ZU DESSEN HERSTELLUNG

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Synthese von DOPA mit einer fotolabilen Schutzgruppe und Zwischenprodukten zu dessen Herstellung.

In der Human- und Veterinärmedizin existieren verschiedene Klebstoffe zur Wundbehandlung oder Hämostase, während z.B. für die Behandlung von Kno- chenbrüchen keine Klebstoffe zur Verfügung stehen. Allerdings weisen die am Markt erhältlichen Produkte gravierende Nachteile auf. Dazu zählen insbeson dere das Toxizitätspotential der Klebstoffe (z. B. Cyanacrylat), die teilweise unge- nügende Kontrolle der Klebewirkung mit der Folge von unerwünschter Verkle- bung von Gewebe und Instrumentarien, hohe Behandlungskosten sowie die Ge- fahr der Übertragung infektiöser Agentien bei Stoffen humanen und tierischen Ur- sprungs (z.B. Fibrin). Miesmuscheln stellen einen biologischen Peptid-basierten Klebstoff her, der ihnen das Kleben auf verschiedenen Oberflächen im Wasser ermöglicht - eine Umgebung in der die meisten Klebstoffe nicht funktionieren - und dabei den marinen Gezeiten kräften zu widerstehen. Entscheidend für die Klebewirkung der Proteine ist der hohe Anteil der nicht-kanonischen Aminosäure DOPA (L-3,4-Dihydroxyphenylalanin). Setzt man DOPA mit einer fotolabilen ONB-Schutzgruppe, wie sie schon in zahlreichen Studien verwendet wurde, ein, ermöglicht es die Produktion photoaktivierbarer Proteine oder hier genauer pho- toaktivierbarer Protein-Klebstoffe, wobei eine Abspaltung durch Bestrahlung mit Licht der Wellenlänge 365 nm erfolgt. Diese Strategie hat folgende Vorteile: 1)

Die unerwünschte Oxidation von DOPA wird verhindert. 2) Die Klebewirkung kann bei Bedarf durch Lichtbestrahlung aktiviert werden, indem die fotolabile ONB-Schutzgruppe abgespalten wird.

In der Fachzeitschrift Eur. J. Org. Chem, 2018, 2053-2063, S. 2053-2063 ist eine Synthese für diese Komponente beschrieben. Sie umfasst 8 Stufen mit einer Ge- samtausbeute von 4%. Auf der letzten Stufe erfolgt eine enzymatische Race- matspaltung, was aus pharmakologischer Sicht ein Problem bedeuten könnte.

In der veröffentlichten US-Anmeldung US 2014/0023603 A1 werden neue Wirk- stoffe mit hautaufhellender und antioxidativer Wirkung und einer Aktivität in Be- zug auf den Peroxisom-Proliferator-aktivierten Rezeptor beschrieben. Auf Seite 22 wird in Tabelle 8 mit Bezugszeichen 86 und 87 (Z)-2-methoxy-4-((2-methyl-5- oxooxazol-4(5H)-ylidene)methyl)phenylazentat und (Z)-2-Ethoxy-4-((2-methyl-5- oxooxazol-4(5H)-ylidene)methyl)phenylazentat benannt. Diese Stoffe ähneln Zwi- schenprodukten, die in dem hiervorgestellten Verfahren entstehen, wobei die hier vorgestellten Zwischenprodukte fotolabile Substituenten tragen, die mit dem in US-Anmeldung US 2014/0023603 A1 vorgestellten Herstellungsverfahren nicht kompatibel sind.

In dem Fachartikel Biotechnology and Polymers, Plenum Press, New York, 1991, S. 229-243 wird über L-3,4-Dihydroxyphenylalanin (DOPA) und Umlagerungen zu N-Acetyl-α ,ß-Dehydro-DOPA berichtet. Auf S. 234 dieses Fachartikels beginnt eine Charakterisierung von nicht substituiertem N-Acetyl- α ,ß-Dehydro-DOPA- ethylester.

In der internationalen PCT-Anmeldung W002/00245 A1 werden neurotoxische Oligomere zum Einsatz bei der Behandlung der Alzheimer-Erkrankung offenbart. Eines dieser Oligomere, dort vorgestellt in Figur 7B, wird IsoDiatee genannt und kommt in diastereomerer Form vor, wobei sich die Konfigurationsvielfalt mit je- dem weiteren Monomer verdoppelt. . Diese Stoffe ähneln Zwischenprodukten, die in dem hiervorgestellten Verfahren entstehen, wobei die hier vorgestellten Zwi- schenprodukte jedoch andere und fotolabile Substituenten tragen. Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur enantioselektiven Herstellung von DOPA mit einer fotolabilen Schutzgruppe zur Verfügung zu stellen.

Die Aufgabe der Erfindung wird gelöst durch ein Verfahren nach Anspruch 1.

Nachfolgend wird das Verfahren nach Anspruch 1 in seiner bestmöglichen Aus- prägung vorgestellt, nämlich eine vollsynthetische, enantioselektive Synthese, die 5 Stufen umfasst und das Produkt in einer Gesamtausbeute von 5-7% erzeugt. Schlüsselschritt ist eine asymmetrische Hydrierung mit einer chiralen Rhodium- spezies.

Allgemeine Syntheseroute: wobei R ausgesucht ist aus der Gruppe bestehend aus:

wobei die Cumarin-Abkömmlinge für R den besonderen Vorteil haben, dass diese beim photoinduzierten Austritt beim Einsatz am Patienten keine toxischen Neben- produkte bilden. Bevorzugte Syntheseroute: Beschreibung der Einzelschritte

1 . Einführung der lichtempfindlichen Austrittsgruppe R

Bevorzugt Einführung der Nitrobenzyl Gruppe als lichtempfindliche Austritts- gruppe

30,9 g Natriumhydrid (774 mmol; 2,03 eq. 60% in Mineralöl) werden dreimal mit je 100 ml Hexan gewaschen und unter Feinvakuum getrocknet. Man suspendiert in 500 ml DMF (abs.) und kühlt im Eisbad. 52,6 g Dihydroxybenzaldehyd (381 mmol) werden innerhalb von 15 Minuten portionsweise addiert und werden 30 Mi- nuten im Eisbad nachgerührt. 82,3 g o-Nitrobenzylbromid (381 mmol; 1eq.) wer- den in 160 ml DMF (abs.) gelöst und innerhalb von 25 Minuten zugetropft. Nach 20 Minuten wird ein Gemisch aus 1 ,95 ml Wasser und 250 ml 2M Salzsäure ein- gegossen und mit 700 ml Essigsäureethylester versetzt. Man rührt einige Minuten nach und filtriert dann über eine G3 Fritte. Die Phasen werden getrennt und die wässrige Phase noch dreimal mit je 700 ml Essigsäureethylester extrahiert. Die vereinten organischen Phasen werden dreimal mit je 700 ml Wassergewaschen, sowie über Natriumsulfat getrocknet.

Nach Filtration und Einengen erhält man 99,95 g gelboranges Öl.

Dieses Öl wird in 300 ml warmem Methanol gelöst. 500 ml Wasser werden ad- diert und man erwärmt für 15 Minuten auf 80-85°C. Die entstehende kaugummi- artige Masse wird durch Filtration über eine G3 Fritte abgetrennt, bei 40°C am Rotationsverdampfer getrocknet, sowie mit Methanol abgeraucht. 79,83 g einer harzartigen Masse werden isoliert.

150 ml Dichlormethan werden addiert und man erwärmt zum Sieden. Man lässt bei 4°C kristallisieren. Es wird über eine G3 Fritte filtriert und fünfmal mit je 20 ml kaltem Dichlormethan gewaschen.

Man erhält 23,26 g Produkt (85 mmol, 22%, 09-19-11-08 P8571) als weißen Fest- stoff.

¹ H-NMR-Daten für R gleich Nitrobenzyl

¹ H (DMSO): s 10,38 (1 H, OH); s 9,76 (1 H, CHO); dd 8,15(8,2/1 ,1 Hz, 1 H, CH _ar N0 ₂ Benzyl); d 7,92 (7,4 Hz, 1 H, CH _ar N0 ₂ Benzyl), dt 7,82 (7, 6-7, 7/1-1 , 2 Hz, 1 H, CH _ar N0 ₂ Benzyl), m 7,61-7,66 (1 H, CH _ar N0 ₂ Benzyl); m 7,45-7,49, 2H, 2xCH _ar ); m 7,01-7,05 (1 H, CH _ar ); s 5,53 (2H, CH ₂ Benzyl) 2. Bildung des Azlactons

23,26 g Produkt der Vorstufe (85 mmol), 9,08 g Natriumacetat (111 mmol, 1 ,3 eq.) und 11 ,98 g N-Acetylglycin (102 mmol, 1 ,2 eq.) werden trocken vorgemischt und in 40 ml Essigsäureanhydrid (426 mmol, 5 eq.) suspendiert. Man erwärmt 4 Stunden auf 120°C. Zunächst bildet sich eine gut rührbare Mischung, dann eine gelbe Suspension. Nach Abkühlen werden 70 ml Wasser addiert und man zerkleinert mechanisch, um Rührbarkeit zu erreichen. Es wird über eine G3 Fritte filtriert und sechsmal mit je 23 ml eines 1 :1 Gemisches aus Wasser und Ethanol gewaschen, sowie bei 40°C getrocknet.

31 ,4 g eines gelben Feststoffes (79 mmol, 93%, 09-19-11-15 P8579) werden als Produkt isoliert.

¹ H-NMR-Daten für R gleich Nitrobenzyl

¹ H (DMSO): dd 8,18 (0,7/8, 2 Hz, 1H, CH _ar N0 ₂ Benzyl); d 8,03 (1 ,7 Hz, 1 H, CH _ar ); dd 7,83 (1 ,7/8, 3 Hz, 1 H, CH _ar ); dt 7,80 (1/7, 5-7, 7 Hz, 1H, CH _ar N0 ₂ Benzyl); d 7,73 (6,9 Hz, 1 H, CH _ar N0 ₂ Benzyl); m 7,6-7,66 (wohl dt, 1 H, CH _ar N0 ₂ Benzyl); d 7,28 (8,3 Hz, 1 H, CH _ar ); s 7,18 (1 H; CH _oief ); s 5,57 (2H, CH ₂ Benzyl); s 2,37 (3H; CH ₃ ); S 2,31 (3H; CH3COO-)

Bevorzugt Öffnung des Azlactons mit R gleich Nitrobenzyl

31 ,4 g Produkt der Vorstufe werden in 184 ml Ethanol suspendiert und mit 56 ml Triethylamin versetzt und erwärmt 28h unter Rückfluss. Reaktionskontrolle ist nach Verdünnen mit DCM mit dem Gemisch EE/PE 2:1 möglich. Man nimmt in 1 ,6 I Essigester auf und addiert 1 I Wasser und 1 I Kochsalzlösung. Mit 56 ml Salzsäure (25%) bringt man auf pH 1 und trennt die Phasen. Die wässrige Phase wird noch viermal mit je 800 ml Essigsäureethylester extrahiert. Die vereinten or- ganischen Phasen werden mit 600 ml Kochsalzlösung gewaschen, sowie über Natriumsulfat getrocknet. Nach Filtration und Einengen werden 32,15 g Rohpro- dukt als rot-gelber Feststoff isoliert. Man löst in der Wärme in 200 ml Ethanol, lässt kurz abkühlen und addiert 3,57 g Aktivkohle. Es wird aufgekocht und warm über Celite filtriert. Mit 250 ml warmem Ethanol wird nachgespült. Man destilliert soviel Ethanol ab bis eine dicke Suspension entstanden ist (ca. 60 ml) und lässt sie bei 8°C kristallisieren. Der ausgefallene Feststoff wird abfiltriert, mit insgesamt 70 ml kaltem Ethanol gewaschen, sowie bei 40°C getrocknet. 18,08 g Produkt (58%) werden als blassgelber Feststoff (09-19-11-19 P8598) erhalten.

Es werden 4,26 g Produkt (09-19-1-47 P8459, 95%) als rot-brauner Feststoff iso- liert.

¹ H-NMR-Daten für R gleich Nitrobenzyl

¹ H (DMSO): s 9,73 (1 H; NH 1); s 9,41 (1 H, OH 2); dd 8,17 (1-2/8, 2 Hz, 1 H, CH _ar N0 ₂ Benzyl 3); d 7,91 (7,4 Hz, 1 H, CH _ar N0 ₂ Benzyl 4); dt 7,82 (1 ,2-1 ,4/7, 4-7, 6 Hz, CH _ar N0 ₂ Benzyl 5); m 7,60-7,66 (wohl dt, 1 H, CH _ar N0 ₂ Benzyl 6); d 7,37 (1 ,9 Hz, 1 H, CH _ar 7); dd 7,14 (1 ,8-1 , 9/8, 3 Hz, 1 H, CH _ar 8); s 7,10 (1H, CH _oief 9); d 6,89 (8,3 Hz, 1 H, CH _ar 10); s 5,50 (2H, CH ₂ Benzyl 11), q 4,14 (7,1 Hz, CH2-0 12); s 1 ,93 (3H, CH ₃ COO 13); 1 1 ,22 (7,11 Hz, 3H, CH ₃ -CH ₂ 0 14) 4. Asymmetrische Hydrierung

Bevorzugt Asymmetrische Hydrierung mit R gleich Nitrobenzyl

220 ml Methanol werden durch Durchperlen von Stickstoff entgast. 23 mg S,S Et- Duphos (0,15 mol%) werden in einem ausgeheizten Kolben zweimal entgast und in 14 ml entgastem Methanol gelöst, sowie nochmals zweimal entgast. 23,1 mg Bisoctadienyl Rhodiumtetrafluoroborat (0,55 mol%) werden addiert und man ent- gast zweimal. Die Lösung wird eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt.

4,53 g Produkt der Vorstufe werden in 205 ml entgastem Methanol suspendiert, mit der Katalysatorlösung versetzt, sowie im Autoklav verschlossen. Man spült dreimal mit Stickstoff, dreimal mit Wasserstoff und rührt schließlich bei 5 bar bei Raumtemperatur unter Wasserstoff. Nach 17 Stunden wird der Autoklav geöffnet. Reaktionskontrolle ist mit dem Gemisch EE/PE 10:1 möglich. Man filtriert über etwa 32 g Kieselgel und spült das Kieselgel mit Methanol nach. Produkt enthal- tende Fraktionen werden vereint und eingeengt. Man erhält 4,68 g Rohprodukt.

In den 4 Durchläufen werden insgesamt 18,36 g Produkt isoliert.

Diese werden vereint, mit 3,61 g Aktivkohle versetzt und kurz zum Sieden erhitzt Man filtriert in der Hitze über Cellite und spült mit 150 bis 200 warmem Methanol. Die Lösung wird bei 40°C eingeengt. 17,79 g heller Feststoff werden isoliert (09- 19-11-38 P8623, 98%)

¹ H-NMR-Daten für R gleich Nitrobenzyl

¹ H (DMSO): s 8,17 (1 H, NH 1); dd 8,15 (1 ,2/8,2 Hz, 1 H, CH _ar N0 ₂ Benzyl 2); dd 7,93 (0,7-0, 8/7, 7 Hz, 1 H, CH _ar N0 ₂ Benzyl 3); dt 7,80 (1 ,2/7, 5-7, 7 Hz, 1 H, CH _ar N0 ₂ Benzyl 4); m 7,59-7,66 (1 H, wohl eigentlich dt, CH _ar N0 ₂ Benzyl 5); d 6,85 (1 ,9 Hz; 1 H, CH _ar 6); d 6,75 (8 Hz, 1 H, CH _ar 7); dd 6,65 (1 ,9/8,1 Hz, 1H, CH _ar 8); : 5,43 (2H, CH ₂ Benzyl 9); m 4,30-4,37 (1 H; CH-N 10); q 4,02 (7,1 Hz, 2 H, CH ₂ -0 11); dd 2,85 (5,8/13,8 Hz, 1 H, CH ₂ -Ar 12); dd 2,74 (8,8/13,8 Hz, 1 H, CH ₂ -Ar 13); s 1 ,76 (3H; CH ₃ CO 14); 1 1 ,12 (7,1 Hz, 3H, CH ₃ CH ₂ 15) 5. Abspalten der Schutzgruppen

Bevorzugt Abspalten der Schutzgruppen mit R gleich Nitrobenzyl

17,79 g Produkt der Vorstufe (44,2 mmol) werden in 95 ml Dioxan suspendiert und erwärmt, um eine Lösung zu erhalten. 95 ml 32% Salzsäure werden addiert und man erwärmt 5h unter Rückfluss. Es wird bei 60°C eingeengt und in 140 ml 1M Salzsäure gelöst. Man extrahiert mit 270 ml Essigester und zweimal 230 ml Essigester. Langsam werden 19,81 g Natriumhydrogencarbonat addiert, bis pH 7 erreicht ist. Eine grünliche Suspension bildet sich, die auf 4°C gekühlt wird. Nach 2h filtriert man, wäscht mit viermal 60 ml kaltem Wasser und trocknet bei 50°C. 9,33 g gelber Feststoff werden isoliert (28 mmol, 64%, 09-19-11-42 P8625), der leicht verunreinigt ist.

8,10 g werden in 320 ml Methanol suspendiert und bei Raumtemperatur 1h 40 gerührt. Es wird über eine G4 Fritte filtriert und zweimal mit je 80 ml Methanol gewaschen, sowie bei 40°C getrocknet. 5,56 g Produkt (09-19-11-58 P8656, 69%) werden isoliert. Der Enantiomeren-Exzess (ee) beträgt 98%.

¹ H-NMR-Daten für R gleich Nitrobenzyl

¹ H (DMSO): s 8,17 (1 H, NH 1); dd 8,15 (1 ,2/8,2 Hz, 1 H, CH _ar N0 ₂ Benzyl 2); dd 7,93 (0,7-0, 8/7, 7 Hz, 1 H, CH _ar N0 ₂ Benzyl 3); dt 7,80 (1 ,2/7, 5-7, 7 Hz, 1 H, CH _ar N0 ₂ Benzyl 4); m 7,59-7,66 (1 H, wohl eigentlich dt, CH _ar N0 ₂ Benzyl 5); d 6,85 (1 ,9 Hz; 1 H, CH _ar 6); d 6,75 (8 Hz, 1 H, CH _ar 7); dd 6,65 (1 ,9/8,1 Hz, 1H, CH _ar 8); s 5,43 (2H, CH ₂ Benzyl 9); m 4,30-4,37 (1 H; CH-N 10); q 4,02 (7,1 Hz, 2 H, CH ₂ -0 11); dd 2,85 (5,8/13,8 Hz, 1 H, CH ₂ -Ar 12); dd 2,74 (8,8/13,8 Hz, 1 H, CH ₂ -Ar 13); s 1 ,76 (3H; CH ₃ CO 14); 1 1 ,12 (7,1 Hz, 3H, CH ₃ CH ₂ 15)

Zuvor genannte Verbindungen D, E und F sind bisher nicht in der Literatur be- schrieben. B E Z U G S Z E I C H E N L I S T E Einführung der Nitrobenzyl Gruppe Bildung des Azlactons Öffnen des Azlactons asymmetrisches Hydrieren Abspalten der Schutzgruppen