MEMORIA DESCRIPTIVA

CAMPO DE APLICACIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un proceso para el control “in situ” de la contaminación de aguas subterráneas por infiltración de aguas de tranques de relave de la minería.

DESCRIPCIÓN DE LO CONOCIDO EN LA MATERIA

Todas las actividades mineras generan residuos, como rocas de desecho (rocas excavadas que no son minerales) y relaves (el residuo del proceso de extracción o refinamiento de mineral). En el desarrollo de la minería, el diseño, operación y cierre de una instalación de gestión de relaves es una parte clave del proceso minero. La gestión ambiental efectiva de la eliminación de relaves durante la vida de la mina y después del cierre es un factor importante en el manejo de impactos ambientales a largo plazo.

Los problemas asociados con el almacenamiento de relaves son cada vez mayores. Los avances en tecnología, permiten que minerales de baja ley, puedan ser explotados, lo que genera un mayor volumen de residuos que requieren un almacenamiento seguro. Las regulaciones ambientales también están avanzando, generando requisitos más rigurosos a la industria minera, en particular con respecto a las prácticas de almacenamiento de relaves. A pesar de los rigurosos estudios que se realizan para decidir su ubicación, siempre se presenta el problema de la filtración de las aguas del tranque a las napas freáticas. Es por ello, que es de gran importancia contar con tecnologías que permitan controlar efectiva y económicamente la contaminación de las napas freáticas, evitando que las soluciones generadas por la minería afecten negativamente.

i Dentro de los materiales de residuo generados por la industria minera, los relaves corresponden a una suspensión fina de sólidos en líquido. Estos están constituidos fundamentalmente por el mismo material presente in-situ en el yacimiento, además de reactivos y elementos químicos utilizados en los procesos de obtención del mineral. El relave contiene altas concentraciones de químicos y elementos que alteran el medio ambiente, por lo que deben ser transportados y almacenados en "tranques o depósitos de relaves", donde lentamente los contaminantes se van decantando en el fondo y el agua es recuperada o evaporada. Debido a la disminución de las leyes de mineral de los yacimientos, será necesario extraer cada vez mayores tonelajes de material para mantener sus niveles de producción, lo que significará un aumento proporcional de la cantidad de desechos que deben ser dispuestos en la forma de relaves.

Actualmente, los tranques de relaves activos e inactivos se encuentran expuestos a posibles fallas que pueden generar importantes incidentes en el medio ambiente, correspondientes a 5 millones de m ³ de relave liberados al medioambiente (Azam, S., & Li, Q. (2010). Tailings dam failures: a review of the last one hundred years. Geotechnical news, 28(4), 50-54). Lamentablemente, los incidentes reportados indican que las fallas se han generado en tranques de relaves tanto activos como no activos (Venegas F. (2011), lo que implica que el cierre de una faena minera, no significa el término del problema. Algunos de los mecanismos de fallo a largo plazo en los tranques de relaves, incluyen daño acumulativo (ej. erosión o terremotos), peligros geológicos (ej. deslizamientos), licuefacción y los patrones climáticos cambiantes (Chambers, D. M., & Higman, B. (2011). Long term risks of tailings dam failure. Center for Science in Public Participation, Bozeman, Montana). A pesar que se ha descrito que la mayor parte de las fallas de los tranques de relaves se deben a causas combinadas (39%) (Rico, M., et al. (2008) "Reported tailings dam failures: a review of the European incidents in the worldwide context." Journal of hazardous materials 152.2: 846-852), estudios que han diferenciado las causas de los incidentes de fallas a nivel mundial, han mostrado que entre el 8% y el 20% de los incidentes (1990-2009) tienen como causa a las filtraciones y los canales generados por ellas. Esto es consistente con que la falta de control del régimen hidrológico del tranque es una de las causas más comunes de falla. Es importante mencionar que este tipo de fallas son las más evidentes o más fácilmente detectables, ya que han provocado incidentes importantes que han sido registrados a través del tiempo. Es importante tener en consideración que se ha estimado que el riesgo de fallos en los tranques de relaves se encuentra en aumento, donde éste se ve directamente relacionado al número de tranques de acumulación de relaves mayores que 5.000.000 metros cúbicos de capacidad, necesarios para permitir la extracción económica de minerales de baja ley. Adicionalmente, se prevé por lo menos 11 fallas catastróficas a nivel mundial entre 2010 y 2019, con un costo total aproximado USD$6 mil millones (Mining (2015). Catastrophic mine waste spills increasing in frequency, severity and cost world-wide. http://www.mining.com/web/catastrophic- mine-waste-spills-increasing-in-frequency-severity-and-cost- world-wide/). Otro tipo de filtraciones, que no son evidentes o fácilmente detectables, corresponden a las que se generan desde las aguas de la cubeta del tranque hacia las napas freáticas impactadas por el tranque de relaves, lo cual deriva en la contaminación de las aguas subterráneas. En este caso, no se trata de fallas o desastres de gran violencia y notoriedad. Por el contrario, estas infiltraciones a las aguas subterráneas son un problema que ocurre de manera permanente e invisible, pero que puede causar un daño de gran magnitud, impactando negativamente la salud de las personas y el medioambiente con dosis tóxicas de determinados elementos. Es conocido que el flujo de filtraciones desde un embalse superficial de relaves es inevitable y se señala que el vertido cero de la filtración de una instalación de residuos sigue siendo un objetivo difícil de alcanzar, incluso con sistemas de revestimiento complejos (Tailingsinfo (2013). Water Management Considerations for Conventional Storage. http://www.tailings.info/technical/water.htm).

Existen innumerables estudios que reportan filtraciones hacia las napas freáticas que se encuentran impactadas por la infiltración de tranque de relaves, y que dan cuenta que efectivamente este fenómeno está ocurriendo a nivel mundial (Duda, R. (2014). The Influence of Drainage Wells Barrier on Reducing the Amount of Major Contaminants Migrating from a Very Large Mine Tailings Disposal Site. Archives of Environmental Protection, 40(4), 87-99; Brindha K, Elango L. 2014. Geochemical Modelling of the Effects of a Proposed Uranium Tailings Pond on Groundwater Quality. Mine Water Environ. Vol. 33:110-120; Huang, X. et al. (2016). Hydrogeochemical signatures and evolution of groundwater impacted by the Bayan Obo tailing pond in northwest China. Science of the Total Environment, 543, 357- 372; Martín-Crespo, T. et al. (2018). Geoenvironmental characterization of unstable abandoned mine tailings combining geophysical and geochemical methods (Cartagena-La Union district, Spain). Engineering Geology, 232, 135-146). Estos estudios se realizan con mediciones inherentes a cada tranque y permiten evidenciar la existencia de este tipo de filtraciones.

En la actualidad los tranques de relaves consideran en su diseño y operación diferentes medidas de monitoreo y control de las posibles fugas o filtraciones para evitar que puedan llegar a contaminar aguas subterráneas. Entre las medidas de monitoreo se puede considerar la utilización de pozos de monitoreo aguas abajo de piscinas colectoras de drenes, sistema de medición de caudales, niveles freáticos y monitoreo de aguas superficiales. Actualmente, el tratamiento de las infiltraciones en napas subterráneas impactadas por los tranques de relaves se realiza mediante pozos de recolección de filtraciones instalados cuesta abajo del embalse (Duda, R. (2014). The Influence of Drainage Wells Barrier on Reducing the Amount of Major Contaminants Migrating from a Very Large Mine Tailings Disposal Site. Archives of Environmental Protection, 40(4), 87- 99). Este pozo se equipa con bombas hidráulicas que envían las filtraciones de nuevo al tranque de relaves. Estas unidades se pueden utilizar en conjunto con muros o zanjas de corte para minimizar filtraciones cuesta abajo. En estos pozos la calidad del efluente es monitoreado para dimensionar la posibilidad de filtraciones, ya que cualquier filtración que se produzca en las napas subterráneas, puede ocasionar complicaciones de la operación de la faena minera con la consecuente pérdida económica asociada. Es importante mencionar, que dependiendo de la calidad del efluente, la operación de la bomba hidráulica puede continuar indefinidamente (EPA, 1994). En consecuencia, el tratamiento actual, con la bomba hidráulica no resuelve por completo el problema.

Respecto a las medidas de control, el agua que filtra por el muro se recupera a través de drenes y de la canalización del flujo. El agua del muro se puede devolver al tranque, o se puede juntar en un estanque común con el agua recuperada de la laguna para su recirculación a la planta de beneficio (SERNAGEOMIN (2003) Guía de buenas prácticas ambientales para la pequeña minería; Levenick J.L. et al. (2009). Hydrogeological assessment of seepage through the Antamina tailings dam - Antamina copper/zinc mine, Perú, South America, International Mine Water Conference 19th - 23rd October 2009, Pretoria, South Africa). El agua que se infiltra a nivel del subsuelo se recircula desde una serie de pozos de captación ubicados aguas abajo y se monitorea mediante sondajes independientes. Sin embargo, de acuerdo a la información disponible, no existe una tecnología que permita controlar el total de las fugas o perdidas que ocurren a nivel del subsuelo del tranque.

El problema que se presenta es que la identificación de la ubicación de la fuga es complicada, la accesibilidad de la fuga es pobre y los costos de tratamiento son muy altos. Los métodos tradicionales para reparar la fuga in situ, tales como la inyección de compuestos químicos (ej. silicatos, acrilatos, acrilamidas, poliuretanos o biopolímeros) son caros y tienen efectos negativos en la salud y el medio ambiente (Ivanov, V., & Chu, J. (2008). Applications of microorganisms to geotechnical engineering for bioclogging and biocementation of soil in situ. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology, 7(2), 139-153). Además, se hace necesario inyectar en el subsuelo una gran cantidad de estos compuestos para poder reducir la permeabilidad global, ya que a menudo no se conoce la ubicación exacta de la fuga.

Considerando el problema expuesto, se hace necesario el desarrollo de una alternativa que sea lo suficientemente rentable y eficiente para el control de la contaminación de las aguas subterráneas con filtraciones de tranques de relaves. Este tipo de filtraciones podrían ser controladas mediante un sistema de tratamiento que permita reducir la permeabilidad hidráulica a nivel de los acuíferos subterráneos contaminados con altos niveles de sulfato. Teniendo en cuenta que la inyección de compuestos químicos es de alto costo y tiene efectos negativos en la salud y el medio ambiente, se podría pensar en la infiltración de microorganismos en las aguas subterráneas contaminadas para promover su crecimiento in situ y reducir la permeabilidad del acuífero. Del análisis del estado de la técnica, se desprende que actualmente no existe ningún desarrollo biotecnológico que permita solucionar el problema de las filtraciones de los tranques de relave a las aguas subterráneas. Sin embargo, se ha descrito el empleo de bacterias ureolíticas para reducir la permeabilidad hidráulica mediante la precipitación de carbonato de calcio (Eryürük et al. "Reducing hydraulic conductivity of porous media using CaCÜ3 precipitation induced by Sporosarcina pasteurii." Journal of bioscience and bioengineering 119.3 (2015): 331-336). La mayor parte de las investigaciones se han realizado con la bacteria ureolítica Sporosarcina pasteurii en un medio que contiene urea y cloruro de calcio (Whiffin et al., 2007; van Paassen et al., 2010; Al-Thawadi, 2011 ; Al Qabany et al., 2012; Ng et al., 2012; Keykha et al., 2012; Ivanov, et al. 2015). Debido a esta reacción enzimática, aumenta el pH y se produce bicarbonato. Se inicia la precipitación de carbonato de calcio, que se une las partículas del suelo (Ca ²⁺ + CC>3 ² CaC03j). Desde el punto de vista tecnológico la mayor parte de las aplicaciones que utilizan bacterias ureolíticas, especialmente Sporosarcina pasteurii, como agentes precipitante de carbonato de calcio, se han orientado a procesos de cementación microbiana (Solicitud de EP1974031 , Solicitud de Patente WO 2008120979, Solicitud de Patente WO 2009133312, Patente US 8.182.604, Patente US 8.210.776 y Patente US 9.199.880, US 8.951.786, US 8.728.365, Solicitud de Patente US 20130196419, Solicitud de Patente US 20180119185A1 , Solicitud de Patente US. 20180072632, Solicitud de Patente US No. 15/066,692, Solicitud de Patente US No. 15/066,692).

Las alternativas disponibles actualmente para un tratamiento biológico presentan diferentes inconvenientes, por lo que no son aplicables a acuífero subterráneos contaminados con filtraciones de tranques de relaves. Por ejemplo, Sporosarcina pasteurii no es capaz de crecer y su actividad ureolítica se inhibe bajo la ausencia de oxígeno (Martin et al., Inhibition of Sporosarcina pasteurii under Anoxic Conditions: Implications for Subsurface Carbonate Precipitation and Remediation vía Ureolysis. Environmental Science & technology, 46(15), 8351-8355, 2012). Esto se debe a que la biosíntesis de novo de su enzima ureasa, fundamental para el proceso, se reprime en condiciones de anoxia. Por esta razón, no es factible la aplicación de este proceso en un acuífero subterráneo que presenta bajos niveles de oxígeno y que presenta condiciones de anoxia cuando se inyectan nutrientes para estimular el crecimiento de bacterias. La temperatura en las aguas subterráneas se caracteriza por ser baja, lo que dificulta la actividad enzimática de las bacterias ureolíticas que tienen su óptimo a 30°C (Kimet al. "Effect of Temperature, pH, and Reaction Duration on Microbially Induced Calcite Precipitation." Applied Sciences 8.8: 1277, 2018). Otra desventaja importante es que las bacterias ureolíticas no son capaces de remover el ión sulfato que es un contaminante que se encuentra en altas concentraciones en el acuífero a tratar. A todo esto, se debe agregar las características químicas especiales del agua subterránea contaminada con infiltraciones de tranques de relave, que contiene altas concentraciones de sulfato y otras sales minerales y, especialmente, la presencia de diferentes metales tóxicos, que dificultan el crecimiento de muchos grupos de microorganismos. En ambientes naturales, tales como sedimentos marinos y en tapetes microbianos, se ha sugerido la participación de bacterias reductoras de sulfato en la precipitación de carbonatos de calcio. Sin embargo, el estado de la técnica es desalentador respecto al verdadero rol de estos microorganismos y su posible aplicación. Así, por ejemplo, Meiter en tu trabajo titulado "Two opposing effects of sulfate reduction on carbonate precipitation in normal marine, hypersaline, and alkaline environments" (Geology 41.4: 499-502, 2013) concluye que la reducción biológica de sulfato causa una disminución en el pH, que favorece la disolución más que la precipitación de carbonatos. La contribución exacta de las bacterias reductoras de sulfato a la mineralización de carbonatos sigue siendo muy controvertida en la literatura científica (Gallagher et al. "Two opposing effects of sulfate reduction on carbonate precipitation in normal marine, hypersaline, and alkaline environments: COMMENT." Geology 42.1 : e313-e314, 2014; Meister, "Two opposing effects of sulfate reduction on carbonate precipitation in normal marine, hypersaline, and alkaline environments: REPLY." Geology 42.1: e315-e315, 2014). El empleo de la precipitación de carbonatos mediante bacterias reductoras de sulfato en un proceso industrial tampoco aparece promisoria en el estado de la técnica. Es así como Zhu y Dittrich ("Carbonate precipitation through microbial activities in natural environment, and their potential in biotechnology: a review." Frontiers in bioengineering and biotechnology 4: 4, 2016) concluyeron que“la ureolisis es la tecnología más desarrollada entre otros metabolismos, seguida de la fotosíntesis. Aunque la "reducción de sulfato" ha sido estudiada ampliamente, es menos probable que sea aprovechada en proyectos de ingeniería”.

La solución descrita en la presente solicitud de patente muestra que es técnicamente posible la bioprecipitación bajo condiciones anóxicas, mediante bacterias reductoras de sulfato. Esta invención resuelve los problemas del estado de la técnica utilizando un proceso biológico para la reducción de la permeabilidad de sectores del acuífero afectado por las fugas de las aguas del tranque de relave, basado en la inyección en un subsuelo con un solución de nutrientes y la inoculación de un consorcio microbiano que presenta una alta capacidad de biomineralizar“in situ” (procesos simultáneos de biocolmatación y bioprecipitación). Este consorcio tiene la capacidad de crecer condiciones anóxicas, a baja temperatura y en aguas subterránea contaminadas con filtraciones de un tranque se relave. Por la capacidad de reducir sulfato del consorcio microbiano utilizado, este proceso permite adicionalmente reducir la concentración de este contaminante.

Por lo tanto, la solución propuesta tiene las siguientes ventajas sobre el estado de la técnica:

• Se genera una zona de baja conductividad hidráulica en el acuífero subterráneo contaminado.

• La zona tratada es de gran estabilidad por la organomineralización de precipitación de carbonatos de calcio.

El proceso ocurre aun en ausencia de oxígeno • El proceso está diseñado para operar a baja temperatura (por ejemplo a 19°C)

• El consorcio microbiano está adaptado a aguas subterránea contaminadas con filtraciones de un tranque se relave.

El proceso permite adicionalmente reducir la concentración de sulfato.

DEFINICIÓN DE LA INVENCIÓN

El principal objeto de la presente invención es un método para reducir la conductividad hidráulica y generar la precipitación de minerales insolubles en un acuífero subterráneo, que comprende al menos los pasos de:

a) proveer un cultivo de microorganismos enriquecido en bacterias reductoras de sulfato y adaptado a las aguas subterráneas del acuífero a tratar,

b) inyectar el acuífero subterráneo con un cultivo de microorganismos enriquecido, c) inyectar el acuífero subterráneo con un donador de electrones y nutrientes adecuados para cultivo de microorganismos enriquecido en bacterias reductoras y uno o más cationes metálicos que favorezcan la precipitación de minerales insolubles, y

d) permitir que los microorganismos se multipliquen y colonicen el material del sólido del acuífero subterráneo, reduciendo la permeabilidad hidráulica del acuífero subterráneo y generando la precipitación de minerales insolubles en el material sólido del acuífero subterráneo.

En una realización de la invención, el acuífero subterráneo está afectado por filtraciones de agua superficiales. Una realización particular se refiere a un acuífero subterráneo que está afectado por filtraciones de agua de un tranque de relave minero.

En una realización de la invención, el cultivo de microorganismos enriquecido en bacterias reductoras de sulfato y adaptado a las aguas subterráneas del acuífero a tratar, se produce con un método que comprende al menos los pasos: a) inocular un cultivo de microorganismos enriquecido en bacterias reductoras de sulfato y adaptado a las aguas subterráneas del acuífero a tratar en un biorreactor anaerobio de lecho fijo con un material de soporte,

b) alimentar en forma continua con agua extraída del acuífero subterráneo, un donador de electrones y nutrientes adecuados para el cultivo de bacterias reductoras de sulfato,

c) permitir que los microorganismos se multipliquen, colonicen el material de soporte del biorreactor, y

d) producir un efluente del biorreactor que contiene un cultivo de microorganismos enriquecido en bacterias reductoras de sulfato y adaptado a las aguas subterráneas del acuífero a tratar para ser inyectado a dicho acuífero.

En otra realización de la invención, el material de soporte del biorreactor se selecciona del grupo de la arena, la piedra silícica, el vidrio y la cerámica.

En otra realización preferida de la invención, la inyección del acuífero subterráneo con un cultivo de microorganismos enriquecido y la inyección del acuífero subterráneo con un donador electrones y nutrientes adecuados para cultivo de microorganismos enriquecido en bacterias reductoras, y uno o más cationes metálicos que favorezcan la precipitación de minerales insolubles se realiza mediante uno o más pozos de inyección.

En otra realización adicional de la invención, el donador electrones adecuado para cultivo de microorganismos enriquecido en bacterias reductoras se selecciona del grupo del formiato, ácido fórmico, acetato y ácido acético.

En otra realización adicional de la invención, los dichos nutrientes adecuados para cultivo de microorganismos enriquecido en bacterias reductoras, comprende, al menos, amonio y fosfato.

En otra realización de la invención, los nutrientes adecuados para cultivo de microorganismos enriquecido en bacterias reductoras, comprende además un nutriente complejo, rico en vitaminas, seleccionado del grupo del extracto de levadura y el agua colada de maíz.

En una realización de la invención, el mineral insoluble que precipita en el material sólido del acuífero subterráneo es carbonato de calcio.

En otra realización de la invención, el mineral insoluble que precipita en el material sólido del acuífero subterráneo es sulfuro de hierro.

En una realización de la invención, el método para reducir la conductividad hidráulica y generar la precipitación de minerales insolubles en un acuífero subterráneo permite, además, remover sulfato de las aguas subterránea de dicho acuífero.

En una realización de la invención, el cultivo de microorganismos enriquecido en bacterias reductoras de sulfato y adaptado a las aguas subterráneas del acuífero a tratar está constituido, al menos por bacterias de los Filos Proteobacteria, Firmicutes y Bacteroidetes.

En otra realización de la invención, el cultivo de microorganismos enriquecido en bacterias reductoras de sulfato y adaptado a las aguas subterráneas del acuífero a tratar está constituido, al menos por bacterias del Filo Proteobacteria o Firmicutes.

En otra realización de la invención, el cultivo de microorganismos enriquecido en bacterias reductoras de sulfato y adaptado a las aguas subterráneas del acuífero a tratar está constituido, al menos por bacterias de las Clases Gammaproteobacteria, Clostridia, Deltaproteobacteria y Bacteroidia.

En otra realización de la invención, el cultivo de microorganismos enriquecido en bacterias reductoras de sulfato y adaptado a las aguas subterráneas del acuífero a tratar está constituido, al menos por bacterias de la Clase Clostridia o Deltaproteobacteria. En otra realización de la invención, el cultivo de microorganismos enriquecido en bacterias reductoras de sulfato y adaptado a las aguas subterráneas del acuífero a tratar contiene, al menos bacterias del Orden Desulfovibrionales.

En otra realización de la invención, el cultivo de microorganismos enriquecido en bacterias reductoras de sulfato y adaptado a las aguas subterráneas del acuífero a tratar contiene, al menos bacterias del Orden Desulfobacterales.

En una realización de la invención, el cultivo de microorganismos enriquecido en bacterias reductoras de sulfato y adaptado a las aguas subterráneas del acuífero a tratar contiene, al menos bacterias del Orden Desulfuromonadales.

En otra realización de la invención, el cultivo de microorganismos enriquecido en bacterias reductoras de sulfato y adaptado a las aguas subterráneas del acuífero a tratar contiene, al menos bacterias del Orden Clostridiales.

En una realización preferida de la invención, el cultivo de microorganismos enriquecido en bacterias reductoras de sulfato y adaptado a las aguas subterráneas del acuífero a tratar contiene, al menos un género de bacterias reductoras de sulfato de seleccionados del grupo constituido por Desulfomicrobium, Desulfovibrio, Desulfonema, Desulfuromonas, Desufutomaculum y Desulfosporosinus.

En otra realización preferida de la invención, el cultivo de microorganismos, enriquecido en bacterias reductoras de sulfato adaptado a las aguas subterráneas del acuífero a tratar, se obtiene a partir de muestras extraídas de microbialitos vivos de lagunas o lagos salinos. Las muestras de estos microbialitos vivos se encuentran, por ejemplo, en los trombolitos vivos del Lago Sarmiento, o en los estromatolitos vivos de la Laguna Amarga, ambos en Parque Nacional Torres del Paine, Chile, en los microbialitos vivos de la Laguna Interna y la Laguna La Brava en el Salar de Atacama, Chile, en la laguna Socompa, Salta, Argentina, en la Lagoa Salgada zona de Río de Janeiro, Brasil, en la Laguna Bacalar y en la Laguna Alchichica, México o en el lago Clifton, Australia. En una realización de la invención, el cultivo de microorganismos, enriquecido en bacterias reductoras de sulfato y adaptado a las aguas subterráneas del acuífero a tratar, se obtiene con un método que comprende al menos los pasos:

a) inocular una muestra de dicho microbialito vivo de un lago salino o laguna salina en una columna rellena con arena,

b) alimentar en forma continua con agua extraída del acuífero subterráneo, un donador de electrones y nutrientes adecuados para el cultivo de bacterias reductoras de sulfato,

c) permitir que los microorganismos se multipliquen, colonicen la arena del biorreactor y se enriquezca el cultivo en bacterias reductoras de sulfato, y

d) producir un cultivo de microorganismos enriquecido en bacterias reductoras de sulfato y adaptado a las aguas subterráneas del acuífero a tratar.

En una realización de la invención, el microbialito vivo es un estromatolito vivo. En otra realización de la invención, el microbialito vivo es un trombolito vivo.

Definiciones:

Microbialitos: en ésta invención, el concepto de microbialitos se entiende como los "depósitos organo-sedimentarios que se han acrecentado como resultado de una comunidad microbiana bentónica atrapada y unida a sedimentos detríticos y / o formando el lugar de la precipitación minerales tales como carbonato cálcico. Las estructuras de los microbialitos pueden ir desde los estromatolitos laminados bien estructurados hasta los trombolitos coagulados. Los microbialitos se han encontrado en distintos ambientes, por ejemplo, fuentes termales, lagunas dolomíticas, lagos hipersalinos y / o alcalinos, ríos y los lagos, ambientes marinos abiertos y ambientes marinos hipersalinos.

Estromatolitos: son microbialitos que se caracterizan por ser estructuras organo- sedimentarias laminadas (típicamente de CaCÜ3) que crecen adheridas al sustrato y emergen verticalmente del mismo, produciendo estructuras de gran variedad morfológica, volumétrica y biogeográfica. Trombolitos: son microbialitos relacionados con los estromatolitos, pero carecen de laminación y se caracterizan por un tejido coagulado macroscópico.

Microbialitos, estromatolitos o trombolitos vivos: son estructuras organo- sedimentarias que actualmente se encuentran en sistemas lacustres o marinos y que presentan una comunidad microbiana activa, cuyo metabolismo participa en el proceso mineralización de estas estructuras.

Consorcio microbiano: en ésta invención, el concepto de consorcio microbiano se entiende como un grupo de diferentes microorganismos que actúan en conjunto. En un consorcio microbiano se pueden encontrar microorganismos con diferentes capacidades metabólicas. En el caso particular del consorcio microbiano reductor de sulfato, éste está compuesto, por ejemplo, por microorganismos anaeróbicos fermentativos, acetogénicos y reductores de sulfato.

Biocolmatación: La biocolmatación se define como la reducción de la conductividad hidráulica y la porosidad de un medio poroso saturado debido al crecimiento microbiano.

Mineralización inducida biológicamente: La mineralización inducida biológicamente es el proceso en el cual la actividad metabólica de los microorganismos (por ejemplo, las bacterias) produce condiciones químicas favorables para la formación de minerales (por ejemplo, la precipitación de carbonatos de calcio inducida por el aumento de la alcalinidad).

Descripción de las Figuras

FIGURA 1 :

Esta figura muestra un diagrama esquemático del biorreactor relleno con arena. Los biorreactores (1) fueron fabricados de vidrio. Para el control de temperatura se utilizó una camisa de vidrio exterior (2), alimentada con agua proveniente de un baño termorregulado. El biorreactor se rellenó con arena (3) esterilizada. Para controlar la presión interna del sistema, se utilizó un par de piezómetros de vidrio ubicados uno en la parte inferior (4) y otro en la parte superior (5) del biorreactor. La alimentación se hizo mediante bombas peristálticas desde la parte inferior (6) hasta la parte superior (7) del biorreactor.

FIGURA 2:

Esta figura muestra los parámetros en efluente de biorreactor inoculado con microorganismos de un trombolito vivo del Lago Sarmiento. (A) valores de pH, (B) concentraciones de sulfato (cuadrados rellenos) y concentraciones de calcio (cuadrados vacíos). FIGURA 3:

Esta figura muestra los parámetros en el efluente de un biorreactor inoculado con microorganismos de un estromatolito vivo de la Laguna Amarga. (A) valores de pH y potencial de óxido-reducción, (B) concentraciones de sulfato (cuadrados rellenos) y concentraciones de ácido sulfhídrico (cuadrados vacíos), (C) concentración de calcio.

FIGURA 4:

Esta figura muestra esquemáticamente el diseño de las columnas de acero de 1 ,40 metros de altura y 25 centímetros de diámetro, con salidas laterales a los 8, 50, 90 y 130 centímetros desde la base para la instalación de instrumentos de medición de presión, utilizadas para medir la reducción de la conductividad hidráulica en el lecho de arena por los consorcios microbianos enriquecidos.

FIGURA 5:

Esta figura muestra los parámetros en el efluente de la columna A inoculada con el consorcio microbiano enriquecido a partir de la muestra del microbialito del Lago Sarmiento. (A) ATP microbiano en el efluente (cuadrados vacíos) y potencial de óxido- reducción (cuadrados rellenos), (B) concentraciones de sulfato (rombos vacíos) y ácido sulfhídrico en el efluente (rombos rellenos). La línea indica la concentración de sulfato en el medio de cultivo agregado. FIGURA 6: Esta figura muestra los parámetros en el efluente de la columna B inoculada con el consorcio microbiano enriquecido a partir de la muestra estromatolitos de la Laguna Amarga. (A) ATP microbiano en el efluente (cuadrados vacíos) y potencial de óxido- reducción (cuadrados rellenos), (B) concentraciones de sulfato (rombos vacíos) y ácido sulfhídrico en el efluente (rombos rellenos). La línea indica la concentración de sulfato en el medio de cultivo agregado.

FIGURA 7:

Esta figura muestra los parámetros en el efluente de la columna C con biocida. (A) ATP microbiano en el efluente (cuadrados vacíos) y potencial de óxido- reducción (cuadrados rellenos), (B) concentraciones de sulfato (rombos vacíos) y ácido sulfhídrico en el efluente (rombos rellenos). La línea indica la concentración de sulfato en el medio de cultivo agregado.

FIGURA 8:

Esta figura muestra las mediciones de pH en los biorreactores B1 , B2 y B3. Los biorreactores B1 y B3 se alimentaron con el medio de cultivo A, pero el biorreactor B1 se cambió al medio de cultivo B en el día 170. El biorreactor B2 se alimentó permanentemente con el medio de cultivo B.

FIGURA 9:

Esta figura muestra la determinación del ATP intracelular y el recuento bacteriano en los biorreactores B1 , B2 y B3. Los biorreactores B1 y B3 se alimentaron con el medio de cultivo A, pero el biorreactor B1 se cambió al medio de cultivo B en el día 170. El biorreactor B2 se alimentó permanentemente con el medio de cultivo B.

FIGURA 10:

Esta figura muestra las mediciones de sulfuro (ácido sulfhídrico) en los biorreactores B1 , B2 y B3. Los biorreactores B1 y B3 se alimentaron con el medio de cultivo A, pero el biorreactor B1 se cambió al medio de cultivo B en el día 170. El biorreactor B2 se alimentó permanentemente con el medio de cultivo B.

FIGURA 11 : Esta figura muestra las mediciones de sulfato remanente en los biorreactores B1 , B2 y B3. Los biorreactores B1 y B3 se alimentaron con el medio de cultivo A, pero el biorreactor B1 se cambió al medio de cultivo B en el día 170. El biorreactor B2 se alimentó permanentemente con el medio de cultivo B. FIGURA 12:

Esta figura muestra un ejemplo del diseño del modelo de acuífero construido en base a cámaras de acrílico. Se muestra una cámara de acrílico con tapa removible empacada con arena de cuarzo. En la figura se pueden distinguir los puertos para la inoculación y estimulación de microorganismos, y para la toma de muestras. En sus extremos, se les instaló internamente una tubería para la entrada de agua del flujo y otra para la salida de efluente.

FIGURA 13:

Esta figura muestra los parámetros de reducción microbiana de sulfato (S04 ^2- y H2S) y fisicoquímicos (pH y potencial de óxido-reducción) en los modelos de acuífero inoculados. Se muestran las mediciones de ácido sulfhídrico (A), sulfato (B), pH (C) y potencial de óxido-reducción (D). Los valores corresponden al promedio de duplicados (n=2) para los modelos inoculados (círculos rellenos), y a un solo valor (n=1) en el caso del control no inoculado (círculos vacíos).

FIGURA 14: Esta figura muestra los valores de ATP intracelular en el efluente de los modelos de acuífero. Los valores corresponden al promedio de duplicados (n=2) para los modelos inoculados (círculos rellenos), y a un solo valor (n=1) en el caso del control no inoculado (círculos vacíos).

FIGURA 15:

Esta figura muestra los tiempos de retención relativos de los modelos de acuífero durante del tiempo de experimentación. Se muestran los tiempos de retención relativos al tiempo de retención inicial de los modelos de acuífero. Los valores corresponden al promedio de duplicados (n=2) para los modelos inoculados (círculos rellenos), y a un solo valor (n=1) en el caso del control no inoculado (círculos vacíos).

FIGURA 16:

Esta figura muestra el cambio del flujo del trazador alrededor de una zona de menor permeabilidad en el medio poroso de los modelos de acuífero. Se muestra un ejemplo del paso del trazador en uno de los modelos de acuífero en el día 55 de funcionamiento. Se observa el desvío del trazador al encontrarse con la zona ennegrecida del medio poroso (o): punto de inoculación. FIGURA 17:

Esta figura muestra esquemáticamente un mapa del pH en el la arena de los modelos de acuífero inoculados al finalizar el experimento (60 días). En todos los modelos inoculados, se observa una zona de pH 8 que se distribuye a partir de la zona de inoculación y alcanza el extremo por donde sale el efluente, así como zonas puntuales de pH 8,5 en uno de los duplicados. En cambio, en el modelo control se observó un pH 7,5 en todas las zonas del modelo. El círculo representa el punto de inoculación y estimulación con medio de cultivo.

FIGURA 18:

Esta figura muestra esquemáticamente los mapas del ATP microbiano en la arena de los modelos de acuífero al final del experimento. Se muestra el valor de ATP (en URL/g de arena) en las tres zonas de la arena de los modelos de acuífero inoculados (n=2) y el modelo control (n=1). Las flechas negras indican el sentido del flujo hidráulico en el interior de los modelos de acuífero. El círculo representa el punto de inoculación y estimulación con medio de cultivo.

FIGURA 19:

Esta figura es una fotografía que ilustra la biomineralización de la arena de cuarzo en el punto de inoculación de los modelos de acuífero. Se muestra una porción de arena de cuarzo biomineralizada que se ubicó en el punto de inoculación de los modelos inoculados. En zonas más distantes al punto de inoculación, no se observó la formación de aglomerados de arena similares al de la imagen. FIGURA 20:

Esta figura muestra los parámetros de reducción microbiana de sulfato (SCU ^2- y H2S) y fisicoquímicos (pH y potencial de óxido-reducción) en los modelos de acuífero estimulados con las distintas concentraciones de formiato. Se muestran las mediciones de sulfato (A), ácido sulfhídrico (B), potencial de óxido-reducción (C) y pH (D) de los modelos de acuífero estimulados con las distintas concentraciones de formiato (3, 6 12 y 18 g/L). Los valores corresponden al promedio de duplicados (n=2).

FIGURA 21 :

Esta figura muestra la concentración remanente de formiato en los modelos de acuífero estimulados con las distintas concentraciones del dador de electrones. Las líneas continuas representan la cantidad de formiato agregada en los modelos considerando la cantidad de formiato en el medio de cultivo y su dilución en los modelos. Los valores corresponden al promedio de duplicados (n=2).

FIGURA 22:

Esta figura muestra los tiempos de retención relativos al tiempo inicial en los modelos de acuífero estimulados con las distintas concentraciones de formiato. Los valores corresponden al promedio de duplicados (n=2).

FIGURA 23:

Esta figura muestra esquemáticamente los mapas de pH en la arena de los modelos de acuífero estimulados con las distintas concentraciones de formiato al finalizar el experimento (60 días). En general, los valores de pH en arena tienden a aumentar a medida que se aumenta la concentración de formiato en el medio de cultivo. En los modelos estimulados con 12 y 18 g/L de formiato, se observaron zonas puntuales de pH 8,5. Las flechas negras indican el sentido del flujo hidráulico en el interior de los modelos de acuífero. El círculo (o) representa el punto de inoculación y estimulación con medio de cultivo. FIGURA 24:

Esta figura muestra esquemáticamente los mapas de ATP microbiano en la arena de los modelos de acuífero estimulados con las distintas concentraciones de formiato al finalizar el experimento. Se muestra el valor de ATP (en URL/g de arena) en las tres zonas de la arena de los modelos de acuífero estimulados con las distintas concentraciones de formiato. Las flechas negras indican el sentido del flujo hidráulico en el interior de los modelos de acuífero. El círculo blanco (o) representa el punto de inoculación y estimulación con medio de cultivo. Los valores corresponden al promedio de duplicados (n=2).

FIGURA 25:

Esta figura muestra la mineralización inducida biológicamente de la arena de cuarzo de los modelos de acuífero inoculados con las distintas concentraciones de formiato al final del experimento. Se muestran los modelos de acuíferos destapados al final del experimento. La línea roja delimita la zona mineralizada (de mayor dureza respecto a otras zonas) del medio poroso de los modelos de acuífero. Se muestra la totalidad de los modelos (duplicados) utilizados (columna central). En el biorreactor de la derecha se muestra el porcentaje del área ocupada por la zona mineralizada respecto a la superficie total de la cara superior de los modelos (Calculado utilizando el programa ImageJ).

FIGURA 26:

Esta figura muestra el área de la superficie de arena biomineralizada en los modelos de acuífero en función de la concentración de formiato en el medio de cultivo. Se observa una dependencia directa de la concentración de formiato y el área de la arena biomineralizada en los modelos de acuífero, la cual alcanza un valor máximo en las mayores concentraciones ensayadas (12 y 18 g de formiato/L). Los valores corresponden al promedio de duplicados (n=2). FIGURA 27:

Esta figura muestra los porcentajes de carbonatos totales determinados por titulación ácido base en el medio poroso de los modelos de acuífero estimulados con las distintas concentraciones de formiato en el punto de inoculación y río abajo al finalizar el experimento. Las barras representan el valor promedio de duplicados (n=2). FIGURA 28:

Esta figura muestra las imágenes obtenidas por microscopía electrónica de barrido de la arena de cuarzo de los modelos de acuífero estimulados con la menor y mayor concentración de formiato (3 y 18 g/L) al final del experimento. A: Mineral cristalino de CaCÜ3 y cúmulos bacterianos en una muestra de arena de cuarzo de uno de los modelos estimulados con 3 g/L de formiato. B: Mineral cristalino de CaCÜ3 y cúmulos bacterianos en una muestra de arena de cuarzo de uno de los modelos estimulados con 18 g/L de formiato. ac: arena de cuarzo carb: carbonato. Flechas: cúmulos bacterianos.

FIGURA 29:

Esta figura ilustra el diagrama del flujo de una aplicación particular del proceso para reducir la permeabilidad hidráulica y generar la precipitación de minerales insolubles in situ de un acuífero subterráneo contaminados con sulfatos.

Los siguientes ejemplos ilustran algunas aplicaciones concretas de la invención, pero no pretenden limitar el marco ni los alcances de la presente invención.

EJEMPLOS

Ejemplo 1

Enriquecimiento de un consorcio microbiano reductor de sulfato a partir de trombolitos vivos.

Se tomó muestras de trombolitos vivos del Lago Sarmiento de Gamboa (51°03O0"S, 72°45'0 W), Parque Nacional Torres del Paine, XII Región, Chile. Lago Sarmiento posee una profundidad máxima de 312 m y un área aproximada entre 83 y 84 km ² . El Lago Sarmiento de Gamboa es un lago alcalino con una salinidad promedio de 1 ,9 mg/L, un pH entre 8,3 y 8,7, y una temperatura media superficial de 6,2°C en invierno y 12,2°C en verano. El Lago Sarmiento presenta microbialitos vivos, que poseen una estructura no laminada constituida por coágulos de carbonatos la cual los clasifica como trombolitos. Estos trombolitos vivos se encuentran bajo la superficie del espejo de agua (Solari et al. Paleoclimatic significance of lacustrine microbialites: A stable isotope case study of two lakes at Torres del Paine, Southern Chile. Palaeogeography, Palaeoclimatology, Palaeoecology, 297(1), 70-82, 2010).

El proceso de muestreo consistió en la extracción manual de trombolitos vivos situados bajo el agua en la orilla del sector Noreste del lago, los cuales fueron colocados a 6 °C en frascos de plástico estériles. Por ser un Área Silvestre Protegida del Estado, se obtuvo el permiso de la Corporación Nacional Forestal (CONAF Autorización N° 012/2014) para realizar el muestreo.

Mediante difracción de rayos X (equipo de difracción de rayos X D8 Advance, Bruker, Alemania), se determinó que la mineralogía de los trombolitos vivos del Lago Sarmiento está representada principalmente por magnesio calcita (Mgo,o6Cao,94CC>3).

Para realizar el enriquecimiento del consorcio se utilizó biorreactores rellenos de arena (Figura 1). Los biorreactores (1) fueron fabricadas de vidrio y tenían 173 mL de capacidad, 18 cm de longitud y 3,5 cm de diámetro interno. Para el control de temperatura se utilizó una camisa de vidrio exterior (2), alimentada con agua proveniente de un baño termorregulado a 18 °C. El biorreactor se rellenó con arena (3). Para ello, se instaló en la parte inferior del biorreactor un filtro para impedir que la arena escurra hacia las mangueras de alimentación. Este filtro consistió en un tubo de PVC cubierto con una malla de plástico, por la apertura inferior. El biorreactor se llenó con agua destilada estéril, cuidando de sacar todo el aire atrapado. Posteriormente, se agregó una capa de 40 g de arena gruesa (aproximadamente 850 pm), sobre la cual se colocó 120 g de una capa de arena fina (de 300 a 500 pm). Ambos tipos de arena fueron lavadas previamente con HCI al 10%, el que se enjuagó con agua destilada hasta que el enjuague alcanzó pH 6.

Posterior al lavado, la arena se esterilizó y secó en un horno a 180 °C por 2 horas. Para controlar la presión interna del sistema, se utilizó un par de piezómetros de vidrio ubicados uno en la parte inferior (4) y otro en la parte superior (5) del biorreactor. La diferencia en la altura de agua de los piezómetros permitió determinar la conductividad hidráulica. La alimentación se hizo mediante bombas peristálticas (Cole-Palmer, modelo 7557-14, 1-100 rpm, EEUU) desde la parte inferior (6) hasta la parte superior (7) del biorreactor, con un flujo ascendente de 0,2 mL/min.

Se conectó con mangueras de silicona la camisa externa del biorreactor al baño termorregulado, mientras las otras conexiones se efectuaron de la siguiente forma: con mangueras de silicona, las entradas, salidas e instalación de los piezómetros; con mangueras de Tygon (impermeables a intercambio gaseoso) las vías de alimentación, recirculación y salida de efluentes. Todas las mangueras del sistema, y sus conectores, fueron previamente esterilizados en autoclave. Para generar el flujo de alimentación se empleó una bomba peristáltica (Cole-Palmer, modelo 7557-14, 1- 100 rpm, EEUU). Para impedir cambios en la temperatura interna del sistema, junto con impedir el paso de luz al interior (simulando las condiciones de la napa subterránea), se envolvió a los biorreactores con un aislante térmico.

Una vez montado el biorreactor, se realizó un lavado bombeando agua destilada, hasta que no se vio turbidez en el efluente. Por último, se alimentó el biorreactor con aproximadamente 1 L de medio de cultivo PCM estéril, cuya composición se indica a continuación: K2SO4 2,4 g/L; MgS04 ^* 7H ₂ 0 0,061 g/L; NaHCOs 0,35 g/L; CaCI ₂ 1 ,3 g/L; K ₂ HPC>4 0,01 g/L; Na ₂ (Si0 ₃ ) 0,009 g/L; citrato de sodio 0,28 g/L; NhUCI 1 g/L; extracto de levadura 1 g/L; acetato de sodio 1 ,3 g/L. El medio se ajunto a pH 7,9. El medio de cultivo se preparó en agua de subterránea extraída de la barrera hidráulica de un tranque de relaves, cuyos principales componentes son HCO3 ^· 217,7 mg/L, Ca ²⁺ 302 mg/L, Mg ²⁺ 76,6 mg/L y SCL ^2- 1192,3 mg/L. Se utilizó agua subterránea extraída de un acuífero contaminado para preparar el medio de cultivo para enriquecer un consorcio microbiano adaptado a las condiciones ambientales del sitio a tratar.

Una vez que todo el sistema se rellenó con el medio PCM, se procedió inmediatamente a inocularlo. Este proceso involucró una etapa de introducción de una muestra de microbialito vivo al biorreactor y posteriormente de un periodo de colonización, que consistió en una recirculación a 10 rpm (con un caudal nominal 2,1 ml/min) por 24 horas, se alimentó con medio de cultivo la columna, sin recirculación, a un caudal promedio de 173 mL/día por 68 días, después a 80 mL/día por 26 y finalmente a 18 mL/día hasta el final del experimento.

Para determinar la concentración de sulfato en solución se utilizó el método estándar basado en la precipitación del sulfato contenido en las muestras como sulfato de bario (BaSCL) que se forma al agregar la sal soluble cloruro de bario (BaCh) en exceso (American Public Health Association, American Water Works Association y Water Environment Federation. 1998a. "4500-S04-2 E". En: "Standard methods for the examination of water and wastewater". Ed. 20). El sulfato de bario formado fue determinado por turbidimetría mediante un espectrofotómetro a 450 nm (Espectrofotómetro Dynamica, modelo HALO RB-10, Gran Bretaña).

La concentración de calcio en solución se realizó mediante espectrometría de absorción, usando el siguiente protocolo: se centrifugó 1 mL de efluente por 10 minutos a 11.600 g (centrífuga Microcentaur MSB010.Cx2,5; Sanyo, Gran Bretaña), 500 pL de sobrenadante se diluyó en agua destilada, para situar la determinación dentro del rango medible. De la solución mencionada se tomó 1 mL de solución y se agregó a un tubo de ensayo con 8 mL de agua destilada y 1 mL de una solución de Sr ²⁺ de 4.000 mg/L con HCIO4 0,8N. Finalmente la solución se mide usando un espectrofotómetro de absorción atómica Perkin Elmer, modelo 3110, EEUU (American Public Health Association, 1992a; American Public Health Association, 1992b).

El resultado del enriquecimiento del consorcio microbiano se muestra en la Figura 2. En la parte (A) se observa que los valores de pH en el efluente, alcanzan valores iguales a 8,5. La alcalinización generada por este consorcio es una condición muy importante para la mineralización inducida biológicamente. Este aumento se hace más evidente a medida que se disminuye el volumen de alimentación. Por su parte, las concentraciones de sulfato, graficadas en la parte (B), indican una tendencia al descenso asociado a la disminución de los volúmenes de alimentación. En este caso, se alcanzó concentraciones de sulfato menores a 2500 mg/L. Esto sugiere la acción de bacterias reductoras de sulfato en este consorcio. Para las concentraciones de calcio se observa una disminución progresiva a partir del punto en el cual se redujo el volumen de alimentación, cabe destacar que incluso se registraron concentraciones de calcio por debajo de los 200 mg/L. La reducción en la concentración de calcio se explica por la mineralización de carbonato de calcio al interior del biorreactor (mineralización inducida biológicamente). El efluente de esta columna, que contiene el consorcio microbiano reductor de sulfato a partir de trombolitos del Lago Sarmiento, Torres del Paine, se utiliza como inoculo para un proceso que permita reducir la permeabilidad hidráulica y generar la precipitación de minerales insolubles en un acuífero contaminado. Además, este efluente se emplea para inocular un nuevo biorreactor de igual o mayor tamaño. Ejemplo 2

Enriquecimiento de un consorcio microbiano reductor de sulfato a partir estromatolitos vivos.

Se tomó muestras de estromatolitos vivos de la Laguna Amarga (50°58'27"S, 72°44'55"W), Torres del Paine, XII Región, Chile. Laguna Amarga es una laguna mesosalina, endorreica, somera (profundidad máxima 4 m) con un área aproximada de 1 ,9 km ² . El pH promedio del lago es de 9,1 , mientras que la salinidad y la temperatura promedio es de 26,1 mg/L y 11 ,7 °C, respectivamente. La Laguna Amarga presenta microbialitos laminares o estromatolitos vivos, con formas de bulbos, domos y alargados (Solari et al. Paleoclimatic significance of lacustrine microbialites: A stable isotope case study of two lakes at Torres del Paine, Southern Chile. Palaeogeography, Palaeoclimatology, Palaeoecology, 297(1), 70-82, 2010). Los estromatolitos vivos con forma de domo están compuestos por una secuencia de láminas blancas y grises. El proceso de muestreo consistió en la extracción manual de estromatolitos situados cerca de la orilla del extremo Este de la laguna, los cuales fueron colocados a 6 °C en frascos de plástico estériles. Mediante difracción de rayos X (equipo de difracción de rayos X D8 Advance, Bruker, Alemania), se determinó que los estromatolitos vivos presentan minerales de carbonato, particularmente aragonita (Ca(CC>3), además de halita (NaCI), cuarzo (SiOz), albita calciana ((Nao,84Cao,i6)Ali,i6S¡2,8408) y anortita (Nao,25Cao,7i(AÍ2S¡208)).

Para realizar el enriquecimiento del consorcio se utilizó biorreactores rellenos de arena, de acuerdo a lo descrito anteriormente en el Ejemplo 1. La inoculación de los biorreactores con una muestrea de estromatolito de la Laguna Amarga y la posterior colonización de la arena se realizó, también, según lo ya descrito en el Ejemplo 1. A continuación se alimentó medio de cultivo al biorreactor, sin recirculación, con un caudal de 30-90 mL/semana. La determinación de las concentraciones de sulfato y calcio en solución se realizaron de acuerdo al Ejemplo 1.

Las mediciones de ácido sulfhídrico (o sulfuras) se realizaron de acuerdo a lo indicado en "Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater" (American Public Health Association, American Water Works Association y Water Environment Federation. 1998b. "4500-S-2 D". En: "Standard methods for the examination of water and wastewater". Ed. 20.), cuyo fundamento es la medición de la absorbancia producida por la formación de azul de metileno al reaccionar el compuesto N,N-dimetil-1 ,4-fenildiamino oxalato y el sulfuro presente en la muestra.

El resultado del enriquecimiento del consorcio microbiano se muestra en la Figura 3. En la Figura 3A se observa que los valores de pH en el efluente, alcanzan valores cercanos a 8,5 a los 120 días y que el potencial de óxido reducción tiende a disminuir en el tiempo, lo que es adecuado para el establecimiento de un consorcio microbiano reductor de sulfato. Por su parte, la Figura 3B muestra una importante reducción de la concentración de sulfato en el efluente del biorreactor, comparado con la concentración agregada con el medio de cultivo. En este caso, se alcanzó concentraciones de sulfato menores a 1500 mg/L. En la Figura 3B también se puede ver que a partir del día 100 aumenta en forma importante la concentración de ácido sulfhídrico. Esto muestra la actividad de los microorganismos reductores de sulfato del consorcio microbiano enriquecido. Al igual que en el ejemplo 1 , la Figura 3C muestra un progresivo descenso de la concentración de calcio en el efluente en comparación con lo que se agrega en el medio de cultivo.

El efluente de este biorreactor, que contiene el consorcio microbiano reductor de sulfato enriquecido a partir de estromatolitos de la Laguna Amarga, se utiliza como inoculo para un proceso que permita reducir la permeabilidad hidráulica y generar la precipitación de minerales insolubles en un acuífero contaminado. Además, este efluente se emplea para inocular un nuevo biorreactor de igual o mayor tamaño.

Ejemplo 3

Disminución de la conductividad hidráulica en columnas

Para demostrar la disminución de la conductividad hidráulica debida al crecimiento del consorcio microbiano en un lecho de arena, se diseñó y construyó un prototipo de laboratorio, constituido por una columna de acero inoxidable AISI 304. La Figura 4 muestra esquemáticamente el diseño de las columnas. Se utilizó 3 columnas de 1 ,40 metros de altura y 25 centímetros de diámetro, con salidas laterales a los 8, 50,

90 y 130 centímetros desde la base para la instalación de instrumentos de medición de presión. Se instaló filtros de malla de PVC y malla de acero inoxidable con poros de 0,3 mm de diámetro en la base de la columna. Además, se colocó filtros de malla de acero inoxidable al costado de las columnas, para proteger las salidas de medición de presión.

Para las columnas se usó 70 kilogramos de arena de cuarzo 35-50 mallas, la que no fue tamizada nuevamente para empacar las columnas. Sin embargo, se caracterizó su tamaño de partícula por, tamizado (tamizador Erweka AR 400, Alemania) y posteriormente pesando la arena que quedaba en cada tamiz (Tabla 1). La arena utilizada en todas las columnas se lavó con agua, posteriormente se trató con ácido clorhídrico al 20% para remover carbonatos, se neutralizó mediante lavados con agua destilada y finalmente se secó y esterilizó en un horno Pasteur a 180 °C por dos horas.

Tabla 1. Caracterización de la arena utilizada en el empaque de las columnas.

Se empacó todas las columnas llenándolas con agua hasta alcanzar 30 centímetros de altura, para luego agregar la arena de forma uniforme hasta que decantara. Las columnas se empacaron sobre una malla de acero inoxidable ubicada encima de un lecho piedras de cuarzo entre 0,64 cm y 2,5 cm de diámetro. Esto último con el fin de evitar el descenso de la arena empacada hacia las mangueras de alimentación.

Una vez que se terminó de agregar la arena a la columna se colocó la tapa de la columna y se realizó las conexiones de mangueras usando mangueras Tygon. Luego se enrolló a lo largo de la columnas una manguera conectada a un baño termorregulado y se rodeó la estructura con un aislante térmico, con el fin de mantener el interior de las columnas a 18°C.

Se utilizó el siguiente medio de cultivo: K2SO4 4,6 g/L; MgS04*7H ₂ 0 0,06 g/L; NaHCOs 0,035 g/L; CaCI ₂ ^* 2H ₂ 0 3,4; NhUCI 1 g/L; Na ₂ (Si0 ₃ ) 0,009 g/L; KH ₂ R0 ₄ 0,05 g/L; citrato de sodio 0,279 g/L; acetato de sodio 4,5 g/L; extracto de levadura 1 g/L; tioglicolato de sodio 0,099 g/L. El medio de cultivo se preparó con agua subterránea extraída del de la barrera hidráulica de un tranque de relaves, cuyos principales componentes son HCO3 ^· 217,7 mg/L, Ca ²⁺ 302 mg/L, Mg ²⁺ 76,6 mg/L y SCL ^2- 1192,3 mg/L. Además, también se agregó tioglicolato, compuesto reductor que le otorga al medio de cultivo un potencial de óxido reducción adecuado para el desarrollo de bacterias reductoras de sulfato.

La columna A fue inoculada con el efluente del biorreactor del Ejemplo 1. La columna B fue inoculada con el efluente del biorreactor del Ejemplo 2. La columna C (control sin microorganismos) no fue inoculada y se le agregó un biocida. Para la inoculación se hizo pasar 50 litros de medio de cultivo a través de cada columna de acero inoxidable, posteriormente las columnas A y B se inocularon 450 mL del efluente del biorreactor del Ejemplo 1 y de Ejemplo 2, respectivamente. La columna C no fue inoculada y se le agregó 920 mg/L de sulfato de cadmio al medio de cultivo que la alimentó para inhibir el desarrollo microbiano.

Todas las columnas se iniciaron con una recirculación del medio durante 15 días, para favorecer la adherencia de los microorganismos sobre las partículas de arena del relleno. Posteriormente se agregó medio de cultivo, en forma continua, de acuerdo al siguiente régimen de alimentación para cada una de las columnas:

- Columna A: 816 mL/día 16 al 29, 302 mL/día del día 30 al 106, 907 mL/día del día

107 al 138, 302 mL/día del día 139 al 168 y 907 mL/día del día 169 al 182.

- Columna B: 816 mL/día 16 al 29, 302 mL/día del día 30 al 126, 907 mL/día del día 127 al 172.

- Columna C: 816 mL/día 16 al 29, 302 mL/día del día 30 al 126, 907 mL/día del día 127 al 172.

La determinación de las concentraciones de sulfato y calcio se realizó de acuerdo al ejemplo 1 y la medición de ácido sulfhídrico (o sulfuros) en solución, de acuerdo al Ejemplo 2.

La concentración de ATP en los efluentes se determinó con el sistema comercial de medición de ATP LixKit ^® , Biohidrica, Chile, el que se basa en la reacción de oxidación de luciferina dependiente de ATP catalizada por la enzima luciferasa. La cantidad de luz producida por la reacción se determinó mediante un luminómetro Kikkoman, modelo Lumitester PD-20, Japón. Para esto, se tomaron 5 mL de efluente de los modelos, del cual se concentraron los microorganismos por filtración en membranas de nitrocelulosa (0,22 pm). Posteriormente, los microorganismos filtrados fueron recolectados con la tórula provista en el sistema, la que se inserta en la varilla de reacción que contiene el líquido de lisis celular y los demás componentes liofilizados para la oxidación de luciferina dependiente de ATP. El valor de luminiscencia obtenido (en Unidades Relativas de Luz, URL), fue dividido por 5 para obtener el valor de URL/mL.

En al caso de la columna A, en la Figura 5A, se observa una disminución en el potencial de óxido-reducción a lo largo del experimento, lo que favorece el establecimiento del metabolismo reductor de sulfato en la columna, dado que este metabolismo se asocia a bajos niveles de potencial. La Figura 5A muestra que la medición de ATP intracelular en el efluente de la columna, se relaciona directamente con la actividad microbiana presente, se mantiene alta durante todo el experimento, aunque con una tendencia a la baja al final de éste. La Figura 5B muestra que durante un periodo de 175 días de operación la columna inoculada con el consorcio enriquecido fue capaz de reducir sulfato. En cuanto a la producción de ácido sulfhídrico en esta columna (Figura 5B), se puede observar una tendencia al aumento en los valores de las mediciones de sulfuros a lo largo del tiempo, con una pendiente mayor a partir del día de operación número 120, cuando aumenta la reducción de sulfato al interior de la columna, llegando a valores cercanos a 180 mg/L hacia el final del experimento.

Para la columna B se observó que el potencial de óxido-reducción tiene un comportamiento similar a la columna A (Figura 6A), alcanzando valores negativos y manteniéndose al fin del experimento alrededor de los -350 mV. Esto da indicios del desarrollo de un metabolismo reductor de sulfato al interior de la columna inoculada. La Figura 6A muestra altos valores de ATP intracelular en el efluente de la columna al inicio del experimento, los que se reducen a lo largo del tiempo. Las mediciones de sulfato a partir del efluente, que se muestran en la Figura 6B, indican que desde el inicio del experimento hubo una disminución en los valores de sulfato en el efluente de la columna B en comparación con la concentración de sulfato alimentada con el medio de cultivo. La Figura 6B muestra una activa producción de ácido sulfhídrico a partir del día 60, incrementándose su concentración en el efluente, para llegar a valores de 450 mg/L en el día 140.

Como control comparativo, en la Figura 7A se puede observar que a diferencia de lo ocurrido en las columnas A y B, la columna C con biocida no hay reducción en el potencial de óxido reducción, manteniéndose la condiciones oxidativas con un valor promedio de + 200 mV. La medición de ATP intracelular en el efluente mostró bajos niveles de actividad microbiana. De la misma manera, esta columna no mostro cambios respecto a la concentración de sulfato del medio de cultivo (Figura 7B). Tampoco fue posible detectar la producción de ácido sulfhídrico en esta columna, lo que confirma la ausencia de actividad microbiana reductora de sulfato (Figura 7B).

Para evaluar si el crecimiento y la actividad del consorcio microbiano reducen el flujo de un líquido a través de la arena, se empleó la conductividad hidráulica. Este parámetro mide la facilidad con que un acuífero transmite agua. A mayor dificultad para el flujo es menor la conductividad hidráulica. La conductividad hidráulica se determinó al terminar el experimento en las columnas, realizando mediciones de presión con transmisores de presión (transmisores de presión de diafragma rasante modelo C9000156, Veto, Chile). La conductividad hidráulica se calculó usando la ecuación de Darcy, presentada a continuación:

Donde "Hsat" es la conductividad hidráulica de saturación, "Q" es el caudal (velocidad de alimentación de la columna), "L" la distancia entre las estaciones de medición, "A" el área de diámetro de la columna y "DH" es la diferencia entre las alturas de las columnas de agua medidas. Posteriormente, el valor obtenido se normalizó con una medición de Hsat a tiempo cero, con lo que se obtuvo un valor adimencional, siendo ambas mediciones realizadas a la misma velocidad.

Tabla 2. Conductividad hidráulica en las columnas. Valores obtenidos en el cálculo de la conductividad hidráulica (Hsat) adimensional.

Se encontró que la conductividad hidráulica generada durante la prueba fue menor en las columnas A y B inoculadas con los consorcios enriquecidos en el Ejemplo 1 y el Ejemplo 2, en comparación con la conductividad hidráulica de la columna C, en la cual se evitó el crecimiento de microorganismos mediante la adición del biocida. La mayor reducción en la conductividad hidráulica se produjo en la columna B, inoculada con el consorcio microbiano reductor de sulfato enriquecido a partir de trombolitos del Lago Sarmiento.

Ejemplo 4

Efecto del medio de cultivo sobre la mineralización inducida biológicamente y biocolmatación en biorreactores

Con el objeto de mostrar el efecto del medio de cultivo sobre la mineralización inducida biológicamente y biocolmatación, se montaron tres biorreactores rellenos de arena de 250 mi de volumen interno de acuerdo al Ejemplo 1 y se denominaron: B1 , B2 y B3. Cada uno de los biorreactores contiene como material de soporte interno arena de cuarzo (tamaño de partícula de 297-841 pm) y son mantenidos bajo condiciones anaeróbicas a una temperatura de 18°C y alimentados periódicamente con medios de cultivo A y B descritos en la Tabla 3. Los medios se diferencian porque el medio A contiene formiato, en cambio el medio B tiene acetato como donador principal de electrones. Además, el medio A carece de citrato y tiene una menor concentración de extracto de levadura. Estos medios de cultivos fueron preparados en agua proveniente del tranque de relave, la cual tenía un pH de 7,9 y concentración de sulfato de 1500 mg/L. Los tres biorreactores fueron inoculados con el efluente del biorreactor del Ejemplo 1 , que contiene el consorcio microbiano reductor de sulfato enriquecido a partir de trombolitos del Lago Sarmiento.

Dos biorreactores fueron alimentados con el medio de cultivo A (B1 y B3), sin embargo, el biorreactor B1 se cambió al medio de cultivo B en el día 170. Por otra parte, el biorreactor B2 se alimentó permanentemente con el medio de cultivo B. A cada uno de los biorreactores, se realizó mediciones periódicas de parámetros físico-químicos (pH, sulfato, sulfuro,) y biológicos (recuento bacteriano, ATP), con el fin de determinar y establecer posibles condiciones que ocurren en los sistemas montados.

Tabla 3: Composición de los medios de cultivo

La determinación de las concentraciones de sulfato, calcio, de acuerdo al Ejemplo 1 , ATP según el Ejemplo 3 y ácido sulfhídrico (o sulfuras) en solución se realizaron de acuerdo al Ejemplo 2. El recuento microbiano se realizó utilizando una cámara de Petroff Hausser en un microscopio de contraste de fases (Zeiss, modelo Standard 20, Alemania).

Con respecto a los parámetros físico-químicos, el pH demuestra un claro aumento (>8,2) en el biorreactor B2, que contiene formiato como fuente de carbono (medio de cultivo A). Del mismo modo, el biorreactor B1 , al ser suministrado con formiato (a partir del día 170 de operación), el pH aumenta considerablemente desde 7,2 y sobrepasando los 8,5. El biorreactor B3, mantiene un pH constante, variando levemente entre 7,1 y 7,6 (Figura 8).

El recuento bacteriano (Figura 9), mantiene un ritmo variable hasta el día 125, sin embargo, luego consigue un estado estacionario hasta el día 170, manteniendo un recuento de los 3 biorreactores entre 1 ,8 y 3,0 x 10 ⁸ bacterias/mL. Lo mismo se observa en las mediciones de ATP intracelular. Se observa un aumento significativo del recuento bacteriano (5,0 x 10 ⁸ bacterias/mL) en el biorreactor B1 al realizar el cambio de donador de electrones a formiato en el día 200 (medio de cultivo A).

Un aumento también ocurre con los valores de sulfuro (Figura 10), que ascienden a casi 700 mg/L en el biorreactor B1 al cambiar a formiato y por consecuencia una disminución de los valores de sulfato (Figura 11).

Los resultados de este ejemplo muestran la importancia del medio de cultivo en la generación de un ambiente alcalino, propicio para inducir la precipitación de carbonato de calcio. Se concluye que formiato es un donador de electrones adecuado para lograr incrementar el pH al interior del biorreactor.

Ejemplo 5

Mineralización inducida biológicamente y biocolmatación en acuíferos modelo

Para mostrar el efecto de la inyección de nutrientes y el consorcio microbiano en un acuífero subterráneo contaminado se diseñó un modelo de acuífero o (caja de arena) en el que fluye horizontalmente el agua a través de un lecho de arena. Este modelo de acuífero cuenta con una entrada (pozo de infiltración) para la inyección de nutrientes y el consorcio microbiano y puertos de toma de muestra. Para la construcción de los modelos de acuífero se utilizaron cámaras de acrílico transparente (Plexiglás) de dimensiones internas de 32 x 12 x 1 cm; largo, ancho y alto respectivamente (Figura 12). Estas estaban provistas por una tapa removible, la cual contaba con orificios donde se instalaron puertos para la inoculación y estimulación de microorganismos, y un puerto de toma de muestras situado rio abajo respecto a los anteriores. Para establecer un frente del flujo hidráulico homogéneo a través de toda la sección de los modelos, en uno de sus extremos se instaló una tubería interna, que abarcó todo el ancho del modelo, construido con manguera de Tygon (MasterFlex) perforada cada 1 cm, que se utilizó para la entrada del agua que simula el flujo hidráulico acuífero subterráneo. En el otro extremo, se instaló una manguera de Tygon para la salida del efluente de los modelos. Luego, el volumen interno del modelo (384 mL) fue empacado con 545 g de arena de cuarzo de tamaño de partícula entre 200-800 pm, la que fue previamente lavada con HCI al 10% (v/v), enjuagada con agua destilada, y secada a 180°C por 4 horas para eliminar carbonatos y microorganismos que puedan encontrarse antes de los experimentos. Una vez armados los sistemas, se les pasó agua destilada utilizando bombas peristálticas, fijando el flujo de salida de la bomba a 0,6 m/L. La estandarización de los parámetros hidráulicos básales de los modelos se llevó a cabo usando agua destilada, la cual fue reemplazada por agua de barrera hidráulica un día antes del comienzo de la infiltración de los microorganismos.

Una vez construidos los modelos de acuífero, se estableció el flujo hidráulico utilizando agua destilada, a la velocidad mencionada previamente. Para alcanzar una velocidad del flujo constante en el interior de los modelos, éstos funcionaron por 48 horas sólo con agua, luego de lo cual se determinó los siguientes parámetros hidráulicos previos a la inoculación de los modelos:

Para determinar el tiempo de retención del acuífero modelo, se hizo pasar 250 mL de una solución de azul brillante (AB) (como trazador) a una concentración de 100 mg/L, a través de la entrada del agua del flujo de los modelos, y se tomó muestras desde el puerto de toma de muestra cada 30 minutos desde que se observó su entrada en los modelos. Se realizó este procedimiento hasta que la concentración del trazador en el puerto de muestras alcanzó la mitad de la concentración en la solución inicial (es decir, 50 mg/L), y se registró aquel tiempo como el necesario para que el trazador se desplazara por esa sección de modelo (o tiempo de retención). La concentración de AB fue determinada en un espectrofotómetro a 630 nm (es pectrof otó metro Dynamica, modelo HALO RB-10, Gran Bretaña).

Para el flujo del líquido en los modelos de acuífero, se recolectó el volumen de efluente durante 5 min en un tubo de ensayo previamente tarado. El valor obtenido fue dividido por 5 para obtener el volumen de efluente en mL por minutos.

El valor del flujo de efluente medidos en 13 modelos de acuíferos (sin inocular con microorganismos) fue de 0,61 ± 0,04 mL/min (media ± desviación estándar) reflejando el valor establecido en las bombas peristálticas (cercano a 0,6 mL/min). El tiempo de retención determinado en todos los modelos de acuífero fue 228 ± 27 min. La variabilidad observada en los tiempos de retención, se debe a diferencias menores en el empacado.

Una vez determinados los parámetros hidráulicos, se realizó la inoculación de los modelos de acuífero con el consorcio microbiano reductor de sulfato utilizando el efluente del biorreactor B1 del Ejemplo 4. La composición microbiana de este consorcio se detalla más adelante en el Ejemplo 6 (ver Tablas 4, 5, 6, 7 y 8). Para este experimento, se utilizaros 3 modelos de acuíferos y se infiltraron a 0,2 mL/min, (n=2 modelos). En todos los experimentos, cada pulso de inoculo contenía T10 ⁹ microorganismos según lo calculado por recuento microbiano. Además, se utilizó un modelo como control no inoculado (n=1 modelo), en el cual se infiltró agua de barrera hidráulica con el fin de simular la inoculación. Luego de las inoculaciones, se suministró medio de cultivo continuamente a una velocidad de 0,2 mL/min. La composición del medio de cultivo por litro fue: 0,035 g de NaHCC>3, 0,03 g de MgSO7H ₂ 0, 2,4 g de K2SO4, 0,007 g FeSC>4-7H ₂ 0, 1 g de NH ₄ CI, con 4,95 g de formiato de sodio, 0,01 g de KH ₂ PC>4, 1 ,72 g de CaCI ₂ -2H ₂ 0, 0,1 g de extracto de levadura y 0,099 g de ácido tioglicólico. El medio de cultivo se preparó con agua subterránea extraída de la barrera hidráulica de un tranque de relaves, cuyos principales componentes son HCO3 ^· 217,7 mg/L, Ca ²⁺ 302 g/L, Mg ²⁺ 76,6 mg/L y S04 ² - 1192,3 mg/L

En el caso del control no inoculado, luego de la infiltración de agua se inyectó continuamente agua de barrera hidráulica a 0,2 mL/min. Los modelos inoculados fueron re-inoculados, a la velocidad correspondiente, los días 15, 30, 45, 48, 52, 55 y 58, contados a partir de la primera inoculación.

Se obtuvo entre 20-350 pL (dependiendo del parámetro a determinar) de solución desde el puerto de toma de muestra de los modelos utilizando jeringas estériles, cuidando de no extraer el volumen rápidamente, con el fin de evitar cambios bruscos en el flujo que resultan de la disminución de presión local producto de la extracción. Estas muestras fueron utilizadas para la determinación de sulfato, ácido sulfhídrico y tiempo de retención (cuando se utilizó el trazador).

El efluente de los modelos fue utilizado para realizar las determinaciones de pH, potencial, formiato, recuento microbiano y ATP.

La determinación de las concentraciones de sulfato, calcio, de acuerdo al

Ejemplo 1 , ATP según el Ejemplo 3 y ácido sulfhídrico (o sulfuros) en solución se realizaron de acuerdo al Ejemplo 2. Recuento microbiano se realizó utilizando la metodología descrita en el Ejemplo 4.

Una vez terminado el experimento en los modelos de acuífero, se procedió a su apertura y a la toma de muestras de arena para los siguientes análisis:

Se utilizó un protocolo para determinar la cantidad de ATP de los microorganismos adheridos a la arena de cuarzo de los modelos de acuífero. Para esto, se tomaron 200 mg de una muestra de arena, la que fue lavada con agua destilada para remover las bacterias presentes en el volumen de poro, luego de lo cual se agregó 1 mL de la solución de lisis celular contenida en el sistema de determinación de ATP. Posteriormente, el sobrenadante de la lisis se hizo reaccionar con los demás componentes liofilizados (luciferina-luciferasa) para determinar la cantidad de ATP mediante un luminómetro Kikkoman, modelo Lumitester PD-20, Japón. El valor de luminiscencia obtenido se expresó como URL/g de arena. Determinación de pH en el agua de poro: Una vez abiertos los modelos de acuífero, inmediatamente se determinó el pH en el agua de poro de la arena en distintas zonas de los modelos, humedeciendo tiras indicadoras de pH. Se compararon los colores de las tiras con el patrón provisto en el envase del producto. Las lecturas de pH fueron utilizadas para realizar un mapa de pH correspondiente al plano superior del medio poroso de los modelos.

Determinación de carbonatos totales en muestras de arena: Se obtuvo pequeñas muestras de arena (aprox. 300 mg) desde distintas zonas de los modelos, las cuales se pusieron bajo una lupa y se les agregó gotas de HCI concentrado (1 M) con el fin de observar burbujeos que dan cuenta de la posible presencia de carbonatos. Las muestras que resultaron positivas a esta prueba, se enviaron al laboratorio de Química y Bioquímica de Suelos de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, donde se determinó los carbonatos totales por titulación acido- base.

Difracción de rayos X: Las muestras de arena fueron molidas en un mortero para obtener una muestra con granulometría adecuada para realizar la difracción de rayos X (DRX). Luego fueron analizadas utilizando un equipo de difracción de rayos X D8 Advance, Bruker, Alemania. El difractograma obtenido se comparó con los correspondientes a muestras estándar de minerales de CaCC>3.

Al finalizar el experimento con el modelo de acuífero y para cuantificar el porcentaje de la superficie de la arena de cuarzo que presento formación de carbonato (formación de agregados de arena cementados), se realizó el análisis de las imágenes fotográficas utilizando el programa ImageJ. Para calcular un área biomineralizada se empleó la siguiente la ecuación:

Area biomineralizada

donde el área del medio poroso biomineralizado y el área total del medio poroso corresponden al número de pixeles que resultaron de selecciones a mano alzada sobre las fotografías al finalizar el experimento. Los resultados de los modelos de acuíferos dieron cuenta de la actividad reductora de sulfato del consorcio microbiano inoculado y los cambios en el flujo hidráulico del medio poroso durante 60 días.

A partir del día 10, se detectó la presencia de ácido sulfhídrico en los modelos de acuífero inoculados con el consorcio enriquecido en bacterias reductoras de sulfato (Figura 13A). Esto coincide con el tiempo en que se observó una reducción en la concentración de sulfato en el efluente de los modelos (Figura 13B). Los valores de sulfato descendieron a 1500 mg/L en promedio después del día 14, fluctuando entre 1400-2000 mg/L hasta el final del experimento, mientras que la concentración de ácido sulfhídrico aumentó a valores entre 60-80 mg/L, alcanzando entre 130-200 mg/L en los días finales del experimento (Figura 13A).

A su vez, se observó acidificación del efluente en los experimentos inoculados en comparación con el control no inoculado. Este parámetro fluctuó en el rango 7,4- 7,6 en los modelos inoculados a partir del día 20, mientras que el control se mantuvo en el rango de 7, 7-8,0 durante todo el experimento (Figura 13C). En los modelos inoculados se presentó un importante descenso del potencial de óxido-reducción, ya que a partir del día 5 el valor de este parámetro alcanzó entre -170 a -190 mV, disminuyendo gradualmente hasta valores menores a -250 mV en los días finales del experimento. Estas condiciones anóxicas son adecuadas para las bacterias reductoras de sulfato. En cambio, el modelo control mostró un menor descenso de este parámetro, promediando solo -70 mV durante todo el transcurso del experimento (Figura 13D).

En el efluente de los modelos inoculados y control se determinó periódicamente la cantidad de ATP intracelular, encontrando altos valores de ATP, los que variaron entre 800-2500 URL/mL, lo que mostró la colonización microbiana al interior de los modelos de acuífero inoculados (Figura 14). En cambio, los valores de ATP intracelular en el control no inoculado, permanecieron bajos durante todo el experimento.

La disminución de la permeabilidad del medio poroso de los modelos de acuífero debido a la reducción del tamaño de poro provocada por la biocolmatación por biomasa microbiana y precipitación de minerales carbonatados se demostró mediante el cambio del tiempo de retención del trazador. A partir del día 22, se observaron aumentos en el tiempo de retención del trazador en los modelos inoculados, lo que no fue observado en el modelo control, a excepción de un leve aumento de este parámetro en el día 55 de experimentación (Figura 15). En los modelos inoculados se observó una región de menor permeabilidad ubicada en la zona central, la que ralentiza la llegada del trazador al puerto de toma de muestra. En efecto, con el transcurso del experimento, en los modelos inoculados se observa una pluma oscura, que emerge en los puertos de inoculación y estimulación, y que se extiende hacia la salida del efluente, siguiendo la dirección del flujo del agua.

Los análisis de los experimentos con el trazador en el día 55 dan cuenta que las plumas ennegrecidas representan una zona de menor permeabilidad respecto a otras zonas del medio poroso, puesto que se observa que el colorante se desvía cuando se encuentra con esta zona, provocando que la mayor parte del flujo hidráulico ocurra por las zonas no ennegrecidas (Figura 16). Las zonas ennegrecidas de la pluma se deben a la formación de precipitados de sulfuras de hierro a partir del ácido sulfhídrico generado en los modelos inoculados y la presencia de trazas de hierro en el medio de cultivo infiltrado.

Después de 60 días de prueba, se desarmó los modelos de acuífero para determinar en la arena el pH, el ATP intracelular microbiano, la abundancia relativa de los microorganismos y los minerales de carbonato formados.

El valor del pH en el agua de poro de la arena se determinó mediante varillas indicadoras de pH. Esto permitió hacer un mapa de este parámetro (Figura 17). Se distinguieron tres zonas en la arena de los modelos: a) zona 1 : primer tercio ubicado en las cercanías de la zona de entrada del agua del flujo, b) zona 2: segundo tercio ubicado en la zona central, y c) zona 3: tercer tercio ubicado hacia la zona de salida de efluente. En todos los modelos de acuífero inoculados, se observó una zona de pH 8 en las zonas 2 y 3. También se observaron zonas puntuales de pH 8,5 en uno de los duplicados, los que se ubican dentro de las zonas de pH 8. Se observó un menor valor de pH (cercano a 7,5) en la zona 1. Los altos valores locales de pH son de gran importancia para inducir la precipitación de carbonatos. En cambio, en el modelo control no se observó alcalinización, ya que en todas las zonas se detectó un pH de 7,5.

Se realizó mediciones de ATP intracelular correspondientes a los microorganismos adheridos a la arena de los modelos de acuífero. En los modelos inoculados, se observó la mayor cantidad de ATP en arena en la zona 2. Tanto en las zonas 1 y 3, se encontraron cantidades similares de ATP en ambos experimentos. Estos resultados confirman la colonización microbiana de la arena y demuestran además que los microorganismos adheridos están metabólicamente activos. El modelo control (no inoculado), mostró valores considerablemente menores en todas las zonas en comparación a los inoculados (Figura 18).

Al momento de la toma de muestras de arena desde los modelos inoculados, se encontró una fracción de arena de cuarzo altamente biomineralizada, cuyas partículas de arena se encontraron aglomeradas, producto de la mineralización inducida biológicamente. Esta zona se centró en el punto de inoculación y estimulación de microorganismos, en forma de círculo irregular de unos 3 cm de diámetro y ocupando todo el alto interno del modelo (Figura 19).

Para detectar la formación de carbonatos en la arena, se tomaron muestras de arena, desde distintas zonas de los modelos inoculados, a las cuales se les agregó gotas de HCI concentrado, con el fin de observar efervescencia que revela la posible presencia de carbonatos. De los modelos cuyas muestras se generó efervescencia, se extrajo dos muestras para la cuantificación de carbonatos totales por titulación ácido-base: a) desde la zona ubicada en el punto de inoculación, y b) desde un punto ubicado río abajo (12 cm) al punto de inoculación. La mayor cantidad de carbonatos se generaron en la zona de inoculación (5,8% de carbonatos totales en la arena), donde se encontraron valores hasta 7 veces mayores respecto a la zona rio abajo (0,8% de carbonatos totales en la arena). En la prueba de carbonatos con HCI de las muestras de arena del modelo control no se observó la producción de gas.

Los análisis de DRX para la evaluación de la composición mineralógica de las muestras de arena de los modelos inoculados, confirmaron la presencia de los minerales calcita, vaterita y aragonita en distintas proporciones dependiendo de la muestra (Tabla 9).

Tabla 9. Cantidad de CaCC>3 (vaterita, aragonita y calcita) determinados por DRX en arena de los modelos de acuífero en el experimento de evaluación de las velocidades de inoculación. Se muestran los porcentajes de CaCÜ3 en el punto de inoculación y río abajo en uno de los duplicados de los modelos de acuífero inoculados a distintas velocidades. N.D.: no detectado.

Este ejemplo muestra que es posible establecer un consorcio microbiano reductor de sulfato activo en el medio poroso de un modelo de acuífero con flujo hidráulico continuo, el que consiste en agua de barrera hidráulica de un tranque de relave que contiene sulfato. La reducción microbiana de sulfato, que es producto de la inoculación y estimulación del consorcio microbiano, fue capaz de biomineralizar una porción de la arena de cuarzo (medio poroso), debido a la acumulación de minerales de CaCÜ3, la que según los experimentos realizados con el trazador, corresponde a una zona de menor permeabilidad al flujo hidráulico.

Ejemplo 6

Abundancia relativa de los microorganismos del inoculo y de los microorganismos adheridos a la arena en los modelos de acuífero

Con el objeto de determinar la composición microbiana del inoculo y de los microorganismos adheridos a la arena en los acuíferos se utilizó la secuenciación masiva del gen del ARNr 16S. Los microorganismos del inoculo se concentraron por centrifugación a partir de una muestra del efluente del biorreactor B1 del Ejemplo 4, utilizado para la producción del inoculo. Para realizar el análisis de la comunidad microbiana establecida en la arena de los modelos de acuífero inoculados, se tomó una muestra de arena de los acuíferos modelo inoculados en el Ejemplo 5. A partir de estas muestras centrifugadas del inoculo o las muestras de arena, se extrajo el ADN genómico total utilizando un sistema comercial de extracción de ADN (PowerSoil DNA Isolation Kit, MOBIO, EEUU). La PCR y secuenciación de las amplificaciones de la región hipervariable V4 del gen del ARNr 16S se realizó de acuerdo al protocolo utilizado por el servicio de secuenciación del Centro de Genómica y Bioinformática de la Facultad de Ciencias de la Universidad Mayor. Las secuencias obtenidas fueron procesadas y comparadas para su identificación con la base de datos SILVA de 2018.

Para realizar el análisis de la comunidad microbiana establecida en la arena de los modelos de acuífero inoculados, se tomó una muestra de arena de la zona central (zona 2) de uno de los duplicados inoculados. A partir de estas muestras se extrajo el ADN genómico total de los microorganismos adheridos a la arena para su posterior secuenciación masiva del gen del ARNr 16S por tecnología lllumina.

En las Tablas 4, 5, 6, 7 y 8 se presenta la abundancia relativa de las secuencias del gen del ARNr 16S en los extractos de ADN de los microorganismos del inóculo utilizado, a nivel de Filo, Orden, Clase, Familia y género, respectivamente.

Los resultados de la secuenciación mostraron que los principales Filos presentes en la comunidad microbiana de inóculo se clasificaron como Proteobacteria, Firmicutes y Bacteroidetes (Tabla 4). A nivel taxonómico de Clases, la comunidad microbiana de inoculo estaba compuesta principalmente de Gammaproteobacteria, Clostridia, Deltaproteobacteria, Betaproteobacteria, Alphaproteobacteria y Bacteroidia (Tabla 5). Los Ordenes predominante correspondieron a Oceanospirillales, Clostridiales, Enterobacteriales, Desulfovibrionales, Burkholderiales, Pseudomonadales, Bacteroidales y Caulobacterales (Tabla 6). A nivel taxonómico de Familias, los principales microorganismos presentes fueron: Oceanospirillaceae, Peptococcaceae, Enterobacteriaceae, Desulfomicrobiaceae, Pseudomonadaceae, Comamonadaceae, Porphyromonadaceae, Clostridiaceae, Caulobacteraceae y [Tissierellaceae] (Tabla 7). Los resultados de la secuenciación mostraron que los principales Géneros de la comunidad microbiana del inoculo se clasificaron en: Familia Oceanospirillaceae, Desulfosporosinus, Desulfomicrobium, Pseudomonas, Citrobacter, Familia

Comamonadaceae, Familia Porphyromonadaceae, Brevundimonas, Familia Clostridiaceae, Familia Enterobacteriaceae, Sedimentibacter, Familia Rhodobacteraceae, Tissierella_Soehngenia y Stenotrophomonas (Tabla 8). Los microorganismos que mostraron mayor abundancia relativa fueron Fam. Oceanospirillaceae (29,74%), Desulfosporosinus (14,42%) y Desulfomicrobium (8,36%). Entre ellos se destacan Desulfosporosinus y Desulfomicrobium por su capacidad de reducción biológica de sulfato.

Tabla 4. Abundancia relativa de las secuencias del gen del ARNr 16S a nivel de Filos en los extractos de ADN de los microorganismos del inoculo utilizado y de los microorganismos adheridos a la arena de los modelos de acuífero al final del experimento.

Tabla 5. Abundancia relativa de las secuencias del gen del ARNr 16S a nivel de Clases en los extractos de ADN de los microorganismos del inoculo utilizado y de los microorganismos adheridos a la arena de los modelos de acuífero al final del experimento.

Tabla 6. Abundancia relativa de las secuencias del gen del ARNr 16S a nivel de Ordenes en los extractos de ADN de los microorganismos del inoculo utilizado y de los microorganismos adheridos a la arena de los modelos de acuífero al final del experimento.

Tabla 7. Abundancia relativa de las secuencias del gen del ARNr 16S a nivel de Familias en los extractos de ADN de los microorganismos del inoculo utilizado y de los microorganismos adheridos a la arena de los modelos de acuífero al final del experimento.

Tabla 8. Abundancia relativa de las secuencias del gen del ARNr 16S a nivel de Géneros en los extractos de ADN de los microorganismos del inóculo utilizado y de los microorganismos adheridos a la arena de los modelos de acuífero al final del experimento.

En los modelos inoculados, se encontró que la comunidad microbiana similar adherida a la arena de cuarzo al final del experimento es cualitativamente similar a la del inoculo utilizado (Tablas 4, 5, 6, 7 y 8).

Los resultados de la secuenciación mostraron que los principales Filos presentes en la comunidad microbiana adherida a la arena de cuarzo se clasificaron como Proteobacteria, Firmicutes y Bacteroidetes (Tabla 4). A nivel taxonómico de Clases, la comunidad microbiana de la arena estaba compuesta principalmente de Gammaproteobacteria, Clostridia, Deltaproteobacteria y Bacteroidia (Tabla 5). Los Ordenes predominante correspondieron a Clostridiales, Desulfovibrionales, Pseudomonadales y Bacteroidales (Tabla 6). A nivel taxonómico de Familias, los principales microorganismos presentes fueron: Desulfomicrobiaceae,

Pseudomonadaceae, Porphyromonadaceae y [Tissierellaceae] (Tabla 7).

Los resultados de la secuenciación mostraron que los principales Géneros de la comunidad microbiana de la arena se clasificaron en: Desulfomicrobium, Pseudomonas, Familia Porphyromonadaceae, Familia Clostridiaceae, Sedimentibacter, Tissierella_Soehngenia y Orden Bacteroidales (Tabla 8). Los microorganismos que mostraron mayor abundancia relativa fueron Desulfomicrobium (58,37%), Familia Porphyromonadaceae (19,04%) y Pseudomonas (4,53%). Entre ellos se destaca Desulfomicrobium por su capacidad de reducción biológica de sulfato.

Las secuencias correspondientes al género reductor de sulfato

Desulfomicrobium aumentaron considerablemente respecto a la composición porcentual de la comunidad del inoculo (Tabla 8). También se encontró un aumento importante de secuencias correspondientes un género de la familia Porphyromonadaceae. Estas diferencias pueden ser atribuidas a las condiciones microambientales particulares de la arena.

Los análisis de este ejemplo muestran que el consorcio microbiano enriquecido utilizado como inoculo en el Ejemplo 5 presenta una alta diversidad bacteriana, entre las que se puede encontrar algunas clases que incluyen bacterias reductoras de sulfato, como es el caso de las Deltaproteobacteria. Entre ellos se destacan los géneros Desulfosporosinus y Desulfomicrobium por su capacidad de reducción biológica de sulfato. Al estudiar comunidad microbiana adherida a la arena de cuarzo al final de experimento en el modelo de acuífero, se encontró que esta era cualitativamente similar a la del inoculo utilizado, con algunos microorganismos que aumentan su proporción de manera importante. Este es el caso del género Desulfomicrobium. Ejemplo 7

Efecto de la concentración de formiato en la mineralización inducida biológicamente y biocolmatación en acuíferos modelo

Para mostrar el efecto del cambio de la concentración de formiato en el medio de cultivo, se construyeron 8 modelos de acuífero, los que se operaron y monitorearon bajo las mismas condiciones y metodologías que en el Ejemplo 6. Las concentraciones de formiato fueron 3, 6, 12 y 18 g/L. En este caso, los modelos fueron inoculados con la misma cantidad de microorganismos que en Ejemplo 6, y re-inoculados el día 15 de funcionamiento. La velocidad de inoculación fue de 0,2 mL/min en todos los modelos. Luego, en experimentos independientes (n=2 modelos), los modelos fueron estimulados con los medios de cultivo conteniendo las distintas concentraciones de formiato durante 60 días.

Para determinar la concentración del formiato remanente en el efluente de los acuíferos, se utilizó un método colorimétrico previamente descrito por Sleat y Mah (Quantitative Method for Colorimetric Determination of Fórmate in Fermentation Media. Applied and Environmental Microbiology. 47 (4): 884-885, 1984). La reacción entre los componentes del método y la muestra fue incubada a temperatura ambiente por 2,5 hrs, luego de lo cual se cuantificó el producto de la reacción en un espectrofotómetro a 510 nm (espectrofotómetro Dynamica, modelo HALO RB-10, Gran Bretaña).

Durante el tiempo de experimentación (60 días), en todos los ensayos se observó reducción en la concentración de sulfato en los modelos a partir del día 15 (Figura 20A). A su vez, se verificó la producción de ácido sulfhídrico en todos los modelos. Sin embargo, puede apreciarse un retardo en el alza de este parámetro en los experimentos realizados a mayores concentraciones de formiato (12 y 18 g/L) (Figura 20B). En los modelos estimulados con menor concentración de formiato (3 y 6 g/L) (Figura 20C), se alcanzó más rápidamente disminución del potencial de óxido reducción en comparación con los de mayor concentración. También, puede apreciarse que los valores de pH en el efluente de los modelos estimulados con la menor cantidad de formiato (3 g/L) sigue una tendencia a la baja respecto a los valores de los demás experimentos (Figura 20D).

En el efluente de los modelos estimulados con las mayores concentraciones de formiato (12 y 18 g/L) se observó una apreciable disminución de la concentración de este sustrato respecto de la concentración de formiato agregada durante el tiempo de experimentación (Figura 21). Sin embargo, en los ensayos realizados con las menores concentraciones de formiato (3 y 6 g/L), no se observó la misma tendencia de consumo de formiato.

En todas las concentraciones de formiato ensayadas, se logró aumentar el tiempo de retención del trazador hasta un valor similar en todos los modelos (Figura 22).

Después de 60 días de prueba, se desarmó los modelos de acuífero para determinar en la arena el pH, el ATP intracelular microbiano, la abundancia relativa de los microorganismos y los minerales de carbonato formados.

El valor del pH en el agua de poro de la arena se determinó mediante varillas indicadoras de pH. Esto permitió hacer un mapa de este parámetro (Figura 23). Se distinguieron tres zonas en la arena de los modelos: a) zona 1 : primer tercio ubicado en las cercanías de la zona de entrada del agua del flujo, b) zona 2: segundo tercio ubicado en la zona central, y c) zona 3: tercer tercio ubicado hacia la zona de salida de efluente. Los valores de pH en arena tendieron a aumentar a medida que se aumentó la concentración de formiato en el medio de cultivo (Figura 23). En promedio, en los modelos estimulados con las mayores concentraciones de formiato (12 y 18 g/L), este parámetro alcanzó valores sobre 8 en la zona 2 y 3, mientras que se registró un valor menor a 8 en las mismas zonas de los modelos estimulados con las menores concentraciones de formiato (3 y 6 g/L).

Se realizó mediciones de ATP intracelular correspondientes a los microorganismos adheridos a la arena de los modelos de acuífero. En todos los ensayos, los valores de ATP en arena fueron mayores en las zonas 2 y 3 de los modelos, mientras que la zona 1 (rio arriba al punto de inoculación) fue menor respecto a las otras zonas (Figura 24). Especialmente en las zonas 2 y 3, se observó un aumento dependiente de la concentración de formiato en el medio de cultivo de este parámetro, dentro del rango entre 3 y 12 g/L. En este último, se alcanza un valor máximo de ATP/g de arena, ya que en los modelos con la mayor cantidad de formiato (18 g/L), estos disminuyen hasta valores similares a los del ensayo realizado con 6 g/L de formiato.

El aumento de la concentración de formiato en el medio de cultivo produjo un enriquecimiento de las secuencias correspondientes al género reductor de sulfato Desulfomicrobium, las cuales predominaron en todas las muestras (Tabla 10), alcanzando el 35, 48, 52 y 57% en la arena de los modelos de acuífero estimulados con 3, 6, 12 y 18 g/L de formiato, respectivamente. El aumento del dador de electrones también produjo el notorio enriquecimiento de las secuencias correspondientes al género Pseudomonas. También se observó el efecto contrario sobre otros componentes de la comunidad microbiana, ya que se observó la disminución de las secuencias de la familia predominantemente aeróbica

Comamonadaceae y del género anaeróbico obligado Proteiniclasticum.

Los resultados anteriores demuestran que existe un efecto de la concentración de formiato en el medio de cultivo sobre el alcance de la mineralización inducida biológicamente del medio poroso en el modelo de acuífero utilizado, ya que se observó un aumento de los carbonatos totales rio abajo y del área biomineralizada en los modelos en función del aumento del dador de electrones. Esto se relaciona con los valores de formiato medidos en efluente, pues el dador de electrones fue utilizado en mayor medida en los experimentos que contenían las mayores cantidades de formiato, mientras que en los modelos estimulados con las menores concentraciones de éste, no hubo utilización considerable del dador. Tabla 10. Abundancia relativa de las secuencias del gen del ARNr 16S en los extractos de ADN de los microorganismos adheridos a la arena de los modelos de acuífero al final del experimento de evaluación de las concentraciones de formiato.

Se comprobó la presencia de una porción de arena biomineralizada en todos los modelos de acuífero (Figura 25). El cálculo del área comprendida por la arena biomineralizada, en base al análisis de imágenes utilizando el programa ImageJ, reveló una directa relación entre el área del arena aglomerada y la cantidad de formiato en el medio de cultivo (Figura 26). Esta relación es lineal en el rango de concentraciones de formiato comprendido entre los 3-12 g/L, luego de lo cual el área biomineralizada tiende a no aumentar a mayores concentraciones de formiato.

El análisis cuantitativo de carbonatos totales en las zonas definidas en el experimento anterior (punto de inoculación y punto río abajo) confirman el aumento de la cantidad de carbonatos precipitados en el punto río abajo producto del aumento de la concentración de formiato (Figura 27). También, resulta interesante que la cantidad de carbonatos en el punto de inoculación disminuye con el aumento del formiato en el medio de cultivo

Mediante análisis por DRX se encontró la formación de calcita en los acuíferos modelo a todas las concentraciones de formiato. Los análisis cuantitativos del contenido de calcita presentaron la misma tendencia que la determinada por el análisis cuantitativo de carbonatos por titulación ácido-base, es decir, el aumento de la cantidad de carbonatos precipitados en el punto río abajo de los modelos (Tabla 11).

Tabla 11. Cantidad de CaCC>3 (calcita) determinados por DRX en la arena de los modelos de acuífero estimulados con las distintas concentraciones de formiato. Se muestran los porcentajes de CaCÜ3 en el punto de inoculación y río abajo de uno de los duplicados de los modelos de acuífero estimulados con distintas concentraciones de formiato.

Al final del experimento, se realizó observaciones por microscopía electrónica de barrido (MEB), de la arena mineralizada. Para ello se tomó aproximadamente 100 mg de muestra de arena de cuarzo del punto de inoculación de uno de los modelos estimulados con la menor y mayor concentración de formiato y se les añadió una solución fijadora de cacodilato-glutaraldehído 2,5%. Luego de esto, se realizó el secado de las muestras en un secador de punto crítico y el recubrimiento con oro (recubridor oro/carbono Dentón Desk V, EEUU y secador de punto crítico Autosamdri - 815, EEUU). Posteriormente, las muestras fueron observadas en un microscopio electrónico de barrido de alta resolución (HR-SEM), modelo INSPECT- F50, Holanda.

En las Figura 28A y 28B, correspondientes a muestras de arena de cuarzo de los modelos estimulados con la menor y mayor concentración de formiato, respectivamente, se pueden ver cúmulos bacterianos compuestos en su gran mayoría por microorganismos con forma de bacilo, adheridas sobre la superficie de la arena de cuarzo y adyacentes a minerales cristalinos, posiblemente calcita, según lo determinado previamente por DRX. Ejemplo 8

Proceso para la reducir la permeabilidad hidráulica y generar la precipitación de minerales insolubles in situ de un acuífero subterráneo contaminados con sulfatos

El proceso consiste en un sistema para reducir la permeabilidad hidráulica y generar la precipitación de minerales insolubles en un acuífero con agua subterránea contaminada con sulfato y/o con sulfato y metales. El proceso se compone de al menos los pasos de: a) proveer un cultivo de microorganismos enriquecido en bacterias reductoras de sulfato y adaptado a las aguas subterráneas del acuífero a tratar, b) inyectar el acuífero con un cultivo de microorganismos enriquecido, c) inyectar el acuífero con un donador electrones y nutrientes adecuados para cultivo de microorganismos enriquecido en bacterias reductoras de sulfato y uno o más cationes metálicos que favorezcan la precipitación de minerales insolubles, y d) permitir que los microorganismos se multipliquen y colonicen el material del sólido del acuífero, reduciendo la permeabilidad hidráulica del acuífero y generando la precipitación de minerales insolubles en el material sólido del acuífero.

Como se muestra en la Figura 29, el proceso se inicia con la extracción de agua subterránea contaminada con sulfato y/o con sulfato y metales (1), desde un acuífero subterráneo, cuya dirección del flujo está indicada con las flechas (2). Para realizar la extracción del agua subterránea se emplea uno pozo o más pozos de extracción (3), que se instalan desde el nivel superficial del suelo (4) para extenderse por debajo del nivel freático (5). En el sector del nivel freático el o los pozos tienen ranuras, perforaciones u otras secciones permeables (6), que permiten la extracción del agua subterránea. El agua subterránea extraída ingresa por medio del conducto (7) al estanque (8). A éste último, por medio del conducto (9), se le agrega un donador de electrones y nutrientes adecuados para cultivo de microorganismos enriquecido en bacterias reductoras de sulfato y uno o más cationes metálicos que favorezcan la precipitación de minerales insolubles. Los compuestos agregados se agitan en el estanque para obtener una solución Por medio del conducto (10) se ingresa la solución en el biorreactor anaerobio de lecho fijo (11), el cual ha sido previamente inoculado con un consorcio microbiano reductor de sulfato enriquecido, de acuerdo a los Ejemplos anteriores. El efluente del biorreactor (11), que contiene los microorganismos del consorcio reductor de sulfato, por medio del conducto (12), se ingresa a uno pozo o más pozos de inyección (13), que se instalan desde el nivel superficial del suelo (4) para extenderse por debajo del nivel freático (5). En el sector del nivel freático el o los pozos tienen ranuras, perforaciones u otras secciones permeables (14), que permiten la inyección de microorganismos y soluciones nutritivas al agua subterránea. Para estimular el crecimiento y la actividad metabólica del consorcio microbiano reductor de sulfato, también se agrega la solución del estanque (8) directamente, por medio del conducto (15) a uno pozo o más pozos de inyección (13), dicha solución se inyecta al agua subterránea mediante las ranuras, perforaciones u otras secciones permeables (14). Los microorganismos proliferan en los poros y en la superficie del material particulado del acuífero subterráneo, obstaculizando el flujo del agua. Además, la actividad metabólica de los microorganismos, especialmente la reducción biológica de sulfato, produce la remoción parcial del sulfato y la alcalinización de la solución. Como resultado de lo anterior se logra generar una zona de reducción de la permeabilidad hidráulica y de precipitación de minerales insolubles in situ (16) en una zona aguas abajo del punto de inyección en un acuífero subterráneo contaminado con sulfatos. Los minerales insolubles son principalmente carbonatos y sulfuras metálicos. Los carbonatos, tales como calcita, aragonita o vaterita, se forman en el ambiente alcalino, a partir del bicarbonato producido por la degradación microbiana anaerobia de materia orgánica y el calcio agregado y/o presente en el agua subterránea. Adicionalmente, precipitan sulfuras metálicos, particularmente FeS, por la reacción entre el H2S formado biológicamente y los óxidos de hierro, tales como maghemita, magnetita, hematita o goetita comúnmente presente en suelos y en material particulado de los acuíferos subterráneos.