Die Erfindung betrifft ein mikrobielles, fermentatives Verfahren zur Herstellung von

3.4-Dihydroxybenzoat ausgehend von D-Xylose-Einheiten mit coryneformen Bakterien.

3.4-Dihydroxybenzoesäure (3,4-Dihydroxybenzoat, Protocatechuat, PCA) ist eine phenolische Verbindung, die natürlicherweise in Pflanzen vorkommt. In der chemischen Industrie ist Protocatechuat von besonderem Interesse, da es als Copolymer zusammen mit Anilinen ein begehrtes Ausgangsmaterial für eine Vielzahl neuer Polymere und Plastikverbindungen bzw. von neuen Polymer-Fasern darstellt. Auch als Supplement in der Nahrungs- und Futtermittelindustrie ist PCA begehrt. Darüber hinaus birgt PCA aufgrund seiner entzündungshemmenden, anti-oxidativen, anti-bakteriellen, anti-viralen, anti-aging bzw. anti-fibrotischen Eigenschaften ein großes Potential für kosmetische oder pharmazeutische Anwendungen. Außerdem werden PCA positive Aktivitäten in der Bekämpfung von Krebs zugeschrieben.

Aufgrund der chemischen Synthese aus Erdöl, mit den bekannten Nachteilen einer Zeit-, Material-, Kosten- und Ressourcen-intensiven Herstellung, die zudem besonders umweltbelastend ist, ist die Notwendigkeit der Bereitstellung eines Systems bzw. Verfahrens zur Herstellung von Protocatechuat, das die zuvor genannten Nachteile nicht mehr aufweist, von enormer ökonomischer Relevanz. Gleichzeitig stellt sich die Herausforderung zu gewährleisten, dass mit einem neuen Verfahren Ausbeuten und Produkttitern erreicht werden, die eine Herstellung im industriellen Maßstab attraktiv machen.

Verschiedene Mikroorganismen zeigen ein natives Potenzial zur Biosynthese von PCA. Zum Beispiel exkretiert das Bodenbakterium Bacillus thuringiensis PCA ins Medium unter Eisen- limitierten Bedingungen (Garner, B.L., et al., Curr Microbiol, 2004. 49(2): p. 89-94). Azotobacter paspali akkumuliert PCA bei der Kultivierung in definiertem Medium mit Acetat und D-Glucose oder Saccharose als Kohlenstoff- und Energiequellen (Collinson, S.K., et al., Canadian Journal of Microbiology, 1987. 33(2): p. 169-175). In diesen Fällen sind die resultierenden Titer jedoch sehr gering und beide Organismen haben bisher keine industrielle Bedeutung.

Der industriell bedeutsame Organismus Corynebacterium glutamicum ist sowohl in der Lage PCA nativ zu synthetisieren (Kallscheuer, N. et al., Microb Cell Fact, 2018. 17(1): p. 70) als auch umgekehrt PCA als Kohlenstoff- und Energiequelle zu nutzen (Shen, X.H. et al., Applied Microbiology and Biotechnology, 2012. 95(1): p. 77-89). Die

Bestätigungskopie natürliche PCA-Produktionsleistung von C. glutamicum ist allerdings aufgrund dessen auch in diesem Stamm sehr gering.

Aus diesem Grund wurde in verschiedenen Ansätzen versucht, die PCA Produktion mit coryneformen Bakterien zu steigern. Der Phenylalanin-produzierende Stamm C. glutamicum ATCC 21420 wurde modifiziert, um das Gen vanAB zu exprimieren, welches für die Vanillat- O-Demethylase kodiert. Der Stamm C. glutamicum ATCC 21420 pCH_vanAB zeigte die Biokonversion von 16.0 mM Ferulasäure, einer von Lignin abgeleiteten phenolischen Verbindung, in 6.91 mM PCA nach 12 h Fed-Batch-Kultivierung (Okai, N., et al., AMB Express, 2017. 7(1): p. 130). Die Expression des Gens ubiC, welches für die Chorismat-Pyruvat-Lyase kodiert, im Stamm C. glutamicum ATCC 21420, ermöglichte die Bildung von 1 .4 mM PCA aus D-Glucose nach 80 h Kultivierung in einem 3 L Schüttelkolben. Derselbe Stamm (C. glutamicum ATCC 21420 pCH_ubiC) zeigte eine maximale Produktion von 7.4 mM PCA aus D-Glucose nach 96 h Fed-Batch-Fermentation im Bioreaktor-Maßstab (Okai, N., et al., Appl Microbiol Biotechnol, 2016. 100(1 ): p. 135-45). In beiden Ansätzen wurde der natürliche PCA-Katabolismus in C.glutamicum nicht unterbunden.

Weiterführende Arbeiten zielten daher zunächst auf die gezielte Unterbindung des PCA-Katabolismus und Bereitstellung des neuen Plattformstammes C. glutamicum DelAro ⁵ ab (Kalischeuer, N. et al., Microb Cell Fact, 2018. 17(1): p. 70). Dieser Stamm wurde weiter modifiziert durch Mutagenese der lolR-Operatorsequenz in der iolT1-Promotorregion zur Verbesserung des Zuckerimports sowie durch Überexpression der Gene aroF*, qsub und tkt, welche für die 3-Desoxy-D-arabinoheptulosonate-7-Phosphat-Synthase, die Dehydroshikimat-Dehydratase bzw. die Transketolase kodieren und der Verstärkung der PCA-Biosynthese dienten. Der resultierende Stamm

C. glutamicum DelAro ⁵ C7 P06-iolT1 pMKEx2_aroF*_qsuB pEKEx3_tkt zeigte eine Produktion von 13 mM PCA in Schüttelkolben ausgehend von D-Glucose als einziger Kohlenstoff und Energiequelle (Kallscheuer, N. et al., Microb Cell Fact, 2018. 17(1): p. 70). Diese Ausbeute ist für die industrielle Herstellung von PCA zu gering und somit unattraktiv. Auch jüngste Arbeiten von Kogure et al (2020, Metabolie Engineering), die zunächst den Anschein erwecken, dass die Produktion von PCA mit einem Titer von 82,7 g L ^-1 möglich erscheint, weisen für eine wirtschaftlich relevante Produktion von PCA nach wie vor deutliche Nachteile auf. So ist dort ein zweistufiger Fermentationsansatz erforderlich bei dem die Zellen in einem ersten Schritt auf Komplexmedium zu hohen Zelldichten kultiviert werden müssen. Danach müssen die Zellen in einem manuellen Zentrifugationsschritt aufkonzentriert und geerntet werden. Erst dann kann in einer anschließend durchzuführenden Biotransformation die Herstellung von PCA ausgehend von D-Glukose erfolgen. Nachteilig bleibt neben dem zweistufigen Ansatz außerdem der Einsatz von kostspieligen Komplexmedien bzw. D-Glukose, so dass auch dieser Prozess für eine wirtschaftliche sowie Kosten- und Ressourcen-schonende Produktion nicht besonders geeignet ist.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, einen Mikroorganismus bereitzustellen, der eine PCA-Synthese durch biotechnologische Fermentation im industriellen Maßstab ermöglicht. Aufgrund des gesteigerten Umweltbewusstseins ist es auch eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung einen Mikroorganismus bereitzustellen, der eine sichere und gleichzeitig umweltverträgliche PCA-Synthese ermöglicht, die Zeit, Material, Kosten und Ressourcen schont. Ziel der vorliegenden Erfindung ist es überdies einer nachhaltigen Bioökonomie bei der großtechnischen Herstellung von umfangreich einsetzbaren Grundbausteinen wie PCA gerecht zu werden. Eine weitere Aufgabe ist dabei, eine biotechnologische Synthese von PCA ausgehend von nachwachsenden, preiswerten Rohstoffen vornehmen zu können und entsprechend sichere Mikroorganismen mit PCA-Synthesekapazitäten bereitzustellen, die solche Rohstoffe als Ausgangsmaterial nutzen können.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von 3,4-Dihydroxybenzoesäure, enthaltend die Schritte a) Bereitstellen einer Lösung enthaltend wenigstens Wasser, Stickstoff, Mineralsalze und eine C5-Kohlenstoff-Quelle, b) mikrobielle Umsetzung der C5-Kohlenstoffquelle in einer Lösung gemäß Schritt a) zu 3,4-Dihydroxybenzoesäure in Anwesenheit einer modifizierten coryneformen Bakterienzelle, deren Pyruvat-Kinase-Aktivität (PK) teilweise oder komplett inaktiviert ist oder deren Gen kodierend für die Pyruvat-Kinase (pyk) partiell oder komplett deletiert ist sowie c) optional die Isolierung und/oder Aufbereitung von 3,4-Dihydroxybenzoesäure aus der Lösung.

Ferner wird die hier zugrundeliegende Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch eine modifizierte coryneforme Bakterienzelle, die eine teilweise oder komplett inaktivierte Pyruvat-Kinase-Aktivität und eine gesteigerte Xylose-Isomerase- und Xylulose-Kinase-Aktivität aufweist oder deren Gen kodierend für die Pyruvat-Kinase (pyk) teilweise oder komplett deletiert ist und deren Gene kodierend für eine Xylose-Isomerase (xylA) und Xylulose-Kinase (xylB) überexprimiert sind.

Die vorliegende Aufgabe wird ferner erfindungsgemäß gelöst durch die Verwendung einer erfindungsgemäß modifizierten corynformen Bakterienzelle ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Corynebacterium und Brevibacterium zur mikrobiellen Herstellung von 3,4-Dihydroxybenzoesäure aus D-Xylose.

Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den darauf rückbezogenen Unteransprüchen.

Vorteilhafte Ausgestaltungen des Verfahrens sowie der modifizierten coryneformen Bakterienzelle und deren Verwendung ergeben sich ebenfalls aus den jeweils hierauf rückbezogenen Patentansprüchen.

Erfindungsgemäß umfasst ist ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von

3.4-Dihydroxybenzoesäure, enthaltend die Schritte a) Bereitstellen einer Lösung enthaltend wenigstens Wasser, Stickstoff, Mineralsalze und eine C5-Kohlenstoff-Quelle, b) mikrobielle Umsetzung der C5-Kohlenstoffquelle in einer Lösung gemäß Schritt a) zu

3.4-Dihydroxybenzoesäure in Anwesenheit einer modifizierten coryneformen Bakterienzelle, deren Pyruvat-Kinase-Aktivität (PK) teilweise oder komplett inaktiviert ist oder deren Gen kodierend für die Pyruvat-Kinase (pyk) teilweise oder komplett deletiert ist und c) eine optionale Isolierung und/oder Aufbereitung von 3,4-Dihydroxybenzoesäure aus der Lösung.

Im Sinne der vorliegenden Erfindung ist unter einer „modifizierten" coryneformen Bakterienzelle zu verstehen, dass eine coryneforme Bakterienzelle gegenüber der Wildtyp-Wirtszelle oder einem entsprechenden Ausgangsstamm oder Vorläuferstamm endogene Eigenschaften in verändertem Maße, wie z.B. verstärkt oder reduziert, aufweist oder zusätzliche Eigenschaften durch heterologe Expression erworben hat. Dies kann im Sinne der Erfindung durch gebräuchliche Methoden erfolgen, wie beispielsweise eine verstärkte Expression endogener Gene durch Erhöhung der Kopienzahl dieser Gene z.B. durch Einbau weiterer Kopien in das Genom oder das Einbringen von Plasmiden mit erhöhter Kopienzahl in die coryneforme Bakterienzelle. Diese Methoden kann erfindungsgemäß auch für die verstärkte Expression heterologer Gene angewandt werden. Das gleich gilt analog auch für die Reduktion, Abschwächung oder teilweise bzw. kompletten Inaktivierung von endogenen oder heterolog erworbenen Eigenschaften einer coryneformen Bakterienzelle.

Im Sinne der vorliegenden Erfindung ist unter „teilweise oder komplett inaktiviert“ oder „teilweise oder komplett deletiert“ zu verstehen, dass beispielsweise eine Inaktivierung der Pyruvat-Kinase (PK) durch eine Deletion des Gens cg2291 bzw. durch das Einfügen eines Vektors oder einer alternativen Sequenz in den Genbereich von cg2291 erreicht werden kann. Dabei kann das Gen kodierend für die Pyruvat-Kinase teilweise oder komplett verändert oder deletiert sein mit der Folge der vollkommenen oder fast vollkommenen (teilweisen) Inaktivierung der enzymatischen Aktivität.

Alternativ kann eine Abschwächung oder Reduktion der Genexpression der Pyruvat-Kinase durch genetische Veränderung (Mutation) der Signalstrukturen der Genexpression erfolgen. Signalstrukturen der Genexpression sind beispielsweise Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, das Startkodon und Terminatoren. Angaben hierzu findet der Fachmann z. B. in der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Boyd und Murphy (J. Bacteriol. 1988. 170: 5949), bei Voskuil und Chambliss (Nucleic Acids Res. 1998. 26: 3548, bei Jensen und Hammer (Biotechnol. Bioeng. 1998 58: 191), bei Patek et al. (Microbiology 1996. 142: 1297 und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers („Molekulare Genetik“, 8. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 2001) oder dem von Winnacker („Gene und Klone“, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990).

Mutationen, die zu einer Veränderung der funktionellen Eigenschaften von PK führen, insbesondere zu einer veränderten Substratspezifität sind aus dem Stand der Technik bekannt. Als Beispiele seien die Arbeiten von Yano et al. 1998 Proc Natl Acad Sci U S A. 95:5511-5, Oue S. et al. J. Biol. Chem. 1999, 274:2344-9. und Onuffer et al. Protein Sei. 1995 4:1750-7 genannt. Als Mutationen kommen Transitionen, Transversionen, Insertionen und Deletionen in Betracht, sowie Methoden der gerichteten Evolution. Anleitungen zur Erzeugung derartiger Mutationen und Proteine gehören zum Stand der Technik und können bekannten Lehrbüchern (R. Knippers „Molekulare Genetik“, 8. Auflage, 2001 , Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland), oder Übersichtsartikeln (N. Pokala 2001 , J. Struct. Biol. 134:269-81 ; A. Tramontano 2004, Angew. Chem. Int. Ed Engi. 43:3222-3; N. V. Dokholyan 2004, Proteins. 54:622-8; J. Pei 2003, Proc. Natl. Acad. Sei. U S A. 100:11361-6; H. Lilie 2003, EMBO Rep. 4:346-51; R. Jaenicke Angew. Chem. Int. Ed. Engi. 42:140-2) entnommen werden.

„Vermindert“ oder „ausgeschaltet“ im Sinne der vorliegenden Erfindung meint, dass die Expression der kodierenden Nukleinsäuresequenz im Vergleich zur Situation in einer Wildtyp-Wirtszelle schlechter ist oder nicht mehr unter der Expressionskontrolle regulatorischer Strukturen wie im Vergleich zur Situation im Wildtyp-Wirtszelle steht. Im Sinne der vorliegenden Erfindung ist „vermindert“ oder „ausgeschaltet“, gleichbedeutend für „dereguliert“ oder „dereprimiert“ zu versehen. Im Sinne der Erfindung kann analog auch die regulatorische oder katalytische Aktivität von Proteinen oder Enzymen „vermindert“ oder „ausgeschaltet“ sein.

Gleiches gilt für analog für die „Steigerung“ oder „Erhöhung“ von regulatorischen oder katalytischen Aktivitäten von Proteinen oder Enzymen.

Im Sinne der vorliegenden Erfindung ist „gesteigert“ gleichbedeutend mit „erhöht“, oder „verbessert“, „verändert“ oder „dereguliert“ zu verstehen und wird synonym verwendet. „Gesteigert“ im Sinne der vorliegenden Erfindung meint beispielsweise die gesteigerte Genexpression eines Gens im Vergleich zu der Expression des jeweiligen Ausgangsgens oder der Situation in einer Wildtyp-Wirtszelle im unveränderten, natürlicherweise nicht gesteigerten Zustand. Gleiches ist im Sinne der Erfindung bezüglich der erhöhten Enzymaktivität gemeint. Beispielsweise stellt der Wildtyp einer coryneformen Bakterienzelle ein genetisch nicht verändertes Ausgangsgen oder -enzym dar. Bevorzugt sind coryneforme Wildtypzellen der Gattung Corynbacterium oder Brevibacterium, besonders bevorzugt sind coryneforme Bakterienzellen des Wildtyps Corynebacterium glutamicum.

Erfindungsgemäß umfasst im Sinne von „Wildtyp-Wirtszellen“ oder als „Ausgangsstamm“ oder „Vorläuferstamm“ oder als „Produktionsstamm“ oder als „Wildtyp-Plattformstamm“ für die erfindunsgemäß modifizierten corynformen Bakterienzellen sind auch coryneforme Bakterienzellen, die ihrerseits bereits derart in ihren Eigenschaften verändert sind, dass sie definierte und etablierte Plattformstämme oder definierte Produktionsstämme coryneformer Bakterienzellen sind, die für eine Produktion von Intermediaten auch im großtechnischen oder industriellen Maßstab vorbereitet und somit geeignet sind. Die Gattung Corynebacterium ist beispielsweise in der Fachwelt für ihre Fähigkeit bekannt L-Aminosäuren und organische Säuren zu produzieren. Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Art Corynebacterium glutamicum, sind beispielsweise die bekannten Wildtypstämme Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium glutamicum MB0001 (DE3), Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und Brevibacterium divaricatum ATCC14020, sowie daraus hergestellte, überproduzierende Mutanten bzw. Stämme, sogenannte Produktionsstämme oder Plattformstämme. Erfindungsgemäß vorteilhaft als „Wildtyp-Wirtszellen“ oder als „Ausgangsstamm“ oder „Vorläuferstamm“ oder als „Produktionsstamm“ oder als „Wildtyp-Plattformstamm“ im Sinne der vorliegenden Erfindung ist auch der Stamm Corynebacterium glutamicum DelAro ⁵ -C7 P _O6 iolT1. Die vorliegende Erfindung umfasst somit auch modifizierte coryneforme Bakterienzellen, die eine erfindungsgemäße Weiterentwicklung des Ausgangstammes Corynebacterium glutamicum DelAro ⁵ -C7 P _O6 iolT1 darstellen, wobei dieser Ausgangstamm erfindungsgemäß als „Wildtyp-Plattformstamm“ anzusehen ist. Zu weiteren Experimenten wurden erfindungsgemäß auch modifizierte coryneforme Bakterienzellen hergestellt und sind somit erfindungsgemäß umfasst, die eine Weiterentwicklung des Stammes Cornyebacterium glutamicum MB0001 (DE3) darstellen oder auch eine Weiterentwicklung des Stammes Cornyebacterium glutamicum DelAro5 darstellen, wobei dann der jeweilige Ausgangsstamm für diese Weiterentwicklung erfindungsgemäß als „Wildtyp-Wirtszellen“ oder als „Ausgangsstamm“ oder „Vorläuferstamm“ oder als „Produktionsstamm“ oder als „Wildtyp-Plattformstamm“ anzusehen ist. In einer Variante der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren umfasst, bei dem eine modifizierte coryneforme Bakterienzelle eingesetzt wird, die eine gesteigerte Xylose-Isomerase- und Xylulose-Kinase-Aktivität (XylA, XylB) aufweist oder deren Gene kodierend für eine Xylose-Isomerase (xylA) und Xylulose-Kinase (xyl B) überexprimiert sind.

Erfindungsgemäß kann eine gesteigerte Expression der Xylose-Isomerase (xylA) und/oder Xylulose-Kinase (xylB) auf Veränderungen beruhen, ausgewählt aus der Gruppe enthaltend a) Veränderung der Regulation oder von Signalstrukturen zur Genexpression, b) Veränderung der Transkriptionsaktivität der kodierenden Nukleinsäuresequenz, oder c) Erhöhung der Genkopienzahl der kodierenden Nukleinsäuresequenz. Erfindungsgemäß umfasst sind dabei Veränderung der Signalstrukturen der Genexpression, wie beispielsweise durch Veränderung der Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren; Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, des Startkodons, Terminatoren. Ebenso umfasst sind das Einführen eines stärkeren Promoters, wie beispielsweise des tac-Promotors oder einen IPTG-induzierbaren Promotors. Das Einführen eines stärkeren Promoters, wie z. B. den tac-Promoter (Amann et al (Gene 1988 69:301-15), oder Promotoren aus der Gruppe der bei Patek et al (Microbiology 1996 142:1297) beschriebenen Promotoren ist bevorzugt, aber nicht limitierend für die vorliegende Erfindung. Weitere Beispiele finden sich in der WO 96/15246 oder in Boyd and Murphy (Journal of Bacteriology 170: 5949 (1988)), in Voskuil and Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3548 (1998), in Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191 (1998)), in Pätek et al. (Microbiology 142: 1297 (1996)), in Knippers ("Molekulare Genetik", 6th Edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1995) oder auch bei Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany, 1990). Eine erhöhte Genkopienzahl der erfindungsgemäß kodierenden Nukleinsäuresequenz kann in weiteren Varianten der Erfindung chromosomal-kodiert oder Vektor-basiert, bevorzugt Plasmid-kodiert, vorliegen. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine coryneforme Bakterienzelle bei der die Erhöhung der Kopienzahl chromosomal-kodiert oder extra-chromosomal-kodiert, bevorzugt Vektor-kodiert oder Plasmid-kodiert, vorliegt. Erfindungsgemäß eignen sich als Plasmide solche, die in coryneformen Bakterien repliziert werden. Zahlreiche bekannte Plasmidvektoren wie z. B. pZ1 (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554), pEKExI (Eikmanns et al., Gene 102:93-98 (1991)) oder pHS2-1 (Sonnen et al., Gene 107:69-74 (1991)) beruhen auf den kryptischen Plasmiden pHM1519, pBL1 oder pGA1. Andere Plasmidvektoren wie z. B. solche, die auf pCG4 (US-A 4, 489, 160), oder pNG2 (Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)), oder pAGI (US-A 5, 158, 891 ) beruhen, können in gleicher Weise verwendet werden (O. Kirchner 2003, J. Biotechnol. 104:287-99). Ebenso können Vektoren mit regulierbarer Expression benutzt werden, wie zum Beispiel pEKEx2 (B. Eikmanns, 1991 Gene 102:93-8; O. Kirchner 2003, J. Biotechnol. 104:287-99). Auch kann das Gen durch Integration in das Chromosom in einfacher Kopie (P. Vasicova 1999, J. Bacteriol. 181 :6188-91), oder mehrfacher Kopie (D. Reinscheid 1994 Appl. Environ Microbiol 60: 126-132) exprimiert werden. Die Transformation des gewünschten Stammes mit dem Vektor zur Erhöhung der Kopienzahl erfolgt durch Konjugation oder Elektroporation des gewünschten Stammes von beispielsweise C. glutamicum. Die Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al. (Applied and Environmental Microbiology (1994) 60:756-759) beschrieben. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters (1994)123:343-347) beschrieben.

In einer weiteren Variante der vorliegenden Erfindung kann eine erhöhte Aktivität der Xylose-Isomerase (xylA) und/oder Xylulose-Kinase (xylB) auf Veränderungen beruhen, ausgewählt aus der Gruppe enthaltend a) eine Erhöhung der Expression der kodierenden Nukleinsäuresequenz, b) eine Expression einer Nukleinsäuresequenz oder Fragmenten davon, die für eine Xylose-Isomerase (xylA) und/oder Xylulose-Kinase (xylB) mit erhöhter katalytischer Aktivität und/oder Substratspezifität kodiert, c) eine Erhöhung der Stabilität der mRNA abgeleitet von der kodierenden Nukleinsäuresequenz, oder d) eine Veränderung der katalytischen Aktivität und/oder Substratspezifität einer Xylose-Isomerase (XylA) und/oder Xylulose-Kinase (XylB) für den Umsatz von D-Xylose oder eine Kombination von a) - d). Die Erhöhung der mRNA-Stabilität kann beispielsweise durch Mutation der terminalen Positionen erreicht werden, welche den Abbruch der Transkription steuern. Maßnahmen, die zu einer Veränderung der katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen führen, insbesondere zu einer veränderten Substratspezifität sind aus dem Stand der Technik bekannt. Neben erfindungsgemäß bevorzugten partiellen oder kompletten Deletionen regulatorischer Strukturen sind erfindungsgemäß auch Veränderungen, wie z. B. Transitionen, Transversionen oder Insertionen umfasst, sowie Methoden der gerichteten Evolution. Anleitungen zur Erzeugung derartiger Veränderungen können bekannten Lehrbüchern (R. Knippers „Molekulare Genetik“, 8. Auflage, 2001 , Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland) entnommen werden.

In einer weiteren Variante der vorliegenden Erfindung kommt bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eine corynforme Bakterienzelle zum Einsatz, die derart modifiziert ist, dass sie eine erhöhte Aktivität oder Überexpression des Gens kodierend für eine heterologe Xylose-Isomerase (XylA, xyla) aufweist, bevorzugt eine heterologe Xylose-Isomerase aus dem bakteriellen Isomerase-Stoffwechselweg ausgehend von D-Xylose, besonders bevorzugt aus dem Organismus Xanthomonas campetris. Erfindungsgemäß umfasst ist auch eine Variante eines Verfahrens bei dem eine corynforme Bakterienzelle zum Einsatz kommt, die derart modifiziert ist, dass sie eine erhöhte Aktivität oder Überexpression des Gens kodierend für eine endogene bzw. native Xylulose-Kinase (XylB, xylB) aufweist, bevorzugt eine endogene Xylulose-Kinase aus dem bakteriellen Isomerase-Stoffwechselweg ausgehend von D-Xylose, besonders bevorzugt aus dem Organismus Corynebacterium glutamicum.

Erfindungsgemäß umfasst ist auch ein Verfahren, bei dem eine modifizierte coryneforme Bakterienzelle eingesetzt wird, deren kataboler Stoffwechsel für aromatische Verbindungen inaktiviert ist und die zusätzlich eine erhöhte Aktivität einer DAHP-Synthase (AroF), bevorzugt einer feedback-deregulierten, DAHP-Synthase (AroF*), und einer 3-Dehydroshikimate Dehydrogenase (QsuB) aufweist oder deren Gene kodierend für Enzyme des katabolen Stoffwechsels aromatischer Verbindungen (DelAro ⁵ ) deletiert sind und eine Überexpression der Gene kodierend für eine DAHP-Synthase (aroF), bevorzugt einer feedback-deregulierten, DAHP-Synthase (AroF*), und einer 3-Dehydroshikimate Dehydrogenase (qsuB) aufweist.

Erfindungsgemäß wird bei dem vorliegenden Verfahren die mikrobielle Umsetzung eine C5-Kohlenstoffquelle mittels einer modifizierten coryneformen Bakterienzelle durchgeführt, in der das katabole Netzwerk zum Abbau aromatischer Verbindungen durch Deletion von 27 Genen, ausgeschaltet ist (DelAro ⁵ ). Zusätzlich weist die erfindungsgemäße Bakterienzelle eine erhöhte Aktivität 3-Desoxy-D-Arabinoheptulosanat-7-phosphat-Synthase (DAHP-Synthase; AroF), bevorzugt einer feedback-deregulierten DAHP-Synthase (AroF*), besonders bevorzugt einer heterologen feedback-deregulierten DAHP-Synthase (AroF*) aus Escherichia coli, sowie einer 3-Dehydroshikimate Dehydrogenase (QsuB), bevorzugt einer endogenen, nativen oder homologen 3-Dehydroshikimate Dehydrogenase (QsuB) aus coryneformen Bakterien auf. Oder die erfindungsgemäß modifizierte coryneforme Bakterienzelle weist eine Überexpression des Gens kodierend für eine DAHP-Synthase (aroF), bevorzugt eine feedback-deregulierte DAHP-Synthase (aroF*) aus Escherichia coli, die ganz besonders bevorzugt hinsichtlich des genetischen Codes für coryneforme Bakterien Codon-optimiert ist, sowie eine Überexpression des Gens kodierend für eine 3- Dehydroshikimate Dehydrogenase (qsuB), besonders bevorzugt ein Gen kodierend für eine endogene, native, homologe 3-Dehydroshikimate Dehydrogenase (QsuB) aus coryneformen Bakterien, bevorzugt Corynebacterium glutamicum, auf.

Optional kann die Lösung enthaltend 3,4-Dihydroxybenzoesäure (PCA) nach gängigen Methoden der mikrobiellen bzw. biotechnologischen Praxis aufbereitet werden und/oder PCA aus der Lösung isoliert werden. Gegebenenfalls kann das Produkt des erfindungsgemäßen Verfahrens auch weiter gereinigt oder aufkonzentriert werden oder zur weiteren Verwendung mit Zusatzstoffen versehen werden, die dem finalen Endprodukt angepasst sind.

Eine weitere Variante der vorliegenden Erfindung umfasst ein Verfahren bei dem eine modifizierte coryneforme Bakterienzelle eingesetzt wird, die zusätzlich ein Phosphotransferase-(PTS)-unabhängiges Kohlenstofftransportersystem aufweist, bevorzugt einen myo-lnositol/Proton-Symporter iolT1 , besonders bevorzugt eine lolR-dereprimierten myo-lnositol/Proton-Symporter P ₆ -iolT 1 .

Weiter ist im Sinne der Erfindung ein Verfahren umfasst, bei dem eine modifizierte coryneforme Bakterienzelle eingesetzt wird, ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Corynebacterium und Brevibacterium, bevorzugt Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium acetoglutamicum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum und Brevibacterium divaricatum.

In einer weiteren Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine modifizierte coryneforme Bakterienzelle der Gattung Corynebacterium glutamicum eingesetzt, die aus einer „Wildtyp-Wirtszelle“ oder einem „Ausgangsstamm“ oder „Vorläuferstamm“ oder einem „Produktionsstamm“ oder einem „Wildtyp-Plattformstamm“ der Gattung Corynebacterium glutamicum hervorgeht, bevorzugt aus dem Stamm Corynebacterium glutamicum DelAro ⁵ -C7 P _O6 iolT1 hervorgeht.

Erfindungsgemäß umfasst ist auch ein Verfahren, bei dem die mikrobielle Umsetzung in einer Lösung ausgehend von einer C5-Kohlenstoff-Quelle erfolgt ausgewählt aus der Gruppe enthaltend a) Oligosaccharide oder Polysaccharide, enthaltend D-Xylose-Einheiten, b) D-Xylose, c) Lignocellulose-, Cellulose-, oder Hemicellulose-haltige Biomasse, deren Hydrolysat oder daraus gewonnener Extrakt enthaltend D-Xylose-Einheiten oder d) eine Kombination von a) bis c). In einer weiteren Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird als C5-Kohlenstoffquelle Sulfitablauge, Maisstroh, Reisstroh oder Bagasse, oder deren Hydrolysate oder daraus gewonnene Extrakte enthaltend D-Xylose-Einheiten eingesetzt.

Varianten des erfindungsgemäßen Verfahrens können kontinuierlich oder diskontinuierlich, z.B. im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed-batch- (Zulaufverfahren) oder repeated fed-batch-Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) gefahren werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.

Ein zu verwendendes Kulturmedium sollte in geeigneterWeise den Ansprüchen der jeweiligen Mikroorganismen genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedenener Mikroorganismen sind im Handbuch ''Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981) enthalten. Neben D-Xylose als Ausgangssubstrat der PCA-Bildung können als Kohlenstoffquelle Zucker und Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z.B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z.B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden.

Erfindungsgemäß umfasst sind auch Lignocellulose-, Cellulose-, oder Hemicellulose-haltige Biomasse, deren Hydrolysat oder daraus gewonnener Extrakt enthaltend D-Xylose-Einheiten oder eine Kombination der zuvor genannten Substrate. Darüber hinaus sind als C5-Kohlenstoffquelle auch Sulfitablauge, Maisstroh, Reisstroh oder Bagasse, oder deren Hydrolysate oder daraus gewonnene Extrakte enthaltend D-Xylose-Einheiten erfindungsgemäß umfasst.

Diese zuvor genannten Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.

Als Stickstoffquelle können organische, stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Phosphorquelle können Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden.

Das Kulturmedium muss weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe, wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.

Zur pH - Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak oder saure Verbindungen wie Salzsäure, Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, z. B. Antibiotika, hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten werden Sauerstoff oder sauerstoffhaltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum an PCA gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner eine modifizierte coryneforme Bakterienzelle, die eine teilweise oder komplett inaktivierte Pyruvat-Kinase-Aktivität (PK) und eine gesteigerte Xylose-Isomerase- und Xylulose-Kinase-Aktivität (XylA, XylB) aufweist oder deren Gen kodierend für die Pyruvat-Kinase (pyk) teilweise oder komplett deletiert ist und deren Gene kodierend für eine Xylose-Isomerase (xylA) und Xylulose-Kinase (xylB) überexprimiert sind.

Erfindungsgemäß umfasst ist eine modifizierte coryneforme Bakterienzelle, die eine teilweise oder komplette Inaktivierung der Pyruvat-Kinase (PK) aufweist, die erfindungsgemäß durch eine Deletion des Gens cg2291 bzw. durch das Einfügen eines Vektors oder einer alternativen Sequenz in den Genbereich von cg2291 erreicht werden kann. Dabei kann das Gen kodierend für die Pyruvat-Kinase (pyk) teilweise oder komplett verändert oder deletiert sein (Δpyk), mit der Folge der vollkommenen oder fast vollkommenen bzw. teilweisen Inaktivierung der enzymatischen Aktivität der Pyruvat-Kinase (PK). Erfindungsgemäß handelt es sich bei der Pyruvat-Kinase (PK) oder dem Gen kodierend für die Pyruvat-Kinase (pyk) um das endogene Enzym bzw. Gen aus der Gattung Cornyebacterium oder Brevibacterium. Bevorzugt handelt es sich um die Pyruvat-Kinase bzw. das sie kodierende Gen aus Corynebacterium glutamicum. Interessanterweise ist eine modifizierte coryneforme Bakterienzelle der vorliegenden Erfindung auch ohne Pyruvat-Kinase-Aktivität lebensfähig und zudem zur mikrobiellen Herstellung von PCA fähig ist, was nicht zu erwarten war.

In einer weiteren Variante der vorliegenden Erfindung kommt eine modifizierte corynforme Bakterienzelle zum Einsatz, die zusätzlich zur Inaktivierung der PK bzw. Deletion Δpyk eine erhöhte Aktivität oder Überexpression des Gens kodierend für eine heterologe Xylose-Isomerase (XylA, xyla) aufweist, bevorzugt eine heterologe Xylose-Isomerase aus dem bakteriellen Isomerase-Stoffwechselweg ausgehend von D-Xylose, besonders bevorzugt aus dem Organismus Xanthomonas campestris. Erfindungsgemäß umfasst ist auch eine Variante einer corynforme Bakterienzelle, die zusätzlich zur Inaktivierung der PK bzw. Deletion Δpyk und einer erhöhten Aktivität einer heterologen Xylose-Isomerase oder Überexpression des Gens kodierend für eine heterologe Xylose-Isomerase (XylA, xyla) noch eine erhöhte Aktivität oder Überexpression des Gens kodierend für eine Xylulose-Kinase (XylB, xylB), bevorzugt eine endogene Xylulose-Kinase aus dem bakteriellen Isomerase-Stoffwechselweg ausgehend von D-Xylose, besonders bevorzugt aus dem Organismus Corynebacterium glutamicum, aufweist. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine modifizierte coryneforme Bakterienzelle, die a) eine teilweise oder komplette Inaktivierung einer Pyruvat-Kinase (PK) mit einer Aminosäuresequenz von wenigstens 70% Identität zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder Fragmente davon aufweist, b) eine Xylose-Isomerase-Aktivität (XylA) mit einer Aminosäuresequenz von wenigstens 70% Identität zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder Fragmente davon aufweist, c) eine gesteigerte Aktivität einer Xylose-Isomerase-Aktivität (XylB) mit einer Aminosäuresequenz von wenigstens 70% Identität zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3 oder Fragmente davon aufweist.

Eine Variante einer erfindungsgemäßen modifizierte coryneforme Bakterienzelle zeichnet sich dadurch aus, dass sie a) eine Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Xylose-Isomerase (xylA) mit wenigstens 70% Identität zu SEQ ID NO. 5 oder Fragmente oder Allele davon aufweist, und b) eine gesteigerte Expression einer Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Xylulose-Kinase (xylB) mit wenigstens 70% Identität zu SEQ ID NO. 6 oder Fragmente oder Allele davon aufweist. c) eine teilweise oder komplette Deletion der Nukleinsäuresequenz kodierend für die Pyruvat-Kinase gemäß SEQ ID NO. 4 der Fragmente oder Allele davon aufweist.

Erfindungsgemäß umfasst ist auch eine Variante einer modifizierte coryneforme Bakterienzelle mit a) einer Nukleinsäuresequenz, die unter stringenten Bedingungen mit einer komplementären Sequenz einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 5 oder SEQ ID NO. 6 oder Fragmente oder Allele davon hybridisiert, b) einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 5 und SEQ ID NO. 6 oder Fragmente davon, oder c) einer Nukleinsäuresequenz entsprechend jeder der Nukleinsäuren gemäß a) oder b), die sich jedoch von diesen Nukleinsäuresequenzen durch die Degeneriertheit des genetischen Codes oder funktionsneutrale Mutationen unterscheidet. d) einer Nukleinsäure entsprechend jeder der Nukleinsäuren gemäß a) - c), die an die Codon-Usage des Wirts-Stammes angepasst (Codon-optimiert) ist, und e) einer teilweisen oder kompletten Deletion der Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 4.

Eine Variante der vorliegenden Erfindung umfasst ferner eine modifizierte coryneforme Bakterienzelle, deren Enzyme für den Katabolismus aromatischer Verbindungen inaktiv sind und die zusätzlich eine erhöhte Aktivität einer DAHP-Synthase (AroF), bevorzugt einer feedback-deregulierten DAHP-Synthase (AroF*), und einer 3-Dehydroshikimate Dehydrogenase (QsuB) aufweist oder deren Gene kodierend für Enzyme des Katabolismus aromatischer Verbindungen (Delaro ⁵ ) deletiert sind und die eine Überexpression der Gene kodierend für eine DAHP-Synthase (aroF), bevorzugt eine feedback-deregulierte DAHP-Synthase (aroF*), und einer 3-Dehydroshikimate Dehydrogenase (qsuB) aufweist.

Erfindungsgemäß umfasst ist eine modifizierte coryneforme Bakterienzelle, in der das katabole Netzwerk zum Abbau aromatischer Verbindungen durch Deletion von 27 Genen, ausgeschaltet ist (DelAro ⁵ ). Zusätzlich weist die erfindungsgemäße Bakterienzelle eine erhöhte Aktivität 3-Desoxy-D-Arabinoheptulosanat-7-phosphat-Synthase

(DAHP-Synthase; AroF), bevorzugt einer feedback-deregulierten DAHP-Synthase (AroF*), besonders bevorzugt einer heterologen feedback-deregulierten DAHP-Synthase (AroF*) aus Escherichia coli, sowie einer 3-Dehydroshikimate Dehydrogenase (QsuB), bevorzugt einer endogenen, nativen oder homologen 3-Dehydroshikimate Dehydrogenase (QsuB) aus coryneformen Bakterien auf. Oder die erfindungsgemäß modifizierte coryneforme Bakterienzelle weist eine Überexpression des Gens kodierend für eine DAHP-Synthase (aroF), bevorzugt eine feedback-deregulierte DAHP-Synthase (aroF*) aus Escherichia coli, die ganz besonders bevorzugt hinsichtlich des genetischen Codes für coryneforme Bakterien Codon-optimiert ist, sowie eine Überexpression des Gens kodierend für eine 3-Dehydroshikimate Dehydrogenase (qsuB), besonders bevorzugt ein Gen kodierend für eine endogene, native, homologe 3-Dehydroshikimate Dehydrogenase (QsuB) aus coryneformen Bakterien, bevorzugt Corynebacterium glutamicum, auf.

Erfindungsgemäß umfasst ist weiter eine modifizierte coryneforme Bakterienzelle, die zusätzlich zu den zuvor erläuterten Eigenschaften ein Phosphotransferase-(PTS)- unabhängiges Kohlenstofftransportersystem aufweist, bevorzugt einen myo-lnositol/Proton-Symporter iolT1 , besonders bevorzugt eine lolR-dereprimierten myo-lnositol/Proton-Symporter P ₆ -iolT1 .

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine modifizierte coryneforme Bakterienzelle, die eine gesteigerte Expression der Xylose-Isomerase (xylA) und Xylulose-Kinase (xylB) aufweist, beruhend auf Veränderungen in nicht-kodierenden regulatorischen Sequenzen vor oder hinter dem kodierenden Bereich von xyl A und/oder xylB, einschließlich der Promotor- Region. Erfindungsgemäß umfasste Varianten sind auch modifizierte coryneforme Bakterienzellen, die eine gesteigerte Expression der Xylose-Isomerase (xylA) und Xylulose-Kinase (xylB) aufweisen beruhend auf einer Erhöhung der Kopienzahl einer Nukleinsäure kodierend für ein xylA- und/oder xylB-Gen. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine modifizierte coryneforme Bakterienzelle bei der eine erhöhte Kopienzahl einer Xylose-Isomerase und Xylulose-Kinase kodierenden Nukleinsäuresequenz chromosomal-kodiert vorliegt. Erfindungsgemäß umfasst ist auch eine modifizierte coryneforme Bakterienzelle, bei der eine erhöhte Kopienzahl einer Xylose-Isomerase und Xylulose-Kinase kodierenden Nukleinsäuresequenz extrachromosomal-kodiert, bevorzugt Plasmid-kodiert oder Vektor-kodiert, vorliegt.

In einer besonderen Variante der Erfindung ist eine modifizierte coryneforme Bakterienzelle umfasst, a) die eine Xylose-Isomerase (XylA) mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 2 oder Fragmente davon und/oder eine Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Xylose-Isomerase (xylA) gemäß SEQ ID NO. 5 oder Fragmente oder Allele davon aufweist, b) bei der die Aktivität einer Xylulose-Kinase (XylB) mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 3 oder Fragmente davon und/oder die Expression einer Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Xylulose-Kinase (xylB) gemäß SEQ ID NO. 6 oder Fragmente oder Allele davon gesteigert ist, c) bei der die Pyruvat-Kinase (PK) mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 teilweise oder komplett inaktiviert ist und/oder eine Nukleinsäuresequenz kodierend für die Nukleinsäuresequenz (pyk) gemäß SEQ ID NO. 4 teilweise oder komplett deletiert ist, d) die eine gesteigerte Aktivität und/oder Expression der Gene kodierend für eine feedback deregulierte DAHP-Synthase (AroF*) und einer 3-Dehydroshikimate Dehydrogenase (QsuB) aufweist, e) die eine gesteigerte Aktivität und/oder Expression der Gene kodierend für Phosphotransferase-(PTS)-unabhängiges Kohlenstofftransportersystem aufweist, bevorzugt einen myo-lnositol/Proton-Sym porter iolT1 , besonders bevorzugt eine lolR-dereprimierten myo-lnositol/Proton-Symporter P ₆ -iolT1 , und f) bei der die Aktivität der Enzyme verantwortlich für den Abbau von aromatischen Verbindungen teilweise oder komplett inaktiviert ist und/oder die Nukleinsäuresequenzen kodierend für Enzyme verantwortlich für den Abbau von aromatischen Verbindungen teilweise oder komplett deletiert sind, sowie g) eine Kombination aus a) - f).

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine modifizierte coryneforme Bakterienzelle ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Corynebacterium und Brevibacterium, insbesondere Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium acetoglutamicum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum und Brevibacterium divaricatum.

Erfindungsgemäß besonders geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Art Corynebacterium glutamicum, sind beispielsweise die bekannten Wildtypstämme Corynebacteriumglutamicum ATCC13032, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und Brevibacterium divaricatum ATCC14020, sowie daraus hergestellte, überproduzierende Mutanten bzw. Stämme, sogenannte Produktionsstämme oder Plattformstämme.

Erfindungsgemäß umfasst sich somit auch coryneforme Bakterienzellen, die ihrerseits bereits derart in ihren Eigenschaften verändert sind, dass sie definierte und etablierte Plattformstämme oder definierte Produktionsstämme coryneformer Bakterienzellen sind, die für eine Produktion von Intermediaten auch im großtechnischen oder industriellen Maßstab vorbereitet und somit geeignet sind. Die Gattung Corynebacterium ist beispielsweise in der Fachwelt für ihre Fähigkeit bekannt L-Aminosäuren und organische Säuren zu produzieren. Darüber hinaus sei bemerkt, dass die biotechnologischen Produkte, die mit coryneformen Bakterien hergestellt werden, den „Generally Recognized As Safe“-Status (GRAS) genießen, wodurch coryneforme Baktieren eine überaus hohe Akzeptanz für die mikrobielle Herstellung von Stoffwechselintermediaten genießen. Coryneforme Bakterien erreichen auf definierten Medien hohe Wachstumsraten und Biomasseerträge (Grünberger et al., 2012) und es existiert umfangreiche Erfahrung im industriellen Einsatz coryneformer Bakterien (Becker et al., 2012). Dies ist eine allgemeine Information aus dem Stand der Technik, die dem Fachmann wohlbekannt ist.

Im Sinne der vorliegenden Erfindung eignet sich als „Wildtyp-Wirtszellen“ oder als „Ausgangsstamm“ oder „Vorläuferstamm“ oder als „Produktionsstamm“ oder als „Wildtyp-Plattformstamm“ für erfindungsgemäße Varianten einer modifizierten coryneformen Bakterienzelle beispielsweise bevorzugt der Stamm Corynebacterium glutamicum. Erfindungsgemäß vorteilhaft als Ausgangsstamm für die Varianten der vorliegenden Erfindung ist der Stamm Corynebacterium glutamicum DelAro ⁵ -C7 P _O6 iolT1.

Die vorliegende Erfindung umfasst somit eine modifizierte coryneforme Bakterienzelle, die eine erfindungsgemäße Weiterentwicklung des Plattformstammes Corynebacterium glutamicum DelAro ⁵ -C7 P _O6 iolT1 darstellt, wobei der zuvor genannte Plattform stamm auch als eine Art „Wildtyp-Plattformstamm“ anzusehen ist, gegenüber dem die zuvor genannten Eigenschaften der Enzymaktivitäten oder Genexpressionen der erfindungsgemäß modifizierten coryneformen Bakterienzellen verändert sind.

Diese erfindungsgemäß modifizierte coryneforme Bakterienzelle zeichnet sich besonders vorteilhaft dadurch aus, dass sie in einem unerwartet hohen Maße PCA (3,4- Dihydroxybenzoesäure; Protocatechuat) ausgehend von D-Xylose, Oligosacchariden oder Polysacchariden enthaltend D-Xylose-Einheiten, D-Xylose, Lignocellulose-, Cellulose-, oder Hemicellulose-haltige Biomasse deren Hydrolysat oder daraus gewonnener Extrakt enthaltend D-Xylose-Einheiten oder ausgehend von Sulfitablauge, Maisstroh, Reisstroh oder Bagasse oder deren Hydrolysate oder daraus gewonnene Extrakte enthaltend D-Xylose-Einheiten oder Kombinationen davon produziert.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine modifizierte coryneforme Bakterienzelle der zuvor beschriebenen Art zur Herstellung von 3.4-Dihydroxybenzoesäure aus einer C5-Kohlenstoffquelle. Bevorzugt wird im Sinne der vorliegenden Erfindung eine C5-Kohlenstoffquelle ausgehend von Oligosacchariden oder Polysacchariden enthaltend D-Xylose-Einheiten, D-Xylose, Lignocellulose-, Cellulose-, oder Hemicellulose-haltige Biomasse, deren Hydrolysat oder daraus gewonnener Extrakt enthaltend D-Xylose-Einheiten oder ausgehend von Sulfitablauge, Maisstroh, Reisstroh oder Bagasse, oder deren Hydrolysate oder daraus gewonnene Extrakte enthaltend D-Xylose-Einheiten oder Kombinationen davon.

Erfindungsgemäß umfasst ist auch ein Verfahren der zuvor beschriebenen Art, bei dem eine modifizierte coryneforme Bakterienzelle der zuvor beschriebenen Art eingesetzt wird.

Die vorliegende Erfindung umfasst ferner eine Verwendung einer modifizierten corynformen Bakterienzelle der zuvor beschriebenen Art zur mikrobiellen Herstellung von 3,4-Dihydroxybenzoesäure aus D-Xylose oder D-Xylose-haltigen Hydrolysaten oder Extrakten nachhaltiger Rohstoffe.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine Zusammensetzung enthaltend 3,4-Dihydroxybenzoesäure herstellt mit einer modifizierten coryneformen Bakterienzelle der zuvor beschriebenen Art oder nach einem Verfahren der zuvor beschriebenen Art.

Erfindungsgemäß umfasst ist auch die Verwendung von 3,4-Dihydroxybenzoesäure, hergestellt mit einer modifizierten coryneformen Bakterienzelle der vorliegenden Erfindung oder nach einem Verfahren der zuvor beschriebenen Art, sowie die Verwendung einer Zusammensetzung der zuvor beschriebenen Art zur Herstellung von Plastik, Plastikfasern, Pharmazeutika, Kosmetika, Lebensmitteln und/oder Futtermitteln.

Tabellen und Figuren:

Tabelle 1 zeigt eine Übersicht an Bakterienstämmen und Plasmiden der vorliegenden Erfindung. Der Ausgangs- oder Plattformstamm Corynebacterium glutamicum DelAro ⁵ -C7 P _O6 iolT1 ist dabei als ein vorteilhafter „Wildtyp-Ausgangsstamm“ anzusehen, gegenüber dem die Varianten der erfindungsgemäßen Bakterienzellen bzw. Bakterienstämmen modifiziert sind.

Tabelle 2 zeigt eine Übersicht der SEQ ID NO‘s der vorliegenden Erfindung

Figur 1a)-e) zeigt die Plasmide pK19mobsacB_cg0344-7 (Fig. 1a), pK19mobsacB_cg2625- 40 (Fig 1 b), pK19mobsacB_0502 (Fig 1c), pK19mobsacB_cg1226 (Fig. 1d) und pK19mobsacB_cg3349-54 (Fig. 1e) mit denen die fünf Gen-Cluster kodierend für Enzyme beteiligt am Abbau aromatischer Verbindungen deletiert wurden.

Figur 2 zeigt die Plasmide pK19mobsacB-540-del (Figur 2a) und pK19mobsacB- PgltA::PdapA-C7 (Figur 2b) mit denen die regulatorische Bindestelle im Promotorbereich der Citratsynthase CS durch Nukleotidsubstitutionen und Integration in das Genom coryneformer Bakterienzellen verändert wurde. Die erfindungsgemäße Promotorregion PgltA::PdapA-C7 weist neben dem Austausch der Promotorregion von gtlA gegen dapA zusätzlich Nukleotidsubstitutionen an Position 70 (a->t) und 71 (g->a) vor dem Startcodon ATG auf.

Figur 3 zeigt das Plasmid pK19mobsacB_P _O6 iolT1 zur Veränderung der regulatorischen Bindestelle im Promotorbereich des /Wyo-Inositol-Transporters lolT1 durch Nukleotidsubstitutionen in C. glutamicum.

Figur 4 zeigt Plasmid pMKEX2_aroF*_qsuB für die Expression der Gene aroF* aus Escherichia coli und qsuB aus C. glutamicum.

Figur 5 zeigt Plasmid pEKEx3-tkt für die Expression des tkt Gens aus C. glutamicum

Figur 6 zeigt Plasmid pK19mobsacB _pyk mit dem die Nukleinsäuresequenz kodierend für die Pyruvat-Kinase erfindungsgemäß im Genom von Corynebacterium glutamicum deletiert wurde.

Figur 7 zeigt Plasmid pEKEx3_xylA-xylB für die Expression der Gene xylA aus Xanthomonas campestris pv.campestris ATCC33913 und xylB aus C. glutamicum.

Figur 8 zeigt das Wachstum, die Substrataufnahme und die Protocatechuat-Bildung unterschiedlicher Varianten coryneformer Bakterienzellen. Die Kultivierungen wurden in Schüttelkolben in definiertem CGXII-Medium unter Zugabe von entweder 222 mM D-Glucose (Stämme: DelAro ⁵ -C7 P _O6 -iolT1 pMKEx2_aroF*_qsuB pEKEx3_tkt und DelAro ⁵ -C7 P _O6 -iolT1 Δpyk pMKEx2_aroF*_qsuB pEKEx3_tkt) oder 266 mM D-Xylose (Stämme: DelAro ⁵ -C7 P _O6 - iolT1 pMKEx2_aroF*_qsuB pEKEx3_xylA_xylB und DelAro ⁵ -C7 P _O6 -iolT1 Δpyk pMKEx2_aroF*_qsuB pEKEx3_xylA_xylB) als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle durchgeführt. Mittelwerte und Standardabweichungen wurden von mindestens drei unabhängigen Kulturen ermittelt.

Figur 9 zeigt PCA-Titer der C. glutamicum-Stämme DelAro ⁵ -C7 Po&-iolT1 pMKEx2_aroF*_qsuB pEKEx3_tkt (PC A _GLC ), DelAro ⁵ -C7 P _O6 -iolT1 Δpyk pMKEx2_aroF*_qsuB pEKEx3_tkt (PCA _GLC Δpyk), DelAro ⁵ -C7 P _O6 -iolT1 pMKEx2_aroF*_qsuB pEKEx3_xylA_xylB (PCAXYL) und DelAro ⁵ -C7 P _O6 -iolT1 Δpyk pMKEx2_aroF*_qsuB pEKEx3_xylA_xylB (PCAXYL Δpyk) nach 98 h Kultivierung. Mittelwerte und Standardabweichungen wurden von mindestens drei unabhängigen Kulturen ermittelt.

Figur 10 zeigt das Wachstum, die Substrataufnahme und die Protocatechuat-Bildung unterschiedlicher Varianten coryneformer Bakterienzellen. Die Kultivierungen wurden in Schüttelkolben in definiertem CGXII-Medium unter Zugabe von 266 mM D-Xylose als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle durchgeführt. Mittelwerte und Standardabweichungen wurden von mindestens drei unabhängigen Kulturen ermittelt.

Weitere Vorteile der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen und aus der nachfolgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen der vorliegenden Erfindung, die in den Tabellen und Figuren dargestellt sind. Nachfolgend wird der Gegenstand der Erfindung anhand von Tabellen und Figuren näher erläutert, ohne dass der Gegenstand der Erfindung dadurch beschränkt wird.

Stammkonstruktion C. glutamicum 13032 DelAro ⁵

Die nachfolgend beschriebene Methodik wurde für die Konstruktion von C. glutamicum 13032 DelAro ⁵ verwendet.

Als Ausgangsstamm für die Konstruktion von C. glutamicum 13032 DelAro ⁵ wird der Stamm C. glutamicum MB001 (DE3) gewählt. Hierbei handelt sich um einen Prophagen-freien C. glutamicum ATCC13032 Wildtyp-Stamm (Stamm C. glutamicum MB001 ; Baumgart et al, 2013b), https://doi.org/10.1128/AEM.01634-13), der im Weiteren über eine chromosomal-integrierte T7-Polymerase verfügt, welche die Nutzung des starken und induzierbaren T7-Promotors erlaubt (Stamm C. glutamicum MB001 (DE3); (Kortmann et al., 2015 https://doi.Org/10.1111/1751-7915.12236). Dieser Promotor befindet sich auch auf den pMKEx2-Plasmiden, die für die Expression an der Synthese des jeweiligen Produkts beteiligter Gene pflanzlichen Ursprungs genutzt werden.

Ausgehend von C. glutamicum MB001 (DE3) wird durch Deletion der Gen(-cluster) cg0344-47, cg2625-40 und cg1226 der Stamm C. glutamicum DelAro ³ konstruiert (Kalischeuer et al., 2016a, https://d0i.0rg/l 0.1016/j.ymben.2016.06.003).

Bei cg0344-47 handelt es sich um das phdBCDE-Operon, welches für Gene codiert, die am Katabolismus von Phenylpropanoiden, wie z. B. p-Cumarsäure beteiligt ist.

Um die unspezifische Umwandlung von Phenylpropanoiden durch Enzym-katalysierte Ring-Hydroxylierung oder Ring-spaltende Reaktionen zu verhindern (die natürlichen Substrate der jeweiligen Enzyme 4-Hydroxybenzoate-3-Hydroxylase PobA bzw. Protocatechuat Di-oxygenase PcaGH zeigen eine hohe strukturelle Ähnlichkeit zu Phenylpropanoiden) werden die entsprechenden Gen(-cluster) cg1226 (poM) und cg2625-40 (cat, ben und pca Gene, die essentiell für den Abbau von 4-Hydroxybenzoat, Catechol, Benzoat und Protocatechuat sind) deletiert.

Die 3-Dehydroshikimat Dehydratase QsuB katalysiert die thermodynamisch irreversible Umwandlung des Shikimat-Weg-Intermediates 3-Dehydroshikimat zu Protocatechuat und führt so zu einem ungewünschten Verlust von Intermediaten des Syntheseweges aromatischer Aminosäuren. Die Deletion von qsuB reduzierte die Akkumulation von Protocatechuat. Somit wird in dem konstruierten Stamm C. glutamicum DelAro ³ zusätzlich das Gen cg0502 (qsuB) deletiert, resultierend in dem Stamm C. glutamicum DelAro ⁴ .

Darüber hinaus wurden die Gene für den Gentisatabbauweg deletiert. Die Enzyme dieses katabolen Weges werden von Genen des Genclusters naglKL-nagR-nagT-genH kodiert (cg3349-54). Um jeglichen Produktabbau zu verhindern wurde das gesamte Gencluster deletiert, woraus letztendlich der Stamm C. glutamicum DelAro ⁵ resultiert.

Konstruktion pK19mobsacB-cg0344-47-del und pK19mobsacB-cg2625-40-del

Zur Konstruktion des Plasmides pK19mobsacB-cg0344-47-del (Figur 1a) und pK19mobsacB- cg2625-40-del (Figur 1 b) zwecks Deletion der Gencluster cg0344-47 und cg2625-40 in C. glutamicum wurden die für das homologe Rekombinationsereignis benötigten flankierenden Fragmente des jeweils zu deletierenden Genclusters per PCR ausgehend von isolierter genomischer C. glutamicum DNA amplifiziert.

Für die Generierung des stromaufwärts gelegenen Fragments wurde das Primerpaar cgXXXX- XX-up-s / cgXXXX-XX-up-as verwendet, die stromabwärts gelegene Flanke wurde mit dem Primerpaar cgXXXX-XX-down-s / cgXXXX-XX-down-as amplifiziert. Die Codierung XXXX-XX steht hierbei jeweils für die cg-Nummern der zu deletierenden Gene. Beispielsweise wird für die Deletion der Genclusters cg0344-47 das Primerpaar cg0344-47-up-s/ cg0344-47-up-as benutzt und analog für die Deletion der Genclusters cg2625-40 das Primerpaar cg2625-40-up-s/ cg2625-40-up-as. Die Überprüfung der generierten DNA-Fragmente auf die erwartete Basenpaargröße wurde mittels gelelektrophoretischer Analyse auf einem 1 % Agarosegel durchgeführt. Die Nukleotidsequenzen der inneren (dem zu deletierenden Gen zugewandten) Primer (cgXXXX-XX-up-as / cgXXXX-XX-down-s) wurden dabei so gewählt, dass die beiden amplifizierten Fragmente up und down zueinander komplementäre Überhänge enthalten. Für das Gencluster cg0344-47 ist dies das Primerpaar cg0344-47-up-as/ cg0344-47-down-s und analog für das Gencluster cg2625-40 das Primerpaar cg2625-40-up-as/ cg2625-40-down-s. In einer zweiten PCR (ohne Zugabe von DNA-Primern) lagern sich die gereinigten Fragmente über die komplementären Sequenzen an und dienen sich gegenseitig sowohl als Primer als auch als Matrize (overlap-extension PCR). Das so generierte Deletionsfragment wurde in einer finalen PCR mit den beiden äußeren (dem Gen abgewandten) Primern aus der ersten PCR amplifiziert (cgXXXX-XX-up-s / cgXXXX-XX-down-as). Für das Gencluster cg0344-47 ist dies das Primerpaar cg0344-47-up-s/ cg0344-47-down-as und analog für das Gencluster cg2625-40 das Primerpaar cg2625-40-up-s/ cg2625-40-down-as. Nach elektrophoretischer Trennung auf einem 1 % TAE-Agarosegel wurde das finale Deletionsfragment mit dem NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel, Düren) nach dem beiliegenden Protokoll aus dem Gel isoliert. Für die Konstruktion der Deletionsplasmide wurden sowohl die Deletionfragmente als auch der pK19-mobsacB-Leervektor mit den FastDigest-Varianten (Thermo Fisher Scientific) der Restriktionsenzyme Xba\ und EcoRI linearisiert. Die Restriktionsansätze der genannten Fragmente wurden mit dem NucleoSpin Gel and PCR Clean-up-Kit (Macherey-Nagel, Düren) gereinigt. Für die Ligation der hydrolysierten DNA-Fragmente mittels Rapid DNA Ligation-K\t (Thermo Fisher Scientific) wurde jeweils eines der beiden Deletionsfragmente in einem dreifachen molaren Überschuss gegenüber dem linearisierten Vektorrückgrat pK19mobsacB eingesetzt. Nach erfolgter Ligation der Fragmente wurden das gesamte Ansatzvolumen für die Transformation chemisch kompetenter E. coli DH5a-Zellen mittels Hitzeschock bei 42 °C für 90 Sekunden verwendet. Im Anschluss an den Hitzeschock wurden die Zellen 90 Sekunden auf Eis regeneriert bevor diese mit 800 pL LB-Medium versehen worden und bei 37 °C in einem Thermomixer (Eppendorf, Hamburg) bei 900 RPM für 60 Minuten regeneriert worden sind. Im Anschluss wurden 100 pL der Zellsuspension auf LB-Agarplatten mit Kanamycin (50 pg/ml) ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die korrekte Assemblierung der Deletionsplasmide in den gewachsenen Transformanden wurde mittels Kolonie-PCR überprüft. Hierfür wurde der 2x DreamTaq Green PCR Master Mix (ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) verwendet. Die DNA-Matrize wurde dem PCR-Ansatz hierbei durch das Hinzufügen von Zellen der gewachsenen Kolonien beigesetzt. Durch den initialen Denaturierungsschritt des PCR-Protokolls bei 95 °C für 3 Minuten werden die Zellen lysiert, sodass die DNA-Matrize freigesetzt wurde und für die DNA-Polymerase zugänglich war. Als DNA-Primer für die Kolonie-PCR wurde das Primerpaar univ / rsp verwendet, welches spezifisch an das pK19mobsacB-Vektorrückgrat bindet und im Falle einer korrekten Ligation der eingesetzten Fragmente ein PCR-Produkt spezifischer Größe bildet, welches per Gelelektrophorese überprüft wurde. Klone, deren PCR-Produkt auf eine korrekte Assemblierung des jeweiligen Deletionsplasmides pK19mobsacB-cg0344-47-del bzw. pK19mobsacB-cg2625-40-del hindeutet, wurden über Nacht in LB-Medium mit Kanamycin (50 pgZmL) für die Isolierung der Plasmide angezogen. Die Plasmide wurden anschließend mit dem NucleoSpin Plasmid (NoLid)-Kit. (Macherey-Nagel, Düren) isoliert und mit den genannten Amplifizierungs-und Kolonie-PCR-Primern sequenziert.

Ein Aliquot elektrokompetenter C. glutamicum-Zellen wurde mit dem beschriebenen Protokoll mit dem jeweiligen Deletionsplasmid transformiert und auf BHIS-Kan ¹⁵ -Platten ausgestrichen. Da das pK19mobsacB-Plasmid in C. glutamicum nicht replizieren kann, konnte bei der anschließenden Selektion der vermittelten Kanamycin-Resistenz davon ausgegangen werden, dass diese nur ausgebildet wird, falls das Deletionsplasmid erfolgreich über die homologen Sequenzen in das Genom von C. glutamicum integriert werden konnte. Die erhaltenen Integranten wurden in einer ersten Selektionsrunde auf BHI-Kan ²⁵ -Platten sowie BHI 10 % Saccharose (w/v)-Platten ausplattiert und über Nacht bei 30°C inkubiert. Bei erfolgreicher Genomintegration des Deletionsplasmids wird neben der Kanamycin-Resistenz die von sacB codierte Levan-Sucrase gebildet. Dieses Enzym katalysiert die Polymerisierung von Saccharose zum toxischen Levan, sodass es zu einer induzierten Letalität bei Wachstum auf Saccharose kommt (Bramucci & Nagarajan, 1996). Demnach sind Kolonien, die das Deletionsplasmid über homologe Rekombination in ihr Genom integriert haben, resistent gegenüber Kanamycin und sensitiv gegenüber Saccharose.

Die Exzision von pK19mobsacB fand in einem zweiten Rekombinationsereignis über die nun doppelt vorliegenden DNA-Bereiche statt, bei dem das zu deletierende Gen aus dem Chromosom letztendlich gegen das eingebrachte Deletionsfragment ausgetauscht wurde. Dazu wurden Zellen, die den beschriebenen Phänotyp (kanamycinresistent, saccharosesensitiv) zeigten, in einem Reagenzglas mit 3 ml BHI-Medium (ohne Zugabe von Kanamycin) für 3 Stunden bei 30 °C und 170 RPM inkubiert. Im Anschluss wurden je 100 pl einer 1 :10- Verdünnung auf BHI-Kan ²⁵ -Platten sowie BHI-10 % Saccharose (w/v)-Platten ausgestrichen und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Insgesamt wurden 50 der auf der BHI 10 % Saccharose (wZv)-Platte gewachsenen Klone ausgewählt und % Saccharose (wZv) ausgestrichen und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Sollte das Plasmid vollständig entfernt worden sein, so zeigt sich dies in einer Sensitivität gegenüber Kanamycin und einer Resistenz gegenüber Saccharose des jeweiligen Klons. Das zweite Rekombinationsereignis (Exzision) kann neben der gewünschten Gendeletion auch zur Wiederherstellung der Wildtyp-Situation führen. Die erfolgreiche Deletion in den erhaltenen Klonen nach Exzision wurde über die erwartete Fragmentgröße bei Deletion des Gens oder Genclusters mittels Kolonie-PCR der erhaltenen Klone überprüft. Die verwendeten Primer del-cgXXXX-XX-s Z del-cgXXXX-XX-as wurden hierbei so gewählt, dass sie im Chromosom außerhalb des deletierten DNA-Bereiches und auch außerhalb der amplifizierten flankierenden Genbereiche binden. Für das Gencluster cg0344-47 ist dies das Primerpaar del-cg0344-47-s/ del-cg0344-47-as und analog für das Gencluster cg2625-40 das Primerpaar del-cg2625-40-s / del-cg2625-40-as.

Verwendete Primer univ: CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC rsp: CACAGGAAACAGCTATGACCATG pK19mobsacB-cg0344-47-del

_C g0344-47-up-s: CTCTCTAGAGCGGTGGCGATGATGATCTTCGAG cg0344-47-up-as: AAGCATATGAGCCAAGTACTATCAACGCGTCAGGGCGACT

TTTCCATTGAGAGACATTTC cg0344-47-down-s: CTGACGCGTTGATAGTACTTGGCTCATATGCTTTTCCTCAC

CCGCTTCTACGCTTAAAAG cg0344-47-down-as: GACGAATTCGTGTGGCCACCACCTCAATCTGTG del-cg0344-47-s: AGAGATTCACCCTCGGCGATGAG del-cg0344-47-as: GACCCGCAATGGTGTCGCCAG pK19mobsacB-cg2625-40-del cg2625-40-up-s: ACATCTAGAGGTCGGCGAATCAAGCTCCATG cg2625-40-up-as: CGTCTCGAGTTCACATATGCAACGCGTGCTCAAGATGA

CAATATCTTGAGGGTTCATTTTTTGATCCTTAATTTAG cg2625-40-down-s: TTGAGCACGCGTTGCATATGTGAACTCGAGACGGTC

GGTGGAGGCGACCAGGGATAAC cg2625-40-down-as: TCTGAATTCATCAAGGCCAATCATGATGAGTGCGAAAC del-cg2625-40-s: AAGAGGAGTTGATGGGATGGTCGAACAATC del-cg2625-40-as: GTTGGCATGCCAGCTTTGTGGGATG

Konstruktion pK19mobsacB-cg0502-del

Zur Konstruktion des Plasmides pK19mobsacB-cg0502-del (Figur 1c) für die Deletion des Gens cg0502 in C. glutamicum wurden die für das homologe Rekombinationsereignis benötigten flankierenden Fragmente per PCR ausgehend von isolierter genomischer C. glutamicum DNA amplifiziert.

Für die Generierung des stromaufwärts gelegenen Fragments wurde das Primerpaar cg0502-up-s / cg0502-up-as verwendet, die stromabwärts gelegene Flanke wurde mit dem Primerpaar cg0502-down-s / cg0502-down-as amplifiziert. Die Überprüfung der generierten DNA-Fragmente auf die erwartete Basenpaargröße wurde mittels gelelektrophoretischer Analyse auf einem 1 % Agarosegel durchgeführt. Die Nukleotidsequenzen der inneren (dem zu deletierenden Gen zugewandten) Primer (cg0502-up-as / cg0502-down-s) wurden dabei so gewählt, dass die beiden amplifizierten Fragmente up und down zueinander komplementäre Überhänge enthalten. In einer zweiten PCR (ohne Zugabe von DNA-Primern) lagern sich die gereinigten Fragmente über die komplementären Sequenzen an und dienen sich gegenseitig sowohl als Primer als auch als Matrize (overlap-extension PCR). Das so generierte Deletionsfragment wurde in einer finalen PCR mit den beiden äußeren (dem Gen abgewandten) Primern aus der ersten PCR amplifiziert (cg0502-up-s / cg0502-down-as). Nach elektrophoretischer Trennung auf einem 1 % TAE-Agarosegel wurde das finale Deletionsfragment mit dem NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel, Düren) nach dem beiliegenden Protokoll aus dem Gel isoliert. Für die Konstruktion des Deletionsplasmids wurden sowohl das Deletionfragment als auch der pK19-mobsacB-Leervektor mit den FastDigest-V arianten (Thermo Fisher Scientific) der Restriktionsenzyme HindIII und BamHI linearisiert. Die Restriktionsansätze der genannten Fragmente wurden mit dem NucleoSpin Gel and PCR Clean-up-Kit (Macherey-Nagel, Düren) gereinigt. Für die Ligation der hydrolysierten DNA-Fragmente mittels Rapid DNA Ligation-Kit (Thermo Fisher Scientific) wurde das Deletionsfragment in einem dreifachen molaren Überschuss gegenüber dem linearisierten Vektorrückgrat pK19mobsacB eingesetzt. Nach erfolgter Ligation der Fragmente wurden das gesamte Ansatzvolumen für die Transformation chemisch kompetenter E. coli DH5a-Zellen mittels Hitzeschock bei 42 °C für 90 Sekunden verwendet. Im Anschluss an den Hitzeschock wurden die Zellen 90 Sekunden auf Eis regeneriert bevor diese mit 800 pL LB-Medium versehen worden und bei 37 °C in einem Thermomixer (Eppendorf, Hamburg) bei 900 RPM für 60 Minuten regeneriert worden sind. Im Anschluss wurden 100 pL der Zellsuspension auf LB-Agarplatten mit Kanamycin (50 pg/ml) ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die korrekte Assemblierung der Deletionsplasmide in den gewachsenen Transformanden wurde mittels Kolonie-PCR überprüft. Hierfür wurde der 2x DreamTaq Green PCR Master Mix (ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) verwendet. Die DNA-Matrize wurde dem PCR-Ansatz hierbei durch das Hinzufügen von Zellen der gewachsenen Kolonien beigesetzt. Durch den initialen Denaturierungsschritt des PCR-Protokolls bei 95 °C für 3 Minuten werden die Zellen lysiert, sodass die DNA-Matrize freigesetzt wurde und für die DNA-Polymerase zugänglich war. Als DNA-Primer für die Kolonie-PCR wurde das Primerpaar univ / rsp verwendet, welches spezifisch an das pK19mobsacB- Vektorrückgrat bindet und im Falle einer korrekten Ligation der eingesetzten Fragmente ein PCR-Produkt spezifischer Größe bildet, welches per Gelelektrophorese überprüft wurde. Klone, deren PCR-Produkt auf eine korrekte Assemblierung des Deletionsplasmides pK19mobsacB-cg0502-del hindeutet, wurden über Nacht in LB-Medium mit Kanamycin (50 pg/mL) für die Isolierung der Plasmide angezogen. Die Plasmide wurden anschließend mit dem NucleoSpin Plasmid (NoLid)-Kit (Macherey-Nagel, Düren) isoliert und mit den genannten Amplifizierungs-und Kolonie-PCR-Primern sequenziert. Ein Aliquot elektrokompetenter C. glutamicum-ZeWen wurde mit dem beschriebenen Protokoll mit dem jeweiligen Deletionsplasmid transformiert und auf BHIS-Kan ¹⁵ -Platten ausgestrichen. Da das pK19mobsacB-Plasmid in C. glutamicum nicht replizieren kann, konnte bei der anschließenden Selektion der vermittelten Kanamycin-Resistenz davon ausgegangen werden, dass diese nur ausgebildet wird, falls das Deletionsplasmid erfolgreich über die homologen Sequenzen in das Genom von C. glutamicum integriert werden konnte. Die erhaltenen Integranten wurden in einer ersten Selektionsrunde auf BHI-Kan ²⁵ -Platten sowie BHI 10 % Saccharose (wZv)-Platten ausplattiert und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Bei erfolgreicher Genomintegration des Deletionsplasmids wird neben der Kanamycin-Resistenz die von sacB codierte Levan-Sucrase gebildet. Dieses Enzym katalysiert die Polymerisierung von Saccharose zum toxischen Levan, sodass es zu einer induzierten Letalität bei Wachstum auf Saccharose kommt (Bramucci & Nagarajan, 1996). Demnach sind Kolonien, die das Deletionsplasmid über homologe Rekombination in ihr Genom integriert haben, resistent gegenüber Kanamycin und sensitiv gegenüber Saccharose.

Die Exzision von pK19mobsacB fand in einem zweiten Rekombinationsereignis über die nun doppelt vorliegenden DNA-Bereiche statt, bei dem das zu deletierende Gen aus dem Chromosom letztendlich gegen das eingebrachte Deletionsfragment ausgetauscht wurde. Dazu wurden Zellen, die den beschriebenen Phänotyp (kanamycinresistent, saccharosesensitiv) zeigten, in einem Reagenzglas mit 3 ml BHI-Medium (ohne Zugabe von Kanamycin) für 3 Stunden bei 30 °C und 170 RPM inkubiert. Im Anschluss wurden je 100 μl einer 1 :10-Verdünnung auf BHI-Kan ²⁵ -Platten sowie BHI-10 % Saccharose (wZv)-Platten ausgestrichen und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Insgesamt wurden 50 der auf der BHI 10 % Saccharose (wZv)-Platte gewachsenen Klone ausgewählt und zur Überprüfung der erfolgreichen Exzision von pK19mobsacB auf BHI-Kan ²⁵ sowie BHI 10 % Saccharose (wZv) ausgestrichen und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Sollte das Plasmid vollständig entfernt worden sein, so zeigt sich dies in einer Sensitivität gegenüber Kanamycin und einer Resistenz gegenüber Saccharose des jeweiligen Klons. Das zweite Rekombinationsereignis (Exzision) kann neben der gewünschten Gendeletion auch zur Wiederherstellung der Wildtyp-Situation führen. Die erfolgreiche Deletion in den erhaltenen Klonen nach Exzision wurde über die erwartete Fragmentgröße bei Deletion des Gens oder Genclusters mittels Kolonie-PCR der erhaltenen Klone überprüft. Die verwendeten Primer del-cg0502-s / del-cg0502-as wurden hierbei so gewählt, dass sie im Chromosom außerhalb des deletierten DNA-Bereiches und auch außerhalb der amplifizierten flankierenden Genbereiche binden.

Verwendete Primer cg0502-up-s: ACGAAGCTTTGTCCGGCATGCTGGCTGAC cg0502-up-as: TGCGCATATGTGGCCGTCTAGATACGCGTACGTCAAA CAAACAGTGGCAATGGATGTACGCATG cg0502-down-s: ACGTACGCGTATCTAGACGGCCACATATGCGCAATCG AGCGGGGAATCCCAAACTAGCATC cg0502-down-as: TATGGATCCTACGCCTGTACACCGTCGCACGTC del-cg0502-s: GTGAACATTGTGTTTACTGTGTGGGCACTGTC del-cg0502-as: TGATGTTCAGGCCGTTGAAGCCAAGGTAGAG univ: CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC rsp: CACAGGAAACAGCTATGACCATG

Konstruktion pK19mobsacB-cg1226-del

Zur Konstruktion des Plasmides pK19mobsacB-cg1226-del (Figur 1d) für die Deletion des Gens cg1226 in C. glutamicum wurden die für das homologe Rekombinationsereignis benötigten flankierenden Fragmente per PCR ausgehend von isolierter genomischer C. glutamicum DNA amplifiziert.

Für die Generierung des stromaufwärts gelegenen Fragments wurde das Primerpaar cg1226-up-s / cg1226-up-as verwendet, die stromabwärts gelegene Flanke wurde mit dem Primerpaar cg1226-down-s / cg1226-down-as amplifiziert. Die Überprüfung der generierten DNA-Fragmente auf die erwartete Basenpaargröße wurde mittels gelelektrophoretischer Analyse auf einem 1 % Agarosegel durchgeführt. Die Nukleotidsequenzen der inneren (dem zu deletierenden Gen zugewandten) Primer (cg1226-up-as / cg1226-down-s) wurden dabei so gewählt, dass die beiden amplifizierten Fragmente up und down zueinander komplementäre Überhänge enthalten. In einer zweiten PCR (ohne Zugabe von DNA-Primern) lagern sich die gereinigten Fragmente über die komplementären Sequenzen an und dienen sich gegenseitig sowohl als Primer als auch als Matrize (overlap-extension PCR). Das so generierte Deletionsfragment wurde in einer finalen PCR mit den beiden äußeren (dem Gen abgewandten) Primern aus der ersten PCR amplifiziert (cg1226-up-s / cg1226-down-as). Nach elektrophoretischer Trennung auf einem 1 % TAE-Agarosegel wurde das finale Deletionsfragment mit dem NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel, Düren) nach dem beiliegenden Protokoll aus dem Gel isoliert. Für die Konstruktion des Deletionsplasmids wurden sowohl das Deletionfragment als auch der pK19mobsacB-Leervektor mit den FastDigest-Varianten (Thermo Fisher Scientific) der Restriktionsenzyme HindIII und BamHI linearisiert. Die Restriktionsansätze der genannten Fragmente wurden mit dem NucleoSpin Gel and PCR Clean-up-Kit (Macherey-Nagel, Düren) gereinigt. Für die Ligation der hydrolysierten DNA-Fragmente mittels Rapid DNA Ligation-Kit (Thermo Fisher Scientific) wurde das Deletionsfragment in einem dreifachen molaren Überschuss gegenüber dem linearisierten Vektorrückgrat pK19mobsacB eingesetzt. Nach erfolgter Ligation der Fragmente wurden das gesamte Ansatzvolumen für die Transformation chemisch kompetenter E. coli DH5a-Zellen mittels Hitzeschock bei 42 °C für 90 Sekunden verwendet. Im Anschluss an den Hitzeschock wurden die Zellen 90 Sekunden auf Eis regeneriert bevor diese mit 800 pL LB-Medium versehen worden und bei 37 °C in einem Thermomixer (Eppendorf, Hamburg) bei 900 RPM für 60 Minuten regeneriert worden sind. Im Anschluss wurden 100 pL der Zellsuspension auf LB-Agarplatten mit Kanamycin (50 pg/ml) ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die korrekte Assemblierung der Deletionsplasmide in den gewachsenen Transformanden wurde mittels Kolonie-PCR überprüft. Hierfür wurde der 2x DreamTaq Green PCR Master Mix (ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) verwendet. Die DNA-Matrize wurde dem PCR-Ansatz hierbei durch das Hinzufügen von Zellen der gewachsenen Kolonien beigesetzt. Durch den initialen Denaturierungsschritt des PCR-Protokolls bei 95 °C für 3 Minuten werden die Zellen lysiert, sodass die DNA-Matrize freigesetzt wurde und für die DNA-Polymerase zugänglich war. Als DNA-Primer für die Kolonie-PCR wurde das Primerpaar univ / rsp verwendet, welches spezifisch an das pK19mobsacB-Vektorrückgrat bindet und im Falle einer korrekten Ligation der eingesetzten Fragmente ein PCR-Produkt spezifischer Größe bildet, welches per Gelelektrophorese überprüft wurde. Klone, deren PCR-Produkt auf eine korrekte Assemblierung des Deletionsplasmides pK19mobsacB-cg1226-del hindeutet, wurden über Nacht in LB-Medium mit Kanamycin (50 pg/mL) für die Isolierung der Plasmide angezogen. Die Plasmide wurden anschließend mit dem NucleoSpin Plasmid (NoLid)-Kit (Macherey-Nagel, Düren) isoliert und mit den genannten Amplifizierungs-und Kolonie-PCR- Primern sequenziert.

Ein Aliquot elektrokompetenter C. glutamicum-ZeWen wurde mit dem beschriebenen Protokoll mit dem jeweiligen Deletionsplasmid transformiert und auf BHIS-Kan ¹⁵ -Platten ausgestrichen. Da das pK19mobsacB-Plasmid in C. glutamicum nicht replizieren kann, konnte bei der anschließenden Selektion der vermittelten Kanamycin-Resistenz davon ausgegangen werden, dass diese nur ausgebildet wird, falls das Deletionsplasmid erfolgreich über die homologen Sequenzen in das Genom von C. glutamicum integriert werden konnte. Die erhaltenen Integranten wurden in einer ersten Selektionsrunde auf BHI-Kan ²⁵ -Platten sowie BHI 10 % Saccharose (w/v)-Platten ausplattiert und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Bei erfolgreicher Genomintegration des Deletionsplasmids wird neben der Kanamycin-Resistenz die von sacB codierte Levan-Sucrase gebildet. Dieses Enzym katalysiert die Polymerisierung von Saccharose zum toxischen Levan, sodass es zu einer induzierten Letalität bei Wachstum auf Saccharose kommt (Bramucci & Nagarajan, 1996). Demnach sind Kolonien, die das Deletionsplasmid über homologe Rekombination in ihr Genom integriert haben, resistent gegenüber Kanamycin und sensitiv gegenüber Saccharose.

Die Exzision von pK19mobsacB fand in einem zweiten Rekombinationsereignis über die nun doppelt vorliegenden DNA-Bereiche statt, bei dem das zu deletierende Gen aus dem Chromosom letztendlich gegen das eingebrachte Deletionsfragment ausgetauscht wurde. Dazu wurden Zellen, die den beschriebenen Phänotyp (kanamycinresistent, saccharosesensitiv) zeigten, in einem Reagenzglas mit 3 ml BHI-Medium (ohne Zugabe von Kanamycin) für 3 Stunden bei 30 °C und 170 RPM inkubiert. Im Anschluss wurden je 100 μl einer 1 :10-Verdünnung auf BHI-Kan ²⁵ -Platten sowie BHI-10 % Saccharose (wZv)-Platten ausgestrichen und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Insgesamt wurden 50 der auf der BHI 10 % Saccharose (w/v)-Platte gewachsenen Klone ausgewählt und zur Überprüfung der erfolgreichen Exzision von pK19mobsacB auf BHI-Kan ²⁵ sowie BHI 10 % Saccharose (wZv) ausgestrichen und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Sollte das Plasmid vollständig entfernt worden sein, so zeigt sich dies in einer Sensitivität gegenüber Kanamycin und einer Resistenz gegenüber Saccharose des jeweiligen Klons. Das zweite Rekombinationsereignis (Exzision) kann neben der gewünschten Gendeletion auch zur Wiederherstellung der Wildtyp-Situation führen. Die erfolgreiche Deletion in den erhaltenen Klonen nach Exzision wurde über die erwartete Fragmentgröße bei Deletion des Gens oder Genclusters mittels Kolonie-PCR der erhaltenen Klone überprüft. Die verwendeten Primer del-cg1226-s / del-cg1226-as wurden hierbei so gewählt, dass sie im Chromosom außerhalb des deletierten DNA-Bereiches und auch außerhalb der amplifizierten flankierenden Genbereiche binden.

Verwendete Primer up-cg1226-s: CACAAGCTTCCACACGATGAAAATCAATCCGCAG up-cg1226-as: TGCGGTACCCTCGCATATGATATCTCGAGAGCTAATT

GCCACTGGTACGTGGTTCATG down-cg1226-s: AGCTCTCGAGATATCATATGCGAGGGTACCGCAGAC

CTACCACGCTTCGAGGTATAAACGCTC down-cg1226-as: AGTGAATTCCAAGGAAGGCGGTTGCTACTGC del-cg01226-s: TAAATGGTGGAGATACCAAACTGTGAAGC del-cg 1226-as: CGAGTTCTTCTTCGTGTTCGCGATC univ: CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC rsp: CACAGGAAACAGCTATGACCATG

Konstruktion pK19mobsacB-cg3349-54-del

Zur Konstruktion des Plasmides pK19mobsacB-cg3349-54-del (Figur 1e) für die Deletion des Gencluster cg3349-54 in C. glutamicum wurden die für das homologe Rekombinationsereignis benötigten flankierenden Fragmente per PCR ausgehend von isolierter genomischer C. glutamicum DNA amplifiziert.

Für die Generierung des stromaufwärts gelegenen Fragments wurde das Primerpaar del_cg3349-54-up-s / del_cg3349-54-up-as verwendet, die stromabwärts gelegene Flanke wurde mit dem Primerpaar del_cg3349-54-down-s / del_cg3349-54-down-as amplifiziert. Die Überprüfung der generierten DNA-Fragmente auf die erwartete Basenpaargröße wurde mittels gelelektrophoretischer Analyse auf einem 1 % Agarosegel durchgeführt. Die Nukleotidsequenzen der inneren (dem zu deletierenden Gen zugewandten) Primer (del_cg3349-54-up-as / del_cg3349-54-down-s) wurden dabei so gewählt, dass die beiden amplifizierten Fragmente up und down zueinander komplementäre Überhänge enthalten. In einer zweiten PCR (ohne Zugabe von DNA-Primern) lagern sich die gereinigten Fragmente über die komplementären Sequenzen an und dienen sich gegenseitig sowohl als Primer als auch als Matrize (overlap-extension PCR). Das so generierte Deletionsfragment wurde in einer finalen PCR mit den beiden äußeren (dem Gen abgewandten) Primern aus der ersten PCR amplifiziert (del_cg3349-54-up-s / del_cg3349-54-down-as). Nach elektrophoretischer Trennung auf einem 1 % TAE-Agarosegel wurde das finale Deletionsfragment mit dem NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel, Düren) nach dem beiliegenden Protokoll aus dem Gel isoliert. Für die Konstruktion des Deletionsplasmids wurden sowohl das Deletionfragment als auch der pK19-moösacß-Leervektor mit den FastDigest-Varianten (Thermo Fisher Scientific) der Restriktionsenzyme HindIII und BamHI linearisiert. Die Restriktionsansätze der genannten Fragmente wurden mit dem NucleoSpin Gel and PCR Clean-up-Kit (Macherey-Nagel, Düren) gereinigt. Für die Ligation der hydrolysierten DNA-Fragmente mittels Rapid DNA Ligation-Kit (Thermo Fisher Scientific) wurde das Deletionsfragment in einem dreifachen molaren Überschuss gegenüber dem linearisierten Vektorrückgrat pK1 SmobsacB eingesetzt. Nach erfolgter Ligation der Fragmente wurden das gesamte Ansatzvolumen für die Transformation chemisch kompetenter E. coli DH5a-Zellen mittels Hitzeschock bei 42 °C für 90 Sekunden verwendet. Im Anschluss an den Hitzeschock wurden die Zellen 90 Sekunden auf Eis regeneriert bevor diese mit 800 pL LB-Medium versehen worden und bei 37 °C in einem Thermomixer (Eppendorf, Hamburg) bei 900 RPM für 60 Minuten regeneriert worden sind. Im Anschluss wurden 100 pL der Zellsuspension auf LB-Agarplatten mit Kanamycin (50 pg/ml) ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die korrekte Assemblierung der Deletionsplasmide in den gewachsenen Transformanden wurde mittels Kolonie-PCR überprüft. Hierfür wurde der 2x DreamTaq Green PCR Master Mix (ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) verwendet. Die DNA-Matrize wurde dem PCR-Ansatz hierbei durch das Hinzufügen von Zellen der gewachsenen Kolonien beigesetzt. Durch den initialen Denaturierungsschritt des PCR-Protokolls bei 95 °C für 3 Minuten werden die Zellen lysiert, sodass die DNA-Matrize freigesetzt wurde und für die DNA-Polymerase zugänglich war. Als DNA-Primer für die Kolonie-PCR wurde das Primerpaar univ / rsp verwendet, welches spezifisch an das pK19mobsacB-Vektorrückgrat bindet und im Falle einer korrekten Ligation der eingesetzten Fragmente ein PCR-Produkt spezifischer Größe bildet, welches per Gelelektrophorese überprüft wurde. Klone, deren PCR-Produkt auf eine korrekte Assemblierung des Deletionsplasmides pK19mobsacB-cg3349-54-del hindeutet, wurden über Nacht in LB-Medium mit Kanamycin (50 pg/mL) für die Isolierung der Plasmide angezogen. Die Plasmide wurden anschließend mit dem NucleoSpin Plasmid (NoLid)-Kit (Macherey-Nagel, Düren) isoliert und mit den genannten Amplifizierungs-und Kolonie-PCR-Primern sequenziert.

Ein Aliquot elektrokompetenter C. glutamicum-Zellen wurde mit dem beschriebenen Protokoll mit dem jeweiligen Deletionsplasmid transformiert und auf BHIS-Kan ¹⁵ -Platten ausgestrichen. Da das pK19mobsacB-Plasmid in C. glutamicum nicht replizieren kann, konnte bei der anschließenden Selektion der vermittelten Kanamycin-Resistenz davon ausgegangen werden, dass diese nur ausgebildet wird, falls das Deletionsplasmid erfolgreich über die homologen Sequenzen in das Genom von C. glutamicum integriert werden konnte. Die erhaltenen Integranten wurden in einer ersten Selektionsrunde auf BHI-Kan ²⁵ -Platten sowie BHI 10 % Saccharose (w/v)-Platten ausplattiert und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Bei erfolgreicher Genomintegration des Deletionsplasmids wird neben der Kanamycin-Resistenz die von sacB codierte Levan-Sucrase gebildet. Dieses Enzym katalysiert die Polymerisierung von Saccharose zum toxischen Levan, sodass es zu einer induzierten Letalität bei Wachstum auf Saccharose kommt (Bramucci & Nagarajan, 1996). Demnach sind Kolonien, die das Deletionsplasmid über homologe Rekombination in ihr Genom integriert haben, resistent gegenüber Kanamycin und sensitiv gegenüber Saccharose.

Die Exzision von pK19mobsacB fand in einem zweiten Rekombinationsereignis über die nun doppelt vorliegenden DNA-Bereiche statt, bei dem das zu deletierende Gen aus dem Chromosom letztendlich gegen das eingebrachte Deletionsfragment ausgetauscht wurde. Dazu wurden Zellen, die den beschriebenen Phänotyp (kanamycinresistent, saccharosesensitiv) zeigten, in einem Reagenzglas mit 3 ml BHI-Medium (ohne Zugabe von Kanamycin) für 3 Stunden bei 30 °C und 170 RPM inkubiert. Im Anschluss wurden je 100 μl einer 1 :10-Verdünnung auf BHI-Kan ²⁵ -Platten sowie BHI-10 % Saccharose (w/v)-Platten ausgestrichen und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Insgesamt wurden 50 der auf der BHI 10 % Saccharose (w/v)-Platte gewachsenen Klone ausgewählt und zur Überprüfung der erfolgreichen Exzision von pK19mobsacB auf BHI-Kan ²⁵ sowie BHI 10 % Saccharose (wZv) ausgestrichen und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Sollte das Plasmid vollständig entfernt worden sein, so zeigt sich dies in einer Sensitivität gegenüber Kanamycin und einer Resistenz gegenüber Saccharose des jeweiligen Klons. Das zweite Rekombinationsereignis (Exzision) kann neben der gewünschten Gendeletion auch zur Wiederherstellung der Wildtyp-Situation führen. Die erfolgreiche Deletion in den erhaltenen Klonen nach Exzision wurde über die erwartete Fragmentgröße bei Deletion des Gens oder Genclusters mittels Kolonie-PCR der erhaltenen Klone überprüft. Die verwendeten Primer check-cg3349-54-s / check-cg3349-54- as wurden hierbei so gewählt, dass sie im Chromosom außerhalb des deletierten DNA-Bereiches und auch außerhalb der amplifizierten flankierenden Genbereiche binden.

Verwendete Primer: del_cg3349-54-up-s: ACCAAGCTTCATTTTCTAGTTGAGATTCATTATCATAACG

CTTGACAGTACAACTATGTC del_cg3349-54-up-as: GCTTCCGGGGTGAATGACGGAGCCGCTGCGGAGGTTCCA

GAGCCACCGCGCTG del_cg3349-54-down-s: CGCAGCGGCTCCGTCATTCACCCCGGAAGCTGGCGCTAC

GCCCTCCTCGAAC del_cg3349-54-down-as: ACCTCTAGATTTCTGTCTTGAGGGTTCGTGGGGGCTG check-cg3349-54-s: AAAGGCTCCATGAATTCCTCACGGAGGATCTC check-cg3349-54-as: ACATCACAAGTAGAAACCCGCATTTTCTGTAGTTTTTAC univ: CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC rsp: CACAGGAAACAGCTATGACCATG Veränderung der regulatorischen Bindestelle im Promotorbereich der Citratsynthase CS durch Nukleotidsubstitutionen zur Integration in das Genom coryneformer Bakterienzellen

Klonierung pK19mobsacB-540-del und pK19mobsacB-PgltA::PdapA-C7

Zur Konstruktion des Plasmids pK19mobsacB-PgltA::PdapA-C7 (Figur 2b) wurde zunächst das Plasmid pK19mobsacB-540-del (Figur 2a) konstruiert. Hier wurden die flankierenden Bereiche so gewählt, dass ein 540 Basenpaar großes chromosomales Fragment, welches die native g/tA Promotorregion mit den zwei Transkriptionsstart- und Operatorsequenzen trägt, deletiert werden kann. Zwischen die beiden Flanken up und down wurde ein 20 Basenpaar großer Linker eingefügt, der über die Schnittstellen Nsil und Xhol verfügt. Über diese Schnittstellen wurde anschließend die C7-Variante des dapA-Promotors subkloniert.

Für die Klonierung von pK19mobsacB-540-del wurde das stromaufwärts gelegenen Fragment up mit dem Primerpaar PgltA-up-s / PgltA-up-as amplifiziert, die stromabwärts gelegene Flanke wurde mit dem Primerpaar PgltA-down-s / PgltA-down-as amplifiziert. Die Überprüfung der generierten DNA-Fragmente auf die erwartete Basenpaargröße wurde mittels gelelektrophoretischer Analyse auf einem 1 % Agarosegel durchgeführt. Die Nukleotidsequenzen der inneren Primer (PgltA-up-as / PgltA-down-s) wurden dabei so gewählt, dass die beiden amplifizierten Fragmente up und down zueinander komplementäre Überhänge enthalten (inklusive des beschriebenen NsiI/Xhol-Linkers. In einer zweiten PCR (ohne Zugabe von DNA-Primern) lagern sich die gereinigten Fragmente über die komplementären Sequenzen an und dienen sich gegenseitig sowohl als Primer als auch als Matrize (overlap-extension PCR). Das so generierte A540-fragment wurde in einer finalen PCR mit den beiden äußeren (dem Gen abgewandten) Primern aus der ersten PCR amplifiziert (PgltA-up-s / PgltA-down-as). Nach elektrophoretischer Trennung auf einem 1 % TAE-Agarosegel wurde das finale Mutationsfragment mit dem NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel, Düren) nach dem beiliegenden Protokoll aus dem Gel isoliert. Für die Konstruktion von pK19mobsacB-540-del wurden sowohl das generierte A540-Fragment als auch der pK19mobsacB-Leervektor mit den FastDigest-Varianten (Thermo Fisher Scientific) der Restriktionsenzyme Xba\ und Smal verdaut. Die Restriktionsansätze der genannten Fragmente wurden mit dem NucleoSpin Gel and PCR Clean-up-Kit (Macherey-Nagel, Düren) gereinigt. Für die Ligation der hydrolysierten DNA-Fragmente mittels Rapid DNA Ligation-Kit. (Thermo Fisher Scientific) wurde das Deletionsfragment in einem dreifachen molaren Überschuss gegenüber dem linearisierten Vektorrückgrat pK19mobsacB eingesetzt. Nach erfolgter Ligation der Fragmente wurden das gesamte Ansatzvolumen für die Transformation chemisch kompetenter E. coli DH5a-Zellen mittels Hitzeschock bei 42 °C für 90 Sekunden verwendet. Im Anschluss an den Hitzeschock wurden die Zellen 90 Sekunden auf Eis regeneriert bevor diese mit 800 pL LB-Medium versehen worden und bei 37 °C in einem Thermomixer (Eppendorf, Hamburg) bei 900 RPM für 60 Minuten regeneriert worden sind. Im Anschluss wurden 100 pL der Zellsuspension auf LB-Agarplatten mit Kanamycin (50 pg/ml) ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die korrekte Assemblierung von pK19mobsacB-540-del in den gewachsenen Transformanden wurde mittels Kolonie-PCR überprüft. Hierfür wurde der 2x DreamTaq Green PCR Master Mix (ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) verwendet. Die DNA-Matrize wurde dem PCR-Ansatz hierbei durch das Hinzufügen von Zellen der gewachsenen Kolonien beigesetzt. Durch den initialen Denaturierungsschritt des PCR-Protokolls bei 95 °C für 3 Minuten werden die Zellen lysiert, sodass die DNA-Matrize freigesetzt wurde und für die DNA-Polymerase zugänglich war. Als DNA-Primer für die Kolonie-PCR wurde das Primerpaar univ / rsp verwendet, welches spezifisch an das pK19mobsacB-Vektorrückgrat bindet und im Falle einer korrekten Ligation der eingesetzten Fragmente ein PCR-Produkt spezifischer Größe bildet, welches per Gelelektrophorese überprüft wurde. Klone, deren PCR-Produkt auf eine korrekte Assemblierung von pK19mobsacB-540-del hindeutet, wurden über Nacht . in LB-Medium mit Kanamycin (50 pg/mL) für die Isolierung der Plasmide angezogen. Die Plasmide wurden anschließend mit dem NucleoSpin Plasmid (NoLid)-Kit (Macherey-Nagel, Düren) isoliert und mit den genannten Amplifizierungs-und Kolonie-PCR-Primern sequenziert.

Für die Konstruktion von pK19mobsacB-PgltA::PdapA-C7 wurde die C7-Variante des dapA-Promotors mit dem Primerpaar PdapA-s / PdapA-as amplifiziert und auf die erwartete Basenpaargröße mittels gelelektrophoretischer Analyse auf einem 1 % Agarosegel überprüft. Das generierte Fragment wurde mit dem NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel, Düren) nach dem beiliegenden Protokoll gereinigt. Für die Konstruktion von pK19mobsacB-PgltA::PdapA-C7 wurden sowohl das generierte PdapA-Fragment als auch der Zielvektor pK19mobsacB-540-del mit den FastDigest-Varianten (Thermo Fisher Scientific) der Restriktionsenzyme Xhol und Nsi\ verdaut. Die Restriktionsansätze der genannten Fragmente wurden mit dem NucleoSpin Gel and PCR Clean-up-Kit (Macherey-Nagel, Düren) gereinigt. Für die Ligation der hydrolysierten DNA-Fragmente mittels Rapid DNA Ligation-Kit (Thermo Fisher Scientific) wurde das PdapA-Fragment in einem dreifachen molaren Überschuss gegenüber dem linearisierten Vektorrückgrat pK19mobsacB-540-del eingesetzt. Nach erfolgter Ligation der Fragmente wurden das gesamte Ansatzvolumen für die Transformation chemisch kompetenter E. coli DH5a-Zellen mittels Hitzeschock bei 42 °C für 90 Sekunden verwendet. Im Anschluss an den Hitzeschock wurden die Zellen 90 Sekunden auf Eis regeneriert bevor diese mit 800 pL LB-Medium versehen worden und bei 37 °C in einem Thermomixer (Eppendorf, Hamburg) bei 900 RPM für 60 Minuten regeneriert worden sind. Im Anschluss wurden 100 pL der Zellsuspension auf LB-Agarplatten mit Kanamycip (50 pg/ml) ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die korrekte Assemblierung von pK19mobsacB-PgltA::PdapA-C7 in den gewachsenen Transformanden wurde mittels Kolonie- PCR überprüft. Hierfür wurde der 2x DreamTaq Green PCR Master Mix (ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) verwendet. Die DNA-Matrize wurde dem PCR-Ansatz hierbei durch das Hinzufügen von Zellen der gewachsenen Kolonien beigesetzt. Durch den initialen Denaturierungsschritt des PCR-Protokolls bei 95 °C für 3 Minuten werden die Zellen lysiert, sodass die DNA-Matrize freigesetzt wurde und für die DNA-Polymerase zugänglich war. Als DNA-Primer für die Kolonie-PCR wurde das Primerpaar univ / rsp verwendet, welches spezifisch an das pK19mobsacB-Vektorrückgrat bindet und im Falle einer korrekten Ligation der eingesetzten Fragmente ein PCR-Produkt spezifischer Größe bildet, welches per Gelelektrophorese überprüft wurde. Klone, deren PCR-Produkt auf eine korrekte Assemblierung von pK19mobsacB-PgltA::PdapA-C7 hindeutet, wurden über Nacht in LB-Medium mit Kanamycin (50 pg/mL) für die Isolierung der Plasmide angezogen. Die Plasmide wurden anschließend mit dem NucleoSpin Plasmid (NoLid)-Kft. (Macherey-Nagel, Düren) isoliert und mit den genannten Amplifizierungs-und Kolonie-PCR-Primern sequenziert.

Ein Aliquot elektrokompetenter C. glutamicum-Zellen wurde mit dem beschriebenen Protokoll mit pK19mobsacB-PgltA::PdapA-C7 transformiert und auf BHIS-Kan ¹⁵ -Platten ausgestrichen. Da das pK19mobsacB-Plasmid in C. glutamicum nicht replizieren kann, konnte bei der anschließenden Selektion der vermittelten Kanamycin-Resistenz davon ausgegangen werden, dass diese nur ausgebildet wird, falls das Mutationsplasmid erfolgreich über die homologen Sequenzen in das Genom von C. glutamicum integriert werden konnte. Die erhaltenen Integranten wurden in einer ersten Selektionsrunde auf BHI-Kan ²⁵ -Platten sowie BHI 10 % Saccharose (w/v)-Platten ausplattiert und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Bei erfolgreicher Genomintegration des Mutationsplasmides wird neben der Kanamycin-Resistenz die von sacB codierte Levan-Sucrase gebildet. Dieses Enzym katalysiert die Polymerisierung von Saccharose zum toxischen Levan, sodass es zu einer induzierten Letalität bei Wachstum auf Saccharose kommt (Bramucci & Nagarajan, 1996). Demnach sind Kolonien, die das Mutationsplasmid über homologe Rekombination in ihr Genom integriert haben, resistent gegenüber Kanamycin und sensitiv gegenüber Saccharose.

Die Exzision von pK19mobsacB fand in einem zweiten Rekombinationsereignis über die nun doppelt vorliegenden DNA-Bereiche statt, bei dem das zu mutierende Codon aus dem Chromosom letztendlich gegen das eingebrachte Mutationsfragment ausgetauscht wurde. Dazu wurden Zellen, die den beschriebenen Phänotyp (kanamycinresistent, saccharosesensitiv) zeigten, in einem Reagenzglas mit 3 ml BHI-Medium (ohne Zugabe von Kanamycin) für 3 Stunden bei 30 °C und 170 RPM inkubiert. Im Anschluss wurden je 100 μl einer 1 :10-Verdünnung auf BHI-Kan ²⁵ -Platten sowie BHI-10 % Saccharose (w/v)-Platten ausgestrichen und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Insgesamt wurden 50 der auf der BHI 10 % Saccharose (wZv)-Platte gewachsenen Klone ausgewählt und zur Überprüfung der erfolgreichen Exzision von pK19mobsacB auf BHI-Kan ²⁵ sowie BHI 10 % Saccharose (w /v) ausgestrichen und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Sollte das Plasmid vollständig entfernt worden sein, so zeigt sich dies in einer Sensitivität gegenüber Kanamycin und einer Resistenz gegenüber Saccharose des jeweiligen Klons. Das zweite Rekombinationsereignis (Exzision) kann neben der gewünschten Mutation auch zur Wiederherstellung der Wildtyp-Situation führen. Für den Nachweis des erfolgreichen Austausches in den erhaltenen Klonen nach Exzision wurde der entsprechende genomische Bereich per Kolonie-PCR amplifiziert (Primerpaar chk-PgltA-s / chk-PgltA-as) und auf die erwartete Fragmentgröße mittels Gelektrophorese überprüft. PCR-Produkte, die einen Promotor-Austausch anzeigen, wurden mit dem NucleoSpin Gel and PCR Clean-up-Kit (Macherey-Nagel, Düren) gereinigt und zur Verifikation des Austausches mit den Primern chk- PgltA-s und chk-PgltA-as sequenziert.

Die erfindungsgemäße Promotorregion PgltA::PdapA-C7 weist neben dem Austausch der Promotorregion von gtlA gegen dapA zusätzlich Nukleotidsubstitutionen an Position 70 (a->t) und 71 (g->a) vor dem Startcodon ATG auf (Figur 2c Sequenzvergleich Promotorregion).

Verwendete Primer

PgltA-up-s: TGCTCTAGAGCATGAACTGGGACTTGAAG

PgltA-up-as: TATGCATGTTTCTCGAGTGGGCCGAACAAATATGTTTGAAAGG

PgltA-down-s: CCCACTCGAGAAACATGCATAGCGTTTTCAATAGTTCGGTGTC

PgltA-down-as: CCCCCCGGGGGGCCTAGGGAAAGGATGATCTCGTAGCC

PdapA-s: CCAATGCATTGGTTCTGCAGTTATCACACCCAAGAGCTAAAAAT

TCA

PdapA-as: CCGCTCGAGCGGCTCCGGTCTTAGCTGTTAAACCT chk-PgltA-s: ATGAGTCCGAAGGTTGCTGCAT chk-PgltA-as: TCGAGTGGGTTCAGCTGGTCC univ: CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC rsp: CACAGGAAACAGCTATGACCATG

Veränderung der regulatorischen Bindestelle im Promotorbereich des /Wyo-Inositol- Trans porters lolT1 durch Nukleotidsubstitutionen in C. qlutamicum

Konstruktion des Vektors pM mobsacB PoeiolTI C. glutamicum ATCC13032 Poe iolT1 wurden nach Niebisch und Bott (2001) (https://doi.org/10.1007/s002030100262) mit dem Vektor pK19mobsacB über doppelt homologe Rekombination (Schäfer et al., 1994) (https.//doi.orq/10.1016/0378-1119(94)90324-7) konstruiert. Dazu wurden in einem ersten Schritt zwei PCR-Produkte generiert, die die 5’- Region vor dem iolT1 -Gens (Primer: PromiolT1_fw_fw / PromiolT1fw_rev) mit den zwei auszutauschenden Nucleotiden bzw. die 3’-Region des Gens (Primer: Piolt1_rev_fw / Piolt1_rev_rev) enthielten. Für die spätere homologe Rekombination wurden jeweils 500 Basenpaare der flankierenden Regionen amplifiziert. Im zweiten Schritt wurden die DNA-Fragmente zusammen mit dem bereits über die Restriktionsendonucleasen Xbal und EcoRI geschnittenen p19mobsacB- Vektor mittels Gibson Assembly fusioniert (Gibson et al., 2009) (https://doi.org/10.1038/NMETH.1318). Dieses so erhaltene Plasmid pK19mobsacB_PoeiolT1 (Fig. 3) wurde mittels Hitzeschock in E. coli DH5a transformiert. Durch das auf dem Plasmid vorliegenden Kanamycinresistenzgen, konnten nur solche Klone wachsen, die das Plasmid aufgenommen hatten. Diese wurden mittels Kolonie-PCR und anschließender Gelelektrophorese auf Vorhandensein des klonierten Inserts überprüft, und dessen DNA-Sequenz bestimmt. Nach Isolierung des Plasmids wurde ein 150 pL Aliquot elektrokompetenter C. glutamicum Zellen auf Eis aufgetaut, dieses mit 1-4,5 pg des Plasmids vermischt und in eine auf Eis vorgekühlte 0,2 cm Elektroporationsküvette überführt. Die Mixtur wurde mit 800 pL, 4 °C kaltem, 10 %igem Glycerin (v/v) überschichtet und im Elektroporator (2500 V, 25 pF, 200 Ω, 2 mm elektroporiert. Nach der Elektroporation wurde die Mixtur in 4 mL, auf 46 °C vorgewärmtem, BHIS Medium überführt und für 6 min bei 46 °C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen für zwei Stunden bei 30 °C mit 170 Upm inkubiert und die Suspension auf BHIS-Kan15-Agar ausplattiert. Anschließend wurde die Funktion des sacB-Gens getestet, indem die Klone auf BHI-Kan25-Agar und auf BHI-Kan25-Agar mit 10%- Saccharose übertragen wurden. Zur Selektion auf erfolgreiche Exzision bei einem zweiten Rekombinationsereignis, wurden die auf BHI-Kan25 kultivierten Zellen für ca. 5 h in 5 ml BHI-Medium kultiviert und 100 pl der Kultur und einer 1 :10-Verdünnung auf BHI-Agar mit 10 % Saccharose ausplattiert. Die Klone wurden auf BHI-Kan25-Agar und BHI-Agar mit 10 % Saccharose übertragen. Von den Saccharoseresistenten und Kanamycin-sensitiven Klonen wurde eine Kolonie-PCR (Primer: checkPromiolTlfw/ checkPromiolTlrev) mit anschließender DNA-Sequenzierung durchgeführt, um die erfolgreiche Nukelotidsubstitutionen zu bestätigen.

Verwendete Primer:

PromiolT1_fw_fw : TGCATGCCTGCAGGTCGACTGAAAAATTGATCAGCAAACACC PromiolTI fw_rev: GGCAGACACGATATCCCCCGTCAATCGTACATAGGGAA Piolt1_rev_fw: CGGGGGATATCGTGTCTGCCACGATTAAAG piolt1_rev_rev: TTGTAAAACGACGGCCAGTGGAGTCCAAGAAGCACACG checkPromiolTlfw: TACGAATGCCCACTTCGCACCCTT checkPromiolTI rev: CAACTCATTACGGCCAGCCAGTGAGC

Konstruktion des Expressionsplasmids pMKEX2 aroF* qsuB

Zur Konstruktion des Plasmides pMKEX2_aroF*_qsuB (Figur 4) für die Expression der Gene aroF* aus Escherichia coli und qsuB aus C. glutamicum wurden die beiden Gene als für C. glutamicum codon-optimierte Genvarianten von GeneArt Gene Synthesis (Thermo Fisher Scientific) chemisch als String DNA Fragment synthetisiert und als DNA-Template für die Amplifikation per PCR verwendet. Die Gene aroF* und qsuB wurden per PCR mit dem Primerpaar aroF*-s / aroF*-as bzw. qsuB-s / qsuB-as, welches spezifisch für das jeweilige Gen ist, amplifiziert. Die Überprüfung der generierten DNA-Fragmente auf die erwartete Basenpaargröße wurde mittels gelelektrophoretischer Analyse auf einem 1 % Agarosegel durchgeführt. Für die Konstruktion des Plasmides pMKEX2_aroF_qsuB wurde das Plasmid pMKEx2 mit den FastDigest-Varianten (Thermo Fisher Scientific) der Restriktionsenzyme Nco\ und BamHI linearisiert. Die mit den gegebenen Primerpaaren amplifizierten Gene aroF* und qsuB wurden mit den Restriktionsenzymen Nco\ und Kpn\ bzw. Kpn\ und BamHI hydrolysiert. Die Restriktionsansätze der genannten Fragmente wurden mit dem NucleoSpin Gel and PCR Clean-up-Kit (Macherey-Nagel, Düren) gereinigt. Für die Ligation der hydrolysierten DNA-Fragmente mittels Rapid DNA Ligation-Kit (Thermo Fisher Scientific) wurden die beiden Inserts aroF* und qsuB in einem dreifachen molaren Überschuss gegenüber dem linearisierten Vektorrückgrat pMKEx2 eingesetzt. Nach erfolgter Ligation der Fragmente wurden das gesamte Ansatzvolumen für die Transformation chemisch kompetenter E. coli DH5a-Zellen mittels Hitzeschock bei 42 °C für 90 Sekunden verwendet. Im Anschluss an den Hitzeschock wurden die Zellen 90 Sekunden auf Eis regeneriert bevor diese mit 800 pL LB-Medium versehen worden und bei 37 °C in einem Thermomixer (Eppendorf, Hamburg) bei 900 RPM für 60 Minuten regeneriert worden sind. Im Anschluss wurden 100 pL der Zellsuspension auf LB-Agarplatten mit Kanamycin (50 pg/ml) ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die korrekte Assemblierung der eingesetzten Fragmente in den gewachsenen Transformanden wurde mittels Kolonie-PCR überprüft. Hierfür wurde der 2x DreamTaq Green PCR Master Mix (ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) verwendet. Die DNA-Matrize wurde dem PCR-Ansatz hierbei durch das Hinzufügen von Zellen der gewachsenen Kolonien beigesetzt. Durch den initialen Denaturierungsschritt des PCR-Protokolls bei 95 °C für 3 Minuten werden die Zellen lysiert, sodass die DNA-Matrize freigesetzt wurde und für die DNA-Polymerase zugänglich war. Als DNA-Primer für die Kolonie-PCR wurde das Primerpaar chk_pMKEx2_s / chk_pMKEx2_as verwendet, welches spezifisch an das pMKEx2-Vektorrückgrat bindet und im Falle einer korrekten Ligation der eingesetzten Fragmente ein PCR-Produkt spezifischer Größe bildet, welches per Gelelektrophorese überprüft wurde. Klone, deren PCR-Produkt auf eine korrekte Assemblierung des Plasmides pMKEX2_aroF*_qsuB hindeutet, wurden über Nacht in LB-Medium mit Kanamycin (50 pg/mL) für die Isolierung der Plasmide angezogen. Die Plasmide wurden anschließend mit dem NucleoSpin Plasmid (NoLid)-Kit (Macherey-Nagel, Düren) isoliert und mit den genannten Amplifizierungs-und Kolonie-PCR-Primern sequenziert.

Verwendete PrimeraroF*-s

TTCGCTCTTCAAAGCTGCTTAAGGAGGCTATCTATGACCGATGA ACAGGTGCTGATGACCCCAG aroF*-as TACGCTCTTCTGATTTATGCCACGCGTGCGGTCAGCTG qsuB-s TTCGCTCTTCAATCTCTATCAAGGAGGATCGGCATGCGTACATC

CATTGCCACTGTTTGTTTGTC qsuB-as TACGCTCTTCTTCGTTAGTTTGGGATTCCCCGCTCGAGGTC chk_pMKEx2-s: CCCTCAAGACCCGTTTAGAGGC chk_pMKEx2-as: TTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGC

Konstruktion des Expressionsplasmids pEKEX3 tkt

Zur Konstruktion des Plasmides pEKEx3- tkt (Figur 5) für die Expression des tkt Gens aus C. glutamicum wurde das Gen per PCR amplifiziert. Für die tkt-Amplifikation per PCR wird genomische DNA von C. glutamicum isoliert und mit dem Primerpaar tkt’-s / ‘tkt-as spezifisch amplifiziert. Die Überprüfung des generierten DNA-Fragmentes auf die erwartete Basenpaargröße wird mittels gelelektrophoretischer Analyse auf einem 1 % Agarosegel durchgeführt. Für die Konstruktion des Plasmides pEKEx3-tkt wird das Plasmid pEKEx3 mit den FastDigest- Varianten (Thermo Fisher Scientific) der Restriktionsenzyme BamHI und EcoRI linearisiert. Das amplifizierte tkt-Gen wird mit den Restriktionsenzymen BamHI und EcoRI hydrolysiert. Die Restriktionsansätze der genannten Fragmente werden mit dem NucleoSpin Gel and PCR Clean-up-Kit (Macherey-Nagel, Düren) gereinigt. Für die Ligation der hydrolysierten DNA-Fragmente mittels Rapid DNA Ligation-Kit (Thermo Fisher Scientific) wird das tkt-insert einem dreifachen molaren Überschuss gegenüber dem linearisierten Vektorrückgrat pEKEx3 eingesetzt. Nach erfolgter Ligation der Fragmente werden das gesamte Ansatzvolumen für die Transformation chemisch kompetenter E. coli DH5a-Zellen mittels Hitzeschock bei 42 °C für 90 Sekunden verwendet. Im Anschluss an den Hitzeschock werden die Zellen 90 Sekunden auf Eis regeneriert bevor diese mit 800 pL LB-Medium versehen werden und bei 37 °C in einem Thermomixer (Eppendorf, Hamburg) bei 900 RPM für 60 Minuten regeneriert werden. Im Anschluss wurden 100 μL der Zellsuspension auf LB-Agarplatten mit Spectinomycin (100 pg/ml) ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die korrekte Assemblierung der eingesetzten Fragmente in den gewachsenen Transformanden wird mittels Kolonie-PCR überprüft. Hierfür wird der 2x DreamTaq Green PCR Master Mix (ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) verwendet. Die DNA-Matrize wurde dem PCR-Ansatz hierbei durch das Hinzufügen von Zellen der gewachsenen Kolonien beigesetzt. Durch den initialen Denaturierungsschritt des PCR-Protokolls bei 95 °C für 3 Minuten werden die Zellen lysiert, sodass die DNA-Matrize freigesetzt wird und für die DNA-Polymerase zugänglich ist. Als DNA-Primer für die Kolonie- PCR wird das Primerpaar chk_pEKEx3_s / chk_pEKEx3_as verwendet, welches spezifisch an das pEKEx3-Vektorrückgrat bindet und im Falle einer korrekten Ligation der eingesetzten Fragmente ein PCR-Produkt spezifischer Größe bildet, welches per Gelelektrophorese überprüft wird. Klone, deren PCR-Produkt auf eine korrekte Assemblierung des Plasmides pEKEx3-tkt hindeutet, wurden über Nacht in LB-Medium mit Spectinomycin (100 pg/mL) für die Isolierung der Plasmide angezogen. Die Plasmide werden anschließend mit dem NucleoSpin Plasmid (NoLid)-Kit (Macherey-Nagel, Düren) isoliert und mit den genannten Amplifizierungs-und Kolonie-PCR-Primern sequenziert. Das Plasmid ist in Figur 5 dargestellt.

Verwendete Primer: tkt'-s: CATGGATCCAAGGAGGTTCAGCATGACCACCTTGACGCTGTC

ACCTGAACTTCAG

‘tkt-as: TCTGAATTCTTAACCGTTAATGGAGTCCTTGGCCGCTGCCAC chk_pEKEx3_s: GCAAATATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATC chk_pEKEx3_as: CGTTCTGATTTAATCTGTATCAGGCTGAAAATCTTCTC

Deletion der Pyruvat-Kinase (PK) in Corynebacterium glutamicum

C. glutamicum DelAro ⁵ -C7 P _O6 iolT1 Δpyk wurde nach Niebisch und Bott (2001) mit dem Vektor pK19mobsacB (Schäfer et al., 1994) konstruiert. Im ersten Schritt wurden zwei PCR-Produkte generiert, die die 5’- Region vor dem pyk-Gen mit den zwei deletierten Nucleotiden (Primer K0115_p9 und K0115_p2) bzw. die 3’-Region des Gens (Primer K0115_p3 und K0115_p4) enthielten. Dabei wurden für die spätere homologe Rekombination jeweils 500 Basenpaare der flankierenden Regionen amplifiziert. Zusätzlich enthielten die jeweiligen Primer Homologien zu den weiteren PCR-Produkten. Im zweiten Schritt wurden die DNA-Fragmente zusammen mit dem bereits zuvor verdauten pk19mobsacB-Vektor blunt-end kloniert. Dieses so erhaltene Plasmid pK19mobsacB_ pyk (Fig. 6) wurde mittels Hitzeschock in E. coli DH5a transformiert. Durch das auf dem Plasmid vorliegende Kanamycinresistenz-Gen, konnten nur solche Klone wachsen, die das Plasmid aufgenommen hatten. Diese wurden mittels Kolonie-PCR und anschließender Gelelektrophorese auf Vorhandensein des Monierten Inserts überprüft, und dessen Sequenz sequenziert (Primer dpyk_proof_fwd und dpyk_proof_rev). Nach Isolierung des Plasmids wurde ein 150 pL Aliquot elektrokompetenter C. glutamicum Zellen auf Eis aufgetaut, dieses mit 1-4,5 pg des Plasmids vermischt und in eine auf Eis vorgekühlte 0,2 cm Elektroporationsküvetten überführt. Die Mixtur wurde mit 800 pL, 4 °C kaltem, 10 %igem Glycerin (v/v) überschichtet und im Elektroporator (2500 V, 25 pF, 200 Ω, 2 mm) elektroporiert. Nach der Elektroporation wurde die Mixtur in 4 mL, auf 46 °C vorgewärmtem, BHIS Medium überführt und für 6 min bei 46 °C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen für zwei Stunden bei 30 °C mit 170 Upm inkubiert. Die Suspension wurde anschließend auf BHIS-Kan15-Agar ausplattiert. Anschließend wurde die Funktion des sacB-Gens getestet, indem die Klone auf BHI-Kan25-Agar und auf BHI-Kan25-Agar mit 10%- Saccharose übertragen wurden. Zur Selektion auf ein zweites Rekombinationsereignis, die Exzision, bei der das Plasmid aus dem Genom entfernt werden sollte, wurden die auf BHI-Kan25 gewachsenen Klone für ca. 5 h in 5 ml BHI-Medium kultiviert und 100 pl der Kultur und einer 1 :10-Verdünnung auf BHI-Agar mit 10% Saccharose ausplattiert. Die gewachsenen Klone wurden auf BHI-Kan25-Agar und BHI-Agar mit 10% Saccharose übertragen. Von den Saccharose-resistenten und Kanamycin-sensitiven Klonen wurde eine Kolonie-PCR mit anschließender Sequenzierung durchgeführt, um die erfolgreiche Deletion zu überprüfen.

K0115_p9 CGACGCGAAGGCTAACTGCATCCATG

K0115_p2 AGACGGCATGGATTCACGTCCACCTTCTTG

K0115_p3 ACGTGAATCCATGCCGTCTTCTACCAAAC

K0115_p4 GGCATCCGAATCAACACCATC dpyk_proof_fwd GAAGAGTAGTAACTAGTCATAC dpyk_proof_rev ACAAATGCGCGTTGATGAAGC Plasmid-basierte Expression der Xylose-Isomerase (XylA) und Xylulose-Kinase (XylB) in C. qlutamicum

Im ersten Schritt wurde die genomische DNA von C. glutamicum als PCR-Vorlage für die Amplifikation von xylB durch Lösen von Zellen in 50 pL 2 %igem DMSO und anschließendem erhitzen auf 95 °C für 5 min gewonnen. Die Zellsuspension wurde für

1 min bei 11.000 Upm zentrifugiert und 3 pL des Überstandes als Template zur Amplifikation von xylB (Primer xylB_fw_Cgl und xylB_rv_Cgl) verwendet. Für die Amplifikation von xylA wurde genomische DNA aus Xanthomonas campestris pv.campestris ATCC33913 als Vorlage in die PCR-Reaktion eingesetzt und die Primer xylA_fw_Xcc xylA_rv_Xcc verwendet. Die Amplifikate wurde zusammen mit dem bereits zuvor geschnittenen pEKEx3 Vektor mittels Restriktionsklonierung ligiert (pEKEx3_xylA-xylB; Fig. 7). Dieses so erhaltene Plasmid wurde mittels Hitzeschock in E. coli DH5a transformiert. Durch das auf dem Plasmid vorliegenden Spectinomycinresistenzgen, konnten nur solche Klone wachsen, die das Plasmid aufgenommen hatten. Diese wurden mittels Kolonie-PCR und anschließender Gelelektrophorese auf Vorhandensein des Monierten Inserts überprüft, und dessen Sequenz sequenziert (Primer: pEKEx-for2 und pEKEx-rv2). Nach Isolierung des Plasmids wurde ein 150 pL Aliquot elektrokompetenter C. glutamicum Zellen auf Eis aufgetaut, dieses mit 1-4,5 pg des Plasmids vermischt und in eine auf Eis vorgekühlte 0,2 cm Elektroporationsküvetten überführt. Die Mixtur wurde mit 800 pL, 4 °C kaltem, 10 %igem Glycerin (v/v) überschichtet und im Elektroporator (2500 V, 25 pF, 200 Ω,

2 mm) elektroporiert. Nach der Elektroporation wurde die Mixtur in 4 mL, auf 46 °C vorgewärmtem, BHIS Medium überführt und für 6 min bei 46 °C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen für zwei Stunden bei 30 °C mit 170 Upm inkubiert. Die Suspension wurde anschließend auf BHI-Spc100-Agar ausplattiert. xylB_fw_Cgl GAGAAAGGAGGCCCTTCAGATGGCTTTGGTTCTTGGAATCG xylB_rv_Cgl GATCTAGACTAGTACCAACCCTGCGTTG xylA_fw_Xcc

GATCTAGAGAAAGGAGGCCCTTCAGATGAGCAACACCGTTTTCATCG xylA_rv_Xcc GAGAGCTCTCAACGCGTCAGGTACTGATT pEKEx-for2 CGGCGTTTCACTTCTGAGTTCGGC pEKEx-rv2 GATATGACCATGATTACGCCAAGC Medium und Kultivierunqsbedinqunqen

Alle Stämme wurden aerob bei 30°C in BHI-Medium (Difco Laboratories, Detroit, USA) oder definiertem CGXII-Medium mit 4% D-Glucose als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle kultiviert (Keilhauer et al., 1993). C. glutamicum wurde für 6 - 8 h in 100 mL Schüttelkolben mit 15 mL BHI-Medium auf einem Rotationsschüttler bei 250 U min ^-1 kultiviert (erste Vorkultur) und anschließend in 50 mL definiertes CGXII-Medium mit 4% D-Glucose in 500 mL Erlenmeyerkolben mit Schikanen beimpft (zweite Vorkultur). Die Zellsuspensionen wurden über Nacht auf einem Rotationsschüttler bei 250 U min ^-1 kultiviert. Das mikrobielle Wachstum während der Kultivierungen wurde durch Messung der optischen Dichte bei 600 nm (OD ₆ oo) verfolgt. Die Hauptkultur wurde mit 4% (222 mM) D-Glukose oder 4% (266 mM) D-Xylose in definiertem CGXII-Medium auf eine ODeoo von 5.0 inokuliert. Die heterologe Genexpression wurde direkt nach der Inokulation mit 1 mM IPTG induziert.

Die während der Kultivierung gezogenen zellhaltigen Proben wurden anschließend zentrifugiert (10.000 x g, 4°C, 10 min) und die resultierenden Überstände hinsichtlich der Konzentrationen an D-Glucose, D-Xylose und PCA analysiert. Die entsprechende HPLC-Analytik wurde auf einem Agilent 1200-System (Agilent Technologies, Waldbronn, Deutschland) unter Verwendung einer CS Organic Acid Resin (CS Chromatographie Service GmbH, Langerwehe, Deutschland) durchgeführt. Die Trennung erfolgte isokratisch bei 55°C mit 0.1 M H ₂ SO ₄ als mobiler Phase und einer Flussrate von 0.6 ml min ^-1 . D-Glucose und D-Xylose wurden mittels Rl-Detektor nachgewiesen. PCA wurde mittels UV-Detektor bei einer Absorption von 254 nm erfasst. Die Quantifizierungen erfolgten mittels externer Kalibrationen in geeigneten Standardlösungen.

3,4 Dihydroxybenzoat (PCA)-Bildunq im Wirtssvstem erfindunqsqemäß modifizierter coryneformer Bakterienzellen

Die nachfolgenden C. glutamicum-Stämme wurden konstruiert und hinsichtlich ihrer Wachstums- und PCA-Produktionsleistung vergleichend untersucht:

DelAro ⁵ -C7 P _O6 -iolT1 pMKEx2_aroF*_qsuB pEKEx3_tkt (PCA _GLC ; )

DelAro ⁵ -C7 P _O6 -iolT1 Δpyk pMKEx2_aroF*_qsuB pEKEx3_tkt (PCA _GLC Δpyk; )

DelAro ⁵ -C7 P _O6 -iolT1 pMKEx2_aroF*_qsuB pEKEx3_xy/A_xy/B (PCAXYLJ -

DelAro ⁵ -C7 P _O6 -iolT1 Δpyk pMKEx2_aroF*_qsuB pEKEx3_xylA_xylB (PCAXYL Δpyk; Δpyk pMKEx2_aroF*_qsuB pEKEx3_xy/A_xy/B ( ) DelAro ⁵ Δpyk pMKEx2_aroF*_qsuB pEKEx3_xy/A_xy/B

Die nachfolgenden Ausführungen zeigen eindeutig, dass die erfindungsgemäße Expression der Gene xylA und xylB zur Nutzung von D-Xylose als Kohlenstoff- und Energiequelle in Kombination mit der Inaktivierung der Pyruvatkinase zu einer erhöhten Bildung von PCA führen (Figuren 8 und 9).

Wie Figur 8 zu entnehmen ist, zeigen die beiden Stämme PCA _GLC und PCA _GLC Δpyk mit 0.21 h ^-1 bzw. 0.20 h ^-1 ein vergleichbares Wachstum auf D-Glucose als Kohlenstoff- und Energiequelle. Die Substrataufnahmerate ist mit 15.6 C-mmolGLc g _CDW ^-1 h ^-1 bzw. 17.4 C-mmol _GLC g _CDW ^-1 h ^-1 ebenfalls vergleichbar. Hingegen zeigt der Stamm PCA _GLC Δpyk mit Deletion des Gens für die Pyruvatkinase mit 1.22 C-mmolpcA g _CDW ^-1 h ^-1 eine stark erhöhte PCA-Bildungsrate im Vergleich zum Vorläuferstamm mit 0.78 C-mmolpcA g _CDW ^-1 h ^-1 . Der Stamm PCAXYL weist mit 0.11 h ^-1 eine niedrigere Wachstumsrate wie die D-Glucose-basierten Stämme auf. Die Substrataufnahme ist mit 13.0 C-mmolxYL g _CDW ^-1 h ^-1 vergleichsweise hoch und die Produktbildungsrate mit 1.43 C-mmolpcA g _CDW ^-1 h ^-1 auf einem deutlich höherem Niveau als die D-Glucose-basierten Stämme. Der Stamm PCAXYL Δpyk zeigt hingegen mit 0.04 h ^-1 und 6.5 C-mmolxYL g _CDW ^-1 h ^-1 eine stark verminderte Wachstums- und Substrataufnahmerate. Demgegenüber bleibt die PCA-Bildungsrate mit 1 .47 C-mmolpcA g _CDW ^-1 h ^-1 auf dem höchsten Niveau erhalten. Insgesamt wird dadurch in diesem Stamm der aufgenommene Kohlenstoff in Form von D-Xylose zu einem Großteil in das Produkt PCA umgewandelt, wodurch sich der Produktertrag (Yield) signifikant erhöht.

Die resultierenden C-molaren Yields unter Berücksichtigung der unterschiedlichen Substrate ergeben sich damit für die Stämme PCA _GLC , PCA _GLC Δpyk, PCAXYL und PCAXYL Δpykzu 0.02, 0.04, 0.06 und 0.33 C-mol Produkt pro C-mol Substrat.

Figur 9 zeigt die maximalen PCA-Titer nach 98 h Kultivierungszeit. Der Stamm PCA _GLC weist einen maximalen PCA-Titer von 3.5 ± 1.2 mM auf. Der Stamm PCA _GLC Δpyk mit Deletion des Gens für die Pyruvatkinase zeigt einen signifikant erhöhten PCA-Titer von 7.8 ± 1.6 mM. Der Stamm PCAXYL weist einen noch höheren PCA-Titer von 12.0 ± 1.1 mM auf. Der Stamm PCAXYL Δpyk mit zusätzlicher Deletion des Gens für die Pyruvatkinase zeigt den mit Abstand höchsten PCA-Titer von 62.1 ± 12.1 mM.

Figur 10 ist zu entnehmen, dass der Vorläuferstamm Δpyk pMKEx2_aroF*_qsuB pEKEx3_xy/A_xy/B mit intaktem Katabolismus aromatischer Verbindungen nicht in der Lage ist, PCA zu akkumulieren. Hingegen zeigt der Stamm DelAro ⁵ Δpyk pMKEx2_aroF*_qsuB pEKEx3_xy/A_xy/B mit entsprechender Inaktivierung des Katabolismus aromatischer Verbindungen bereits eine moderate PCA-Akkumulation mit einem finalen Titer von 26.6 mM. Dieser Effekt ist eindeutig auf die erfindungsgemäße Deletion des Gens für die Pyruvatkinase Δpyk zurückzuführen. Der erfindungsgemäße Stamm PCA _XYL Δpyk mit erfindungsgemäß zusätzlicher Deletion des Gens für die Pyruvatkinase, einem inaktiven Katabolismus sowie zusätzlich einer erfindungsgemäß erhöhten Aktivität von XylA und XylB zeigt den mit Abstand höchsten PCA-Titer von 62.1 ± 12.1 mM.

Stamm Referenz

Ersatzblatt] Tabelle 2:

Ersatzblatt

Ersatzblatt SEQ