Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Isolierung von Nukleinsäuren.

Vor der Analyse von aus Zellen gewonnenen Nukleinsäuren mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) ist es erforderlich, die Nukleinsäuren aufzureinigen und aufzukonzentrieren. Ferner kann es notwendig sein, aus der zu analysierenden Probe bestimmte die Polymerasekettenraktion störende Substanzen, wie die prosthetische Gruppe von Hämoglobin, von der Probe abzutrennen.

Daneben spielt auch bei anderen Techniken zur Analyse von Nukleinsäuren, bsp. der Hybridisierung, eine Aufreinigung und Aufkonzentration der zu analysierenden Nukleinsäuren eine wichtige Rolle.

Aus "Methods of Enzymology", Vol. 68, S. 170 - 182, ist es bekannt, zur Isolierung von Nukleinsäuren sog. "Spin-columns" zu verwenden. Dabei werden in einer aus der DE 41 39 664 AI bekannten Variante folgende Arbeitsschritte verwendet:

aa) Zellaufschluß, bb ⁾ Adsorption der Nukleinsäuren an einem Glasfaservlies in

Gegenwart eines Puffers mit hoher Ionenstärke und cc ⁾ Elution der Nukleinsäuren mit einem Puffer geringer Ionenstärke.

Beim Schritt lit.aa) wird die flüssige Probe durch ein Glasfaservlies geleitet, an dem die Nukleinsäuren adsorbieren. Anschließend wird das Glasfaservlies mit

verschiedenen Losungen gewaschen. Schließlich werden die Nukleinsäuren in Anwesenheit von Puffern geringer Ionenstarke von der Festphase eluiert.

Das bekannte Verfahren ist in mehrfacher Hinsicht nachteilig: Beim Waschen der Festphase kann es zur Kontamination der Probe kommen. Außerdem können wegen der im Glasfaservlies herrschenden Kapillarkräfte die Nukleinsäuren nur zum Teil daraus zurückgewonnen werden.

Des weiteren sind aus "Methods in Enzymology 65" (1980), S. 371 - 380 gelelektrophoretische Methoden bekannt, bei denen Nukleinsäuren an Gele gebunden und danach mittels Elektroelution wieder in Lösung gebracht werden. Auch dabei kann es zu Kontamination der Lösung kommen. Die Nukleinsäuren liegen in der Lösung in hoher Verdünnung vor. Eine Aufkonzentration findet nicht statt.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren und eine Vorrichtung anzugeben, mit denen die Nachteile des Stands der Technik vermieden werden. Insbesondere soll ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Isolierung von Nukleinsäuren angegeben werden, die eine einfache und kostengünstige Aufreinigung und Aufkonzentration von Nukleinsäuren ermöglichen. Außerdem soll eine weitgehend automatisierte Isolation und Aufkonzentration von Nukleinsäuren durchfuhrbar sein. Schließlich bezweckt die Erfindung die Vermeidung von Kontaminationen.

Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1 und 12 gelost. Zweckmäßige Ausgestaltungen des Verfahrens bzw. der Vorrichtung ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 11 sowie 13 bis 41.

ERSATZBLÄTT(REGEL26)

Nach Maßgabe der Erfindung ist ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus biologischen nukleinsäurehaltigen Flüssigkeiten und Suspensionen vorgesehen, wobei

a) die Nukleinsäuren an ein Adsorptionsmittel gebunden werden,

b) die Nukleinsäuren vom Adsorptionsmittel eluiert und

c) durch Elektrophorese von einem Reaktionsraum in einen damit verbundenen Entnahmeraum bewegt und dort angereichert werden.

Das Verfahren ermöglicht auf einfachem Weg eine Aufreinigung und Aufkonzentration von Nukleinsäuren aus Flüssigkeiten. Insbesondere bei einer automatischen Verfahrensführung kann das Risiko einer Kontamination weitgehend ausgeschlossen werden. Die Elution kann durch Pufferwechsel oder elektrisch durch Elektroelution bzw. Elektrophorese erfolgen.

Nach weiterer Maßgabe der Erfindung ist eine Vorrichtung zur Isolierung von Nukleinsäuren aus biologischen nukleinsäurehaltigen Flüssigkeiten und Suspensionen vorgesehen, wobei ein Reaktionsraum zur Aufnahme eines mit Nukleinsäuren beladenen Adsorptionsmittels mit einem Entnahmeraum verbunden ist, und wobei die Nukleinsäuren mittels einer Elektrophoreseeinrichtung vom Reaktions- in den Entnahmeraum bewegbar und dort anreicherbar sind. - Diese Vorrichtung ermöglicht eine einfach und kostengünstig durchführbare Aufkonzentration und Isolierung von Nukleinsäuren. Durch das Vorsehen eines besonderen

Entnahmeraums kann eine Kontamination weitgehend ausgeschlossen werden.

Nachfolgend werden Ausfuhrungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung naher erläutert. Hier zeigen:

Fig. 1 eine schematische Querschnittsansicht eines ersten Ausfuhrungsbeispiels der Vorrichtung,

Fig. 2 das Ausführungsbeispiel gemäß Fig. 1 mit "Spin- Column",

Fig. 3 eine schematische Querschnittsansicht eines zweiten Ausführungsbeispiels der Vorrichtung,

Fig. 4 eine schematische Querschnittsansicht durch ein erstes Ausfuhrungsbeispiel einer Aufremigungs- und Anreicherungsvorrichtung mit einer Vorrichtung gemäß Fig. 3,

Fig. 5 eine Draufsicht auf ein Agaroseflachbettgel,

Fig. 6a eine schematische Querschnittsansicht eines dritten Ausführungsbeispiels der Vorrichtung,

Fig. 6b eine Abwandlung des in Fig. 6a gezeigten Ausführungsbeispiels,

Fig. 6c eine schematische Querschnittsansicht eines vierten Ausfuhrungsbeispiels der Vorrichtung,

Fig. 7a eine Untersicht eines fünften Ausführungsbeispiels der Vorrichtung,

ERSATZBL _Ä TT(REGEL26)

Fig. 7b eine Draufsicht auf das Ausführungsbeispiel gemäß Fig. 7a,

Fig. 7c eine schematische Seitenansicht des Ausführungsbeispiels gemäß Fig. 7a,

Fig. 7d eine perspektivische Ansicht eines Deckels für ein erstes Ausführungsbeispiel einer

Elutionsvorrichtung,

Fig. 7e eine perspektivische Ansicht des ersten Ausführungsbeispiels der Elutionsvorrichtung ohne Deckel,

Fig. 7f eine perspektivische Ansicht des Ausführungsbeispiels gemäß Fig. 7a bis 7c,

Fig. 8 eine schematische Querschnittsansicht durch ein sechstes Ausführungsbeispiel der Vorrichtung,

Fig. 9 eine schematische Querschnittsansicht durch eine beschichtete Elektrode,

Fig. 10 eine schematische Querschnittsansicht durch ein siebtes Ausführungsbeispiel der Vorrichtung,

Fig. 11 eine schematische Querschnittsansicht durch ein achtes Ausführungsbeispiel der Vorrichtung,

Fig. 12 eine Draufsicht auf ein zweites Ausführungsbeispiel einer Elutionsvorrichtung und

Fig. 13 eine schematische Querschnittsansicht durch ein zweites Ausführungsbeispiel einer Aufreinigungs- und Anreicherungsvorrichtung.

ERSATZBUTT(REGEL26)

In Fig. 1 ist ein schematischer Querschnitt eines ersten Ausführungsbeispiels der Vorrichtung gezeigt. In einem Elektrophoresepuffertank 10 mit einem bodenseitigen Durchbruch 43 ist ein Behälter 15 aufgenommen. Der Behälter 15 umschließt einen Reaktionsraum 17, welcher über einen Kanal 49 mit einem Entnahmeraum 50 verbunden ist. Das Volumen des Reaktionsraums 17 beträgt vorzugsweise 1 bis 20 ml. Der Entnahmeraum 50 ist mittels einer eine erste Öffnung 42 verschließenden ersten permeablen Membran 30 ionenleitend mit einem im Elektrophoresepuffertank 10 aufgenommenen Elektrophoresepuffer verbunden. Das Volumen des Entnahmeraums 50 beträgt vorzugsweise 0,005 bis 0,1 ml. Die erste permeable Membran 30 ist z.B. aus einer Dialysemembran gebildet, welche für Nukleinsäuren nicht durchlässig, für Salze, insbesondere chaotrope Salze, jedoch durchlässig ist. Die erste permeable Membran 30 ist mittels eines flexiblen Rings, bsp. eines 0- Rings, auf einem ersten Stutzen 41 befestigt. Im Reaktionsraum 17 ist ein Adsorptionsmittel 100, bsp. ein Glasfaservlies, Silika, Glasperlen, mit Glas umfangene magnetische Partikel, Anionenaustauscher o. dgl., aufgenommen. In den Reaktionsraum 17 ragt durch eine zweite Öffnung 80 eine Kathode 20a. Eine Anode 20b taucht in den im Elektrophoresepuffertank 10 befindlichen Elektrophoresepuffer ein, dessen Füllstand mit 70 bezeichnet ist. Unterhalb des Adsorptionsmittels 100 erstreckt sich vom Behälter 15 ein zweiter Stutzen 85, der den Durchbruch 43 durchgreift. Der zweite Stutzen 85 ist mittels eines O-Rings 40 gegenüber dem Elektrophoresepuffertank 10 abgedichtet. - Der Entnahmeraum 50 weist eine Entnahmeöffnung 60 auf. Er ist so ausgebildet, daß Lufteinschlüsse vermieden werden. Der Entnahmeraum 50 kann insbesondere als Kapillare ausgebildet sein.

Fig. 2 zeigt im wesentlichen das in Fig. 1 gezeigte erste Ausführungsbeispiel. Dabei ist im Reaktionsraum 17 ein "Spin-

column" 90 aufgenommen. Ein den Elektrophoresepuffertank 10 durchgreifender zweiter Stutzen 85 ist hier nicht vorgesehen.

In Fig. 3 ist eine schematische Querschnittsansicht durch em zweites Ausfuhrungsbeispiel der Vorrichtung gezeigt. Dabei befindet sich die Kathode 20a außerhalb des Reaktionsraums 17. Sie taucht direkt in den Elektrophoresepuffertank 10 ein. Am den Reaktionsraum 17 umgreifenden Teil des Behalters 15 ist em dritter Stutzen 45 vorgesehen, dessen dritte Öffnung 46 durch eine zweite permeable Membran 31 verschlossen ist.

Fig. 4 zeigt eine schematische Querschnittsansicht durch ein erstes Ausfuhrungsbeispiel einer Aufreinigungs- und Anreicherungsvorrichtung mit der Vorrichtung gemäß Fig. 3. Die Vorrichtung gemäß Fig. 3 befindet sich im Wirkbereich eines x, y,z-Pipettors, dessen x,y, z-Pipettierarm mit 190 bezeichnet ist. Der x,y, z-Pipettierarm 190 nimmt eine Pipettierspitze 180, vorzugsweise eme Wegwerfspitze, auf. Em geeigneter x,y, z-Pipettor wird bsp. von der Firma TECAN AG, Schweiz, angeboten. Ferner ist im Wirkbereich des x,y,z- Pipettors ein heizbarer Schuttelbock 170 angeordnet. Im Schuttelbock 170 sind Reaktionsrohrchen 150 für die Lyse aufgenommen. Daneben befinden sich em erstes Gefäß 160 für die Lyse, ein zweites Gefäß 162 zur Aufnahme für eme Waschlosung sowie Probengefaße 165. Mit 185 ist ein Vorrat an Pipettenspitzen und mit 210 sind PCR-Gefaße bezeichnet.

Der Elektrophoresepuffertank 10 ist mit einem Fullstutzen 125 versehen, der mit einem Elektrophoresepuffervorrat 110 unter Zwischenschaltung einer Pumpe 120 verbunden ist. Der zweite Stutzen 85 sowie eme am Boden des Elektrophoresepuffertanks 10 vorgesehene Ableitung 140 stehen mit einer zweiten Pumpe 130 m Verbindung. Die zweite Pumpe 130 ist vorzugsweise als Schlauchpumpe ausgeführt. Eme geeignete Schlauchpumpe wird bsp. von der Firma Cavro, Kalifornien, USA, angeboten. Die

ERSATZBLÄTT(REGEL26)

Kathode 20a sowie die Anode 20b sind über elektrische Zuleitungen 225a bzw. 225b mit einer Spannungsquelle 220 verbunden. Die erste 120 und die zweite Pumpe 130, der Schuttelbock 170, der x,y, z-Pipettor sowie die Spannungsquelle 220 smd so ausgeführt, daß sie mittels eines Prozeßrechners ansteuerbar smd. Somit ist em vollautomatischer Betrieb der Aufreinigungs- und Anreicherungsvorrichtung möglich.

In Fig. 5 ist eme Draufsicht auf eine besonders einfache Variante eines Behalters 15 gezeigt. Dieser ist aus einem Agaroseflachbettgel 11 hergestellt, an dessen gegenüberliegenden Querseiten die Kathode 20a und die Anode 20b anliegen. Im Agaroseflachbettgel 11 ist eine erste den Reaktionsraum 17 bildende Ausnehmung 81 zur Aufnahme von Adsoptionsmittel und eine zweite Ausnehmung 61 vorgesehen. Die zweite Ausnehmung 61 ist schlitzförmig ausgebildet. Sie dient zur Entnahme der darin angereicherten Nukleinsäuren.

In Fig. 6a ist eine schematische Querschnittsansicht durch em drittes Ausfuhrungsbeispiel der Vorrichtung gezeigt. Dabei ist der Behalter 15 in Form eines Kreuzverbindungsstucks ausgebildet. Das Adsorptionsmittel 100 befindet sich auf einem Stutzvlies 302. Die Kathode 20a und die Anode 20b smd als elektrisch leitfahige Kunststoffpipettenspitzen ausgebildet, die mit dem Elektrophoresepuffertank (hier nicht gezeigt) in Verbindung stehen. Sie sind mit dem Behalter 15 über Schlauchstucke 318 verbunden. Im Entnahmeraum 50 angereichte Nukleinsäuren können durch die Entnahmeoffnung 60 abgezogen werden.

Wie m Fig. 6b gezeigt ist, können zwischen dem Entnahmeraum

50 sowie einem Zwischenraum 321 weitere Stutzvliese 303 angeordnet sein. Bei dem m Fig. 6c gezeigten vierten Ausfuhrungsbeispiel smd die Offnungen der als

ERSATZBLÄΓT(REGEL26)

Kunststoffpipettenspitzen ausgebildeten Elektroden 20a bzw. 20b verschlossen.

In den Fig. 7a bis 7c ist em fünftes Ausfuhrungsbeispiel der Vorrichtung in verschiedenen Ansichten gezeigt. Dabei besteht der Behalter 15 aus einem quaderformigen Teil. Der Reaktionsraum 17 ist durch eme Bohrung gebildet. An beiden Seiten smd neben dem Reaktionsraum 17 Ausnehmungen 320, 321 zur Aufnahme der Kathode 20a bzw. der Anode 20b vorgesehen. Die Wand zwischen den Ausnehmungen 320, 321 und dem Reaktionsraum 17 ist lonenleitend ausgebildet. Die Ausnehmungen 320 dienen zur Aufnahme von Elektrophoresepuffer. Sie sind mit Stopfen 340 verschlossen. Der Elektrophoresepuffertank besteht bei dieser Ausführungsform aus zwei Teilbehaltern, welche den Reaktionsraum 17 umgeben. Eine Mehrzahl derartiger Vorrichtungen, von denen in Fig. 7f nochmals eme perspektivisch gezeigt ist, können Bestandteile des in den Fig. 7d und 7e gezeigten ersten Ausführungsbeispiels einer Elutionsvorrichtung sein. Die Elutionsvorrichtung besteht im wesentlichen aus einem Mehrfachbehalter 410 zur Aufnahme mehrerer Vorrichtungen gemäß Fig. 7f. Der Mehrfachbehalter 410 weist einen Vakuumanschluß 401 sowie Anschlüsse 402 für einen Flussigkeitskreislauf zum Beheizen der Elutionsvorrichtung auf. Em m Fig. 7d gezeigter Deckel 400 ist mit Zuleitungen 226a, 226b für die Elektroden versehen.

In Fig. 8 ist em sechstes Ausfuhrungsbeispiel der Vorrichtung gezeigt. Dabei ist die Kathode 20a in die Wand des Reaktionsraums 17 und die Anode 20b m die gegenüberliegende Wand des Entnahmeraums 50 integriert. Im Entnahmeraum 50 ist eme permeable, insbesondere eine semipermeable, Membran 310 vorgesehen, welche für Nukleinsäuren undurchlässig ist. Die Membran 310 verhindert, daß die Nukleinsäuren direkt an die Anode 20b gelangen und

ERSATZBLÄTT(REGEL26)

dort durch Redoxprozesse zerstört werden. - Das Adsorptionsmittel 100 ist über ein Stützvlies 302 am Eingang des zweiten Stutzens 85 abgestützt.

Fig. 9 zeigt eine schematische Querschnittsansicht durch eine beschichtete Elektrode. Eine aus einem Edelmetall, wie Gold, Silber oder Platin, oder elektrisch leitfähigem Kunststoff hergestellte Kathode oder Anode 20a bzw. 20b ist mit einer aus mehreren Lagen bestehenden Beschichtung versehen. Eine erste 323 auf das Edelmetall oder den Kunststoff aufgebrachte Lage besteht aus biotinyliertem Rinderserum Albumin, eine darauf auflagernde zweite Lage 325 besteht aus einem Streptavidin oder Polystreptavidin und eine äußere dritte Lage 324 ist aus einem Oligonukleotid gebildet.

Bei dem in Fig. 10 gezeigten siebten Ausführungsbeispiel der Vorrichtung ist ein beweglicher Permanentmagnet 312 an der Außenseite des Behälters 15 so angeordnet, daß sein Nordpol in der Nähe der Kathode 20a sich befindet. Der Reaktionsraum 17 ist mit einem durchsichtigen Schnappdeckel 316 verschlossen. Der Entnahmeraum 50 ist mit einem Schnappdeckel 326 verschlossen, der mit einem Septum 328 versehen ist. Das Septum 328 kann zur Entnahme bzw. zur Zugabe von Flüssigkeit mittels einer Nadel 327 durchstochen werden. So kann eine Kontamination der in der Vorrichtung befindlichen Flüssigkeit vermieden werden. Mit 314 ist ein Photomultiplier bezeichnet, der oberhalb des durchsichtigen Schnappdeckels 316 angeordnet ist.

In Fig. 11 ist ein schematischer Querschnitt eines achten Ausführungsbeispiels gezeigt. Im Gegensatz zum siebten Ausfuhrungsbeispiel ist hier der bewegliche Permanentmagnet 312 mit seinem Südpol in der Nähe der Außenseite der Anode 20b angeordnet. Der Boden des Entnahmeraums 50 ist durchsichtig. Gegenüber der Entnahmeöffnung 60 befindet sich

ERSÄTZBLATT(REGEL26)

unterhalb des Bodens des Entnahmeraums 50 der Photomultiplier 314.

Fig. 12 zeigt eme Draufsicht auf em zweites Ausfuhrungsbeispiel einer Elutionsvorrichtung. Dabei smd eme Mehrzahl der in Fig. 11 gezeigten Vorrichtungen nebeneinander angeordnet. An den Längsseiten der Vorrichtungen smd jeweils Thermostatplatten 329 vorgesehen, mit denen die Temperatur einstellbar ist.

Fig. 13 zeigt m schematischer Querschnittsansicht em zweites Ausfuhrungsbeispiel einer Aufremigungs- und Anreicherungsvorrichtung. Dabei sind die Elektroden 20a und 20b einer Vorrichtung gemäß Fig. 11 mit einer Spannungsquelle 220 verbunden. Die Vorrichtung gemäß Fig. 11 befindet sich im Wirkbereich eines x, y, z-Pipettierarms 190 eines x,y, z- Pipettierroboters. Die Spannungsquelle 220, die zweite Pumpe 130 zur Entsorgung von zu verwerfenden Losungen, eme Vorrichtung (hier nicht gezeigt) zur Bewegung eines Permanentmagneten 312 sowie der x, y, z-Pipettierroboter sind mittels eines Prozeßrechners, bsp. eines Personal-Computers, vollautomatisch steuerbar.

Die Funktion der beschriebenen Vorrichtungen ist die folgende:

Zu analysierende biologische nukleinsaurehaltige Flüssigkeiten werden mit einem Adsorptionsmittel 100 m Kontakt gebracht. Dabei adsorbieren die m der Losung befindlichen Nukleinsäuren am Adsorptionsmittel 100. Das mit den Nukleinsäuren beladene Adsorptionsmittel 100, bsp. em Spm-column 90, wird durch die zweite Öffnung 80 m den Reaktionsraum 17 eingesetzt. Anschließend wird an die Elektroden 20a, 20b eme Gleichspannung im Bereich von 1 bis 5000 V, vorzugsweise von 25 bis 500 V, angelegt. Die negativ

ERSÄΓZBLATT(REGEL26)

geladenen Nukleinsäuren werden dadurch vom Adsorptionsmittel 100 gelost und in Richtung der in der Nahe des Entnahmeraums 50 angeordneten Anode 20b bewegt. Um einen direkten Kontakt der Nukleinsäuren mit der Anode 20b zu vermeiden, ist eine für Nukleinsäuren undurchlässige erste permeable Membran 30 vorgesehen. Infolge der in Richtung der Anode 20b gerichteten Bewegung der Nukleinsäuren reichern sich diese im Entnahmeraum 50 an. Nach einer Elektrophoresedauer von 1 bis 180 min. wird der durch den Elektrophoresepuffer geleitete Strom abgeschaltet. Durch die Entnahmeoffnung 60 des Entnahmeraums 50 kann nun ein angereicherte Nukleinsäuren enthaltendes Elutionsvolumen entnommen werden.

Um Kontaminationen zu vermeiden, kann die Entnahmeoffnung 60 mit dem Schnappdeckel 326 verschlossen werden, der mit einem Septum 328 versehen ist. Zur Entnahme von Elutionsvolumen kann das Septum 328 mit einer Nadel 327 durchstochen werden.

Je nach Art der zu isolierenden Nukleinsäuren können verschiedenartig gestaltete Elektroden 20a, 20b verwendet werden. In Frage kommt die Verwendung von aus Edelmetall oder aus leitfahigen Kunststoffen hergestellten Elektroden, die beschichtet sein können.

Die erfindungsgemaße Vorrichtung kann mit einer Einrichtung zur Detektion der Chemilumineszenz kombiniert werden. Dazu ist em Photomultiplier 314 in der Nahe des Behalters 15 angeordnet. Zunächst werden die Nukleinsäuren elektrophoretisch vom Adsorptionsmittel 100 m Richtung der Anode 20b bewegt. Im Bereich der Anode 20b kann sodann, bsp. nach der Polymerasekettenreaktion, eme Amplifikation der Nukleinsäuren durchgeführt werden. Die ampliflzierten Nukleinsäuren werden dann durch Zugabe von Magnetpartikeln gebunden. Durch Heranfuhren des Permanentmagneten 312 an die Anode 20b werden die mit Nukleinsäuren beladenen

ERSÄΓZBLÄTT(REGEL26)

Magnetpartikel an die Anode 20b angezogen. Nach Zugabe eines Chemilumineszenspuffers und Anlegen einer Spannung über den Elektroden 20a, 20b wird eine Chemilumineszens ausgelöst. Das dabei ausgesendete Licht wird durch den Photomultiplier 314 detektiert.

Die vorerwähnten Funktionen können mittels eines x,y,z- Pipettierroboters automatisiert werden. Damit ist es möglich, eine Mehrzahl der erfindungsgemäßen Vorrichtungen nacheinander automatisch zu bedienen.

Eine automatische Isolation von Nukleinsäuren kann mit den in den Fig. 4 und 13 gezeigten Aufreinigungs- und Anreicherungsvorrichtungen durchgeführt werden. Dabei hat sich folgendes Steuerungsprogramm als zweckmäßig erwiesen:

Beispiel 1

ERSATZBLÄTT (REGEL 26)

Aufarbeitung einer Vollblutprobe mit Spin-column und Elektrophorese:

Alle Reagenzien sind aus dem QIAamp™Blood Kit (Kat.Nr. 29104) der Firma Qiagen, Hilden entnommen. Nach Lyse und Adsorbtion der Nukleinsäure laut Protokoll des Herstellers wurde das Glasfaservlies aus dem QIAamp spin column herausgenommen und in ein speziell präpariertes Agaroseflachbettgel gemäß Fig. 5 gegeben. Die erste Ausnehmung 81 dient zur Aufnahme des Glasvlieses und die zweite Ausnehmung 61 ist mit Elektrophorespuffer befüllt. Auf diese Weise kann die Nukleinsäure elektrophoretisch aus dem Glasvlies eluiert und in das anschließende Agarosegel und in die zweite Ausnehmung 61 überführt werden. Aus der zweiten Ausnehmung 61 wurde die isolierte konzentrierte Nukleinsäure entnommen.

Beispiel 2

Aufarbeitung einer Plasmaprobe

Alle Reagenzien sind aus dem QIAamp™Blood Kit (Kat.Nr. 29104) der Firma Qiagen, Hilden entnommen. Zur Aufarbeitung wurde das Glasfaservlies aus dem QIAamp spin column entfernt und in die Vorrichtung gemäß Fig.l so eingesetzt, daß es am unteren Auslaß positioniert war. Das Volumen des gesamten Reaktionsgefäßes war 2 ml. Es wurden 200 μl Plasma laut Arbeitsanweisung des Herstellers verarbeitet. Statt Zentrifugation erfolgte das Absaugen mit einer Membranpumpe der Fa. Eppendorf. Zur elektrophoretischen Elution wurde ein Elektrophoresepuffer nach Andrews A.T. (Andrew A.T.: Electrophoresis, Claredon Press, Oxford, 1985, S. 160) verwendet. Als permeable Membran diente ein Dialyseschlauch der Fa. Neolab, Heidelberg (Best.Nr.: 2-9022) . Als Elektroden

ERSATZBLÄTT(REGEL26)

20a, 20b wurden Drähte mit 0,3 mm Durchmesser einer Platin- Ruthenium-Legierung verwendet und als Spannungsgeber der Elektrophoresespannungsgeber der Fa. Hölzel, Dorfen. Aus der Entnahmeöffnung 60 wurden 30 μl Elutionsvolumen mit der Nukleinsäure entnommen.

Beispiel 3

Isolierung von DNA aus Hühnerblut

Von einem frisch geschlachteten weißen Masthuhn wurde Vollblut aus der Halsschlagader aufgefangen und sofort mit Ethylendiamintetraessigsäure (Fa. Sigma, München Best. Nr. E-5513) in einer Konzentration von 0,06 g EDTA/ml Vollblut versetzt. Das EDTA-Vollblut wurde portioniert eingefroren und bei -15°C gelagert. Alle Reagenzien sind dem "High Pure PCR Template Preparation Kit" der Fa. Boehringer Mannheim (Best. Nr. 1 796 828) entnommen. 100 μl EDTA-Vollblut (s.o.) wurden mit 200 μl Lyse-Puffer und 60 μl Proteinase K jeweils aus dem o.g. Reagenziensatz gemischt und 15 min. bei 70°C inkubiert.

Nach Abkühlen auf Raumtemperatur werden 100 μl Isopropanol

(Fa. Roth, Karlsruhe Best.Nr. 9866) hinzugegeben und kräftig gemischt. Anschließend wird die zähflüssige Reaktionsmischung mit einer Vakuumpumpe (Eppendorf, Hamburg Nr. 4151) durch das Glasvlies gesaugt. Danach wurde das Vlies mit fünfmal 500 μl Waschpuffer (aus Kit s.o.) mit 80 % Ethanol (Fa. Roth, Karlsruhe Best. Nr. 5054) gewaschen. Dann wurde das Vlies aus dem Filter-Tube entfernt und in eine Vorrichtung gemäß Fig.5 in die erste Ausnehnung 81 überführt. Anschließend wurden ca. 0,5 ml Elektrophoresepuffer (10 mM Tris-HCI [Fa. Sigma, München Best.Nr. T-8529] 5 mM Natrium-Acetat [Fa Sigma, München Best. Nr. S-3272] 0,5 mM EDTA [s.o.] pH 8,2) auf das Vlies in die erste Ausnehmung 81 zupipettiert, der zuvor auf 70 °C erhitzt worden war. Danach wurde die Elektroelution

ERSATZBLÄTT(REGEL26)

durch Anlegen einer Gleichspannung von max. 10 mA bei ca. 60 grd. C durchgeführt. Als Spannungsquelle diente em Elektrophoresetransformator der Fa Holzel, Dorfen (Nr. 0 628/ 1985) .Die Elution erfolgte in Fraktionen 1-7, wobei nach definierter Zeit (10-15 min) mit einer Eppendorfpipette Fraktionen von ca 50 μl aus der Öffnung (61) entnommen und gesammelt wurden. Die Fraktionen wurden auf einem Agarosegel (0,05 mg Agarose in 60 ml Elektrophoresepuffer mit 40 μl Ethidiumbromidlosung [100 mg Ethidiumbromid (Fa. Sigma, München Nr. E-8751) in dest. Wasser] analysiert. Als Kontrolle wurden 40 μl Lysemischung verwendet. Die Kontrolle und Fraktionen nach 15 min. Elektroelution zeigten eine fluoreszierende Bande nach Elektrophorese von 5 min. bei ca. 40 V und max. 50 mA unter Beleuchtung mit einer UV-Lampe der Fa. Roger Electronic Products (Nr. MD-1782GS) . Als Spannungsquelle diente ein Elektrophoresetransformator der Fa Holzel, Dorfen (Nr. 0 628/ 1985) .

Beispiel 5

Herstellung einer beschichteten elektrisch leitfähigen Kunststoffelektrode (Fig. 9)

Zunächst wird biotinyliertem Rinder-Immunglobulm G (R-IgG) hergestellt. Dazu werden 0,5 ml einer R-IgG-Losung (2mg R-IgG

(Boehrmger Mannheim Cat.No. 1293621103 m 1 ml PBS (

NaH2P04*l H20 2,76 g/1; Na2HP04*2H20 3,56 g/1; NaCl 8 g/1; pH

7,25 ^{) )} mit 6 μl D-Biotinoyl-ε-aminocapronsaure-N- hydroxysuccmimidesterlosung in PBS und DMSO (Ansatz laut Biotin Labelmg Kit von Boehrmger Mannheim Best. Nr. 1418165) vermischt und 2,5 h bei Raumtemperatur auf einem Magnetruhrer gerührt und anschließend über Nacht stehen lassen. Das molare Verhältnis von Biotin: R-IgG betragt 20:1 bei diesem Ansatz.

ERSATZBLÄTT(REGEL26)

Zur Beschichtung von elektrisch leitfahigem Kunststoff mit biotinyliertem P-IgG werden aus einem Rohling, hergestellt im Spritzgußverfahren aus PRE-ELEC TP 4474 (Premix Oy, Finnland) , Scheiben von 4 mm Durchmesser ausgeschnitten, in emen Napf einer unbeschichteten Mikrotiterplatte gelegt und in einer Losung von 0,2 ml Beschichtungspuffer (NaHC03 4,2 g/1; pH 9,6) dreimal, dann in einer Losung von 40 ml Beschichtungspuffer (NaHC03 4,2 g/l;pH 9,6) und 6 μl R-IgG- Biotin-Losung gewaschen. Die Beschichtung erfolgt über Nacht.

Anschließend werden die Scheiben 3 x mit ue 100 ml Milli-Q- Wasser gewaschen, wobei durch Sedimentation oder Zentrifugation die Trennung von fester und flussiger Phase erfolgt. Anschließend werden die Scheiben in 40 ml PBS wieder aufgenommen.

Beispiel 6

Durchfuhrung einer Probenvorbereitung mit Elektroelution, Amplifikation und Elektrochemilumineszenz-Messung zum Nachweis von PCR-Amplifikaten

Die m Fig. 14 gezeigte Vorrichtung wurde zur Durchfuhrung der Isolierung, Amplifikation und Chemilummeszenzmessung automatisch mit einem Computer-Programm mit den folgenden Programmschritten gesteuert:

ERSÄrZBLATT(REGEL26)

ERSATZBLÄTT (REGEL 26)

20

Bezugszeichenliste

10 Elektrophorosepuffertank

11 Agaroseflachbettgel 15 Behälter

17 Reaktionsraum

20a Kathode

20b Anode

30 erste permeable Membran 31 zweite permeable Membran

40 O-Ring

41 erster Stutzen

42 erste Öffnung

43 Durchbruch 44 zweiter Stutzen

45 dritter Stutzen

46 dritte Öffnung

49 Kanal

50 Entnahmeraum 60 Entnahmeöffnung

61 zweite Ausnehmung

70 Füllstand

80 zweite Öffnung

81 erste Ausnehmung 85 zweiter Stutzen

90 Spin-column

100 Adsorptionsmittel

110 Elektrophoresepuffervorrat

120 erste Pumpe 125 Füllstützen

130 zweite Pumpe

140 Ableitung

150 Reaktionsröhrchen

160 erstes Gefäß 162 zweites Gefäß

ERSATZBLÄTT (REGEL 26)

165 Probengefäß

170 Schüttelbock

180 Pipettenspitze

185 Vorrat an Pipettenspitzen 190 x, y, z-Pipettierarm

210 PCR-Gefäße

220 Spannungsquelle

225a, b elektrische Zuleitungen

302 Stützvlies 303 weiteres Stützvlies

310 semipermeable Membran

312 Permanentmagnet

313 Magnetpartikel

314 Photomultiplier 316 durchsichtiger Schnappdeckel

318 Schlauchstück

320, 321 Ausnehmungen

323 erste Lage

324 dritte Lage 325 zweite Lage

326 Schnappdeckel

327 Nadel

328 Septum

329 Heizplatten 340 Stopfen

400 Deckel

401 Vakuumanschluß

402 Anschlüsse

410 Mehrfachbehalter

ERSATZBLAH(REGEL26)