a, 4b, 4c, 6, 7 y 8. En una realización preferente los compuestos 3, 4, 4a, 4b, 4c, 6, 7 y 8 son isómeros ( E,Z ), en relación a los dobles enlaces de la cadena lateral prenilada en posiciones C-3’ y C-7’.

Otra realización preferente de la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo:

en el que R ₃ es H, R ₄ y R ₁₀ son metilo y R ₂ es un derivado de un grupo prenilo de estructura:

, donde A es un átomo de O, y donde dicho compuesto de fórmula I es un compuesto de fórmula III, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo:

en donde Ri, R ₅ , y R ₆ se definen de acuerdo a las realizaciones de la presente invención descritas anteriormente.

Dichos compuestos de fórmula lll presentan igualmente una estructura derivada de los compuestos 1 y 2, pero a diferencia de los compuestos de fórmula II, presentan H en lugar de metilo como grupo R ₃ , y además de las modificaciones en las posiciones C-6 (-OR ₁ ) y C-9’ (- COOR ₅ ), también presentan modificaciones en la posición C-8’ (Re).

Una realización comprende el enantiómero R de los compuestos de fórmula lll, respecto a la posición C-2 del núcleo benzopirano.

Otra realización comprende el enantiómero R de los compuestos de fórmula lll, respecto a la posición C-2 del núcleo benzopirano.

Una realización comprende el isómero ( E,Z) de los compuestos de fórmula lll, respecto a las posiciones C-‘3 y C-'7 de la cadena lateral prenilada.

Otra realización comprende el isómero ( E,E) de los compuestos de fórmula lll, respecto a las posiciones C-‘3 y C-'7 de la cadena lateral prenilada.

Una realización comprende el isómero (Z ,Z) de los compuestos de fórmula lll, respecto a las posiciones C-‘3 y C-'7 de la cadena lateral prenilada.

Otra realización comprende el isómero (Z ,E) de los compuestos de fórmula lll, respecto a las posiciones C-‘3 y C-'7 de la cadena lateral prenilada. En una realización preferente, R ₁ es un grupo alquilarilo, R ₆ es un grupo -OR ₉ , donde R ₉ es C _1-6 alquilo, y R ₅ es H o un grupo C _1-6 alquilo. Más preferentemente R ₁ es un grupo bencilo, R ₆ es un grupo -OCH ₂ CH ₃ , y R ₅ es H o etilo.

Mas preferentemente R ₁ es un grupo 4-fluorobencilo, R ₆ es un grupo -OCH ₂ CH ₃ , y R ₅ es etilo. Una realización del compuesto de fórmula III, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo, tal como se describe anteriormente, es un compuesto que se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en compuesto 10, 11 y 12:

Otra realización preferente de la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo: en el que R3 es H, R ₄ y R10 son metilo y R ₂ es un grupo alquil-éster de estructura:

, donde A es un átomo de O, y donde dicho compuesto de fórmula I es un compuesto de fórmula IV, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo:

en donde R ₁ y R ₅ se definen de acuerdo a las realizaciones de la presente invención descritas anteriormente.

Dichos compuestos de fórmula IV presentan igualmente una estructura derivada de los compuestos de fórmula I 1 y 2. Sin embargo, los compuestos de fórmula IV son compuestos de fórmula I donde el radical R3 es H, y no metilo tal como presentan los compuestos 1 y 2, y el radical R ₂ es un grupo alquil-éster que, a diferencia de los compuestos 1 y 2, no presenta un segundo grupo prenilo.

Una realización comprende el enantiómero R de los compuestos de fórmula IV, respecto a la posición C-2 del núcleo benzopirano.

Otra realización comprende el enantiómero S de los compuestos de fórmula IV, respecto a la posición C-2 del núcleo benzopirano.

Una realización comprende el isómero E de los compuestos de fórmula IV, respecto al doble enlace de la cadena lateral prenilada. Otra realización comprende el isómero Z de los compuestos de fórmula IV, respecto al doble enlace de la cadena lateral prenilada.

En una realización preferente R ₁ es alquilarilo y R ₅ es C _1-6 alquilo. Más preferentemente R ₁ es 4-fluorobencilo y R ₅ es etilo.

Una realización del compuesto de fórmula IV, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo, tal como se describe anteriormente, es el compuesto 9:

Otra realización preferente de la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo:

en el que R ₃ es H, R ₁₀ es metilo y R ₂ es -C(0)0R ^b , y donde dicho compuesto de fórmula I es un compuesto de fórmula V, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo:

en donde R ^b es un grupo C _1-6 alquilo y, R ₁ y R ₄ se definen de acuerdo a las realizaciones de la presente invención descritas anteriormente. Dichos compuestos de fórmula V presentan igualmente una estructura derivada de los compuestos de fórmula 11 y 2, pero donde en dicha fórmula I el radical R ₂ es un grupo éster en lugar de un grupo alquil-éster prenilado que presentan los compuestos 1 y 2.

Una realización comprende el enantiómero R de los compuestos de fórmula V, respecto a la posición C-2 del núcleo benzopirano.

Otra realización comprende el enantiómero S de los compuestos de fórmula V, respecto a la posición C-2 del núcleo benzopirano.

Una realización comprende el isómero E de los compuestos de fórmula V, respecto al doble enlace de la cadena lateral prenilada.

Otra realización comprende el isómero Z de los compuestos de fórmula V, respecto al doble enlace de la cadena lateral prenilada.

En una realización preferente R ₁ es alquilarilo, R ^b es C _1-6 alquilo y R ₄ es un grupo alcóxido. Más preferentemente R ₁ es bencilo, R ^b es etilo y R ₄ es -OCH ₂ CF ₃ .

Una realización del compuesto de fórmula V, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo, tal como se describe anteriormente, es el compuesto 13:

Una realización de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de al menos un compuesto de fórmula I, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo, tal como se ha descrito anteriormente, y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Se define como cantidad efectiva, a efectos de la presente invención, aquella cantidad del compuesto que proporciona una mejora objetivamente identificable en el estado del paciente, reconocida por un observador cualificado, y donde dicho paciente es tratado con una composición farmacéutica que comprende dicha cantidad del compuesto.

Son excipientes farmacéuticamente aceptables, a efectos de la presente invención, ingredientes inertes tales como, pero no limitados a, codisolventes, tensioactivos, aceites, humectantes, emolientes, conservantes, estabilizadores y antioxidantes. Una realización de la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo:

donde

R ₁ es H o un grupo protector de un fenol;

R ₂ se selecciona independientemente entre un grupo alquil-éster de estructura:

un derivado de un grupo prenilo de estructura:

o un grupo acilo -C(0)0R ^b , donde R ^b es un grupo C _1-6 alquilo, en donde

- A se selecciona independientemente entre un átomo de O, un átomo de S o un grupo NR ₇ , donde R ₇ se selecciona independientemente entre H, ORs o un grupo C _1-6 alquilo, y donde Rs es un grupo H o un grupo C _1-6 alquilo;

- R ₅ se selecciona independientemente entre H o un grupo protector de ácido carboxílico;

- R6 es C _1-6 alquilo o OR ₉ donde R ₉ es C _1-6 alquilo;

donde - R ₃ es H o un grupo C _1-6 alquilo; y

- R ₄ es un grupo C _1-6 alquilo o un alcóxido;

- R ₁₀ se selecciona independientemente entre un grupo C _1-6 alquilo, alilo, alquilamina, alquilamida, alquilarilo, alquiléter, haloalquilo, sililo, carbamato, alquilsulfona o haloalquilsulfona; y

donde cuando R ₁ es H y R ₃ es metilo, R ₅ es distinto de H o metilo, y cuando R ₁ es metilo y R ₃ es metilo, R ₅ es distinto de H o metilo; o una composición farmacéutica que lo comprende, para uso como medicamento.

Otra realización de la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo:

donde

- R ₁ se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H; C _1-6 alquilo; alilo; alquilamida; alquilamina; alquilarilo; alquil-éter; halo-alquilo; sililo; C(0)NR _m R _P , donde R _m y/o R _p son cada uno e independientemente H, C _1-6 alquilo o arilo; acilo C(0)R ^a , donde R ^a es un grupo arilo; alquilsulfona o halo-alquilsulfona;

- R ₂ se selecciona independientemente entre un grupo alquil-éster de estructura:

un derivado de un grupo prenilo de estructura:

o un grupo acilo -C(0)OR ^b , donde R ^b es un grupo C _1-6 alquilo,

en donde

- A se selecciona independientemente entre un átomo de O, un átomo de S o un grupo NR ₇ , donde R ₇ se selecciona independientemente entre H, ORs o un grupo C _1-6 alquilo, y donde Rs es un grupo H o un grupo C _1-6 alquilo;

- R ₅ se selecciona independientemente entre H; C _1-6 alquilo; alilo; alquilamida; alquilamina; alquilarilo; alquil-éter; halo-alquilo; sililo; C(0)NR _m R , donde R _m y/o R _p son cada uno e independientemente H, C _1-6 alquilo o arilo; acilo C(0)R ^a , donde R ^a es un grupo arilo; alquilsulfona o halo-alquilsulfona;

- R ₆ es C _1-6 alquilo o OR ₉ donde R ₉ es C _1-6 alquilo;

donde

- R ₃ es H o un grupo C _1-6 alquilo; y

- R ₄ es un grupo C _1-6 alquilo o un alcóxido;

- R10 se selecciona independientemente entre un grupo C _1-6 alquilo, alilo, alquila ina, alquila ida, alquilarilo, alquiléter, haloalquilo, sililo, carba ato, alquilsulfona o haloalquilsulfona; y donde cuando R ₁ es H y R ₃ es metilo, R ₅ es distinto de H o metilo, y cuando R ₁ es metilo y R ₃ es metilo, R ₅ es distinto de H o metilo; o una composición farmacéutica que lo comprende, para uso como medicamento.

Una realización del compuesto de fórmula I, o de una composición que lo comprende, para uso como medicamento, tal como se describe anteriormente, comprende cualquiera de sus enantiómeros o mezclas de estos, y cualquiera de sus isómeros E/Z y mezclas de ellos, y sus sales farmacéuticamente aceptables. Una realización comprende el enantiómero R. Otra realización comprende el enantiómero S. Una realización comprende el isómero E. Otra realización comprende el isómero Z.

Otra realización preferente se refiere a un compuesto de fórmula I, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo, que se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en 3, 4, 4a, 4b, 4c, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12 y 13, o una composición farmacéutica que lo comprende, para uso como medicamento.

Los compuestos de fórmula I descritos, son agonistas de PPARa y/o PPARy. Por tanto, dichos compuestos son útiles en el tratamiento de enfermedades que responden a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy, es decir, en enfermedades mediadas por agonistas de PPARa y/o PPARy, que equivale a enfermedades cuyo tratamiento se beneficia de la administración de agonistas de PPARa y PPARy. Tal como se ha indicado anteriormente, los PPAR se consideran potentes herramientas terapéuticas en el control de desórdenes cardiovasculares, diabetes tipo 2 (DT2), obesidad, síndrome metabólico, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, quilomicronemia primaria, hiperlipoproteinemia, disbetalipoproteinemia familiar, inflamación y enfermedades neurodegenerativas, tales como el Parkinson, Alzheimer o la esclerosis lateral amiotrófica (ALS) (Ahmadian et al., 2013). Además, los PPAR tienen una importancia adicional ya que están implicados en el control de procesos inflamatorios, por lo que pueden regular la inflamación, función vascular, y el remodelado vascular.

Una realización de la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo:

donde

R ₁ es H o un grupo protector de un fenol;

R ₂ se selecciona independientemente entre un grupo alquil-éster de estructura:

un derivado de un grupo prenilo de estructura:

o un grupo acilo -C(0)0R ^b , donde R ^b es un grupo C _1-6 alquilo, en donde - A se selecciona independientemente entre un átomo de O, un átomo de S o un grupo NR ₇ , donde R ₇ se selecciona independientemente entre H, ORs o un grupo C _1-6 alquilo, y donde Rs es un grupo H o un grupo C _1-6 alquilo;

- R ₅ es H o un grupo protector de un ácido carboxílico;

- R ₆ es C _1-6 alquilo o OR ₉ donde R ₉ es C _1-6 alquilo;

y donde

- R3 es H o un grupo C _1-6 alquilo; y

- R ₄ es un grupo C _1-6 alquilo o un alcóxido; y

- R10 se selecciona independientemente entre un grupo C _1-6 alquilo, alilo, alquilamina, alquilamida, alquilarilo, alquiléter, haloalquilo, sililo, carbamato, alquilsulfona o haloalquilsulfona;

o una composición farmacéutica que lo comprende, para uso en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy.

En una realización la enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy se selecciona independientemente entre desórdenes cardiovasculares, diabetes tipo 2 (DT2), obesidad, síndrome metabólico, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, quilomicronemia primaria, hiperlipoproteinemia, disbetalipoproteinemia familiar, inflamación y enfermedades neurodegenerativas.

En una realización los desórdenes cardiovasculares se refieren a la aterosclerosis.

En una realización las enfermedades neurodegenerativas se seleccionan independientemente entre Parkinson, Alzheimer o la esclerosis lateral amiotrófica (ALS).

Una realización de la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo:

donde

- R ₁ se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H; C _1-6 alquilo; alilo; alquilamida; alquilamina; alquilarilo; alquil-éter; halo-alquilo; sililo; C(0)NR _m R _P , donde R _m y/o R _p son cada uno e independientemente H, C _1-6 alquilo o arilo; acilo C(0)R ^a , donde R ^a es un grupo arilo; alquilsulfona o halo-alquilsulfona; R2 se selecciona independientemente entre un grupo alquil-éster de estructura:

un derivado de un grupo prenilo de estructura:

o un grupo acilo -C(0)0R ^b , donde R ^b es un grupo C _1-6 alquilo,

en donde

- A se selecciona independientemente entre un átomo de O, un átomo de S o un grupo NR ₇ , donde R ₇ se selecciona independientemente entre H, ORs o un grupo C _1-6 alquilo, y donde Rs es un grupo H o un grupo C _1-6 alquilo;

- R ₅ se selecciona independientemente entre H; C _1-6 alquilo; alilo; alquilamida; alquilamina; alquilarilo; alquil-éter; halo-alquilo; sililo; C(0)NR _m R , donde R _m y/o R _p son cada uno e independientemente H, C _1-6 alquilo o arilo; acilo C(0)R ^a , donde R ^a es un grupo arilo; alquilsulfona o halo-alquilsulfona;

- R ₆ es C _1-6 alquilo o OR ₉ donde R ₉ es C _1-6 alquilo;

y donde

- R3 es H o un grupo C _1-6 alquilo; y

- R ₄ es un grupo C _1-6 alquilo o un alcóxido; y

- R10 se selecciona independientemente entre un grupo C _1-6 alquilo, alilo, alquilamina, alquilamida, alquilarilo, alquiléter, haloalquilo, sililo, carbamato, alquilsulfona o haloalquilsulfona;

o una composición farmacéutica que lo comprende, para uso en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy. En una realización la enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy se selecciona independientemente entre desórdenes cardiovasculares, diabetes tipo 2 (DT2), obesidad, síndrome metabólico, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, quilomicronemia primaria, hiperlipoproteinemia, disbetalipoproteinemia familiar, inflamación y enfermedades neurodegenerativas.

En una realización las enfermedades neurodegenerativas se seleccionan independientemente entre Parkinson, Alzheimer o la esclerosis lateral amiotrófica (ALS).

Una realización se refiere a un compuesto de fórmula I o una composición farmacéutica que lo comprende, tal como se describe anteriormente, para uso en el tratamiento de enfermedades autoinmunes, tales como la diabetes tipo 2 (DT2).

Otra realización se refiere a un compuesto de fórmula I o una composición farmacéutica que lo comprende, tal como se describe anteriormente, para uso en el tratamiento de la aterosclerosis. Otra realización se refiere a un compuesto de fórmula I o una composición farmacéutica que lo comprende, tal como se describe anteriormente, para uso en el tratamiento de la aterogénesis.

Otra realización se refiere a un compuesto de fórmula I o una composición farmacéutica que lo comprende, tal como se describe anteriormente, para uso en el tratamiento de la inflamación y de enfermedades relacionadas con procesos inflamatorios.

Otra realización se refiere a un compuesto de fórmula I o una composición farmacéutica que lo comprende, tal como se describe anteriormente, para uso en el tratamiento de hipercolesterolemia.

Otra realización se refiere a un compuesto de fórmula I o una composición farmacéutica que lo comprende, tal como se describe anteriormente, para uso en el tratamiento de hipertrigliceridemia.

Otra realización se refiere a un compuesto de fórmula I o una composición farmacéutica que lo comprende, tal como se describe anteriormente, para uso en el tratamiento del síndrome metabólico.

Otra realización se refiere a un compuesto de fórmula I o una composición farmacéutica que lo comprende, tal como se describe anteriormente, para uso en el tratamiento de la obesidad.

Otra realización se refiere a un compuesto de fórmula I o una composición farmacéutica que lo comprende, tal como se describe anteriormente, para uso en el tratamiento de quilomicronemia primaria. Otra realización se refiere a un compuesto de fórmula I o una composición farmacéutica que lo comprende, tal como se describe anteriormente, para uso en el tratamiento de hiperlipoproteinemia.

Otra realización se refiere a un compuesto de fórmula I o una composición farmacéutica que lo comprende, tal como se describe anteriormente, para uso en el tratamiento de disbetalipoproteinemia.

En una realización de la presente invención cuando R ₁ es H y R ₃ es metilo, R ₅ es distinto de H o metilo, y cuando R ₁ es metilo y R ₃ es metilo, R ₅ es distinto de H o metilo.

Una realización del compuesto de fórmula I, o de una composición que lo comprende, para uso en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy, tal como se describe anteriormente, comprende cualquiera de sus enantiómeros o mezclas de estos, y cualquiera de sus isómeros E/Z y mezclas de ellos, y sus sales farmacéuticamente aceptables. Una realización comprende el enantiómero R. Otra realización comprende el enantiómero S. Una realización comprende el isómero E. Otra realización comprende el isómero Z.

Otra realización de la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo, que se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en II, III, IV o V:

donde R ₁ , R ₄ , R ₅ , R ₆ y R ^b se definen tal como se describe anteriormente, o una composición farmacéutica que lo comprende, para uso en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy.

Una realización de los compuestos de fórmula II, III, IV o V, o de una composición que comprende uno de dichos compuestos, para uso en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy, tal como se describe anteriormente, comprende cualquiera de sus enantiómeros o mezclas de estos, y cualquiera de sus isómeros E/Z y mezclas de ellos, y sus sales farmacéuticamente aceptables.

Otra realización de la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo, que se selecciona independientemente entre un compuesto 1 , 2, 3, 4, 4a, 4b, 4c, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12 o 13, o una composición farmacéutica que lo comprende, para uso en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy.

El compuesto 5 se refiere al compuesto de fórmula I:

En una realización los compuestos 1 , 2, 3, 4, 4a, 4b, 4c, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12 y 13, para uso en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy, descritos anteriormente, comprenden el enantiómero R.

En otra realización los compuestos 1 , 2, 3, 4, 4a, 4b, 4c, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12 y 13, para uso en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy, descritos anteriormente, comprenden el enantiómero S.

En una realización los compuestos 1 , 2, 3, 4, 4a, 4b, 4c, 5, 6, 7, 8, 10, 1 1 y 12, para uso en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy, descritos anteriormente, comprenden el isómero ( E,Z ). En otra realización los compuestos 1 , 2, 3, 4, 4a, 4b, 4c, 5, 6, 7, 8, 10, 11 y 12, para uso en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy, descritos anteriormente, comprenden el isómero ( E,E ).

En una realización los compuestos 1 , 2, 3, 4, 4a, 4b, 4c, 5, 6, 7, 8, 10, 11 y 12, para uso en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy, descritos anteriormente, comprenden el isómero ( Z,Z ).

En otra realización los compuestos 1 , 2, 3, 4, 4a, 4b, 4c, 5, 6, 7, 8, 10, 11 y 12, para uso en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy, descritos anteriormente, comprenden el isómero ( Z,E ).

En una realización los compuestos 9 y 13, para uso en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy, descritos anteriormente, comprenden el isómero E.

En otra realización los compuestos 9 y 13, para uso en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy, descritos anteriormente, comprenden el isómero Z.

Otra realización se refiere al uso de los compuestos de fórmula I en el tratamiento de enfermedades que responden a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy.

Otra realización se refiere a un método de tratamiento que comprende la administración de una cantidad efectiva de al menos un compuesto de fórmula I, o de una composición farmacéutica que lo comprende, a un paciente de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy.

Otra realización de la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I seleccionado independientemente entre el grupo que consiste en 1 , 2, 3, 4c, 5, 7, 8, 9, 10, 11 , 12 y 13, para uso en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas duales de PPARa y PPARy.

En una realización la enfermedad que responde a la administración de agonistas duales de PPARa/g se selecciona independientemente entre desórdenes cardiovasculares, diabetes tipo 2 (DT2), obesidad, síndrome metabólico, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, quilomicronemia primaria, hiperlipoproteinemia, disbetalipoproteinemia familiar, inflamación y enfermedades neurodegenerativas.

En una realización más preferente las enfermedades neurodegenerativas se seleccionan independientemente entre Parkinson, Alzheimer o la esclerosis lateral amiotrófica (ALS).

Otra realización se refiere a un método de tratamiento que comprende la administración de una cantidad efectiva de al menos un compuesto de fórmula I seleccionado independientemente entre el grupo que consiste en 1 , 2, 3, 4c, 5, 7, 8, 9, 10, 11 , 12 y 13, o de una composición farmacéutica que lo comprende, a un paciente de una enfermedad que responde a la administración de agonistas duales de PPARa y PPARy.

Una realización de la invención se refiere al procedimiento de síntesis de los compuestos de fórmula I, tal como se describen anteriormente, donde dicho procedimiento comprende:

(a) condensar una 2,5-dihidroxiacetofenona y un alquilcetoéster para obtener una benzopiran-4-ona de fórmula A;

(b) reducir el grupo cetónico de la benzopiran-4-ona obtenida en el paso (a);

(c) proteger el grupo fenol de la benzopiran-4-ona para obtener un éster benzopirano de fórmula (B);

(d) reducir el grupo éster con reactivos adecuados para obtener un aldehido;

(e) hacer reaccionar el grupo aldehido (C), obtenido en (d), con un reactivo de Grignard para obtener un alcohol alílico;

y someter dicho alcohol alílico a las condiciones de transposición de Johnson-Claisen obteniendo un éster benzopirano (D);

donde opcionalmente,

el aldehido (C) obtenido en el paso (d) se somete a:

(f) condiciones de olefinación de Horner-Wadsworth-Emmons utilizando un fosfonato que comprende un radical -CH(COOR ^b )R4, o

(g) condiciones de olefinación de Wittig utilizando un iluro de fósforo que comprende un radical -C(COOR ^b )R4;

o donde una vez realizado el paso (e), el éster benzopirano (D) obtenido se somete al paso (d):

para obtener un nuevo aldehido (E); y donde se somete dicho nuevo aldehido (E) a (f)- condiciones de olefinación de Horner-Wadsworth- Emmons utilizando un fosfonato que comprende un radical -CH(COOR5)R6, o (g) condiciones de olefinación de Wittig utilizando un iluro de fosforo que comprende un radical -C(COOR ₅ )R ₆ ;

y donde, opcionalmente, se desprotege posteriormente el grupo fenol, y/o el grupo carboxílico en el compuesto resultante del paso (f) o (g); y donde R ₁ , R3 _, R _4, R _5, R6, R10 y R ^b se definen tal como se describe anteriormente en las realizaciones descritas en esta invención.

Mediante dicho procedimiento de síntesis se obtienen los compuestos 1 , 2, 3, 4, 4a, 4b, 4c, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12 y 13 descritos anteriormente. Dicho procedimiento de síntesis de los compuestos de fórmula I se puede esquematizar de la siguiente manera:

Reactivos y condiciones: (a) pirrolidina, EtOH, 45°C, 24 h; (b) Zn, HCI-AcOH (2: 1 , v/v), temp amb, 1 h; (c) R ₁ X donde X es un halógeno, K2CO3, EtOH, reflujo, 4 h; (d) 1 M DIBAL-H (hidruro de diisobutilalumino) en THF, -78 °C, 20 min; (e) 1) R ₄ -MgBr, - 78 °C, 3 h; 2) MeC(OR6) ₃ , ácido isobutírico (2 gotas), 140°C, 2 h; (f) (g) tBuOK o NaH, THF, 0°C a temp amb, 16h.

La formación del núcleo cromano se ha realizado, por tanto, mediante (a) condensación de 2,5-dihidroxi acetofenona y alquilcetoéster, dando lugar a benzopyran-4-ona (Kabbe et al., 1982). A continuación, (b) se redujo el grupo carbonilo mediante reducción de Clemmensen, y (c) se protegió el grupo fenol. La elongación de la cadena lateral se realizó (d) mediante reducción del éster etílico formando el correspondiente aldehido. El compuesto 13 se obtiene sometiendo dicho aldehido obtenido en el paso (d), a una olefinacion mediante reacción de Wittig (f) o de Horner-Wadsworth-Emmons (g) (Bisceglia et ai, 2012 y Toshima et al., 2001).

Para la obtención del compuesto 9, (e) se trató el aldehido obtenido en el paso (d), en primer lugar, con un reactivo de Grignard generando un alcohol alílico que se sometió a las condiciones de transposición de Johnson-Claisen (Sen et al., 1990) para finalmente obtener el éster del compuesto 9. Los compuestos 1-8 y 10-12 se obtienen mediante una segunda elongación de la cadena lateral utilizando nuevamente las condiciones del paso (d) anteriormente descrito para realizar la reducción del grupo éster del compuesto 9 formando el correspondiente aldehido, donde dicho aldehido se somete a una olefinacion mediante reacción de Wittig (f) o de Horner-Wadsworth-Emmons (g).

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Efecto en la viabilidad celular mediante el ensayo de MTT de policerasoidol (1), policerasoidin (2), compuesto 8, WY-14643 y rosiglitazona. En neutrófilos humanos (Fig. 1A) y HUVEC (Fig. 1 B). Datos representados como media ± SEM de n=5 experimentos independientes. *p <0,05 o **p <0,01 relativo al grupo vehículo.

Figura 2. Efecto en la viabilidad celular mediante ensayo de MTT del análogo sintetizado 9. En neutrófilos humanos (A) y HUVEC (B). Datos representados como media ± SEM de n=5 experimentos independientes. *p <0,05 o **p <0,01 relativo al grupo vehículo.

Figura 3. Efecto de policerasoidol (1), policerasoidin (2), compuesto 8, WY-14643 y rosiglitazona, en la viabilidad celular mediante citometría de flujo. Porcentaje de neutrófilos apoptóticos (Fig. 3A), supervivencia (Fig. 3B), apoptosis (Fig. 3C) y supervivencia en HUVEC (Fig. 3D) después de 24 h de incubación con los compuestos 1 , 2, 8, WY-14643 y rosiglitazona. Las células apoptóticas se cuantificaron como porcentaje de la población total de anexinas V ⁺ /PL apoptóticas tardías y/o necróticas como anexina V ⁺ /PI ⁺ , y células no apoptóticas viables como anexina VVPI\ Las columnas son la media ± SEM de n= 3 experimentos independientes. Se han incluido los paneles representativos de citometría de flujo (Fig. 3E) que muestran los efectos del vehículo y compuestos 1 , 2, 8, WY-14643 y rosiglitazona sobre la apoptosis/supervivencia de neutrófilos. *p <0,05 o **p <0,01 relativo al grupo vehículo.

Figura 4. Efecto en la viabilidad celular del compuesto 9 mediante citometría de flujo. Porcentaje de apoptosis de neutrófilos (Fig. 4A), supervivencia (Fig. 4B), apoptosis de HUVEC (Fig. 4C) y supervivencia (Fig. 4D) después de 24 h de incubación. Las células apoptóticas se cuantificaron como porcentaje de la población total anexina V ⁺ /Pl·, apoptóticas tardías y/o necróticas como anexina V ⁺ /PI ⁺ , y células no apoptóticas viables como anexina V- /Pl\ Las columnas son la media ± SEM de n=3 experimentos independientes. Se han incluido los paneles representativos de citometría de flujo (Fig. 4E) que muestran los efectos del vehículo y del compuesto 9 sobre la apoptosis/supervivencia de neutrófilos. *p <0,05 o **p <0,01 relativo al grupo vehículo.

Figura 5. Policerasoidol (1) inhibe la adhesión de células mononucleares a HUVEC inducida por TNFa en condiciones de flujo fisiológico. Las células se pretrataron durante 20 h con 1 mM de policerasoidol (1), policerasoidin (2), compuesto 8, WY-14643 o rosiglitazona, previamente a la estimulación con TNFa (20 ng/mL, 24 h). Neutrófilos humanos recién aislados o células mononucleares se perfundieron sobre monocapas endoteliales durante 5 min a 0,5 dinas/cm ² y se cuantificó la adhesión de neutrófilos (Fig. 5A) y células mononucleares (Fig. 5B). Las curvas dosis-respuesta se realizaron para policerasoidol (1) y rosiglitazona con HUVEC estimuladas con TNFa (20 ng/mL, 24 h) y perfusión de células mononucleares humanas recién aisladas (Fig. 5C). Los resultados son la media ± SEM de 4-6 experimentos independientes. **p <0,01 relativo al grupo vehículo y ^†† p < 0,01 relativo a células estimuladas con TNFa.

Figura 6. El compuesto 9 inhibe la adhesión de células mononucleares a HUVEC inducida por TNFa en condiciones de flujo fisiológico. Algunas células se pretrataron durante 20 h con 3, 30 o 100 pM de compuesto 9, previamente a la estimulación con TNFa (20 ng/mL, 24 h). Neutrófilos humanos recién aislados o células mononucleares se perfundieron sobre monocapas endoteliales durante 5 min a 0,5 dinas/cm ² y se cuantificó la adhesión de neutrófilos (Fig. 6A) y células mononucleares (Fig. 6B). Las curvas concentración-respuesta (0, 1-100 pM) se realizaron para compuesto 9 con HUVEC estimuladas con TNFa (20 ng/mL, 24 h) y perfusión de células mononucleares humanas recién aisladas (Fig. 6C). Los resultados son la media ± SEM de 4-6 experimentos independientes. **p< 0,01 relativo al grupo vehículo y ⁺⁺ p< 0,01 relativo a células estimuladas con TNFa.

Figura 7. Las células endoteliales se transfectaron con siRNA de control o siRNA específico de RXRa, PPARa o PPAR. 48 h después de la transfección, la expresión proteica de RXRa (Fig. 7A), PPARa (Fig. 7B) o PPARy (Fig. 7C) se determinó por Western blot. Los resultados (media ± SEM de n=4 experimentos independientes) se expresan en relación con b-actina. También se muestran las imágenes de los geles representativos. **p <0, 01 con respecto a los valores en el respectivo grupo de control de siRNA.

Figura 8. El silenciamiento de PPARY O RXRa por siRNA detiene el efecto inhibitorio de policerasoidol (1) en las interacciones entre células endoteliales-leucocitos mononucleares inducidas por TNFa. HUVEC se transfectaron con el control, siRNA específico de RXRa, PPARa o PPARY. 48h después de la transfección, las células se pretrataron con policerasoidol (10 mM) o rosiglitazona (1 pM) durante 20h y entonces se estimularon con TNFa (20 ng/ml_, 4h). Se cuantificó la adhesión celular mononuclear. Los resultados son la media ± SEM de 3- 4 experimentos independientes. *p <0,05 o **p <0,01 relativo a grupo vehículo respectivo, ^† p <0,05 o ttp <0,01 relativo a las células estimuladas con TNFa respectivas (Fig. 8A, 8B, 8C). La interacción RXRa/PPARY se midió por immunoprecipitación de PPARY seguido de Western blot para RXRa. Las películas de quimioluminiscencia se cuantificaron por análisis de imagen. El blot representa un n=3 de experimentos independientes (Fig. 8D).

Figura 9. La interacción RXRa/PPARY del compuesto 9 se midió por inmunoprecipitación de PPARY seguido de Western blot para RXRa. Las películas de quimioluminiscencia se cuantificaron por análisis de imagen. El blot representa un n=3 de experimentos independientes.

Figura 10. Policerasoidol (1) inhibe la expresión en HUVEC de ICAM-1 , VCAM-1 y CX3CLI inducida por TNFa. Algunas células se pretrataron con policerasoidol (10 mM) 20 h, antes de la estimulación con TNFa (20 ng/mL, 24 h para ICAM-1 , VCAM-1 y CX3CLI). Mediante citometría de flujo se determinó la expresión de ICAM-1 (Fig. 10A), VCAM-1 (Fig. 10B) y CX3CLI (Fig. 10C). Los resultados (media ± SEM) se expresaron como una media de la intensidad de fluorescencia de n=3-6 experimentos independientes. La expresión de ICAM-1 , VCAM-1 , y CX3CLI también se visualizó en HUVEC no permeabilizadas mediante inmunofluorescencia, utilizando alexa-fluor 488 (verde) (Fig. 10E). Los núcleos se contrastaron con colorante Hoechst (azul). *p <0,05 o **p <0,01 relativo al grupo vehículo, ^† p <0,05 o ttp <0,01 relativo a células estimuladas con TNFa.

Figura 11. Compuesto 9 inhibe la expresión en HUVEC de VCAM-1 , CX3CLI y CXCL16 inducida por TNFa, pero no de ICAM-1. Algunas células se pretrataron con el compuesto 9 (3 pM) 20 h, previamente a la estimulación con TNFa (20 ng/mL, 24 h). Mediante citometría de flujo se determinó la expresión de ICAM-1 (Fig. 11 A), VCAM-1 (Fig. 11 B), CX3CLI (Fig. 11 C) y CXCL16 (Fig. 11 D). Los resultados (media ± SEM) se expresaron como una media de la intensidad de fluorescencia de n=3-6 experimentos independientes. La expresión de ICAM-1 , VCAM-1 , CX3CLI y CXCL16 también se visualizó en HUVEC no permeabilizadas mediante inmunofluorescencia, utilizando alexa-fluor 488 (verde) (Fig. 11 E). Los núcleos se contrastaron con colorante Hoechst (azul). **p <0,01 relativo al grupo vehículo, ^† p <0,05 o ^†† p <0,01 relativo a células estimuladas con TNFa.

Figura 12. Policerasoidol (1) inhibe la activación de p38 MAPK y NF-kB (p65) inducida por TNFa en HUVEC. Las células se estimularon durante 1 h con TNFa (20 ng/mL). Algunas células se pretrataron con policerasoidol (10 mM) 20 h antes de la estimulación con TNFa. La activación de p38 MAPK (Fig. 12A) y NF-kB (Fig. 12B) se determinó mediante citometría de flujo. Los resultados (media ± SEM) se expresaron como la media de intensidad de fluorescencia de n=3-6 experimentos independientes (Fig. 12C y 12D). Se muestran los histogramas representativos. **p <0,01 relativo al grupo vehículo ^† p <0,05 y ^†† p <0,01 relativo a células estimuladas con TNFa.

Figura 13. El compuesto 9 inhibe la activación de p38 MAPK y NF-kB (p65) inducida por TNFa en HUVEC. Las células se estimularon durante 1 h con TNFa (20 ng/mL). Algunas células se pretrataron con el compuesto 9 (3 mM) 20 h antes de la estimulación con TNFa. La activación de p38 MAPK (Fig. 13A) y NF-kB (Fig. 13B) se determinó mediante citometría de flujo. Los resultados (media ± SEM) se expresaron como la media de intensidad de fluorescencia de n=3-6 experimentos independientes (Fig. 13C y 13D). Se muestran los histogramas representativos. **p <0,01 relativo al grupo vehículo y ^† p <0,05 relativo a células estimuladas con TNFa.

Figura 14. El compuesto 9 no produce diferencias significativas en ganancia de peso (g) y eficiencia alimenticia en ratones ob/ob tras 4 días de tratamiento. Los histogramas muestran la ganancia de peso (Fig. 14A) que se expresó como la diferencia de peso entre el día 5 y el día 0 (ds-do), y la eficiencia alimenticia (Fig. 14B) que se calculó como el cociente entre el aumento de peso y el alimento consumido. No se observaron diferencias significativas de aumento de peso ni eficiencia en la alimentación entre los ratones tratados con el compuesto 9 y los grupos control. Las columnas representan la media ± SEM de n=5-6 experimentos independientes.

Figura 15. El compuesto 9 y rosiglitazona reducen los valores de glucosa en plasma en ratones ob/ob tras 4 días de tratamiento. Se ha representado la variación de glucosa respecto al d ₀ , que se ha calculado utilizando la siguiente fórmula: ((d ₅ -d _o )/d _o ) x 100. Las columnas representan la media ± SEM de n=5-6 experimentos independientes. *p <0,05 relativo al grupo de ratones ob/ob tratado con vehículo.

Figura 16. El compuesto 9 no produce diferencias significativas en la ganancia de peso de tejido adiposo blanco (WAT) en ratones ob/ob tras 4 días de tratamiento. Las columnas muestran la media ± SEM de n=5-6 experimentos independientes Figura 17. El compuesto 9 reduce significativamente el área media de los adipocitos de WAT de forma dosis-dependiente en ratones ob/ob tras 4 días de tratamiento. Área media de los adipocitos, en pm ² (Fig. 17A), y sus respectivas imágenes representativas (Fig. 17B). Las columnas representan la media ± SEM de n=5-6 experimentos independientes. *p <0,05 o **p <0,01 relativo al grupo de ratones ob/ob tratados con vehículo.

Figura 18. Estudio del efecto antiinflamatorio en tejido adiposo blanco (WAT) en ratones ob/ob tras 4 días de tratamiento. Nivel de expresión de ARNm de MCP-1 en WAT (Fig. 18A) y Cuantificación de macrófagos F4/80 ⁺ en WAT mediante inmunohistoquímica (Fig. 18B). El compuesto 9 disminuye la expresión de ARNm de MCP-1 y el número de macrófagos infiltrados en el tejido adiposo blanco (WAT). Las columnas son la media ± SEM de n=5-6 experimentos independientes. *p < 0,05 relativo al grupo de ratones ob/ob tratados con vehículo.

Figura 19. El compuesto 9 y WY-14643 aumentan los niveles de colesterol total y HDL-c, y disminuyen los niveles de triglicéridos y ácidos grasos libres en plasma. Valores de colesterol total (Fig. 19A), HDL-c (Fig. 19B), triglicéridos (Fig. 19C) y ácidos grasos libres (Fig.19D). Las columnas representan la media ± SEM de n=5-6 experimentos independiente. *p <0,05 o **p <0,01 relativo al grupo de ratones ob/ob tratados con vehículo.

Figura 20. El compuesto 9 no afectó de forma significativa al peso del hígado ni a los triglicéridos acumulados, en comparación con el grupo control (vehículo). Ganancia de peso del hígado (Fig. 20A) y niveles de triglicéridos en hígado (Fig. 20B). Las columnas representan la media ± SEM de n=5-6 experimentos independiente. *p <0,05 relativo al grupo de ratones ob/ob tratados con vehículo.

Figura 21. El compuesto 9 redujo los niveles circulantes de ALT y AST Niveles de alanina amino transferasa (ALT) y aspártico transaminasa (AST) en plasma de ratones ob/ob tras 4 días de tratamiento. Las columnas representan la media ± SEM de n=5-6 experimentos independiente. *p <0,05 relativo al grupo de ratones ob/ob tratados con vehículo.

EJEMPLOS

Los ejemplos descritos a continuación tienen carácter ilustrativo y no pretenden limitar el ámbito de la presente invención. Toda la investigación con muestras humanas de este estudio se ha llevado a cabo cumpliendo los principios de la Declaración de Helsinki y con la aprobación del Comité ético institucional del Hospital Clínico de Valencia (Valencia, España). 1 : Obtención de compuestos de fórmula I

Todos los reactivos y disolventes se adquirieron de fuentes comerciales y se usaron directamente. Todas las reacciones sensibles a la humedad se llevaron a cabo en matraces secados en horno, bajo atmósfera de nitrógeno y con disolventes secos. Todas las reacciones se controlaron por CCF analítica con gel de sílice 60 F254 (Merck 5554) con detección UV a 254 nm. Los residuos se purificaron a través de una columna de gel de sílice 60H (5-40 pm, Merck 7736) y por cromatografía ultrarrápida (230-400 pm, Merck 9385). La CCF preparativa se realizó usando placas de gel de sílice de 0,5 mm (Merck). Hewlett-Packard (HP-1 100) o TripleTOF5600 (ABSciex) se utilizó para el análisis LC-MS, con la fuente API (ionización de presión atmosférica) configurada como APCI (ionización química a presión atmosférica) o API ES (ionización por electrospray) en modo positivo o negativo. Los espectros de RMN ( ¹ H, ¹³ C, COSY 45, DEPT, HSQC y HMBC) se referenciaron para la señal de disolvente CDCI3 en un Bruker AC 300 o AC-500. Las multiplicidades de resonancias de ¹³ C RMN fueron asignadas por experimentos DEPT. Las asignaciones de RMN se apoyaron en experimentos COSY 45, DEPT, HSQC y HMBC.

1.1. Obtención de los compuestos 1 (policerasoidol) y 2 (policerasoidin)

Se aislaron el policerasoidol (1) y policerasoidin (2) a partir de un extracto metanólico de cortezas de tallos de Polyalthia cerasoides y P. sclerophylla y se identificaron en base a sus características cromatográficas y espectrales (González et al., 1995 y 1996).

1.2. Obtención de los compuestos 3 a 8

Compuesto 3: A una suspensión de policerasoidol (1) (80 mg, 0.2 mmol) y K2CO3 (80 mg) en acetona (2 mL), se añadió 1-bromopropano CH ₃ CH2CH2Br (20 μL 0.2 mmol) y la mezcla se agitó a reflujo durante 4 h. La mezcla de reacción se concentró a sequedad y se volvió a disolver en 10 mL de CH2CI2. La fase orgánica se lavó con salmuera (3 x 10 mL) y H2O (3 x 10 mL), se deshidrató con Na ₂ S0 ₄ anhidro y se evaporó a sequedad en el rotavapor. El crudo de reacción se purificó mediante cromatografía en columna de sílica gel (hexano-AcOEt, 90: 10) para obtener el compuesto 3 (50 mg, 63 %). RMN ¹ H (400 MHz, CDCI3) d 6.49 (d, J= 2.6 Hz, H-7), 6.39 (d, J= 2.6 Hz, H-5), 5.91 (td, J= 1.3, 7.2 Hz, H-7', 5.15 (td, J= 0.9, 7.1 Hz, H-3'), 4.1 1 (t, J= 6.6 Hz, 2H, COOCH2CH2CH3-9'), 2.68 (t, J= 6.6 Hz, 2H, CH ₂ -4), 2.57 (ddd, J= 1.2, 7.5, 15.1 Hz, 2H, CH2-6'), 2.12 (s, 3H, CH ₃ -13'), 2.10-2.03 (m, 4H, CH ₂ -2' y CH ₂ -5'), 1.89 (d, 3H, J= 1.6 Hz, CH ₃ -10'), 1.75 (sex, J= 7.3 Hz, 2H, COOCH2CH2CH3-9'), 1.86-1.60 (m, 4H, CH2-3, CH ₂ -T), 1.59 (s, 3H, CH3- 1 1), 1.25 (s, 3H, CH ₃ -12'), 0.97 (t, J= 7.3 Hz, 3H, COOCH2CH2CH3-9'); RMN ¹³ C (125 MHz, CDCb) d 168.4 (COOCH2CH2CH3-9'), 147.9 (C-6), 145.8 (C-8a), 142.8 (CH-7'), 134.3 (C-4'), 127.2 (C-8'), 127.0 (C-8), 124.9 (CH-3'), 121.1 (C- 4a), 1 15.6 (CH-7), 1 12.6 (CH-5), 75.2 (C-2), 65.8 (COOCH2CH2CH3-9'), 39.6 (CH ₂ -T), 39.0 (CH ₂ -5'), 31.3 (CH ₂ -3), 27.9 (CH ₂ -6'), 23.9 (CH ₃ -12'), 22.4 (CH ₂ -4), 22.1 (COOCH ₂ CH ₂ CH ₃ -9'), 22.0 (CH ₂ -2'), 20.6 (CH ₃ -10'), 16.0 (CH ₃ -13'), 15.7 (CH ₃ -1 1,') 10.5 (COOCH ₂ CH ₂ CH ₃ -9'); LC- MS (APCI modo positivo) m/z 401.1 (100) [MH] ⁺ ; HREIMS m/z 400.263746 [M] ⁺ (400.261360 caled para C ₂₅ H ₃₆ C>4).

Compuesto 4: A una suspensión de policerasoidol (1) (80 mg, 0.2 mmol) y K ₂ C0 ₃ (80 mg) en acetona (2 ml_), se añadió cloruro de bencilo CICH ₂ Ph (25 mI_ 0.2 mmol) y la mezcla se agitó a reflujo durante 4 h. Tras extracción habitual, se purificó el crudo de reacción mediante cromatografía en columna de sílica gel (hexano-AcOEt, 90: 10) para obtener el compuesto 4 (60 mg, 67 %). ¹ H NMR (400 MHz, CDCI ₃ ) d 7.39-7.29 (m, 5H, COOCH ₂ P/7-9'), 6.50 (dd, J= 0.4, 2.7 Hz, H-7), 6.40 (dd, J= 0.4, 2.7 Hz, H-5), 5.95 (td, J= 1.3, 7.2 Hz, H-7'), 5.20 (s, 2H, COOCH ₂ Ph-9'), 5.12 (td, J= 1.1 , 7.1 Hz, H-3'), 2.70 (td, J= 2.5, 6.7 Hz, 2H, CH ₂ -4), 2.57 (ddd, J= 1.3, 7.4, 15.2 Hz, 2H, CH ₂ -6'), 2.14 (s, 3H, CH ₃ -13'), 2.12-1.90 (m, 4H, CH ₂ -2' y CH ₂ -5'), 1.92 (d, 3H, J= 1.6 Hz, CH ₃ -10'), 1.82-1.60 (m, 4H, CH ₂ -3 y CH ₂ -T), 1.56 (s, 3H, CH ₃ -1 , 11').26 (s, 3H, CH ₃ -12'); RMN ¹³ C (125 MHz, CDCI ₃ ) d 167.9 (COOCH ₂ Ph-9'), 147.8 (C-6), 145.8 (C- 8a), 143.6 (CH-7'), 134.1 (C-1" de COOCH ₂ P/7-9'), 134.3 (C-4'), 128.5 (2CH de COOCH ₂ P/7- 9'), 128.0 (3CH de COOCH ₂ P/7-9'), 127.3 (C-8'), 126.7 (C-8), 124.8 (CH-3'), 121.2 (C-4a),

1 15.6 (CH-7), 112.6 (CH-5), 76.0 (C-2), 66.0 (COOCH ₂ Ph-9'), 39.6 (CH ₂ -1 '), 39.0 (CH ₂ -5'), 31.3 (CH ₂ -3), 28.0 (CH ₂ -6'), 24.0 (CH ₃ -12'), 22.4 (CH ₂ -4), 22.1 (CH ₂ -2'), 20.6 (CH ₃ -10'), 16.0 (CH ₃ -13'), 15.7 (CH ₃ -1 1'); LC-MS (APCI modo positivo) m/z 472.2 (100) [MH + Na] ⁺ ; EIMS m/z 357 [M-CH ₂ Ph] ⁺ .

Compuesto 4a: A una suspensión de compuesto 4 (45 mg, 0.1 mmol) y K ₂ C0 ₃ (45 mg) en acetonitrilo (5 ml_), se añadió 2-cloroacetamida CICH ₂ CONH ₂ (0.1 mmol) y la mezcla se agitó a reflujo durante 9 h. Tras extracción habitual, se purificó el crudo de reacción mediante cromatografía en columna de sílica gel (hexano-AcOEt, 90: 10) para obtener el compuesto 4a (25 mg, 50 %). RMN ¹ H (400 MHz, CDCI ₃ ) d 7.38-7.29 (m, 5H, COOCH ₂ P/7-9'), 6.60 (d, J= 3.0 Hz, H-7), 6.46 (dd, J= 3.0 Hz, H-5), 5.93 (td, J= 1.3, 7.3 Hz, H-7'), 5.18 (s, 2H, COOCH ₂ Ph-9'), 5.11 (td, J= 1.2, 7.3 Hz, H-3'), 4.41 (s, 2H, OCH ₂ CONH ₂ -6), 2.72 (td, J= 2.5, 6.5 Hz, 2H, CH ₂ - 4), 2.56 (ddd, J= 1.2, 7.3, 14.8 Hz, 2H, CH ₂ -6'), 2.16 (s, 3H, CH ₃ -13'), 2.10-2.04 (m, 4H, CH ₂ - 2' y CH ₂ -5'), 1.92 (d, 3H, J= 1.2 Hz, CH ₃ -10'), 1.81-1.58 (m, 4H, CH ₂ -3, CH ₂ -T), 1.55 (s, 3H, CH ₃ -1 1'), 1.26 (s, 3H, CH ₃ -12'); RMN ¹³ C (100 MHz, CDCI ₃ ) d 171.8 (OCH ₂ CONH ₂ -6), 167.7 (COOCH ₂ Ph-9'), 149.8 (C-6), 147.0 (C-8a), 143.5 (CH-7'), 136.2 (C-1" de COOCH ₂ P/7-9'), 134.4 (C-4'), 128.4 (2CH de COOCH ₂ P/7-9'), 128.0 (3CH de COOCH ₂ P/7-9'), 126.7 (C-8'),

126.7 (C-8), 124.7 (CH-3'), 121.2 (C-4a), 1 15.6 (CH-7), 1 12.0 (CH-5), 75.5 (C-2), 67.9 (OCH ₂ CONH ₂ -6), 65.9 (COOCH ₂ Ph-9'), 39.6 (CH ₂ -1 '), 39.0 (CH ₂ -5'), 31.2 (CH ₂ -3), 28.0 (CH ₂ - 6'), 24.0 (CH ₃ -12'), 22.6 (CH ₂ -4), 22.1 (CH ₂ -2'), 20.6 (CH ₃ -10'), 16.2 (CH ₃ -13'), 15.7 (CH ₃ -1 ; 1') HREIMS m/z 505.290785 [M] ⁺ (505.282824 caled para C _3i H ₃₉ N0 ₅ ). Compuesto 4b. A una suspensión de compuesto 4 (35 mg, 0.1 mmol) y K ₂ CO ₃ (35 mg) en acetona (5 ml_), se añadió cloruro de bencilo CICH ₂ Ph (10 mI_, 0.1 mmol) y la mezcla se agitó a reflujo durante 15 h. Tras extracción habitual, se purificó el crudo de reacción mediante cromatografía en columna de sílica gel (hexano-AcOEt, 90: 10) para obtener el compuesto 4b (20 mg, 40 %). RMN ¹ H (400 MHz, CDCh) d 7.44-7.29 (m, 10H, OCH ₂ P/7-6, COOCH ₂ P/7-9'), 6.66 (d, J= 3.0 Hz, H-7), 6.54 (dd, J= 3.0 Hz, H-5), 5.94 (td, J= 1.2, 7.2 Hz, H-7'), 5.19 (s, 2H, COOCH ₂ Ph-9'), 5.12 (td, J= 1.2, 7.2 Hz, H-3'), 4.98 (s, 2H, OCH ₂ Ph-6), 2.73 (td, J= 2.8, 6.7 Hz, 2H, CH ₂ -4), 2.56 (ddd, J= 1.2, 7.2, 15.2 Hz, 2H, CH ₂ -6'), 2.16 (s, 3H, CH ₃ -13'), 2.11-2.04 (m, 4H, CH ₂ -2' y CH ₂ -5'), 1.92 (d, 3H, J= 1.2 Hz, CH ₃ -10'), 1.81-1.60 (m, 4H, CH ₂ -3, CH ₂ -T), 1.56 (s, 3H, CH ₃ -H'), 1.27 (s, 3H, CH ₃ -12'); RMN ¹³ C (100 MHz, CDCI ₃ ) d 167.0 (COOCH ₂ Ph- 9'), 151.4 (C-6), 146.2 (C-8a), 143.5 (CH-7'), 137.6 y 136.2 (2C, C-1" de OCH ₂ P/7-6, C-T" de COOCH ₂ P/7-9'), 134.3 (C-4 ¹ ), 128.5-127.5 (10CH, OCH ₂ P/7-6, COOCH ₂ P/7-9'), 127.2 (C-8'), 126.7 (C-8), 124.9 (CH-3'), 120.9 (C-4a), 1 15.7 (CH-7), 1 12.2 (CH-5), 75.3 (C-2), 70.5 (OCH ₂ Ph-6), 65.9 (COOCH ₂ Ph-9'), 39.7 (CH ₂ -T), 39.0 (CH ₂ -5'), 31.4 (CH ₂ -3), 28.0 (CH ₂ -6'), 24.0 (CH ₃ -12'), 22.6 (CH ₂ -4), 22.1 (CH ₂ -2'), 20.6 (CH ₃ -10'), 16.2 (CH ₃ -13'), 15.7 (CH ₃ -1 1'); EIMS m/z 538 [M] ⁺ (70), 447 [M-CH ₂ Ph] ⁺ , 356 (10) [M-2 x CH ₂ Ph] ⁺ , 91 (100).

Compuesto 4c. A una suspensión de compuesto 4 (70 mg, 0.2 mmol) y K ₂ C0 ₃ (70 mg) en acetona (5 ml_), se añadió 1-bromopropano CH ₃ CH ₂ CH ₂ Br (20 mI_, 0.2 mmol) y la mezcla se agitó a reflujo durante 10 h. Tras extracción habitual, el crudo de reacción con el grupo fenol protegido, se disolvió en 10 ml_ de una mezcla EtOH-KOH al 20% (v/v) y se mantuvo a reflujo durante 10 h. Posteriormente, la mezcla de reacción se acidificó con HCI 1 N, se concentró a sequedad y se redisolvió en 10 ml_ de CH ₂ CI ₂ . Tras extracción habitual, el crudo de reacción se purificó mediante cromatografía en columna de sílica gel (hexano-AcOEt, 90: 10) para obtener 4c (34 mg, 43 %). RMN ¹ H (300 MHz, CDCI ₃ ) d 6.58 (d, J= 2.9 Hz, H-7), 6.45 (d, J= 2.9 Hz, H-5), 6.06 (td, J= 1.3, 7.3 Hz, H-7'), 5.16 (td, J= 0.9, 6.6 Hz, H-3'), 3.83 (t, J= 6.6 Hz, 2H, OCH ₂ CH ₂ CH ₃ -6), 2.72 (t, J= 6.8 Hz, 2H, CH ₂ -4), 2.62 (dd, J= 7.5, 14.4 Hz, 2H, CH ₂ -6'), 2.15 (s, 3H, CHs-13'), 2.11-2.05 (m, 4H, CH ₂ -2' y CH ₂ -5'), 1.90 (d, 3H, J= 1.5 Hz, CH ₃ -10'), 1.79-1.72 (m, 6H, OCH ₂ CH ₂ CH ₃ -6, CH ₂ -3 y CH ₂ -T), 1.60 (s, 3H, CH ₃ -1 ,1' 1) .26 (s, 3H, CH ₃ - 12'), 1.01 (t, J= 6.6 Hz, 3H, OCH ₂ CH ₂ CH ₃ -6); RMN ¹³ C (75 MHz, CDCI ₃ ) d 173.0 (COOH-9'), 151.6 (C-6), 146.3 (C-8a), 145.9 (CH-7'), 134.2 (C-4'), 127.1 (C-8'), 126.1 (C-8), 125.1 (CH- 3'), 120.9 (C-4a), 115.4 (CH-7), 11 1.8 (CH-5), 75.2 (C-2), 70.0 (OCH ₂ CH ₂ CH ₃ -6), 39.7 (CH ₂ -1') , 39.0 (CH ₂ -5'), 31.4 (CH ₂ -3), 28.1 (CH ₂ -6'), 24.0 (CH ₃ -12'), 22.7 (CH ₂ -4), 22.6 (OCH ₂ CH ₂ CH ₃ -6), 22.1 (CH ₂ -2'), 20.5 (CH ₃ -10'), 16.2 (CH ₃ -13'), 15.7 (CH ₃ -11 '), 22.6 (OCH ₂ CH ₂ CH ₃ -6); LC-MS (APCI modo positivo) m/z 424.2 (100) [MH + Na] ⁺ .

Compuesto 5. A una disolución de policerasoidol (1) (10 mg, 0.03 mmol) en metanol (5 ml_) se le añadió gota a gota HCI conc (1.5 ml_) a 0°C. La mezcla se agitó a reflujo 7 h. Tras extracción habitual, el crudo de reacción se purificó mediante CCF de sílica gel preparativa (hexano-AcOEt, 90: 10) para obtener 5 (6 mg, 54 %). RMN ¹ H (300 MHz, CDCIs) d 6.48 (d, J= 2.9 Hz, H-7), 6.38 (d, J= 2.9 Hz, H-5), 5.94 (td, J= 1.2, 7.4 Hz, H-7'), 5.16 (td, J= 1.2, 7.4 Hz, H-3'), 3.73 (s, 3H, COOCP ₃ -9'), 2.80-2.57 (m, 4H, CH ₂ -4, CH ₂ -6'), 2.35-2.00 (m, 4H, CH ₂ -2' y CH ₂ -5'), 2.12 (s, 3H, CH ₃ -13'), 1.90-1.82 (m, 4H, CH ₂ -3, CH ₂ -T), 1.90 (d, 3H, J= 1.3 Hz, CH ₃ - 10'), 1.58 (s, 3H, CH ₃ -11 '), 1.25 (s, 3H, CH ₃ -12'); RMN ¹³ C (75 MHz, CDCIs) d 169.1 (COOCH ₃ - 9'), 147.3 (C-6), 146.0 (C-8a), 144.8 (CH-7'), 134.2 (C-4'), 127.2 (C-8'), 127.1 (C-8), 124.9 (CH- 3'), 121.1 (C-4a), 1 15.5 (CH-7), 1 12.5 (CH-5), 75.1 (C-2), 51.1 (COOCP ₃ -9'), 39.5 (CH ₂ -T), 39.0 (CH ₂ -5'), 31.3 (CH ₂ -3), 27.9 (CH ₂ -6'), 23.9 (CH ₃ -12'), 22.3 (CH ₂ -4), 22.0 (CH ₂ -2'), 20.5 (CH ₃ -10'), 16.0 (CH ₃ -13'), 15.7 (CH ₃ -1 1';) HREIMS m/z 372.236641 [M] ⁺ (372.230060 caled para C ₂₃ H ₃₂ C>4).

Compuesto 6. A una suspensión de policerasoidol (1) (100 mg, 0.3 mmol) y K ₂ C0 ₃ (100 mg) en acetona (5 ml_), se añadió cloruro de benzoilo PhCOCI (25 mI_, 0.2 mmol) y la mezcla se agitó a reflujo durante 2 h. Transcurrido este tiempo se añadió metil bromoacetato BrCH ₂ COOCH ₃ (20 mI_, 0.2 mmol) y la mezcla se agitó a reflujo durante 15 h. Tras extracción habitual, el crudo de reacción se purificó mediante cromatografía en columna de sílica gel (hexano-AcOEt, 90: 10) para obtener el compuesto 6 (55 mg, 35 %). RMN ¹ H (400 MHz, CDCI ₃ ) d 8.18 (dd, 2H, J= 1.5, 7.7 Hz, H-2" y H-6" de OCOP/7-6), 7.62 (td, J= 1.5, 7.7 Hz, H-4" de OCOP/7-6), 7.50 (td, 2H, J= 1.5, 7.7 Hz, H-3" y H-5" de OCOP/7-6), 6.80 (dd, J= 0.8, 2.8 Hz, H-7), 6.75 (dd, J= 0.8, 2.8 Hz, H-5), 6.02 (td, J= 1.2, 7.2 Hz, H-7'), 5.17 (td, J= 1.2, 7.2 Hz, H- 3'), 4.69 (s, 2H, COOCH ₂ COOCH ₃ -9'), 3.77 (s, 3H, COOCH ₂ COOCH ₃ -9'), 2.77 (m, 2H, CH ₂ - 4), 2.61 (m, 2H, CH ₂ -6'), 2.18 (s, 3H, CH ₃ -13'), 2.15-2.06 (m, 4H, CH ₂ -2', CH ₂ -5'), 1.94 (d, 3H, J= 1.6 Hz, CH ₃ -10'), 1.80-1.62 (m, 4H, CH ₂ -3, CH ₂ -T), 1.57 (s, 3H, CH ₃ -11 '), 1.30 (s, 3H, CH ₃ - 12'); RMN ¹³ C (100 MHz, CDCI ₃ ) d 170.0-165.0 (3C, OCOPh-6 y COOCH ₂ COOCH ₃ -9'), 149.5 (C-6), 145.0 (CH-7'), 142.7 (C-8a), 134.4 (C-1 " de OCOP/7-6), 134.2 (C-4'), 130.1-128.5 (5CH, de OCOP/7-6), 127.4 (C-8'), 125.9 (C-8), 124.9 (CH-3'), 121. 2 (CH-7), 120.9 (C-4a), 119.2 (CH-5), 75.9 (C-2), 60.4 (COOCP ₂ COOCH ₃ -9'), 52.2 (COOCH ₂ COOCP ₃ -9'), 39.8 (CH ₂ -T), 39.0 (CH ₂ -5'), 31.0 (CH ₂ -3), 28.0 (CH ₂ -6'), 24.1 (CH ₃ -12'), 22.4 (CH ₂ -4), 22.1 (CH ₂ -2'), 20.5 (CH ₃ -10'), 16.1 (CH ₃ -13'), 15.7 (CH ₃ -1 1';) HREIMS m/z 534.267390 [M] ⁺ (534.261754 caled para C ₃₂ H ₃₈ 0 ₇ ).

Compuesto 7. A una suspensión de policerasoidin (2) (20 mg, 0.05 mmol) y K ₂ C0 ₃ (20 mg) en acetona (5 ml_), se añadió dimetil bromomalonato BrCH(COOCH ₃ ) ₂ (5 mI_, 0.05 mmol) y la mezcla se agitó a reflujo durante 6 h. Transcurrido este tiempo, se añadió metil bromoacetato BrCH ₂ COOCH ₃ (20 mI_, 0.2 mmol) y la mezcla se agitó a reflujo durante 15 h. Tras extracción habitual, el crudo de reacción se purificó mediante CCF preparative (hexano-AcOEt, 80:20) para obtener el compuesto 7 (17 mg, 67 %). RMN ¹ H (300 MHz, CDCI ₃ ) d 6.56 (d, J= 2.8 Hz, H-7), 6.44 (d, J= 2.8 Hz, H-5), 6.08 (td, J= 1.3, 7.2 Hz, H-7'), 5.62 (s, COOCP(COOCH ₃ ) ₂ -9'), 5.16 (t, J= 6.6 Hz, H-3'), 3.83 (s, 6H, COOCH(COOCP ₃ ) ₂ -9'), 3.73 (s, 3H, COOCP ₃ -6), 2.75- 2.71 (m, 2H, CH ₂ -4), 2.66-2.59 (m, 2H, CH ₂ -6'), 2.18-2.05 (m, 4H, CH ₂ -2' y CH ₂ -5'), 2.15 (s, 3H, CHs-13'), 1.96 (d, 3H, J= 1.3 Hz, CH ₃ -10'), 1.90-1.73 (m, 4H, CH ₂ -3, CH ₂ - 1'), 1.59 (s, 3H, CH ₃ - 1 1), 1.26 (s, 3H, CH ₃ -12'); RMN ¹³ C (75 MHz, CDCl ₃ ) d 169.0-167.2 (3C,

COOCH(COOCH ₃ ) ₂ -9'), 151.5 (C-6), 145.4 (C-8a), 144.4 (CH-7'), 133.7 (C-4'), 126.6 (C-8'), 126.1 (COOCH(COOCH ₃ ) ₂ -9'), 125.3 (C-8), 124.4 (CH-3'), 121.0 (C-4a), 115.0 (CH-7), 1 11.0 (CH-5), 75.4 (C-2), 56.1 (OCH ₃ -6), 52.1 (2C, COOCH(COOCH ₃ ) ₂ -9'), 40.0 (CH ₂ -1 '), 39.0 (CH ₂ - 5'), 31.3 (CH ₂ -3), 28.3 (CH ₂ -6'), 24.1 (CH ₃ -12'), 23.3 (CH ₂ -4), 22.2 (CH ₂ -2'), 20.3 (CH ₃ -10'), 16.3 (CH ₃ -13'), 16.0 (CH ₃ -11 '); HREIMS m/z 502.263390 [M] ⁺ (502.256669 caled para C ₂₈ H ₃₈ 0 ₈ ).

Compuesto 8. A una suspensión de policerasoidin (2) (20 mg, 0.05 mmol) y K ₂ C0 ₃ (20 mg) en acetona (5 mL), se añadió metil bromoacetato BrCH ₂ COOCH ₃ (5 mI_, 0.05 mmol) y la mezcla se agitó a reflujo durante 6 h. Tras extracción habitual, el crudo de reacción se purificó mediante CCF de sílica gel preparativa (hexano-AcOEt, 80:20) para obtener el compuesto 8 (15 mg, 67 %). RMN ¹ H (300 MHz, CDCI ₃ ) d 6.56 (d, J= 2.7 Hz, H-7), 6.44 (d, J= 2.7 Hz, H-5), 6.00 (td, J= 1.5, 7.2 Hz, H-7'), 5.15 (td, J= 1.5, 7.2 Hz, H-3'), 4.68 (s, 2H, COOCH ₂ COOCH ₃ - 9'), 3.76 (s, 3H, COOCH ₂ COOCH ₃ -9'), 3.73 (s, 3H, COOCH ₃ -6), 2.73 (t, 2H, J= 7.0 Hz, CH ₂ - 4), 2.59 (dd, 2H, J= 7.2, 14.8 Hz, CH ₂ -6'), 2.15 (s, 3H, CH ₃ -13'), 2.10-2.04 (m, 4H, CH ₂ -2' y CH ₂ -5'), 1.93 (d, 3H, J= 1.4 Hz, CH ₃ -10'), 1.79-1.56 (m, 4H, CH ₂ -3, CH ₂ -T), 1.59 (s, 3H, CH ₃ - 11') , 1.26 (s, 3H, CH ₃ -12'); RMN ¹³ C (75 MHz, CDCI ₃ ) d 168.8 y 167.4 (2C, COOCH ₂ COOCH ₃ - 9'), 152.5 (C-6), 146.4 (C-8a), 145.4 (CH-7'), 134.7 (C-4'), 127.6 (C-8'), 126.3 (C-8), 125.4 (CH- 3'), 121.3 (C-4a), 1 15.2 (CH-7), 11 1.4 (CH-5), 75.7 (C-2), 60.8 (COOCH ₂ COOCH ₃ -9'), 56.0 (OCH ₃ -6), 52.6 (COOCH ₂ COOCH ₃ -9'), 40.1 (CH ₂ -T), 39.4 (CH ₂ -5'), 31.8 (CH ₂ -3), 28.4 (CH ₂ - 6'), 24.4 (CH ₃ -12'), 23.1 (CH ₂ -4), 22.6 (CH ₂ -2'), 20.9 (CH ₃ -10'), 16.6 (CH ₃ -13'), 16.1 (CH ₃ -1 ; 1') HREIMS m/z 444.252007 [M] ⁺ (444.251189 caled para C ₂₆ H ₃₆ 0 ₆ ).

1.3. Síntesis del compuesto 9:

(a) Síntesis de benzopiran-4-ona: 2,5-dihidroxiacetofenona (0.5 g, 3.28 mmol), etil levulinato (0.46 mL, 3.28 mmol) y pirrolidina (0.87 ml_, 9.86 mmol), se disolvieron en EtOH absoluto (10 ml_) con tamiz molecular de 3-Á (100 mg). ⁶ La mezcla se agitó a 45°C durante 24 h bajo atmósfera de N2. Transcurrido este tiempo, la mezcla de reacción se filtró, y el filtrado se diluyó con CH2CI2 (100 mL) y se lavó con HCI 1 N (3 x 50 mL), H2O (3 x 50 mL) y sal muera (3 x 50 mL), se secó sobre Na ₂ S0 ₄ anhidro y se evaporó en el rotavapor. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de sílica gel (hexano-AcOEt, 70:30) para obtener la benzopiran-4-ona (729 mg, 2.62 mmol, 80%) como un aceite amarillo. RMN ¹ H (400 MHz, CDCI3) d 7.34 (d, J= 3.0 Hz, H-5), 7.07 (dd, J= 8.9, 3.0 Hz, H-7), 6.80 (d, J= 8.9 Hz, H-8), 4.14 (q, J= 7.1 Hz, 2H, COOCH2CH3), 2.78 (d, J= 16.7 Hz, 1 H, CH _2a -3), 2.63 (d, J= 16.7 Hz, 1 H, CH _2b -3), 2.53-2.46 (m, 2H, CH ₂ -2'), 2.1 (m, 2H, CH ₂ -1 '), 1.38 (s, 3H, CH ₃ -4'), 1.25 (t, J= 7.1 Hz, 3H, COOCH2CH3); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCI3) d 193.0 (C-4), 173.3 (COOCH ₂ CH ₃ -3'), 153.7 (C-8a), 150.2 (C-6), 125.2 (CH-7), 120.1 (C-4a), 119.5 (CH-8), 1 10.6 (CH-5), 79.8 (C- 2), 60.8 (COOCH2CH3), 47.2 (CH ₂ -3), 34.1 (CH ₂ -1 '), 28.7 (CH ₂ -2'), 23.3 (CH ₃ -4'), 14.1 (COOCH2 CH ₃ y, EIMS m/z 278 [M: CI ₅ HI ₈ 0 ₅ ] ⁺ (35), 233 (25), 177 (100), 137 (75); HREIMS (%) m/z 278.1 1408 [M] ⁺ (278.1 1542 caled para CI ₅ HI ₈ 0 ₅ ).

(b) Reducción del grupo cetona: Se disolvió el benzopiran-4-ona (0.4 g, 1.44 mmol) en una mezcla de AcOH-H ₂ 0 (2: 1 , v/v) (14 mL). Entonces, se añadió poco a poco Zn en polvo (1.69 g, 25.92 mmol) y HCIconc (9 mL) durante 30 min y la mezcla se agitó durante 1 h a temperatura ambiente. Se añadió H2O (15 ml_) a la mezcla de reacción y se filtró y el filtrado se extrajo con AcOEt (3 x 15 ml_). Las fases orgánicas se combinaron, se secaron sobre Na ₂ S0 ₄ anhidro y se evaporó en el rotavapor. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de sílica gel (hexano-AcOEt, 85: 15) para obtener el éster de benzopirano (220.3 mg, 0.834 mmol, 58%) como un aceite incoloro. RMN ¹ H (300 MHz, CDCI ₃ ) d 6.55 (m, 3H, H-5, H-7, H-8), 4.12 (q, J= 7.1 Hz, 2H, COOCH2CH3), 2.70 (m, 2H, CH ₂ -4), 2.44 (t, J= 7.7 Hz, 2H, H-2'), 2.05-1.70 (m, 4H, CH2-3, CH2-I'), 1.23 (s, 3H, CH ₃ -2), 1.24 (t, J= 7.1 Hz, 3H, COOCH2CH3); ¹³ C NMR (75 MHz, CDCb) d 174.1 (COOCH ₂ CH ₃ -3'), 148.8 (C-6), 147.4 (C-8a), 121.6 (CH-7), 117.8 (CH- 8), 1 15.4 (C-4a), 114.6 (CH-5), 74.6 (C-2), 60.5 (COOCH2CH3), 34.3 (CH ₂ -3), 31.1 (CH ₂ -T), 28.8 (CH ₂ -2'), 34.3 (CH ₂ -3), 23.7 (CH ₃ -2), 22.1 (CH ₂ -4), 14.1 (COOCH ₂ CH3). EIMS m/z 264 [M: CI ₅ H _2O 0 ₄ ] ⁺ (100), 218 (50), 163 (35), 123 (55). HREIMS (%) m/z 264.13562 [M] ⁺ (264.13616 caled para C15H20O4) (100).

(c) O-protección del éster de benzopirano: Una suspensión de éster de benzopirano (0.5 g, 1.89 mmol), cloruro de p-flurobencilo pF(Ph)CH ₂ CI (0.3 mL, 2.46 mmol), K2CO3 anhidro (0.4 g, 2.83 mmol) en EtOH absoluto (20 mL) se agitó a 65°C bajo atmósfera de N ₂ durante 4 h. La mezcla de reacción se evaporó en el rotavapor, se añadió H ₂ 0 (3 x 20 mL) y se extrajo con CH2CI2 (3 x 15 mL). Las fases orgánicas se combinaron, se lavaron con HCI 1 M (2 x 15 mL) y salmuera (2 x 15 mL), deshidrataron con Na ₂ SC>4 anhidro y se evaporaron a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de sílica gel (hexano- AcOEt, 90:10) para obtener el éster de benzopirano O-protegido (556 mg, 1.49 mmol, 79%) como un aceite incoloro. RMN ¹ H (300 MHz, CDCI ₃ ) d 7.39 (m, 2H, H-2", H-6"), 7.05 (m, 2H, H-3", H-5"), 6.70 (m, 3H, H-5, H-7, H-8), 4.94 (s, 2H, p-F-PhCHgO), 4.13 (q, J= 7.1 Hz, 2H, CO2CH2CH3), 2.76 (t, 2H, J= 6.7 Hz, CH ₂ -4), 2.48 (t, J= 7.7 Hz, 2H, CH ₂ -2'), 1.91 (m, 4H, CH ₂ - 3, CH ₂ -T), 1.24 (t, J= 7.2 Hz, 3H, C0 ₂ CH ₂ CH ₃ -3'); RMN ¹³ C (75 MHz, CDCI ₃ ) d 173.6 (COOCH ₂ CH ₃ -3'), 162.3 (d, _C F=243.7 HZ, C-4"), 152.0 (C-6), 147.9 (C-8a), 133.1 (d, J _c F= 3 Hz, C-1"), 129.1 (d, 2C, _C F= 8.3 Hz, C-2", C-6"), 121.4 (C-4a), 1 17.7 (CH-5), 1 15.2 (d, 2C, CF= 24.8 Hz, CH-3", CH-5"), 1 15.1 y 114.4 (CH-7 y CH-8), 74.6 (C-2), 69.9 (p-F-PhCH ₂ O), 60.3 (C0 ₂ CH ₂ CH ₃ ), 34.3 (CH ₂ -T), 31.0 (CH ₂ -3), 28.7 (CH ₂ -2'), 23.6 (CH ₃ -2), 22.2 (CH ₂ -4), 14.1 (C0 ₂ CH ₂ CH ₃ )·, HREIMS m/z (%) 372.1730 [M] ⁺ (372.173688 caled para C ₂₂ H ₂₅ 0 ₄ F) (83).

(d) Reducción del éster de benzopirano O-protegido Una disolución de éster de benzopirano O-protegido (0.2 g, 0.54 mmol) en CH ₂ CI ₂ anhidro (6 mL) a -78°C bajo atmósfera de N ₂ se agitó durante 15 min. A esta disolución se le añadió gota a gota una disolución de hidruro de diisobutilaluminio (DIBAL-H) 1 M en THF (2.47 mL, 2.47 mmol). Transcurridos 20 min, se detuvo la reacción mediante adición de MeOH (1 mL) y se agitó durante 15 min, y entonces se añadió una disolución acuosa saturada de NH4CI (1 mL). La mezcla se agitó durante 1 h a temperatura ambiente, se filtró y el filtrado se extrajo con AcOEt (3 x 15 mL). Se combinaron las fases orgánicas, se secaron sobre Na ₂ S0 ₄ anhidro y se evaporó a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna (hexano-AcOEt, 90: 10) para obtener el aldehido (128 mg, 0.34 mmol, 63%) como un aceite incoloro. RMN ¹ H (300 MHz, CDCIs) d 9.78 (t, J= 1.6 Hz, 1 H, CHO), 7.39 (m, 2H, H-2" y H-6"), 7.06 (m, 2H, H-3" y H-5"), 6.73 (m, 3H, H-5, H-7, H-8), 4.94 (s, 2H, OCH ₂ Ph-p-F), 2.75 (m, 2H, CH ₂ -4), 2.60 (m, 2H, CH ₂ - 2'), 1.90 (m, 4H, CH ₂ -3, CH ₂ -T), 1.30 (s, 3H, CH ₃ -2); RMN ¹³ C (75 MHz, CDCIs) d 202 (CHO), 162.4 (d, _C F=244.4 HZ, C-4"), 152.1 (C-6), 147.7 (C-8a), 133.1 (d, J _c F= 3.3 Hz, C-1"), 129.3 and 129.2 (d, 2C, JCF= 8.3 Hz, C-2", C-6"), 121.4 (C-4a), 117.7 (CH-5), 1 15.2 (d, 2C, JCF= 24.8 Hz, CH-3", CH-5"), 115.2 y 114.5 (CH-7 y CH-8), 74.6 (C-2), 69.9 (OCH ₂ Ph-p-F), 38.4 (CH ₂ - 2'), 31.8 (CH ₂ -1 '), 31.2 (CH ₂ -3), 23.7 (CH ₃ -2), 22.3(CH ₂ -4); HREIMS m/z (%) 329.1552 [M] ⁺ (329.1547 caled para C ₂₀ H ₂ I O ₃ F), 343.1710 (343.1704 caled para C _2i H ₂₃ 0 ₃ F).

(e) Reacción de Grignard y transposición de Johnson-Claisen: Una disolución del intermedio aldehido (0.2 g, 0.61 mmol) en THF anhidro (5 ml_) se agitó a -78°C bajo atmósfera de N ₂ durante 15 min, y entonces se trató con una solución de bromuro de isopropenilmagnesio 0.5 M (7.32 ml_, 3.66 mmol) (Sen et al., 1990). ⁷ La mezcla se agitó a - 78°C durante 3 h. La mezcla de reacción se trató con una solución de NH ₄ CI saturada y se agitó durante 15 min a temperatura ambiente. Se añadió H ₂ 0 y se extrajo con con AcOEt (3 x 15 mL). Se combinaron las fases orgánicas y la fase orgánica resultante se lavó con H ₂ 0 (3 x 15 mL) y sal muera (3 x 15 mL), se deshidrató con Na ₂ S0 ₄ anhidro y se concentró en el rotavapor.

El residuo obtenido (250 mg) se utilizó en la siguiente reacción sin purificar. El residuo se trató con 10 mL de trietil ortoacetato y cantidades catalíticas de ácido isobutírico (3 gotas) (Sen et al., 1990). ⁷ La mezcla se agitó a 140°C durante 2 h. Después de enfriar, la mezcla se concentró en el rotavapor para eliminar el exceso de trietilortoacetato. El residuo se diluyó con CH ₂ CI ₂ (20 mL) y se lavó con H ₂ 0 (3 x 15 mL), se deshidrató con Na ₂ S0 ₄ anhidro y se concentró en el rotavapor. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de sílica gel (hexano/ AcOEt, 98:2) para obtener 126 mg de compuesto 9 (0.29 mmol, 47 %). RMN ¹ H (500 MHz, CDCI ₃ ) d 7.39 (m, 2H, H-2" y H-6"), 7.06 (m, 2H, H-3" y H-5"), 6.73 (m, 3H, H-5, H-7, H-8), 5.14 (t, J= 7.0 Hz, 1 H, CH-3'), 4.94 (s, 2H, OCHgPh-p-F), 4.11 (q, J= 7.4 Hz, 2H, COOCH ₂ CHs), 2.72 (t, J= 6.8, 2H, CH ₂ -4), 2.39 (m, 2H, CH ₂ -6'), 2.28 (m, 2H, CH ₂ -5'), 2.08 (m, 2H, CH ₂ -2'), 1.82 (m, 2H, CH ₂ -3), 1.67 (m, 6H, CH ₂ -T), 1.60 (s, 3H, CH ₃ -4'), 1.27 (s, 3H, CH ₃ -2), 1.23 (t, J=

7.3 Hz, 3H, COOCH ₂ CH ₃ ); RMN ¹³ C (125 MHz, CDCIs) d 173.4 (CO), 162.4 (d, _C F=245 HZ, C-4"), 151.9 (C-6), 148.2 (C-8a), 133.5 (C-4'), 133.3 (d, J _C F= 3 Hz, C-1"), 129.2 (d, 2C, JCF=

8.3 Hz, C-2", C-6"), 124.9 (C-3'), 121.7 (C-4a), 117.8 (CH-5), 115.3 (d, 2C, JCF= 24.8 Hz, CH- 3", CH-5"), 115.2 y 1 14.4 (CH-7 y CH-8), 75.6 (C-2), 70.1 (OCH ₂ Ph-p-F), 60.2 (COOCH ₂ CH ₃ ), 39.2 (CH ₂ -1 '), 34.6 (CH ₂ -6'), 33.2 (CH ₂ -5'), 30.9 (CH ₂ -3), 24.1 (CH ₃ -2), 22.4 (CH ₂ -4), 22.2 (CH ₂ - 2'), 15.8 (CHs-4'), 14.2 (COOCH ₂ CH ₃ ); HREIMS m/z (%) 441.2441 [M] ⁺ (441.2436 caled para C ₂₇ H ₃₃ F0 ₄ ). 1.4. Síntesis de los compuestos 10 a 12:

Se procede a realizar los pasos (a), (b), (c), (d) y (e) tal como se describen en la sección 1.3 para el compuesto 9, si bien, la O-protección del éster de benzopirano se realiza en el caso de los compuestos 10 y 11 con cloruro de bencilo (Ri= bencilo) y en el caso del compuesto 12 con cloruro de p-flurobencilo (Ri= p-FluoroBn).

Una vez realizado el paso (e), se vuelve a realizar una reducción del grupo éster, obtenido mediante transposición de Johnson-Claisen, para volver a obtener un aldehido, de acuerdo con las condiciones descritas en el paso (d) de la sección 1.3.

Los compuestos 10 y 12 se obtienen mediante olefinación del aldehido obtenido llevando a cabo la reacción de Wittig con un iluro de fósforo (Ph)3P=C(CH2CH3)(COOCH2CH3) o la reacción de Horner-Wadsworth-Emmons con un fosfonato (EtO) ₂ P(0)- CH(CH2CH3)(COOCH2CH3). El compuesto 11 se obtiene por hidrólisis del grupo éster, mediante tratamiento con KOH a reflujo del compuesto 10.

1.5. Síntesis del compuesto 13:

Se procede a realizar los pasos (a), (b), (c) y (d) tal como se describen en la sección 1.3, en donde la O-protección del éster de benzopirano se realiza con cloruro de bencilo. El aldehido obtenido tras el paso (d) se somete a olefinación llevando a cabo la reacción de Wittig con un iluro de fósforo (Ph)3P=C(CH2CF3)(COOCH2CH3) o la reacción de Horner-Wadsworth- Emmons con un fosfonato (Et0)2P(0)-CH(CH2CF3)(C00CH2CH3).

Estudios in vitro

Ejemplo 2: Evaluación de la transactivación hPPARa v hPPARy

Los compuestos naturales 1 y 2, los compuestos 3-8 y el compuesto (9), se estudiaron in vitro mediante ensayos de transactivación PPARa/g. Se utilizó un ensayo de transcripción en células Cos-7 transitoriamente transfectadas con un plásmido reportero de luciferasa en presencia de vectores de expresión pGAL4hPPARa y pGAL4hPPARy (Carmona et al., 2007). Las células Cos-7 se obtuvieron de la ATCC (CRL-1651). Las células se mantuvieron bajo condiciones de cultivo estándar (medio esencial mínimo de Eagle modificado por Dulbecco, DMEM, por sus siglas en inglés) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FCS) a 37°C en una atmósfera de humedad al 5% CO2. El medio se cambiaba cada 2 días. Las células Cos-7 se sembraron en discos de 60 mm a una densidad de 5,5 x 10 ⁵ células/disco en DMEM supiementado con 10% de FCS e incubado a 37°C durante 16 h antes de la transfección. Las células fueron transfectadas en DMEM, usando jetPEI, con reportador (pG5-TK-pGL3) y plásmidos de expresión (pGal4-h, hPPARa o hPPARy). El plásmido de expresión pCMV-b- galactosidasa se co-transfectó como control para la eficiencia de la transfección. Después de 16 h se detuvo la transfección adicionando DMEM supiementado con 10% FCS, y las células se tripsinizaron y sembraron en placas de 96-pocillos e incubaron durante 6 h en DMEM conteniendo 10% FCS. Posteriormente, las células se incubaron durante 24 h en DMEM conteniendo 0,2% FCS y se ensayaron concentraciones crecientes de los compuestos o del vehículo (DMSO, concentración máxima 0,1%). Finalmente, las células se lavaron una vez con PBS enfriado sobre hielo, se Usaron y se realizaron los ensayos de luciferasa y b- galactosidasa.

Para evaluar los compuestos sobre la actividad transcripcional PPAR, los ensayos se llevaron a cabo en una quimera de un sistema de gen reportero de luciferasa PPAR/Gal4 humano para determinar la respuesta de transactivación máxima de cada compuesto. Los distintos compuestos se ensayaron en un rango de concentraciones de 0,001 a 10 mM. Los resultados obtenidos de todos los compuestos se compararon con los datos de los compuestos de referencia WY-14643 y rosiglitazona en hPPARa y hPPARy, respectivamente.

Los resultados se resumen en la Tabla 1.

( ^a ) Máxima actividad obtenida con cada compuesto expresada como porcentaje de actividad máxima de WY-14643 para PPARa (CE50 12 pM) y rosiglitazona para PPARy (CE50 4 nM) respectivamente. (NA: no activo sobre el hPPAR ensayado). De entre todos los compuestos ensayados, el producto natural policerasoidol (1) mostró la mayor actividad agonista dual PPARa/g y su respuesta máxima resultó comparable a la obtenida por los compuestos de referencia (WY-14643 y rosiglitazona). Los datos de CE50 mostraron que el compuesto natural 1 , y su derivado semisintético 3, con el grupo fenólico libre, presentan actividad agonista total sobre hPPARa y hPPARy, y elevados porcentajes de transactivación (107-100% y 95-86% para hPPARa y hPPARy, respectivamente). El compuesto 4c, el derivado O-propilado con una función carboxílica libre en C-9’, mostraba el máximo porcentaje de transactivación (191 % y 88% para hPPARa y hPPARy, respectivamente). Los otros derivados de policerasoidol (4a, 4b y 5) mostraron porcentajes de transactivación más bajos que los compuestos 1 , 3 y 4c a las concentraciones ensayadas. Las modificaciones sobre el grupo carboxílico en C-9’ de la cadena lateral en posición 2, introduciendo el grupo COOCH(COOCH3)2 daba lugar al compuesto 7 con selectividad sobre la activación PPARa (76% para hPPARa y 37% para hPPARy). Sin embargo, el derivado 8, con un grupo COOCH2COOCH3 en C-9’, mostró una menor activación PPARa (39% para hPPARa y 24% para hPPARy). El compuesto 9 también mostró una actividad agonista dual y un porcentaje de transactivación elevado (251 % para hPPARa y 57% para hPPARy, respectivamente).

Los compuestos 10, 11 , 12 y 13 también mostraron actividad agonista dual PPARa y PPARy, destacando la potencia del compuesto 11 , con porcentajes de transactivación del 96% y 62% para hPPARa y hPPARy respectivamente.

Cabe destacar que el compuesto 1 (natural) y 9 (sintético) mostraron una potente acción agonista dual de los receptores PPARa y PPARy. El compuesto 2 presentó una actividad dual PPARa/y moderada y el compuesto 8 desplazaba su selectividad hacia la activación de PPARy (Tabla 1).

Ejemplo 3: Estudios de citotoxicidad en neutrófilos humanos v células endoteliales de venas de cordón umbilical humano (HUVEC)

Anteriormente se ha mencionado que existen importantes limitaciones en la utilización de agonistas PPAR para su uso en humanos, debido a sus efectos adversos como hepatotoxicidad, cáncer, cardiotoxicidad u otros efectos cardiovasculares. Los glitazares son los compuestos más estudiados con actividad agonista PPARy, sin embargo, como hemos mencionado en la introducción, únicamente está aprobado el uso de los agonistas duales saroglitazar (Lipaglyn™) en la India desde 2013 y lobeglitazona en Corea (Duvie™) con efectos antidiabéticos e hipolipemiantes. En la actualidad, existe un mayor interés en desarrollar agonistas duales PPARa y PPARy que muestren menos efectos adversos que los ligandos selectivos a o y (Tan et al., 2017). Con la finalidad de evaluar los posibles efectos adversos (citotoxicidad) de los compuestos de la invención, los compuestos 1 , 2 y 8 así como los compuestos de referencia, se evaluaron a concentraciones de 30 y 100 mM en neutrófilos humanos (Fig. 1A) y cultivos celulares primarios de células endoteliales de venas de cordón umbilical humano (HUVEC) (Fig. 1 B) mediante dos técnicas distintas: el ensayo de colorimetría de MTT y el análisis de citometría de flujo de apoptosis celular y supervivencia. Además, el compuesto sintetizado 9 se evaluó a 10, 30 y 100 pM (Fig. 2).

Ensayo de MTT. La viabilidad de neutrófilos y HUVEC se determinó mediante el ensayo de colorimetría de MTT (bromuro de 3(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio).

Se obtuvieron neutrófilos a partir de la fracción leucoplaquetaria ( buffy coats) de donantes sanos mediante centrifugación con gradiente de densidad de Ficoll-Hypaque.

Las células endoteliales de venas de cordón umbilical humano (HUVEC) se aislaron mediante el tratamiento de colagenasa y mantenidas en medio basal endotelial específico humano (EBM-2) suplementado con medio de crecimiento endotelial (EGM-2) y 10% FCS. Se cultivaron células de pase 1 hasta confluencia en placas de 24-pocillos. Antes de iniciar cada experimento, las células se incubaron 24 h en medio conteniendo 1 % FBS.

Se añadieron 100 pL de neutrófilos y la suspensión de HUVEC en medio RPMI suplementado (2 x 10 ⁵ células/mL) a cada pocilio de una placa de 96-pocillos. Las células se incubaron en ausencia y/o presencia de los compuestos a 37°C durante 24h. Se preparó una disolución de MTT (2 mg/mL en PBS). Se añadieron 100 pL de la disolución de MTT a cada pocilio y se incubó a 37°C durante otras 3 h. Los sobrenadantes se descartaron y se añadieron 200 pL de DMSO a cada pocilio para disolver el precipitado de formazán. Se midieron las densidades ópticas a dos longitudes de onda (560 y 630 nm) en un espectrofotómetro (Infinite M200, Tecan, Mannedorf, Suiza).

Todos los compuestos mostraron una citotoxicidad significativa a 100 pM sobre ambos tipos de células (Figuras 1 y 2). Policerasoidin (2) y el derivado 8 también presentaron toxicidad a 30 pM en neutrófilos y HUVEC, y WY-14643 produjo citotoxicidad a 30 pM (9%) pero solo en neutrófilos humanos (Fig. 1). El compuesto sintetizado 9, mostró únicamente citotoxicidad en HUVEC a 30 pM (Fig. 2) pero del 12% respecto al vehículo.

Además, la tasa de apoptosis y supervivencia en neutrófilos humanos y HUVEC se determinó mediante doble tinción con anexina V y yoduro de propidio (Pl) mediante citometría de flujo.

Análisis de citofluorometría de apoptosis y supervivencia. Se utilizó el kit FITC Annexin V Apoptosis Detección (BD Bioscience, San José, CA). El protocolo de tinción y todos los reactivos se suministraron en el kit comercial. Las HUVEC se separaron de los frascos de cultivo mediante acutasa (StemPro® Accutase® Cell dissociation reagent, Thermofischer Scientific Waltham, MA). Ambos tipos celulares se incubaron a 37°C durante 24h en presencia o ausencia de los compuestos a ensayar. HUVEC confluentes y neutrófilos recién aislados se lavaron, resuspendieron en binding buffer 1x (1 x 10 ⁶ cells/ml_) y se tiñeron con anexina V conjugada con FITC y yoduro de propidio (Pl), tal y como se describe en las instrucciones del fabricante. Las células se analizaron en un citómetro de flujo BD FACSVerse Flow Cytometer (BD Biosciences, San José, CA) y se diferenciaron como células de apoptosis temprana (anexina V ⁺ y Pl ), apoptosis tardía y/o necrótica (anexina V ⁺ y Pl ⁺ ), y células vivas (anexina V- y PI-).

En neutrófilos, solo el compuesto 8 y rosiglitazona a la dosis de 100 mM causó un efecto mínimo en la supervivencia celular (5,3% y 8,5% respectivamente) (Figura 3B). El compuesto de síntesis 9 también provocó un efecto mínimo en la supervivencia de neutrófilos a las dosis de 30 y 100 mM (1 ,07% y 1 ,55%, respectivamente), en comparación con el vehículo (Figura 4B). Por el contrario, todos los compuestos aumentaron la apoptosis de forma significativa y disminuyeron la supervivencia a partir de 30 pM en células HUVEC, con excepción de policerasoidol (1) (Figura 3C y D) y el compuesto 9 (Figura 4C y D). En HUVEC, los compuestos más tóxicos fueron policerasoidin (2), su análogo 8 y rosiglitazona, que disminuyeron la supervivencia celular un 38,9, 61 ,3 y 79,2%, respectivamente, a 100 pM y ejercieron algunos efectos significativos a 30 pM (Figura 3C y D). Cabe destacar la ausencia de toxicidad del compuesto 9 en HUVEC a las dosis ensayadas, incluida a 100 pM, en comparación con el vehículo (Figura 4 C y D).

En la introducción hemos mencionado el uso limitado en humanos de numerosos agonistas PPARa y PPARy debido a problemas de toxicidad que conlleva a importantes efectos adversos. De hecho, a pesar de que rosiglitazona ejerce numerosos efectos beneficiosos en pacientes con diabetes tipo 2, las evidencias de sus efectos adversos cardiovasculares que incluyen aumento del riesgo de infarto de miocardio e insuficiencia cardiaca, ha obligado la retirada del fármaco en numerosos países de la Comunidad Europea (Palee et al., 2011). Así pues, los estudios de toxicidad son importantes en este tipo de compuestos y mediante los ensayos de MTT y citometría de flujo hemos demostrado que los compuestos 1 y 9 son menos citotóxicos que los agonistas específicos de referencia para PPARa y PPARy.

Ejemplo 4: Efecto de los compuestos 1. 2. 8 9 sobre la interacción leucocito-endotelio inducida por TNFa bajo condiciones de flujo

El endotelio que recubre internamente los vasos sanguíneos presenta diversas funciones, cuyas alteraciones (“disfunción endotelial”) se han visto relacionadas con enfermedades cardiovasculares, tromboembolismo y aterosclerosis. De hecho, la disfunción endotelial es una de las primeras manifestaciones del inicio de aterosclerosis que conlleva a un fenotipo proinflamatorio y protrombótico del endotelio, provocando la liberación y migración de leucocitos al espacio subendotelial. Los PPAR, en particular PPARcr y PPARy, se expresan en la mayoría de las células vasculares, incluyendo endoteliales y células del músculo liso, donde participan en efectos antiinflamatorios específicos y el control lípidico (Rosenson et ai, 2012). ¹² Los agonistas PPARy (rosiglitazona) son capaces de inhibir el proceso inflamatorio, disminuyendo la acumulación de neutrófilos y células mononucleares (Palee et al., 2011).

Se utilizó la técnica de cámara de flujo paralelo que permite visualizar la adhesión celular bajo condiciones dinámicas de flujo fisiológico.

En la realización de este estudio, los neutrófilos y las células mononucleares se perfundieron a través de monocapas de HUVEC previamente estimuladas o no con TNFa (20 ng/mL) durante 24 h. Para ello, los neutrófilos y células mononucleares humanas se obtuvieron en suspensión de voluntarios sanos mediante el método Ficoll-Hypaque de centrifugación por gradiente de densidad. Las células recién aisladas (1 x 10 ⁶ /mL) se perfundieron a través de la monocapa de células endoteliales (HUVEC) estimuladas o no, con TNFa durante 24 h. En todos los experimentos, se determinaron las interacciones de los leucocitos después de perfundir durante 5 min a 0,5 dinas/cm ² . Las placas de HUVEC se colocaron en la cámara de flujo (GlycoTech, Gaithersburg, MD) y se acopló una cámara colocada sobre un microscopio invertido de contraste de fases (Axio Observer A1 Cari Zeiss microscope, Thornwood, NY) para visualizar la adhesión celular (objetivo 20x y un ocular 10x). Además, las imágenes se grabaron en vídeo para su posterior análisis.

Las HUVEC se pretrataron con policerasoidol (1), policerasoidin (2), el compuesto (8), o el compuesto 9 a dosis de 1 , 3, 10, 30 y 100 mM, así como WY-14643 o rosiglitazona a 1 pM, 20 horas antes de la estimulación con TNFa (Sanz et ai, 2012).

El TNFa provocó un aumento significativo en la adhesión a las células endoteliales de leucocitos mononucleares y neutrófilos (Figuras 5 y 6). Ninguno de los compuestos inhibió significativamente las interacciones HUVEC-neutrófilos a la concentración de 1 pM, sin embargo, cabe destacar que el pretratamiento con policerasoidol (1), el análogo sintetizado 9 y rosiglitazona disminuyeron significativamente la adhesión HUVEC-células mononucleares (Figuras 5 y 6) de forma concentración-dependiente (Figuras 5C y 6B). En este ensayo, policerasoidol (1) fue 5 veces menos potente que rosiglitazona, mientras que el compuesto 9 mostró una potencia de aproximadamente 3,6 y 16 veces mayor que rosiglitazona y policerasoidol, respectivamente (valores CI50 de 0,30 pM vs. 1 , 1 pM y 4,9 pM, respectivamente). Teniendo en cuenta estos resultados y los estudios de citotoxicidad sobre apoptosis y supervivencia en neutrófilos, podemos decir que policerasoidol (1) y el compuesto sintetizado 9, podrían actuar inhibiendo el reclutamiento de células mononucleares sin comprometer la respuesta inmunitaria de neutrófilos, necesaria para la defensa del huésped. Por lo tanto, parece que ambos compuestos son candidatos interesantes para una evaluación inmuno-farmacológica adicional, debido a la capacidad de estos compuestos para reducir el reclutamiento de células mononucleares, la potencia como agonistas duales de PPARa/g y la baja citotoxicidad.

Ejemplo 5: Policerasoidol (1 ) v el compuesto 9 inhibieron la adhesión celular mononuclear al endotelio, inducida por TNFa vía interacción RXRa/PPARv

Policerasoidol (1) y el compuesto sintetizado 9 son ligandos agonistas duales PPARa/g y rosiglitazona es un agonista selectivo PPARY. Para suprimir la expresión PPARa o PPARY en células endoteliales, hemos aplicado una aproximación de silenciamiento de genes mediante ARN de interferencia (siRNA).

Se transfectaron HUVEC confluentes con ARNsi de RXRa, PPARa, PPARY específicos (Dharmacon, Lafayette, CO) utilizando RNAiMAX de lipofectamina (Invitrogen, Carslbad, CA) durante 48 h (Sanz et al., 2012). ¹³ A continuación, las células se trataron durante 20 h con policerasoidol (1) a 10 mM o rosiglitazona a 1 mM y luego se estimularon durante 4 h con TNFa (10 ng/ml_). Con el fin de confirmar el silenciamiento PPARa, PPARY y RXRa vía ARNsi, se realizó el análisis mediante Western blot (Sanz etai, 2012). ¹³ Después de silenciar, se lavaron las células, se rasparon, se recogieron y se centrifugaron a 15.000 g a 4°C durante 30 min para obtener el extracto total de proteína. La concentración de proteína se determinó por el método de Bradford. Las muestras se desnaturalizaron, se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS al 10% (SDS-PAGE) y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon con BSA-PBS al 5% con Tween 20 al 0,05% y se incubaron con el anticuerpo correspondiente. Los anticuerpos policlonales de conejo frente a RXRa y PPARY (H-100) y el anticuerpo monoclonal de ratón frente a PPARa fueron adquiridos a Santa Cruz Biotechnology (dilución: 1 :400, Santa Cruz, CA). Los anticuerpos secundarios IgG anti-conejo o anti-ratón ligados a la peroxidasa de rábano fueron suministrados por DakoCytomation (dilución 1 :2000, Dinamarca).

Transcurridas las 48 horas de la transfección con siRNA específico de PPARa o PPARy, las HUVEC mostraron > 68% y 66% de reducción de proteína, respectivamente, en comparación con los niveles detectados en las células control tratadas con siRNA (Figura 7). En el control de células transfectadas-siRNA, la estimulación con TNFa inducía aumentos significativos en la adhesión de las células mononucleares que eran inhibidas cuando las células endoteliales se pretrataban con policerasoidol (1) o rosiglitazona (Figura 8A y B). Cabe destacar que, mientras estas respuestas no se veían afectadas por el silenciamiento PPARa (Figura 8A), las respuestas inducidas por policerasoidol (1) eran anuladas en HUVEC deficiente de PPARy (Figura 8B). Los PPAR forman heterodímeros con RXR que en algunos casos responden sinérgicamente a ambos agonistas, RXR y el receptor. Dado que PPARY puede interactuar con RXRa para producir su actividad antiinflamatoria (Sanz et al., 2012), la delección dirigida de la expresión de RXRa en HUVEC con siRNA específico de RXRa (>72% de reducción de proteína, Figura 7) también suprimió completamente el efecto inhibidor de policerasoidol (1) sobre la adhesión de células mononucleares inducida por TNFa (Figura 8C).

Además, para confirmar la interacción entre PPARY y RXRa, las HUVEC se inmunoprecipitaron con un anticuerpo anti-PPARY y se sometieron a electroforesis y western- blot con un anticuerpo anti-RXRa, y se detectó el aumento de la interacción RXRa/PPARY en aquellas células pretratadas con policerasoidol (1) o rosiglitazona (Figura 8D).

Para inmunoprecipitación, los extractos de proteína se obtuvieron en 50 mM Tris-HCI (pH 8), 150 mM NaCI, 1 % Nonidet P-40 y proteasa (1 mM PMSF, 40 pg/mL aprotinina y 40 pg/mL leupeptina) e inhibidores de fosfatasa. Entonces, los extractos de proteína (~200 pg) se incubaron con 5 pg de anticuerpo frente a PPARY. Se precipitaron inmunocomplejos utilizando un anti-conejo IgG beads (cat# 8800, eBioscience, San Diego, CA) y se suspendieron en tampón de muestra con 50 mM ditiotreitol (DTT). El Western blot se llevó a cabo con un anticuerpo frente a RXRa y las membranas se incubaron con el secundario HRP-conjugado Conejo TrueBlot (eBioscience, San Diego, CA) como anticuerpo secundario. Se desarrollaron señales de quimioluminiscencia con ECL (GE Healthcare, Madrid, España).

Este mismo experimento de inmunoprecipitación se llevó a cabo con el compuesto de síntesis 9 (Figura 9). Teniendo en cuenta los resultados, podemos concluir que policerasoidol (1) y el compuesto 9, no requieren la activación de PPARa para inhibir el reclutamiento de células mononucleares, pero necesitan la activación de RXRa y PPARY para ejercer su efecto antiinflamatorio, como ocurre con otros agonistas selectivos PPARY O RXRa (Sanz et al., 2012) .

Ejemplo 6: Policerasoidol (1 ) v el compuesto sintetizado 9 disminuyen la expresión de la molécula-1 de adhesión intercelular (ICAM-1), la molécula-1 de adhesión celular vascular (VCAM-1) v fractalquina (CX ₃ CLI), inducidas por TNFa

En enfermedades cardiovasculares y cardiometabólicas (hipertensión, obesidad, diabetes, síndrome metabólico) se han detectado niveles elevados de mediadores circulantes, entre otros, citoquinas y quimiocinas que pueden reflejar alteraciones en la función endotelial. Las citoquinas proinflamatorias estimulan el endotelio para expresar moléculas de adhesión celular (CAM), tales como la molécula-1 de adhesión celular vascular (VCAM-1) y la molécula- 1 de adhesión intercelular (ICAM-1), aumentando la adhesión de leucocitos a las células del endotelio vascular, que constituye un proceso importante de la etapa inicial de las respuestas inflamatorias e inmunológicas (Zernecke et al., 2010). PPARY se expresa en tejidos vasculares y leucocitos, y su activación puede disminuir la expresión de CAMs como ICAM-1 o VCAM-1 , así como la expresión de CX ₃ CLI (fractalquina). CX ₃ CLI es una quimiocina que se expresa en la superficie de células endoteliales, y puede unirse a su receptor CX ₃ CRI , expresado en monocitos, linfocitos T y células NK, promoviendo la adhesión celular. CX ₃ CLI también se puede desprender de la superficie celular por acción de ADAM10 y ADAM17, liberándose una forma soluble capaz de actuar como quimioatrayente de los leucocitos que expresan su receptor. Además de CX ₃ CLI , existe otra quimiocina transmembrana, CXCL16, que al igual que CX ₃ CLI , también se expresa en células endoteliales y puede desprenderse por la acción de ADAM10. Ejerce su acción interaccionando con su receptor CXCR6, presente en determinados subtipos leucocitarios, promoviendo la adhesión de los mismos a la superficie endotelial. Así, estas quimiocinas y moléculas de adhesión regulan la adhesión y migración de los leucocitos a la pared vascular, y existen indicios de que un incremento de su expresión endotelial está asociado a un incremento de la aterosclerosis (Zernecke et al., 2008).

Para investigar la expresión de VCAM-1 , ICAM-1 , fractalquina (CX3CLI) y CXCL16, se pretrataron HUVEC con policerasoidol (1) (10 mM) o el compuesto 9 (3 pM) durante 24 h, y se estimularon con TNFa (20 ng/ml_) durante 24 h adicionales. Las células se recogieron de los frascos utilizando accutasa (StemPro® Accutase® Cell Dissociation Reagent, ThermoFischer Scientific, Waltham, MA). Entonces, se lavaron e incubaron durante 1 h con un anticuerpo APC-conjugado mAb frente a VCAM-1 humano (100 pg/mL; clon STA, BioLegend, San Diego, CA), FITC-conjugado mAb frente a ICAM-1 humano (400 pg/mL; clon HA58, BioLegend, San Diego, CA), PE-conjugado mAb frente a CX3CLI humano (1 ,25 pg/mL; clon 51637, R&D Systems, Minneapolis, MN) o con un anticuerpo monoclonal APC-conjugado frente a CXCL16 humano (clon 256213, R&D Systems, Abingdon, Reino Unido), todos ellos a una dilución 1 :25 en 3% BSA/PBS. Las muestras se analizaron en un citómetro de flujo paralelo (FACSVerse, BD Biosciences, San José, CA).

En este estudio hemos demostrado que el pretratamiento de HUVEC con policerasoidol (1) durante 20 h a 10 pM disminuía significativamente la expresión de ICAM-1 y VCAM-1 , inducida por TNFa (Fig. 10), siendo el efecto más acusado en VCAM-1 (87,8% de inhibición) que ICAM- 1 (23,8% de inhibición). Para investigar el efecto de policerasoidol (1) sobre la expresión de fractalquina (CX ₃ CLI ), las células se estimularon con TNFa y las respuestas se evaluaron por citometría de flujo e inmunofluorescescia después de 24 h.

Los resultados mostraron que policerasoidol (1) a 10 pM reducía la expresión de esta quimiocina en un 77,6% (Figura 10C). La expresión de moléculas de adhesión como VCAM- 1 , ICAM-1 o quimiocinas como CX3CLI o CXCL16, también se determinó para el compuesto 9 a 3 pM, que mostró un descenso significativo de la expresión de VCAM-1 , CX3CLI y CXCL16

(Figura 11). Para realizar los ensayos de inmunofluorescencia HUVEC confluentes se cultivaron sobre cristales y algunas células se incubaron 24 h con policerasoidol (1) (10 mM) o el compuesto 9 (3 mM), antes de ser tratadas con TNFa (20 ng/ml_) durante 24 h adicionales. Entonces, las células se lavaron dos veces con PBS (1x), se fijaron con 4% de paraformaldehído y se bloquearon en solución de PBS (1x) conteniendo 1 % BSA. HUVEC se incubaron a 4°C toda la noche con un anticuerpo monoclonal primario de ratón frente a VCAM-1 humano (dilución 1 :200; clon 1.G1 1 B1 , Serotec, Kidlington, Reino Unido), ICAM-1 (dilución 1 :200; clon 6.5B5, Serotec, Kidlington, Reino Unido), CX3CLI (dilución 1 :200; clon 81506, R&D Systems, Minneapolis, MN) o CXCL16 (1 :200 dilución; Immunostep, Salamanca, España) en una solución 0, 1 % BSA/PBS, seguido de incubación con un anticuerpo secundario alexa-fluor 488-conjugado de cabra anti-conejo (dilución 1 : 1000; A11034, Life Technologies, Carlsbad, CA) a temperatura ambiente durante 1 h. Los núcleos celulares se contrastaron con Hoechst (diluido 1 :4000 en PBS, Sigma-Aldrich, Madrid, España). Se capturaron imágenes con microscopio de fluorescencia (Axio Observer A1 , Cari Zeiss, Thornwood, NY) equipado con un objetivo de lente 40x y un ocular 10x.

Ejemplo 7: Policerasoidol (1 ) v el compuesto 9 inhiben la activación de p38 MAPK v NF-

KB inducida por TNFa en HUVEC

Numerosas evidencias han revelado que los ligandos PPAR son capaces de modular las vías de señalización MAPK (Park et al., 2011). Por lo que hemos investigado las vías de señalización intracelular que subyacen a las respuestas inhibidoras mostradas por polycerasoidol (1) y el compuesto sintetizado 9.

El efecto de policerasoidol (1) o el compuesto 9 sobre la fosforilación de p38 MAPK y p65 (NF- KB) inducida por TNFa se determinó en HUVEC mediante citometría de flujo. HUVEC se incubaron previamente durante 24 h con el compuesto 1 (10 mM) o 9 (3 mM) y se estimularon durante 1 h con TNFa (20 ng/mL). Las células endoteliales se fijaron con BD Cytofix Fixation Buffer (BD Biosciences, San José, CA) y se permeabilizaron con BD Sol Perm III solución (BD Biosciences, San José, CA) y se tiñeron secuencialmente con una dilución 1 : 10 de un anticuerpo PE-conjugado mAb frente a p65 humano (pS529, clon K10-895.12.50; BD Biosciences, San José, CA) y una dilución 1 : 10 de anticuerpo Alexa Fluor-conjugado mAb frente a p38 MAPK humano (pT80/pY182, clon 36/p38; BD Biosciences, San José, CA). Las células se analizaron utilizando un citómetro de flujo BD FACSVerse (BD Biosciences, San José, CA).

Los resultados mostraron que policerasoidol (1) fue capaz de descender de forma considerable (63,4%) la activación de p38 MAPK, así como el compuesto 9 (71 ,9%) (Figuras 12A y 13A). Además, la activación de distintos compuestos de la familia MAPK se asocia con la transactivación de NF-kB (p65), y la movilización de NF-kB al núcleo activa la transcripción de genes que codifican la expresión de numerosos mediadores inflamatorios como las moléculas de adhesión endoteliales o la síntesis de citocinas y quimiocinas (Monaco et al., 2004). Pudimos determinar que policerasoidol (1) y el compuesto 9 fueron capaces de bloquear significativamente la activación de NF-kB inducida por TNFa (Figura 12B y 13B).

Estudios in vivo

Ejemplo 8: Tratamiento de ratones ob/ob con el compuesto 9.

Los protocolos conformes a las directrices de la Unión Europea para el cuidado y la protección de los animales fueron aprobados por el Comité Ético de la Universidad de Valencia. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el número de animales utilizados, así como su sufrimiento.

Los ratones ob/ob presentan una deficiencia de leptina, y están asociados con hiperfagia, y obesidad, además de hiperglicemia e hiperinsulinemia. En este estudio se utilizaron ratones machos ob/ob (C57BL/6J) (Charles River laboratories, Chatillon-sur-Chalaronne, Francia).

Los ratones fueron alojaron en jaulas individuales en una habitación donde se controlaba la temperatura, humedad y luz. Se mantuvieron y criaron (estabularlo de la UCIM, Universitat de Valéncia). en condiciones libres de patógenos con acceso libre a alimento y agua autoclavada, a una humedad del 60-65% y a una temperatura constante de 22±2°C con un ciclo oscuro/luminoso de 12 h (luz de 06:00-18:00 h, oscuridad de 18:00-06:00 h). A los ratones se les permitió aclimatarse durante diez días antes del estudio.

Los ratones machos ob/ob de 7 a 8 semanas de edad se trataron diariamente entre las 9:00 a.m. y las 11 :00 horas con el compuesto 9 por vía oral mediante una sonda orogástrica (10 mg/Kg/d y 30 mg/Kg/d), rosiglitazona (10 mg/ Kg / d) y/ o WY-14643 (30 mg/Kg/d) durante 4 días, y se compararon con el grupo de ratones ob/ob control tratados únicamente con el vehículo (suero fisiológico con HEC 1 %). Las dosis se eligieron en base a resultados previos, obtenidos de un experimento con ratones ob/ob (n=3) en el que el compuesto 9 y los compuestos de referencia, rosiglitazona y WY-14643, se administraron intraperitonealmente (datos no mostrados). Se utilizaron 6 animales por grupo, en experimentos independientes (n=6). Los compuestos se prepararon diariamente como suspensiones en HEC al 1 % para su administración oral. La aleatorización se realizó sobre los valores de glucemia a día 0. Durante la duración del experimento se pesó diariamente para cada ratón: cantidad de alimento ingerido y el peso corporal. Diariamente, entre las 9:00 a.m. y las 1 1 :00 horas (previo al tratamiento) se midió la glucosa en sangre utilizando (Contour next USB Blood glucose meter, BAYER, Basel, Suiza). El quinto día del experimento, los ratones se anestesiaron con isofluorano y se extrajo la sangre por punción cardiaca. La sangre se recogió en tubos conteniendo EDTA o heparina. Una vez tomadas las muestras, los animales se sacrificaron por dislocación cervical y posteriormente, se extrajeron diversos órganos como tejido adiposo blanco (WAT) e hígado, para su estudio posterior. Los órganos se pesaron y se congelaron para un posterior análisis de ARN y poder llevar a cabo estudios histológicos. Las muestras de plasma se obtuvieron por centrifugación y se almacenaron a -80°C.

Análisis histológico

Las muestras de tejido adiposo blanco perigonal (WAT) y de hígado fueron fijadas en paraformaldehído al 4%, embebidas en parafina, seccionadas utilizando un microtomo (Leica RM2245, Leica Biosystems, Wetzlar, Alemania) y montadas en portaobjetos de microscopio Superfrost® plus (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Se obtuvieron secciones transversales de tejido de WAT y de hígado. Se examinaron al menos 10 portaobjetos, que contenían≈ 4 secciones transversales de tejido (5 pm de espesor) de cada animal. Se llevó a cabo una tinción de hematoxilina y eosina (H&E) de WAT e hígado. La infiltración inflamatoria en WAT se midió como se describió previamente (Toyoda et al., 2008). Tras la inactivación de la peroxidasa (H2O2 3%) y del bloqueo con suero de cabra (Abcam, Cambridge, Reino Unido), se incubaron secciones transversales de WAT durante la noche (4°C) con el siguiente anticuerpo monoclonal (mAb) primario: mAb de conejo anti-ratón F4/80 (dilución 1 : 100, Abcam, Cambridge, Reino Unido). Se detectó un mareaje específico con un anticuerpo secundario de cabra anti-conejo conjugado con HRP (dilución 1 :500, Dako, Copenhague, Dinamarca). Con el fin de confirmar la especificidad de los anticuerpos, se usaron anticuerpos control de igual isotipo (Abcam, Cambridge, Reino Unido) o anticuerpo secundario sólo como controles negativos. Las muestras se revelaron usando una solución que contenía 3, 3'- diaminobenzidina (DAB, Vector Laboratories Inc, Burlingame, CA), posteriormente se contratiñeron con hematoxilina de Harris (Sigma-Aldrich, Madrid, España) y se deshidrataron. Cinco campos de cada sección de tejido WAT fueron fotografiados (Axio Observer A1 , microscopio Cari Zeiss, Thornwood, NY) digitalizados y analizados (ImageJ software 1.48V, Bethesda, MA). La cuantificación se realizó a doble ciego y mediante códigos.

Extracción de ARNm, PCR en tiempo real

El ARN total se extrajo de la grasa WAT de ratones mediante homogenización. La transcripción reversa se realizó con 1000 ng de ARN total usando el kit de transcripción inversa TaqMan (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) y se convirtió a cDNA por métodos estándar. El cDNA se amplificó con cebadores específicos para la proteína quimioatrayente monocítica de ratón 1 (MCP-1 o CCL2, Mm00441242_m1) en un aparato de PCR en Tiempo Real 7900HT (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) usando el Mix Universal Master (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) Todos los cebadores fueron prediseñados por Applied Biosystems. La cuantificación relativa de las diferentes transcripciones se determinó con el método 2 ^_AACt usando GAPDH (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Waltha , MA) co o control endógeno y normalizado para el grupo control.

Mediciones de metabolitos

Se determinaron los ácidos grasos libres en plasma (FFA), el enzima aspartato aminotransferasa (AST) y alanina aminotransferasa (ALT) por medio de un kit de ensayo colorimétrico (Sigma-Aldrich, Madrid, España). Además, se determinaron los niveles de lípidos en plasma de colesterol total y triglicéridos (TG) mediante procedimientos enzimáticos (WAKO, Cape Charles, VA). También se determinó la concentración de HDL-colesterol (HDL- c) con el mismo método que el usado para medir colesterol total, después de la precipitación de la apolipoproteína-B (apoB) con sulfato de dextrano/MgCh (Sigma-Aldrich, Madrid, España) como se describió previamente (Zieske et al., 2005).

8.1 El compuesto 9 no provoca variaciones en el peso corporal y en la eficiencia alimenticia.

Un efecto adverso durante el tratamiento con TZD en los individuos con DT2 es la ganancia de peso (Ahmadian et al., 2013). Para determinar los efectos del tratamiento con el compuesto 9, los ratones y la comida ingerida se pesaron diariamente. Se calculó la ganancia de peso al final del tratamiento (d ₅ -d ₀ ) (Figura 14A). El tratamiento con el compuesto 9 a las dosis de 10 y 30 mg/Kg/d no provocó diferencias significativas en la ganancia de peso en relación al grupo control. El aumento de ganancia fue de 1 ,70 ±0,25, 2,5±0,32 y 1 ,88±0,52 g, para los ratones control, tratados con rosiglitazona y compuesto 9 (30 mg/Kg/d), respectivamente. La eficiencia alimenticia siguió esta misma tendencia, y en los ratones tratados con el compuesto 9 no se observaron diferencias significativas (Figura 14B).

8.2 El compuesto 9 disminuye los valores de glucemia

El tratamiento durante 4 días nos permitió observar un aumento del 47% en el porcentaje de glucosa en sangre (248 vs. 300 mg/dL) en los ratones ob/ob del grupo control tratados con vehículo, mientras que la administración del compuesto 9 provocó un descenso del 20% en los niveles de glucosa (261 vs. 194 mg/dL) a la dosis de 30 mg/Kg/d respecto al día 0 (do), por último, el tratamiento con rosiglitazona disminuyó la glucosa un 32% (217 vs. 135 mg/dL) (Figura 15).

8.3 Efecto del compuesto 9 sobre el tejido adiposo blanco (WAT)

El tratamiento de ratones ob/ob con el compuesto 9 no aumentó de forma significativa el peso del tejido adiposo blanco (WAT) perigonadal en comparación con el grupo de ratones control

(Figura 16). Por otra parte, el examen histológico de WAT reveló cambios en la morfología de las células, con un descenso significativo del área media de los adipocitos en ratones tratados con el compuesto 9 de forma dosis-dependiente, similar al efecto producido por WY- 14643 (Figura 17), sugiriendo la capacidad del compuesto 9 para prevenir la hipertrofia de adipocitos. Por el contrario, el tratamiento con rosiglitazona aumentó el número de adipocitos de pequeño tamaño en los depósitos de WAT, disminuyendo el valor medio del área de los adipocitos y confirmando su efecto adipogénico.

8.4 Efecto antiinflamatorio del compuesto 9 sobre el tejido adiposo blanco (WAT)

Existen evidencias de que en individuos obesos con DT2 se desarrolla un proceso de inflamatorio crónico iniciado en el tejido adiposo. En WAT de ratones obesos se encuentran aumentados los niveles de expresión de los genes en las vías inflamatorias, esto se refleja en un aumento de quimiocinas inflamatorias en el tejido adiposo de individuos obesos, tales como la proteína quimioatrayente de monocitos (MCP-1), que participa en el reclutamiento de monocitos en la zona de la inflamación (Yoshimura et al., 1989), así como un aumento de la infiltración de macrófagos en tejido adiposo (MacKnight et al., 1996).

Se realizaron estudios sobre el proceso inflamatorio de WAT y pudimos observar que en ratones ob/ob tratados con el compuesto 9 a 30 mg/Kg/d, disminuyó de forma significativa la expresión de MCP-1 (Figura 18A). Además, la cuantificación de macrófagos en WAT mediante inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo frente a F4/80, nos mostró que el compuesto 9 fue capaz de disminuir significativamente el número de macrófagos a la dosis de 30 mg/Kg/d, indicando la capacidad del compuesto 9 para reducir la infiltración de macrófagos en WAT, similar al efecto producido por rosiglitazona (Figura 18B).

8.5 El compuesto 9 mejora los parámetros lipidíeos en sangre

Se ha estudiado los efectos en la dislipidemia de ratones ob/ob determinando diversos parámetros en plasma como son el colesterol total, HDL-c, triglicéridos y ácidos grasos libres. El tratamiento con el compuesto 9 a la dosis de 30 mg/Kg/d y WY-14643 aumentó de forma significativa los niveles de colesterol total respecto al grupo de ratones control ob/ob (50% y 64%, respectivamente) (Figura 19A). El compuesto 9 a las dosis de 10 y 30 mg/Kg/d y WY- 14643 también aumentaron significativamente el HDL-c, respecto al grupo de ratones control ob/ob (Figura 19B). Además, el compuesto 9 y WY-14643 mostraron un descenso de los niveles de triglicéridos en plasma, aunque no de forma significativa y que podría ser debido al corto periodo de tratamiento (122 mg/dL o 101 mg/dL a la dosis de 10 o 30 mg/Kg/d, respectivamente, vs. 137 mg/dL del control ob/ob) (Figura 19C). El compuesto 9 a 30 mg/Kg/d y WY-14643 fueron capaces de descender significativamente los niveles de ácidos grasos libres en sangre (0,25 y 0,33 moles/pL, respectivamente, vs. 0,67 moles/pL del control ob/ob)

(Figura 19D).

8.6 Efecto del compuesto 9 en el hígado

Se ha estudiado el efecto del compuesto 9 sobre un órgano primordial como es el hígado, observándose un aumento de peso no significativo respecto al grupo control ob/ob (Figura 20A). La cuantificación del contenido de triglicéridos mostró que en el corto periodo de tratamiento con el compuesto 9 a 30 mg/Kg/d, los triglicéridos no se acumularon de forma significativa en hígado en comparación al grupo control ob/ob (Figura 20B).

8.7. El compuesto 9 disminuyó los niveles de alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST)

El compuesto 9 disminuyó los niveles de ALT y AST, sufriendo esta última una reducción estadísticamente significativa a la concentración de 30 mg/Kg/d (28%) en comparación con el grupo control ob/ob tras 4 días de tratamiento (Figura 21). Esto sugiere que el compuesto 9 podría reducir el daño hepático, mostrando un efecto hepatoprotector.

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