Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Oligonudeotiden der im Anspruch 1 angegebenen allgemeinen Formel I. Die erfindungsgemäß hergestell¬ ten Oligonucleotide weisen definierte Sequenzen auf und können als spezifische Primer und Probes eingesetzt werden bzw. sind für die Synthese kompletter Gene von großer Bedeutung (Arzneimittel¬ forschung J30.' 3a, 548, (1980)).

Oligonucleotide werden nach dem neusten Stand der Technik entweder nach der Phosphat- oder Phosphittri- estermethode unter Verwendung polymerer Träger herge¬ stellt (Nachr. Che . Tech. Lab. 2__ , 230 (1981)). Um definierte Sequenzen aufbauen zu können, müssen die einzelnen Bausteine (Nucleoside bzw. Nucleotide) mit geeigneten Schutzgruppen versehen werden. Hier werden für den Schutz der exocyclischen Aminogruppen der hete- rocyclischen Nucleobasen allgemein basenlabile Acyl- gruppen, für die Verankerung der Oligonucleotidkette mit dem polymeren Träger in üblicher Weise eine basen¬ labile Esterbindung und für den Schutz der primären 5*-OH-Gruppe die säurelabilen Tritylethergruppen ver¬ wendet. Als Phosphatschutzgruppe der Phosphattriester- ethode wird üblicherweise entweder die 2-Chlorphenyl- oder 4-Chlorphenylgruppe in esterartiger Bindung ver¬ wendet, die nur durch den Angriff einer Base ^der eines Nucleophils am Phosphoratom entfernt werden kann. Ein solcher Schritt ist an sich unerwünscht, da damit

die Gefahr einer Spaltung der internucleotidischen Phosphatesterbindung gegeben ist. Diese Gefahr wurde durch die Verwendung von Oximat-Anionen (Tetrahedron Lett. 19, 2727 (1978)) stark reduziert, obwohl diese auch im entscheidenden Schritt in unerwünschter- Weise am Phosphoratom angreifen und darüberhinaus den Nach¬ teil aufweisen, daß eine verhältnismäßig geringe Menge an erwünschtem Oligonucleotid mit sehr großen Mengen an nicht flüchtigen und schwer extrahierbaren Salzen verunreinigt ist. Dies erschwert nicht nur die Aufar¬ beitung und nachfolgende Reinigung des synthetisierten Oligonucleotids,sondern führt auch zu erheblichen Sub¬ stanzverlusten.

In der Phosphittriester-Methode wird üblicherweise die Methylgruppe in esterartiger Bindung als Phosphat¬ schutzgruppe verwendet, die durch Angriff eines Nucleo- phils am Methyl-C-Atom entfernt werden kann (J. Amer. Chem. Soc. 9S_, 3526 (1977)). Da ein Angriff am P-Atom vermieden wird, wird die Gefahr einer Spaltung der Inter- nucleotidbindung ebenfalls vermieden. Als N cleophil wird üblicherweise Thiophenol/Triethylamin verwendet, die unangenehm zu handhaben sind und außerdem zu nicht flüchtigen, schwer extrahierbaren Verbindungen führen, die - wie oben erwähnt - sowohl die Aufarbeitung er¬ schweren als auch zu erheblichen Materialverlusten führen.

Obwohl die eigentliche Synthese von Oligonudeotiden nach der Festphasen -Phosphit - bzw. Phophattriester-Methode recht effizient und schnell verläuft, ist die Herstellung von Oligonudeotiden definierter Sequenz nach wie. vor sehr zeitaufwendig. Dies liegt vor allem an den Problemen der nachfolgenden Aufarbeitung und Reinigung, die ein Mehr¬ faches der eigentlichen Synthesezeit beanspruchen. An die¬ sem Punkt setzt das Verfahren der Erfindung ein, das hier

eine entscheidende technische Verbesserung bietet ^,

_U m zu Verbindungen der im Anspruch 1 angegebenen Formel I zu gelangen, in denen B eine Nucleobase, z.B. Adenin ⁽ A ⁾ , Guanin (G) , Cytosin (C) , Thy in (T) oder Uracil ⁽ U ⁾ oder deren Analoga und R ¹ Wasserstoff, Hydroxyl bzw. mit in der Nucleotidchemie üblichen Schutzgruppen geschütztes Hydroxyl sowie n eine ganze Zahl von 1 bis 200 bedeuten, sind erfindungsgemäß verschiedene, definierte Reaktions¬ schritte durchzuführen:

a ⁾ Umsetzung eines Nucleosids der allgemeinen Formel II.

R der allgemeinen .Formel II kann Wasserstoff sein; es handelt sich dann bei den Verbindungen der Formel I um

1 Oligodesoxynucleotide. Die Gruppe R kann auch Hydoxyl- oder gegebenenfalls mit in der Nucleotidchemie üblichen Schutzgruppen geschütztes Hydroxyl sein. Derartige Schutz¬ gruppen sind z.B. Trityl, Moncmethoxytrityl und Dimethoxy- trityl, Acyl, z.B. Acetyl, Benzoyl; Tetrahydropyranyl, Methoxytetrahydrσpyranyl ' o-Nitrobenzyl sowie Sil lether wie z.B. t-Butyl-Diphenylsilylether. Eine allgemeine Über¬ sicht über in der Nucleotidchemie übliche Schutzgruppen findet sich z.B. in Tetrahedron 1981, Seite 363 - 369, Liebigs Ann. Chem. 1978, 839 - 850, sowie Nucleic Acids Research, Symposium Series No. 7, 1980, 39 - 59.

2

R ist ebenfalls eine in der Nucleotidchemie übliche

Schutzgruppe gemäß den vorgenannten Veröffentlichungen, vorzugsweise die säurelabile 4,4-Dirretho y- oder 4,4,4- Tri ethoxytritylgruppe. B' kann ebenfalls eine in 'der Nucleotidchemie übliche Schutzgruppe gemäß den oben genannten Vorveröffentlichungen aufweisen.

OMPI

Das Nucleosid der Formel II wird erfindungsgemäß mit einem Phosphinderivat der allgemeinen Formel III gemäß Anspruch 1 umgesetzt.

In der allgemeinen Formel bedeutet X Chlor, Brom, CN oder

SCN; L bedeutet Chlor, Brom, CN, SCN oder einen Aminrest der Formel -NE 4 (Formel VIII) , wobei die Gruppen R4 pri¬ märe, sekundäre oder tertiäre Alkyreste mit 1 - 10 Kohlen¬ stoffatomen sind oder zusammen einen Cycloalkylrest mit 5 - 7 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls mit Alkylverzweigungen,und/oder einem oder zwei Stickstoff-, Sauerstoff- und/oder Schwe¬ felatomen als Heteroatome enthalten kann,bedeuten. Die Gruppe L kann auch einen reaktiven heterocyclischen Rest bilden, der Imidazolyl, Triazolyl, Tetrazolyl, 3-Nitro-1 ,2,4-triazolyl, Thiazolyl, Pyrrolyl, Benztriazolyl (gegebenenfalls mit Substituenten im Phenylrest) oder Benzhydroxytriazolyl (gegebenenfalls mit Substituenten im Phenylring) und dergleichen bilden.

R des Phosphinderivats der allgemeinen Formel (III) ist erfindingsgemäß eine mit Hilfe von Basen durch ß-Eliminie- rung entfernbare Gruppe der allgemeinen Formel VII, in der Y Wasserstoff, Methyl oder Ethyl bedeutet. Z stellt eine elektronenziehende Gruppe dar, z.B. Halogen wie Fluor, Chlor oder Brom, CN, NO«. Z kann weiterhin Phenyl, Phenylthio, Phenylsulfoxy oder Phenylsulfonyl bedeuten, wobei die Phenyl- reste in o, o ^* -Stellung und/oder p-Stellung mit Halogen, CN oder NO_ substituiert sein können. Anstelle der Gruppe

H

kann auch eine der Gruppen CF.,, CCl-, oder CBr, stehen.

Die Umsetzung gemäß Schritt a erfolgt in Gegenwart einer organischen Base.

b) Umsetzung des in Schritt a erhaltenen Nucleosid- phosphorigsäure-Derivates der Formel IV.

OM WIP

Die Umsetzung der Verbindung gemäß Formel IV erfolgt mit einem an einen polymeren Träger gebundenen Nucleosid der allgemeinen Formel V gemäß Anspruch 1. Es können lösliche oder unlösliche, d.h. vernetzte, polymere Träger verwen¬ det werden, z.B. modifiziertes Silicagel, Glas, insbe¬ sondere "controlled poreglass", Polyester, Polyamid, Poly- vinylalkohol, Polysiloxan, Polystyrol oder dergleichen. Als Verankerungsfunktion. zwischen Träger und Nucleosid kommen vorzugsweise Esterbindungen in Betracht, einschlie߬ lich solcher, die sich von Lävulinyl- oder ß-Benzoylpro- pionylrest ableiten; die letztgenannten Esterbindungen können unter neutralen Bedingungen mit Hydrazin gespal¬ ten werden. Auch die säurelabile Trityletherbindung, gegebenenfalls mit Substiuenten in den Phenylringen, kommt als Verankerungsmöglichkeit in Betracht, vgl. Liebigs Ann. Che . 1974, 959.

c) Oxidation des in Stufe b erhaltenen trägergebundenen Nucleotidonucleosids der allgemeinen Formel VI.

Die Oxidation führt zu einer Phosphatgruppe; sie kann z.B. mit Jod/H ₂ 0, H ₂ 0- oder organischen Persäuren oder allgemein durch Oxidation durch Einführung von 0, S oder Se durchge¬ führt werden.

d) Maskierung freier primärer 5'-OH-Gruppen, die bei der Reaktion gemäß Stufe b (imProdukt der Formel V) nicht um¬ gesetzt wurden.

Diese freien Hydroxylgruppen werden mit einer permanenten Schutzgruppe maskiert, z.B. durch Reaktion mit Ao.etanhydrid,

e ⁾ Abspaltung der Schutzgruppe(n) R

Die Abspaltung erfolgt beispielsweise unter Verwendung

einer Protonsäure oder Lewissäure wie ZnBr ₂ oder Dialkyl- aluminiumchlorid, wenn R ² eine Tritylgruppe oder Methoxy- derivat derselben darstellt.

f) Einführung weiterer Nucleosidphosphat- oder Oligonu- cleosidphosphateinheiten

Die Stufen a - e können wiederholt werden, wobei mindestens ein Nucleosidphosphatrest eingeführt wird. Beim Einsatz von Oligonucleosidphosphateinheiten werden selbstverständ¬ lich Kettenverlängerungen um mehr als eine Nucleosid- phosphateinheit erreicht.

g) Abspaltung sämtlicher Schutzgruppen

Diese Abspaltung kann in der Weise erfolgen, daß mit wässrigem Ammoniak in einem Schritt die N-Acylgruppen der heterocyclischen Basen, die Esterbindung zwischen Oligonucleotid und Träger (gegebenenfalls kann letztere unter neutralen Bedingungen auch mit Hydrazin gespalten werden) und die Phosphatschutzgruppe gemäß dem allgemeinen Schema 1 am Schluß der Beschreibung durch ß-Eliminierung abgespalten werden. Es wird dann ein Oligonucleotid mit nur 5'-terminaler Tritylschutzgruppe erhalten, das in an sich bekannter Weise nach Entfernung der flüchtigen Base (Ammoniak) direkt durch Hochdruckflüssigkeitschro¬ matographie (HPLC) an "reversed phase"-Material gereinigt werden kann.

Die Zwischenprodukte der allgemeinen Formel IV gemäß Anspruch 1 stellen neue Verbindungen dar. Sie liegen in Form recht stabiler, in reiner Form darstellbarer Ver¬ bindungen vor, sind leicht zu handhaben und dennoch recht reaktiv im Sinne der Knüpfung von Internucleotidbindungen. Der Einsatz von R als eine durch Basen über ß-Eliminierung

( QMPΓ

entfernbare Schutzgruppe ermöglicht es zum ersten Mal, bis auf die 5--Tritylgruppe alle Schutzgruppen in einem Schritt abzuspalten, wobei vorteilhafterweise durch Ver¬ wendung flüchtiger Basen das gewünschte Oligonucleotid in nur sehr- geringem Maße mit Fremdstoffen verunreinigt ist und damit direkt nachfolgend durch die noch vorhandene hydrophobe 5 ^■ -Tritylgruppe über "reversed phase"-HPLC ge¬ reinigt werden kann.

Ein weiterer Vorteil des Verfahrens der Erfindung ergibt sich daraus, daß durch die Entfernung der Schutzgruppe durch ß-Eliminierung kein Angriff am P-Atom erfolgt und damit an keinerder neu geknüpften __nternucleotidbindungen während des Entschützens gespalten werden kann. Das Verfahren der Erfindung führt damit bei stark reduziertem Zeitaufwand zu insgesamt reineren Produkten als die bisher verfügbaren Verfahren.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen näher erläutert, wobei Phophinderivate zur Anwendung kommen, in denen R ein ß-Cyanethylgruppe ist. Einzelheiten der Reaktion und physiklische Kenndaten der hergestellten Verbindungen ergeben sich aus den Schemata 2 und 3, der Tabelle 1 , sowie den Figuren 1 - 7 am Schluß der Beschreibung.

Beispiel 1 :

Herstellung von Phosphinderivaten der allgemeinen Formel III:

Monochlor-ß-cyanethyl-phosphoramidite:

Eine allgemeine Übersicht über die Reaktion ist aus Schema 1 ersiσhtlicht. ^/

Dichlor-ß-cyanethoxyphosphin ( Λ ) wird mit einigen Verbesserunge

O PI

im übrigen jedoch wie in Can. J. Chem. 58_, 2686 ⁽ 1980 ⁾⁾ dar ^¬ gestellt:

137,5 g (1,0 Mol) PC1 ₃ werden in einem Dreihalskolben mit Tropftrichter mit 300 ml Ether und 79,0 g (1 Mol) Pyridin versetzt; die Mischung wird auf -78° unter Argon abgekühlt. Dann wird eine Lösung von 71 ,0 g (1 Mol) ß-Cyanethanol in 150 ml trockenem Ether tropfenweise über 1 bis 1,5 Stunden gegeben. Das Kältebad wird entfernt; man rührt weitere 3 Stunden bei Raumtemperatur (unter Umständen werden erneut 300 ml Ether zugegeben, um eine bessere Rührfähigkeit zu gewährleisten) . Rührer und Tropftrichter werden unter Argon entfernt; das Gemisch wird über Nacht bei 0° C aufbewahrt. Die festen Salze werden unter Argon entfernt; der Nieder¬ schlag wird zweimal mit je 75 ml Ether gewaschen. Die ver¬ einigten organischen Phasen werden im Vakuum konzentriert; der Rückstand wird schließlich im Vakuum destilliert: Siedepunkt 70 - 75° C/0,4 mm.

Monochlor-ß-cyanethylphosphoramidite ( 3) :

Zu einer Lösung des N-trimethylsilylierten sekundären Amins (0,1 Mol) oder sekundären Amin (0,2 Mol) in 30 ml Ether wird tropfenweise bei -20° C unter Argon eine Lösung von 17,2 g (0,1 Mol) ß-Cyanethylphosphordichloridit (__) in 60 ml Ether im Verlauf von 1 bis 1,5 Stunden zugetropft. Nach 20stündigem Rühren bei Raumtemperatur wird das Aminhydrochlorid entfernt; die verbleibende Lösung wird konzentriert. Der Rückstand wird schließlich im Vakuum in einer Kurzwegdestille destilliert.

Die physikalischen Eigenschaften der so erhältlichen Verbin¬ dungen sind in Tabelle 1 zusammengefasst. '

D ⁱ e Figuren 1a, 1b und 1c zeigen ³ P-NMR-Spektren von drei verschiedenen Monochlor-ß-cyanethylphosphoramiditen.

Das N-MorpholInderivat ist thermisch zu instabil, um destilliert werden zu können. Die Präparation ist dennoch so rein, daß der Rückstand direkt für die Herstellung der aktivierten Nucleosid-Derivate verwendet werden kann. Die Reinheit ist gewöhnlich entsprechend den p-NMR-Spektren größer als 95%.

Nucleosid-ß-cyanethylphosphoramidite:

Die Darstellung der entsprechend geschützten Nucleosid- ß-cyanethylphosphoramidite ist aus Schema 3 ersichtlich.

Die Synthese gelingt in Analogie zu Tetrahedron Lett. 22, 1859 (1981) mit einigen Verbesserungen in guten Ausbeuten.

3.0 m Mol des N-geschützten 5'-dimethoxytritylierten Des- oxynucleosLdswerden mit THF/Toluol azeotrop getrocknet, in 15 ml trocknen THF gelöst und mit 12,0 m Mol N, N, N- Diisopropylethylamin zugegeben. Zu dieser Lösung werden unter kräftigem Rühren tropfenweise im Verlauf von 2 Minu¬ ten unter Argon 6,0 m Mol des Monochlor-ß-cyanethylphosphor- amidits zugefügt. Nach kurzer Zeit (2 bis 5 Minuten) fällt Aminhydrochlorid aus. Die Suspension wird für weitere 30 bis 40 Minuten gerührt. Aminhydrochlorid wird unter Argon abfiltriert und gründlich mit trockenem THF (10bis 15 ml) nachgewaschen. Die gesamte organische Phase wird konzen¬ triert und in Argon-gesättigtem Ethylacetat gelöst (100 ml) . Die organische Phase wird zweimal mit je 50 ml Argon-ge¬ sättigter 10%-wässriger Natriu carbonatlösung extrahiert. Die organischen Phasen werden mit Natriumsulfat getrocknet und unter reduziertem Druck zu einem Schaum eingedampft. Der Schaum wird mit wenig Ethylacetat oder T uol aufge¬ löst und in n-Hexan bei -78° C gefällt. Die aktivierten Nucleoside sind stabil für mehrere Monate, wenn man sie unter Argon bei -20° C aufbewahrt.

Figur 2 zeigt das ³¹ P-NMR-Spektrum eines der aktivierten Desoxynucleoside.

Synthese von d(CGGTACCG)

100 mg "controlled pore glass" (CPG) , beladen mit insge¬ samt 8 μ Mol N-Isobutyryl-desoxyguanin (vgl. Tetrahedron Lett. 24, 747 (1983)) wird nacheinander mit den 5 '-dimethoxytrity- lierten N-acylierten ß-Cyanethyl-N,N-diisopropylphosphor- amiditen der Desoxynucleoside C, C, A, T, G, G und C kondensiert, wobei jeweils 20 bis 25 Äquivalente des Phosphor- a idites in Acetonitril mit jeweils 75 - 80 Äquivalenten sublimiertem Tetrazol aktiviert werden. Die Kondensationen sind nach längstens 30 Minuten beendet; die Kopplungsaus¬ beute beträgt mehr als 94%. Nach der Kondensation folgt je¬ weils eine Oxidation mit J ₂ /H ₂ 0 und Maskierung nicht umge¬ setzter 5'-OH-Gruppen mit Acetanhydrid. Anschließend erfolgt Abspaltung der Dimethoxytritylgruppe entweder mit. 3% Tri- σhloressigsäure in Nitromethan/1% Methanol oder ZnBr ₂ /Nitro- methan/1% H ₂ 0.

Die Gesamtausbeute des geschützten Oktanucleotids am

Ende aller Kondensationsschritte beträgt 55%, bezogen auf das trägergebundene Desoxyguanosin.

Die vollständige Entschützung und Abspaltung vom Träger wird in einem Schritt durch Umsetzung der Glasperlen mit konzentriertem wässrigen Ammoniak (3 ml) bei 50° C in 16 Stunden erreicht. Anschließend werden die Glasperlen gründ¬ lich mit 50% wässrigem Methanol gewaschen (3 mal mit je 3 ml) Die flüssige Phase wird durch Einengen (Entfernung des Metha¬ nols ⁾ und Gefriertrocknung entfernt. Anschließend wird ein Aliquot nach Filtration durch Millipore-Filter durch HPLC an RP 18 gereinigt, wie aus Figur 3 ersichtlich ist.

ιz

Die Fraktionen, die das 5'-dimethoxytritylierte Oligo¬ nucleotid enthalten, werden gesammelt; der flüchtige Puffer wird im Vakuum a Rotationsverdampfer entfernt. Der Rück ^¬ stand wird mit 1 ml 80%-iger Essigsäure versetzt. Die Essig¬ säure wird nach 45 Minuten bei Raumtemperatur durch Gefrier¬ trocknung entfernt.

Das so erhaltene Material wird in üblicher eise (Liebigs Ann.

32 Chem. 1978, 982) mit T4-Polynucleotidkinase und γ- P-ATP phosphoryliert. Das erhaltene Produkt wird durch Polyaσryl- a idgelelektrophorese im Vergleich zu einem Homo-oligo- dT-Wellenlängenstandard (Nucleic Acids Res. 6_, 2096 (1979)

(Figur 4) und gemäß Figur 5 durch Sequenzierung (Liebigs Ann.

Chem. 1978, 982) charakterisiert.

Die Figuren 6a bis 6c zeigen die Ergebnisse (HPLC, Gelelektro¬ phorese, Sequenzierung) der Synthese von d (GGGATCCC) unter Verwendung der Nucleosid-ß-cyanethyl-N,N-dimethylphos- phoamidite. Die Figuren 7a bis 7c zeigen die Ergebnisse (HPLC, Gelelektrophorese, Sequenzierung der Synthese von d (GGGATATCCC) unter Verwendung der

Nucleosid-ß-cyanethyl-N-morpholinophosphoamidite.

Die in den Figuren 3, 6a und 7a wiedergegebenen Ergebnisse wurden durch Anwendung eines Gradienten von 10 -25 Vol.-% CH ₃ CN, 5 min., und 25 - 29 Vθl.-% CH.-.CN, 30 min. in 0,1 M Triethylam oniumacetat bei pH 7,0 erhalten.

OM

Tabelle 1 : Physikalische Daten von Monochlor-ß-cyanethylphophoramiditen

Verbindung 3a 3b 3c 1) L = N,N-Dimethylamino L = N,N-Diisopropylamino L = N-Morpholino

Siedepunkt 90-92°/0.6 mm 103-5°/0.08 mm

Chemischer Shift 2) für ³¹ P-NMR in 175,97 ppm 179,82 ppm 168,22 ppm

hemischer Shift 4.01. 4.17 (2t. P-0CH ₂ ,2H) 4.02. 4.2 (2t. P0CH ₂ .2H) 3.96. 4.1 (2t. P0CH für H-NMR in ppm 2.71 (t,-CH ₂ -CN ,2H) 3.8 (m.N(CH) ₂ ,2H) 3.67 (t.0(CH ₂ ) ₂ _4H) 2.77 (t,-CH ₂ CN,2H) 3.17 (m.P-N(CH ₂ ) ₂ ,4

2.7 (d,N(CH ₃ ) ₂ ,6H) 1.29 (d,N-CH(CH ₃ ) ₂ ,12H) 2.74 (t,CH ₂ -CN ₂ .2H)

Massenspektrum 224 (+2), 2 (-C ₃ H ₄ N _ß 0)

' Das Rohprodukt weist nach Abtrennung von Aminhydrochlorid und von im Hochvakuum bei RRaauummtteemmppeerraatur flüchtigen Verbindungen nach dem 31P-NMR-Spektrum eine Reinheit von 93-95% auf.

_r 2)' Die chemischen Shifts sind in Aceton-d _c mit 80%-iger H,PO. als externem Standard gemessen. 18 ^{6 3 4}

Schema 1.

3 Entfernung der Gruppe R durch ß-Eliminierung.

1

1 1 1 1

1

z -

Schema 2

RN /- ^R ι (2 Äquiv. wenn R H) (1 Äquiv. wenn R (CH ₃ ) ₃ Si)

1

c) _j + R ₂ = Morphol ino , I sobutyryl guanin , B enzoyladenin