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Patent Searching and Data


Title:
PROCESS FOR MANUFACTURING A BIOLOGICAL VALVE USING BIOPRINTING
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2022/064125
Kind Code:
A1
Abstract:
Disclosed is a process for manufacturing a biological valve using bioprinting, said process involving: a step of bioprinting at least one sheet consisting of cells and biomaterials; a step of letting the at least one bioprinted sheet mature in a bioreactor; a step of shaping and assembling the at least one sheet around a stent in order to form a tubular portion extended by expanded portions forming the valves.

Inventors:
GUILLEMOT FABIEN (FR)
KAWECKI FABIEN (FR)
ROUBERTIE FRANÇOIS (FR)
METRAS ALEXANDRE (FR)
JALAL ZAKARIA (FR)
THAMBO JEAN-BENOÎT (FR)
LABROUSSE LOUIS (FR)
Application Number:
PCT/FR2021/051595
Publication Date:
March 31, 2022
Filing Date:
September 20, 2021
Export Citation:
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Assignee:
POIETIS (FR)
CENTRE HOSPITALIER UNIV CHU DE BORDEAUX (FR)
UNIV BORDEAUX (FR)
FONDATION BORDEAUX UNIV (FR)
INST NAT SANTE RECH MED (FR)
International Classes:
A61F2/24; B33Y10/00; B33Y30/00; C12M1/26
Domestic Patent References:
WO2019008373A12019-01-10
WO2007123658A12007-11-01
WO2018167401A12018-09-20
Foreign References:
US6666886B12003-12-23
US20030027332A12003-02-06
US20150246072A12015-09-03
US20100040582A12010-02-18
Other References:
ALSOUFI B.: "Aortic valve replacement in children' options and outcomes", J SAUDI HEART ASSOC, vol. 26, no. 1, 2014, pages 33 - 41
GRIGORYAN ET AL., SCIENCE, vol. 365, 2019, pages 482 - 487
Attorney, Agent or Firm:
BREESE, Pierre (FR)
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Claims:
Revendications

1 - Procédé de fabrication d'une valve biologique comportant une étape de préparation d'au moins un feuillet constitué de cellules et de biomatériaux et une étape de mise en forme et d'assemblage dudit au moins un feuillet pour former une partie tubulaire prolongée par des épanouissements formant les valvules caractérisé en ce que ladite étape de préparation d'au moins un feuillet constitué de cellules et de biomatériaux est réalisé par une étape de bio-impression d'au moins un feuillet constitué de cellules et de biomatériaux, ladite étape de bioimpression étant suivie par une étape de maturation dudit au moins un feuillet ainsi préparé dans un bioréacteur avant l'étape de mise en forme et d'assemblage dudit au moins un feuillet maturé autour d'un stent pour former une partie tubulaire prolongée par des épanouissements formant les valvules.

2 - Procédé de fabrication d'une valve biologique par bioimpression selon la revendication 1 caractérisé en ce que le motif d'impression desdites cellules est déterminé pour produire une synthèse du collagène selon des directions privilégiées, dans des plans perpendiculaires à l'axe dudit stent pour la partie de la zone tubulaire opposée aux valvules.

3 - Procédé de fabrication d'une valve biologique par bioimpression selon la revendication 1 caractérisé en ce que le motif d'impression desdites cellules étant déterminé pour produire une synthèse du collagène selon des directions privilégiées, dans des directions transversales pour les zones correspondant aux valvules.

4 - Procédé de fabrication d'une valve biologique par bioimpression selon la revendication 1 caractérisé en ce que ladite étape de bio-impression d'au moins un feuillet comporte une étape de bio-impression d'au moins une couche d'un ou plusieurs types cellulaires à partir d ' une encre biologique contenant lesdites cellules , ladite bioimpression étant réalisée par étapes alternées de bioimpression de cellules et de bioimpression de biomatériau

- soit à partir d ' une bioencre contenant en outre un biomatériau transférable

- soit sur un substrat en biomatériau

5 - Procédé de fabrication d ' une valve biologique par bioimpression selon la revendication 1 caractérisé en ce que ladite étape de bio-impression d ' un feuillet est réalisée sur un substrat cylindrique .

6 - Procédé de fabrication d ' une valve biologique selon la revendication 1 caractérisé en ce lesdites cellules sont en suspension à une concentration comprise entre 25 à 100 millions de cellules/mL

7 - Procédé de fabrication d ' une valve biologique selon la revendication 1 caractérisé en ce que ledit biomatériau est du collagène .

8 - Procédé de fabrication d ' une valve biologique selon la revendication 1 caractérisé en ce qu ' il comporte en outre une étape consistant à enrouler un ou plusieurs feuillets valvulaires et à coudre les deux bords libres , avec un fil de suture stérile pour réunir le ou les feuillets et obtenir une forme cylindrique et une étape consistant à associer le ou les feuillets audit stent .

9 - Procédé de fabrication d ' une valve biologique selon la revendication 1 caractérisé en ce qu ' il comporte une deuxième étape de maturation , dudit feuillet mis en forme . 17

10 - Procédé de fabrication d'une valve biologique selon la revendication 1 caractérisé en ce que ladite étape de bioimpression est réalisée sur un mandrin.

11 - Procédé de fabrication d'une valve biologique selon la revendication 1 caractérisé en ce que le stent comporte une jupe.

12 - Procédé de fabrication d'une valve biologique selon la revendication 1 caractérisé en ce que ladite jupe est composée d'un matériau comprenant un tissu vivant bio-imprimé, du PTFE, ou du Dacron.

13 - Procédé de fabrication d'une valve biologique selon la revendication précédente caractérisé en ce que la liaison entre ledit ou lesdits feuillets et ladite jupe est réalisée par des points de suture en couronne avec un espacement de 120° entre les trois piliers.

14 - Procédé de fabrication d'une valve biologique selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'on procède au dépôt entre une et six couches de collagène pour réaliser ledit substrat .

15 - Procédé de fabrication d'une valve biologique selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'impression du substrat par couches est réalisée par impression par laser, extrusion ou micro-vanne, les couches étant gélifiées les unes après les autres dans un bioréacteur pendant une période comprise entre 10 minutes à 24 heures.

16 - Procédé de fabrication d'une valve biologique selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce qu'il comporte une étape initiale de préparation de l'encre biologique consistant à mettre en culture de cellules autologues 18 ou allogéniques dans un milieu de culture pendant 4 à 10 jours de préférence 7 jours .

17 - Procédé de fabrication d ' une valve biologique selon l ' une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que la deuxième étape comporte entre une et dix alternances de couches de cellules et de couches de collagène .

18 - Procédé de fabrication d ' une valve biologique selon l ' une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que ladite troisième étape de maturation consiste à placer la construction tissulaire après la bioimpression de la dernière couche dans un milieu de culture renouvelé périodiquement jusqu ' à la fin de la maturation .

19 — Installation pour la fabrication d ' une valve biologique par bio-impression conformément au procédé de la revendication 15 caractérisé en ce qu ' elle comprend un isolateur aseptique présentant une fenêtre pour le passage d ' un faisceau laser de balayage et d ' activation de la source de bioimpression , une fenêtre d ' observation de la zone de formation du substrat , ledit isolateur stérile comportant une cellule de bioimpression et un robot pour la manipulation du ou des feuillets pour la mise en forme .

20 — Installation pour la fabrication d ' une valve biologique par bio-impression selon la revendication 19 caractérisé en ce que ledit isolateur aseptique contient en outre un espace thermorégulé de maturation des feuillets mis en forme et un sas stérile pour les échanges entre l ' intérieur et l ' extérieur dudit isolateur .

21 — Installation pour la fabrication d ' une valve biologique par bio-impression selon la revendication 19 ou 20 caractérisé en ce que ledit isolateur aseptique contient en outre 19 des passages stériles de conduits d'alimentation de la source de bioimpression avec les encres biologiques.

22 — Installation pour la fabrication d'une valve biologique par bio-impression selon la revendication 19 ou 20 caractérisé en ce que ledit isolateur aseptique contient en outre au moins un système de transfert à orifice pour l'introduction ou le retrait d'éléments stériles.

Description:
PROCEDE DE FABRICATION D'UNE VALVE BIOLOGIQUE PAR BIO¬

IMPRESSION

Domaine de 1 ' invention

La présente invention concerne le domaine des valves artificielles, notamment les valves cardiaques.

Les prothèses valvulaires cardiaques actuellement commercialisées présentent des inconvénients importants. Les prothèses biologiques (xéno ou allô greffes) sont soumises à une dégénérescence progressive, et les prothèses mécaniques nécessitent un traitement anticoagulant à vie.

En effet, les valves mécaniques sont exposées à un risque thrombotique permanent, ce qui nécessite un traitement d'anticoagulants à prendre tous les jours et à vie, de tel sorte que les patients sont exposés à un risque d'hémorragies. De plus, les bio-prothèses composées de tissus d'animaux décellularisés (péricarde bovin ou porcin, racine aortique porcine...) ont généralement une durabilité inférieure à 15 ans et leur composition xénogènique les exposent à un potentiel rejet chronique par le corps du patient, se traduisant par une dysfonction de la prothèse valvulaire. Plus important encore pour le remplacement des tissus, les substituts valvulaires actuellement disponibles dans le commerce sont limités par des caractéristiques, telles que l'absence de tissus vivants, qui ne peuvent donc pas totalement s'intégrer et se développer dans le corps humain.

Chez l'enfant, le problème majeur du remplacement d'une des valves cardiaques est que les substituts valvulaires actuels (mécaniques ou biologiques) sont incapables de grandir avec le patient. Ainsi, les enfants atteints de cardiopathie congénitale et les autres enfants nécessitant un remplacement valvulaire doivent souvent subir plusieurs opérations de remplacement valvulaire afin d'implanter de nouvelles valves pour s'adapter à la croissance du patient. En effet, les difficultés liées au remplacement de la valve chez les enfants ont fortement orienté le développement de tissus valvulaires vivants et dynamiques, avec une structure contrôlée, une fonction et des mécanismes homéostatiques et adaptatifs aussi proches que possible de ceux de la valvule naturelle. Différentes tailles de substituts valvulaires mécaniques et biologiques sont présentes sur le marché. Cependant, la taille minimum est de 19 mm de diamètre, ce qui ne convient pas aux petits enfants même si des techniques d'agrandissement annulaire peuvent être utilisées. Nous pensons que les techniques d'ingénierie tissulaire, et plus particulièrement la bio-impression 3D, permettraient de produire des substituts valvulaires à façon, de toutes les tailles et formes présentes dans la physiologie humaine, qui serait composée de tissus vivants et pouvant grandir avec le patient.

Tous les patients opérés d'un remplacement valvulaire nécessitent au moins 3 mois de traitement anticoagulant pour les valves biologiques, et à vie pour les valves mécaniques. Ce traitement expose le patient à tous les risques associés à la prise de ce type de traitement, telle que la survenue d'hémorragie pouvant être fatale [Hammermeister KE, Sethi GK, Henderson WG, Oprian C, Kim T, Rahimtoola S. A comparison of outcomes in men 11 years after heart-valve replacement with a mechanical valve or bioprosthesis. Veterans Affairs Cooperative Study on Valvular Heart Disease. N Engl J Med, ; 328 ( 18 ) : 1289-96 , 1993] .

On a donc proposé de remédier à ces inconvénients par l'implantation d'un substitut composé d'un tissu vivant autologue, avec des fonctions homéostatiques et antithrombotiques, qui permettrait d'éliminer le besoin de traiter les patients avec des agents anticoagulants. Les substituts valvulaires à base de tissus biologiques décellularisés ont été mis au point pour éliminer la nécessité d'un traitement anticoagulant. Depuis la fin des années 1950, de nombreux types de valves biologiques ont été créées, allant des valves provenant du propre corps du patient (autogreffes et valves autologues) aux valves de donneurs humains (homogreffes) et de valves d'autres espèces animales (xénogreffes) . Les avantages des substituts biologiques sont leur excellent profil hémodynamique et leur absence de traitement anticoagulant à long terme [Alsoufi B. Aortic valve replacement in children' options and outcomes. J Saudi Heart Assoc, 26(1):33-41, 2014] . Depuis leurs productions en 1965, les substituts valvulaires biologiques les plus implantés sont d'origine xénogénique (péricarde bovin ou porcin décellularisé et traité au glutaraldéhyde ) . Cette origine va avoir pour conséquence d'engendrer des réactions immunitaires chez les patients implantés, pouvant se traduire par une dégradation prématurée du tissu, voir un rejet. Ainsi, ces substituts biologiques vont avoir une durée de vie plus limitée (10-15 ans) comparée aux valves mécaniques, pouvant nécessiter de multiples réimplantations. Nous pensons que l'implantation d'un substitut composé de cellules autologues vivantes sécrétant une matrice endogène sur une matrice allogénique remodelée limitera les problèmes liés aux réactions immunitaires.

Les valves synthétiques doivent donc se rapprocher le plus possible des valves organiques. Les premières valves synthétiques ont été créées à partir de vraies valves, prises chez des porcs, ou avec du tissu traité afin de devenir inerte, comme du péricarde bovin tanné. Les stents les portant sont faits en alliage à mémoire de forme comme le nitinol le plus souvent. Les valves de ce type fonctionnent et sont celles utilisées actuellement. Elles sont dites biologiques. La prochaine génération de valves synthétiques se veut encore plus proche des valves organiques, en utilisant les propres cellules du patient pour les fabriquer.

Les cellules sont ensemencées sur une matrice et sont mises à maturation dans un bioréacteur simulant les conditions physiologiques. Une fois le processus terminé, la valve est implantée, elle se remodèle et grandit pour s'adapter parfaitement à l'anatomie du lieu d'implantation et au flux sanguin .

Les progrès obtenus dans le domaine de l'ingénierie tissulaire permettent ainsi d'envisager la construction de prothèses valvulaires pour le traitement des patients atteints de cardiopathie valvulaire (dysfonctionnement des valves cardiaques), nécessitant le remplacement de la valve.

Le principe général de la production de valve cardiaque par bio-impression selon l'état de la technique consiste à construire un échafaudage d'hydrogel formé d'acide hyaluronique et de collagène avec des cellules interstitielles de valve aortique. Au bout de 7 jours, cette valve est viable.

On peut envisager son utilisation pour remplacer les valves aortiques (ou d'autres valves cardiaques) et en même temps diminuer pour les patients les risques d'endocardite d'Osler (l'infection des valvules cardiaques par des bactéries) .

Une autre solution connue concerne l'utilisation de la technique de la bio-impression assistée par laser pour appliquer des cellules endothéliales qui tapissent les parois internes de tous les vaisseaux sanguins, de veine ombilicale humaine et des cellules souches mésenchymateuses humaines (qui peuvent produire plusieurs types de cellule) dans une zone lésée du cœur.

Grâce à ces techniques, on est capable de produire des tissus sur mesure, autologues et vivants qui constitue la solution idéale pour le remplacement d'une valve cardiaque, avec une durée de vie élevée, pouvant s ' autoréparer et grandir avec le patient dans le cas d'applications en pédiatrie.

La bio-impression par jet d'encre thermique est utilisée pour fabriquer la micro-vascularisation avec un mélange de cellules humaines endothéliales de micro-vaisseaux et de fibrine. Après 21 jours de culture, le mélange imprimé prolifère. Pour former les structures vasculaires, la technique par extrusion est utile pour former un échafaudage et ensemencer ce tissu. Cette base permet d'envisager la construction d'organes vascularisés .

Etat de la technique

On connaît dans l'état de la technique la demande de brevet US20030027332A1 qui concerne une valvule cardiaque faisant appel au génie tissulaire. On utilise du tissu humain autoportant pour réaliser ces éléments. Le tissu considéré comporte des cellules biologiques vivantes et une matrice extracellulaire sans structures supports non viables. La valvule résultante est donc constituée de tissu humain entièrement vivant qui pourrait théoriquement fonctionner comme une structure biologique native, avec un potentiel de croissance, de réparation et de remodelage.

La demande de brevet US20150246072A1 décrit des procédés de formation de tissus tridimensionnels in vivo, notamment de valves cardiaques. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de formation d'un tissu tridimensionnel in vivo, comprenant le dépôt sur une surface, qui est dans ou sur un sujet, d'au moins une composition qui comprend des cellules. Dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de formation d'un tissu tridimensionnel in vivo, comprenant le dépôt sur une surface, qui est dans ou sur un sujet, d'au moins une composition qui comprend des cellules et d'au moins une composition qui comprend une matrice extracellulaire (ECM) . Dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de formation d'un tissu tridimensionnel in vivo, comprenant le dépôt sur une surface, qui est dans ou sur un sujet, d'au moins une composition qui comprend des cellules, d'au moins une composition qui comprend une matrice extracellulaire (ECM) et d'au moins un autre constituant supplémentaire.

L'article « Duan B, Hockaday LA, Kang KH, Butcher JT. 3D Bioprinting of heterogeneous aortic valve conduits with alginate/gelatin hydrogels. J Biomed Mater Res Part A. 2012 : 00A: 000— 000 » décrit un procédé de bio-impression 3D par extrusion pour la fabrication de conduits de valve faits à base d'hydrogel d'alginate/gélatine, avec une architecture anatomique et l'incorporation directe de différents types de cellules en fonction des régions de la construction.

La demande de brevet américaine US20100405582 de la société ORGANOVO décrit différents procédés de constructions cellulaires, de tissus et d'organes bio-imprimés utilisant une technologie de prototypage rapide basée sur un dépôt automatisé assisté par ordinateur en trois dimensions de cellules, y compris des solutions de cellules, des suspensions de cellules, des gels de cellules ou des cellules, et support sur une surface biocompatible (composée d'hydrogel et / ou d'une membrane poreuse) par un dispositif de distribution tridimensionnel (par exemple, une bio-imprimante) .

La publication de l'équipe de Jordan Miller parue dans le magazine Science Advances en 2019 (Grigoryan et al., Science 364, 458—464 (2019) ), décrit une technique pour la fabrication d'une valve cardiaque en 3 dimensions. Cette technique utilise la méthode de stéréolithographie 3D par photopolymérisation appliquée dans un volume non conventionnel constitué d'un hydrogel optimisé servant de support temporaire, thermoréversible, pouvant être éliminé par lavage après impression.

Une autre publication de l'équipe d'Adam Feinberg parue dans le magazine Science en 2019 (Lee et al., Science 365, 482— 487 (2019) ) décrit une technique nouvelle appelée FRESH (Freeform reversible embedding of suspended hydrogels) qui permet de fabriquer un objet en 3D dans un hydrogel. FRESH fonctionne en extrudant des bio-encres dans un bain de support thermoréversible composé d'une suspension de microparticules de gélatine qui fournit un soutien lors de 1 ' impression et est ensuite fondue à 37 ° C. L'article décrit la fabrication d'une valve cardiaque en 3D qui n'est constituée que de collagène.

La demande de brevet W02018167401A1 de la demanderesse décrit le principe général d'un procédé de bioimpression comportant :

• une étape de préparation d'un modèle numérique cible représentatif de l'organisation tridimensionnelle du tissu à fabriquer, (appelé aussi fichier CAO),

• une étape de pilotage d'un équipement de bioimpression pour le dépôt d'une pluralité de couches de cellules vivantes et de biomatériaux

• une étape optionnelle de caractérisation 2D de chacune des couches pendant l'étape de bioimpression

• une étape de calcul d'un modèle numérique d'impression en fonction dudit modèle numérique du produit à fabriquer, d'une part, et d'un modèle prédictif d'évolution d'autre part, ainsi que des caractéristiques des constituants à imprimer (intérêt pour la personnalisation) .

L'étape de pilotage de l'équipement de bioimpression est réalisée avec le modèle numérique d'impression ainsi calculé.

Une étape de maturation du produit d'impression ainsi fabriqué peut également être prévue à 1 ' issue de 1 ' impression lorsqu'on prépare un modèle in vitro.

Pour l'impression in situ (in vivo) il n'y a pas d'étape de maturation. Quant à l'impression de modèles in vitro pour une implantation directe, l'étape de maturation est partielle.

Inconvénients de l'art antérieur Les solutions de l'art antérieur sont très générales et théoriques, et ne permettent pas d'atteindre un niveau de conformité suffisant pour la fabrication de prothèses de valves destinées à une implantation sur l'homme.

En particulier, la méthode de déposition cellulaire et matricielle décrite dans l'article J Biomed Mater Res Part A. 2012 : 00A: 000— 000 est difficilement reproductible avec une précision de déposition d'environ 84,3 ± 10,9 % et le taux de viabilité cellulaire est plutôt faible (84,6 ± 3,1 %) et conduit à un risque de dégénérescence rapide incompatible avec une implantation chez l'homme.

De plus, la bio-impression de valve cardiaque ne se limite pas à la formation d'un tissu plan par superposition de couches imprimées de cellules et de matériel biologique. Elle nécessite la création d'une configuration géométrique particulière et non plane, avec des caractéristiques mécaniques non homogènes sur la surface imprimée. Pour les autres solutions connues, consistant à associer un matériau biocompatible à un stent, la pérénité de la valve n'est pas assurée car les matériaux ne sont pas vivants et sont soumis à des dégradations liées par exemple à la calcification .

Solution apportée par l'invention

Afin de remédier à ces inconvénients, l'invention concerne selon son acception la plus générale un procédé de fabrication d'une valve biologique par bio-impression caractérisé en ce qu'il comporte :

- une étape de bio-impression d'au moins un feuillet constitué de cellules et de biomatériaux,

- une étape de maturation dudit au moins un feuillet ainsi préparé dans un bioréacteur

- une étape de mise en forme et d'assemblage dudit au moins un feuillet autour d'un stent pour former une partie tubulaire prolongée par des épanouissements formant les valvules .

De préférence, le motif d'impression desdites cellules est déterminé pour produire une synthèse du collagène selon des directions privilégiées, dans des plans perpendiculaires à l'axe dudit stent pour la partie de la zone tubulaire opposée aux valvules .

Avantageusement, le motif d'impression desdites cellules étant déterminé pour produire une synthèse du collagène selon des directions privilégiées, dans des directions transversales pour les zones correspondant aux valvules.

Selon un mode de réalisation particulier, ladite étape de bio-impression d'au moins un feuillet comporte une étape de bioimpression d'au moins une couche d'un ou plusieurs types cellulaires à partir d'une encre biologique contenant lesdites cellules, ladite bioimpression étant réalisée par étapes alternées de bioimpression de cellules et de bioimpression de biomatériau :

- soit à partir d'une bioencre contenant en outre un biomatériau transférable

- soit sur un substrat en biomatériau

Selon une variante, ladite étape de bio-impression d'un feuillet est réalisée sur un substrat cylindrique.

Selon un mode de réalisation particulier, lesdites cellules sont en suspension à une concentration comprise entre 25 à 100 millions de cellules/mL

De préférence, ledit biomatériau est du collagène. Selon une variante de réalisation , le procédé comporte en outre une étape consistant à enrouler un ou plusieurs feuillets valvulaires et à coudre les deux bords libres , avec un fil de suture stérile pour réunir le ou les feuillets et obtenir une forme cylindrique et une étape consistant à associer le ou les feuillets audit stent .

Selon une variante particulière il comporte une deuxième étape de maturation , dudit feuillet mis en forme .

Selon une autre variante particulière , ladite étape de bioimpression est réalisée sur un mandrin .

Selon un mode de réalisation particulier , le stent comporte une jupe .

Avantageusement , ladite jupe est composée d ' un matériau comprenant un tissu vivant bio-imprimé , du PTFE , ou du Dacron .

De préférence , la liaison entre ledit ou lesdits feuillets et ladite jupe est réalisée par des points de suture en couronne avec un espacement de 120° entre les trois piliers .

Selon un mode de mise en œuvre particulier , on procède au dépôt entre une et six couches de collagène pour réaliser ledit substrat .

Selon un mode de mise en œuvre particulier , l ' impression du substrat par couches est réalisée par impression par laser , extrusion ou micro-vanne , les couches étant gélifiées les unes après les autres dans un bioréacteur pendant une période comprise entre 10 minutes à 24 heures .

De préférence , le procédé comporte une étape initiale de préparation de l ' encre biologique consistant à mettre en culture de cellules autologues ou allogéniques dans un milieu de culture pendant 4 à 10 jours, de préférence 7 jours.

Selon une alternative, la deuxième étape comporte entre une et dix alternances de couches de cellules et de couches de collagène .

Selon une autre alternative, ladite troisième étape de maturation consiste à placer la construction tissulaire après la bio impression de la dernière couche dans un milieu de culture renouvelé périodiquement jusqu'à la fin de la maturation.

La présente invention concerne aussi une installation pour la fabrication d'une valve biologique par bio-impression conformément au procédé susvisé caractérisé en ce qu'elle comprend un isolateur aseptique présentant une fenêtre pour le passage d'un faisceau laser de balayage et d'activation de la source de bioimpression, une fenêtre d'observation de la zone de formation du substrat, ledit isolateur stérile comportant une cellule de bioimpression et un robot pour la manipulation du ou des feuillets pour la mise en forme.

Avantageusement, ledit isolateur aseptique contient en outre un espace thermorégulé de maturation des feuillets mis en forme et un sas stérile pour les échanges entre l'intérieur et l'extérieur dudit isolateur.

De préférence, ledit isolateur aseptique contient en outre des passages stériles de conduits d'alimentation de la source de bioimpression avec les encres biologiques.

Selon un mode de réalisation particulier, ledit isolateur aseptique contient en outre au moins un système de transfert à orifice pour l'introduction ou le retrait d'éléments stériles. Description détaillée d'un exemple non limitatif de 1 ' invention

La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la description détaillée d'un exemple non limitatif de l'invention qui suit, se référant au dessin annexé où [Fig. 1] la figure 1 correspond à une vue en perspective d'une valve selon 1 ' invention .

L'orientation des fibres de collagène produites par les cellules du tissu bioimprimé est circonférentielle dans la partie tubulaire (1), les fibres étant disposées dans des plans perpendiculaires à l'axe du corps tubulaire.

Au niveau des valvules (2 à 4), les fibres sont alignées transversalement .

Pour obtenir de telles configurations, les cellules sont imprimées sous forme de grappes (en anglais « cluster »), avec des alignements selon la direction dans laquelle doit se former la fibre de collagène au cours de l'étape de maturation.

La présente invention concerne un procédé de fabrication de feuillets vivants bio-imprimés pour le développement de modèles de substituts valvulaires.

Les étapes initiales de la préparation consistent à l'expansion de cellules autologues ou allogéniques (par exemple, des fibroblastes dermiques humains, des myofibroblastes humains, des fibroblastes de valvules interstitielles humaines, etc. ), qui ont été extraites d'un prélèvement du patient ou cryopréservées , afin d'obtenir suffisamment d'unités pour la préparation de l'encre cellulaire. Les cellules doivent être cultivées dans des flacons de culture pendant environ sept jours et dans leur milieu de culture adéquat. Le milieu d'expansion doit être changé trois fois par semaine jusqu'au jour de l'impression des cellules. De plus, un dispositif d'ancrage doit être placé dans une plaque de culture. Ce dispositif d'ancrage composé du papier filtre de cellulose Whatman® stérilisé sera utilisé pour sortir le tissu imprimé de la plaque de culture sans l'endommager. De plus, il préviendra également les contractions du tissu.

Une deuxième étape optionnelle consiste à imprimer une base de collagène sur mesure. Des couches de collagène (entre 1 et 6) de format personnalisé doivent être imprimées à l'aide d'un procédé d'impression par extrusion ou microvalve et gélifiées les unes après les autres dans l'incubateur à 37°C avec les bons taux d'hygrométrie, de C02 et d'02 pendant une période pouvant aller de 10 minutes à 24 heures. Ce collagène peut avoir différentes origines (humain, rat, bovin, etc. ) . Cette base épaisse de collagène, de 1 à 3 mm, sera utilisée comme substrat pour l'impression des cellules et comme matrice initiale pour la conception et le remodelage des tissus au cours de l'étape de maturation .

La troisième étape consiste à effectuer la bio-impression d'un ou plusieurs types de cellules à l'aide d'une plateforme de bio-impression assistée par laser soit sur la base de collagène préparée à l'étape 2, soit concomitamment avec la bio-impression de collagène. Les cellules développées doivent être trypsinées et remises en suspension à une concentration élevée (25 à 100 millions de cellules/mL) pour la préparation de l'encre cellulaire. Des couches de cellules doivent être imprimées sur la base de collagène (entre 1 et 10) . Entre chaque couche de cellules, une couche de collagène doit être imprimée en utilisant le même processus précédemment décrit (entre 0 et 9) . En fonction de la taille du feuillet souhaité, les couches de cellules sont décomposées en plusieurs zones d'impression cellulaires. La taille et la géométrie 2D de ces zones d'impression peuvent être personnalisées. Les motifs imprimés au niveau des zones d'impression comprennent plusieurs gouttes d'encre cellulaire qui peuvent également être personnalisées. Le nombre de cellules imprimées par gouttes peut varier (par exemple entre 1 et 100 cellules/goutte ) en utilisant différentes techniques, telles que l'augmentation de la concentration cellulaire dans l'encre, l'utilisation de différentes énergies de laser et/ou l'impression multiple au même endroit.

La quatrième étape consiste en la maturation des tissus. Immédiatement après 1 ' impression de la dernière couche de cellules, la construction tissulaire doit être placée dans un incubateur à 37°C en présence du milieu de maturation adéquat (par exemple, du DMEM additionné de sérum, d'antibiotiques et d'acide ascorbique) . Le milieu doit être changé trois fois par semaine jusqu'à la fin de la maturation. Le temps de maturation peut varier de 3 à 35 jours. Au cours du temps de maturation, les cellules imprimées vont remodeler le collagène initialement imprimé et elles vont parallèlement sécréter une matrice extracellulaire endogène qui prendra place dans la construction.

La cinquième étape consiste à obtenir les feuillets valvulaires sur mesure en découpant le tissu imprimé. Un cutter ou un emporte-pièce fait sur mesure doit être utilisé pour découper le tissu. Les extras de tissus doivent être retirés de la plaque de culture à l'aide d'une pince. Ensuite, il faut enrouler le feuillet sur un mandrin fait sur mesure et coudre les deux bords libres, avec un fil de suture stérile, pour réunir le feuillet et obtenir une forme cylindrique.

La sixième étape consiste à faire glisser le feuillet sur le bord du mandrin et à positionner un support ou un stent contenant une jupe. Cette jupe peut être composée d'un tissu vivant bio-imprimé, du PTFE, du Dacron, etc... Des points de suture en couronne (espacement de 120 ° entre les trois piliers) doivent être réalisés entre le feuillet et la jupe du stent. Enfin, le substitut valvulaire monté doit être doucement retiré du mandrin et placé dans le milieu de culture jusqu'au jour de 1 ' implantation .