L'invention concerne l'isolement et la caractérisation de promoteurs inductibles par les pathogènes, plus particulièrement par les nématodes, et dirigeant plus spécifiquement l'expression dans les sites nourriciers desdits nématodes après l'infection.

Les nématodes ou « vers ronds » non segmentés forment un groupe zoologique caractérisé par sa richesse en espèces (20000 sont actuellement décrites), une structure corporelle simple et une organisation uniforme. Ce groupe, présent dans presque tous les milieux naturels, comprend des parasites de vertébrés, d'insectes et de plantes, ainsi que des espèces libres bactériophages- saprophages ou des prédateurs. Les nématodes sont les plus simples des animaux organisés. Présents dans la grande majorité des sols, depuis la zone équatoriale jusqu'aux régions tempérées froides, les nématodes phytophages constituent des parasites très importants à l'échelle mondiale. La diversité des stratégies parasitaires développées (des espèces ectoparasites jusqu'aux endoparasites sédentaires), la variabilité des exigences trophiques (spécificité d'hôte stricte ou polyphagie), ainsi que le potentiel reproducteur de ces organismes, sont à l'origine de dépréciations quantitatives et qualitatives des récoltes pouvant empêcher dans certaines conditions extrêmes, toute culture économiquement viable.

Les nématodes à galles et à kystes passent l'essentiel de leur vie à l'intérieur des racines de leur plante-hôte. Leur cycle biologique comprend 4 stades juvéniles (J1 à J4), séparés par des mues, et un stade adulte. C'est au stade J2 qu'a lieu l'infection de la plante. A ce stade, le nématode, mobile, pénètre à l'intérieur de la racine et migre vers la région des tissus vasculaires, où il établit un site nourricier permanent.

Les sites nourriciers ; sont des structures syncitiales ou des cellules géantes résultant de la modification par le nématode de cellules de la plante-hôte.

Après le démarrage du comportement de nutrition, le nématode, devenu sédentaire, subit trois mues successives jusqu'au stade adulte. Les mâles passent par un stade immobile temporaire, puis la troisième mue donne naissance à un stade mobile ; c'est à ce stade que les mâles quittent la racine. Chez la femelle, le stade adulte est entièrement immobile. La production d'oeufs (des centaines par

femelle) débute, selon les espèces et les conditions environnementales, 3 à 6 semaines après l'infection initiale.

Le nématode à kystes (genre Heterodera ou Globodera) pénètre dans la racine au niveau de l'épiderme et migre à travers le cortex en perçant et détruisant les cellules à l'aide de son stylet. Les cellules sont endommagées et des nécroses racinaires peuvent apparaître. Après avoir atteint l'endoderme, le nématode perce la membrane d'une cellule procambiale près du xylème primaire (faisceau conducteur de la sève brute) et injecte des sécrétions grâce aux glandes salivaires.

Rapidement, la cellule procambiale devient métaboliquement très active et se met à grossir par fusion successive avec les cellules voisines. Le syncytium formé peut incorporer plus de 200 cellules et se caractérise alors par des noyaux volumineux, un cytoplasme dense et des invaginations de la paroi cellulosique, qui permettent d'augmenter la surface en contact avec les tissus vasculaires.

Le nématode à galles (du genre Meloidogyne), après une phase de reconnaissance à la surface de la racine, pénètre au niveau de la zone d'élongation proche de l'apex racinaire. Généralement, le nématode migre ensuite en passant entre les cellules, à l'extrémité de la racine, puis remonte dans le cylindre central jusqu'à la zone de différentiation. A cet endroit, le nématode pique, avec son stylet, 5 à 7 cellules et induit leur transformation en cellules géantes par de multiples mitoses sans formation de paroi. Les cellules géantes ainsi activées présentent les mêmes caractéristiques que le syncytium formé par le nématode à kystes : cytoplasme dense, parois épaissies et présence d'invaginations, nombreux (>100) et volumineux noyaux dans chaque cellule. L'augmentation de volume des cellules corticales conduit à la formation d'une galle typique de l'infection par Meloidogyne.

Aux dégâts directs que provoquent les nématodes par l'action de leur stylet buccal peuvent s'adjoindre des effets indirects qui aggravent le stress infligé à la plante (envahissement par d'autres agents pathogènes telluriques ou transmission de virus). Parmi les nématodes phytoparasites, les formes endoparasites obligatoires sédentaires représentées par les nématodes à kystes des genres Heterodera et Globodera et les nématodes à galles du genre Meloidogyne sont responsables des dégâts les plus importants au niveau mondial.

La crucifère Arabidopsis thaliana est une plante-hôte pour de nombreuses espèces de nématodes à galles et à kystes, qui a la particularité de posséder des racines fines et transparentes, se prêtant particulièrement bien à des

études microscopiques. De plus, Arabidopsis thaliana est adaptée à des études moléculaires, du fait de la petite taille de son génome, entièrement séquencé, et de son cycle biologique court.

L'utilisation d'Arabidopsis thaliana permet l'identification de gènes de la plante impliqués dans la formation des sites nourriciers et l'évaluation de l'effet de leur inactivation sur le développement de la plante et du nématode. De plus, on peut tester chez Arabidopsis thaliana des gènes codant pour des composés défavorables au métabolisme du nématode.

Ainsi, cette plante a été un outil important de la recherche sur les interactions nématode/plante-hôte. Des cycles biologiques complets ont été obtenus in vitro pour les parasites suivants : Heterodera schachtii, H. trifolii, H. cajani (nématodes à kystes), Meloidogyne incognita et M. arenaria (nématodes à galles) ainsi que le migrateur Pratylenchus penetrans. Un grand nombre d'écotypes d'Arabidopsis ont été séparés en différents groupes, selon leur sensibilité à H. schachtii. Cependant, aucune résistance aux nématodes n'a encore été montrée chez Arabidopsis.

Une des stratégies pour rendre une plante résistante aux nématodes est la destruction du site nourricier. Cela peut être réalisé par l'expression locale d'un gène cytotoxique, par exemple le gène de la barnase (HARLEY et a/., J. Mol. Biol., vol. 202 (4), p. 913-5,1988) sous le contrôle d'un promoteur de plante inductible par les nématodes et actif dans le site nourricier. Il faut également que ce promoteur soit le plus spécifique possible du site nourricier, afin d'éviter l'expression du gène cytotoxique dans les autres tissus de la plante.

Quelques promoteurs dont l'expression est inductible par une infection par les nématodes ont été décrits dans l'art antérieur.

Des promoteurs induits par l'infection par les nématodes ont été décrits chez Arabidopsis par GODDIJN et al. (Plant J., vol. 4 (5), p. 863-73,1993).

Cinq promoteurs inductibles par les nématodes (ARM1, 1164,728, 25 et Lemmi9) et quatre promoteurs inhibés (CaMV35S, promoteur de la opaline synthase, et les promoteurs RoIC et RoID) ont été fusionnés à un gène reporter GUS et introduits dans les racines de la betterave à sucre par transformation avec Agrobacterium rhizogenes pour évaluer leur profil d'expression. (VAN POUCKE et al., Meded Rijksuniv Gent Fak Landbouwkd Toegep Biol Wet., vol. 66 (2b), p. 591-8, 2001).

La demande française FR 2 779 737 décrit l'implication du gène de la D-ribulose-5-phosphate-3-épimérase (RPE) dans les stades précoces de développement de cellules nourricières induites par les nématodes. La demande WO 97/46692 décrit des séquences nucléotidiques d'A. thaliana capables de diriger l'expression d'une séquence d'intérêt, notamment une séquence codant pour une substance cytotoxique, dans les racines suite à l'infection par des nématodes à galles ou à kystes. Cependant, cette expression n'est que peu spécifique, et nécessite pour éviter des effets phytotoxiques généraux indésirables, d'utiliser en complément une construction chimérique exprimant dans les autres tissus de la plante un gène codant pour un neutralisant de la toxine utilisée. La demande WO 98/31822 se rapporte à des promoteurs inductibles suite à l'infection par un pathogène, notamment par les nématodes. La lignée ARM1 (lignée Att001 dans l'article de BARTHELS et a/. (Plant Cell., vol. 9 (12), p. 2119-34,1997) présente une expression dans les sites nourriciers après infection par Meloidogyne et Heterodera détectée 2 à 4 jours après infection et plus faible à 14 jours. Au cours du développement de la plante, l'expression est détectée au niveau des sites d'initiation des racines latérales mais également dans tous les vaisseaux des feuilles et des racines. De plus on observe une réponse du promoteur après application d'hormones végétales (auxine).

II apparaît souhaitable de disposer d'autres promoteurs inductibles par les nématodes, et dont l'expression est la plus spécifique possible des tissus nourriciers.

Les inventeurs ont montré que les promoteurs des gènes des formines AtFH6 ou AtFH1 ou AtFH10 d'Arabidopsis thaliana étaient capables d'induire l'expression d'une séquence d'intérêt dans les sites nourriciers des racines de la plante après infection par un nématode, à galles ou à kystes. D'autre part l'expression en dehors des sites nourriciers observée au cours du développement de la plante présente un niveau moins important que celle induite par les nématodes et est limitée à certains tissus, notamment, dans le cas d'AtFH6, l'apex racinaire et les zones de différentiation précoce (sites d'initiation des racines latérales) des vaisseaux racinaires, ainsi que les vaisseaux des tissus aériens des très jeunes plantules et stipules. En outre, contrairement à ce qui a été observé pour certains autres promoteurs inductibles par les nématodes, comme par exemple celui décrit

par BARTHELS et al. (1997, précité), les promoteurs des formines ne sont pas inductibles par les hormones végétales.

Les formines sont des protéines impliquées dans la cytokinèse et la polarité cellulaire, chez les levures et la drosophile. Elles ont été mises en évidence récemment chez les végétaux : BANNO et CHUA (Plant Cell Physiology, vol. 41 (5), p. 617-626,2000) décrivent l'identification d'un ADNc complet codant pour AFH1 (Arabidopsis Formin Homology protein 1) et l'obtention de séquences complémentaires par homologie chez le tabac, CYRCKOVA (Genome Biology, vol. 1 (1), 27 avril 2000) divulgue l'utilisation des séquences des régions conservées FH1 et FH2 comme sondes pour identifier des séquences codant potentiellement pour des formines ; DEEKS et a/. (Trends in Plant Science, vol. 7 (11), p. 492-498, 2002) présentent l'identification par analyse bioinformatique de 21 gènes de la famille des protéines FH chez Arabidopsis arabidopsis et discutent de leur rôle putatif comme intermédiaires dans la cascade de signalisation affectant la réorganisation du cytosquelette chez les plantes. Aucune relation entre l'expression des formines chez les plantes et l'infection par des nématodes n'a été rapportée dans l'art antérieur.

La présente invention a en conséquence pour objet l'utilisation du promoteur d'un gène de formine pour exprimer préférentiellement un gène d'intérêt, en réponse à l'infection par un nématode, dans les sites nourriciers formés par ledit nématode.

Selon un mode de mise en oeuvre préféré de la présente invention, ledit promoteur est choisi parmi les promoteurs des gènes de formine AtFH6, AtFH1, ou AtFH10 d'Arabidopsis thaliana, ou parmi les promoteurs des gènes orthologues d'autres espèces végétales.

La présente invention a en particulier pour objet un polynucléotide isolé constituant un promoteur inductible chez une plante par l'infection par un nématode, caractérisé en ce qu'il comprend les séquences de régulation d'un promoteur choisi parmi : - le promoteur du gène de formine AtFH6 d'Arabidopsis thaliana, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 ; - le promoteur du gène de formine AtFH1 d'Arabidopsis thaliana, représenté par la séquence SEQ ID NO : 2 ; - le promoteur du gène de formine AtFH10 d'Arabidopsis thaliana, représenté par la séquence SEQ ID NO : 3 ;

Dans un promoteur, on désigne sous le nom de « séquences de régulation » les séquences reconnues par des facteurs de transcription qui ne sont actifs que dans certains types cellulaires particuliers, ou en réponse à un stimulus spécifique. Dans le cas présent, les séquences de régulation des promoteurs des gènes AtFH6, AtFH1 ou AtFH10 sont les régions de ces promoteurs spécifiquement impliquées dans la réponse à l'infection par un nématode, et/ou dans l'expression préférentielle dans les sites nourriciers.

L'homme du métier peut, à partir des promoteurs définis par les séquences SEQ ID NO : 1,2, ou 3, identifier ces séquences de régulation, par des techniques connues en elles-mêmes de dissection des promoteurs, par exemple en mesurant l'inductibilité par l'infection par un nématode et la spécificité de l'activité promotrice de mutants de délétion de ce polynucléotide, et/ou par des techniques telles que celles des empreintes sur l'ADN (footprints), en incubant les polynucléotides de séquence SEQ ID NO : 1,2, ou 3, ou des portions de ceux-ci, avec des extraits nucléaires de cellules des sites nourriciers, ainsi qu'avec des extraits nucléaires de cellules de tissus dans lesquels les promoteurs des gènes AtFH6, AtFH1 ou AtFH10 sont inactifs.

Selon un mode de réalisation préféré d'un polynucléotide de la présente invention, il comprend une séquence ayant au moins 80%, de préférence au moins 85%, avantageusement au moins 90%, et de manière tout a fait préférée au moins 95% d'identité avec l'une des séquences SEQ ID N° 1, 2 ou 3.

Un polynucléotide de la présente invention peut également être un promoteur chimérique, contenant un promoteur minimal fonctionnel dans une cellule végétale, associé aux séquences de régulation de l'un des promoteurs des gènes AtFH6, AtFH1 ou AtFH10.

Un promoteur minimal comprend au moins les séquences permettant la fixation de l'ARN polymérase et l'initiation de la transcription. Par exemple, un promoteur minimal pour la transcription par l'ARN polymérase Il comprend généralement, outre un site d'initiation de la transcription, au moins une boite TATA située en général à environ 20 à 40pb en amont du site d'initiation de la transcription, et/ou au moins un élément INR (INitiatoR) localisé au niveau du site d'initiation de la transcription ; il peut comprendre en outre, pour un niveau d'expression plus élevé, des séquences dénommées « éléments promoteurs amont » (upstream promoter elements ou UPEs), telles que la boîte CCAAT, et/ou les séquences riches en GC

qui sont reconnues par différents facteurs de transcription exprimés constitutivement dans tous les types cellulaires.

La présente invention a également pour objet tout sous-fragment d'au moins 15, de préférence au moins 20, de manière tout à fait préférée d'au moins 30, et avantageusement d'au moins 50 bases consécutives de l'une des séquences SEQ ID NO : 1,2, ou 3, ou de son complémentaire, ainsi que tout polynucléotide d'au moins 20, de manière tout à fait préférée au moins 30, et avantageusement au moins 50 pb capable de s'hybrider dans des conditions de forte stringence avec l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 1,2, ou 3, ou avec son complémentaire.

Le terme « isolé » au sens de la présente invention désigne un matériel biologique qui a été soustrait à son environnement originel (l'environnement dans lequel il est localisé naturellement). Par exemple, un polynucléotide présent à l'état naturel dans une plante n'est pas isolé. Un polynucléotide peut être inclus dans un vecteur et/ou un tel polynucléotide peut être inclus dans une composition et demeurer néanmoins à l'état isolé du fait que le vecteur ou la composition ne constitue pas son environnement naturel.

Selon la présente invention, on entend par « % d'identité » le pourcentage de nucléotides identiques qui peut être calculé par l'homme du métier en utilisant un programme informatique de comparaison de séquences tel que, par exemple, ceux de la suite BLAST (ALTSCHUL et al., Nucleic Acids Res., vol. 25, p. 3389-3402,1997), ou le programme FastDB avec les paramètres suivants : « Mistmatch penalty : 1. 00 ; Gap penalty : 1.00 ; Gap Size Penalty : 0.33 ; joining penalty : 30.0 ». Ces algorithmes sont présentés dans Current Methods in Sequencing and synthesis Methods and Applications, pages 127-149,1988, Ala. R.

Liss, Inc, incorporé dans la description par référence.

Sauf précision contraire, les pourcentages d'identité indiqués dans le cadre de l'exposé de la présente invention sont ceux obtenus en utilisant les programmes BLAST avec les paramètres par défaut, et sur une fenêtre de comparaison constituée par la totalité de la séquence SEQ ID NO : # indiquée comme séquence de référence.

On peut également définir des polynucléotides selon l'invention par leurs propriétés d'hybridation sélective avec l'un des polynucléotides définis par les séquences SEQ ID n°1 ou SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3 dans des conditions de forte

stringence telles que définies dans SAMBROOK et a/., Molecular Cloning A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 1989) aux paragraphes 11.1 à 11.61.

En général, des conditions de forte stringence, pour un polynucléotide donné peuvent être obtenues en opérant à une température inférieure de 5 à 10°C à la température de fusion du duplex constitué par ledit polynucléotide et son complémentaire, dans un milieu de composition donnée.

A titre d'exemple de conditions d'hybridation de forte stringence utilisables dans un grand nombre de cas, on indiquera les conditions suivantes : Préhybridation : Même conditions que pour l'hybridation Durée : 1 nuit.

Hybridation : 5X SSPE (0.9 M NaCI, 50 mM phosphate de sodium pH 7.7, 5 mM EDTA) 5X Denhardt's (0.2% PVP, 0.2% Ficoll, 0.2% SAB) 0. 1 % SDS Durée : 1 nuit.

Lavages : 2X SSC, 0. 1% SDS 10 min 65°C 1X SSC, 0.1% SDS 10 min 65°C 0.5X SSC, 0. 1% SDS 10 min 65°C 0. 1XSSC, 0. 1% SDS 10 min 65°C Les différences nucléotidiques que peut comprendre un acide nucléique selon l'invention par rapport aux séquences nucléotidiques SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2 ou encore SEQ ID N°3 peut résulter en des substitutions, délétions ou additions d'un ou plusieurs nucléotides consécutifs ou non.

Des modes de réalisation préférés de promoteurs conformes à l'invention sont représentés par les polynucléotides définis par les séquences SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3, ainsi que par les polynucléotides suivants : - le polynucléotide défini par la SEQ ID NO : 4, qui est constitué par une séquence de 1129 pb en amont de l'ATG du gène AtFH6 et qui comprend, outre la séquence SEQ ID N°1, une séquence 5'UTR de 122 pb (soulignée dans la séquence représentée ci-après) : <BR> <BR> GTCTTTTGAAGTTTGGAATTGTTGGCCCATATTATGTTGTAGGTAATATGGAATCAGCCG GT ACACTGGACCACAGAGGATTGTCTTTCCGTCTACAGTCTACAGAATCAGCCGGACTAGTT TT

- le polynucléotide défini par la SEQ ID NO : 5, qui est constitué par une séquence de 1221 pb en amont de l'ATG du gène AtFH1 et qui comprend, outre la séquence SEQ ID N°2, une séquence 5'UTR de 32 pb (soulignée dans la séquence représentée ci-après) :

- le polynucléotide défini par la SEQ ID NO : 6, qui est constitué par une séquence de 1238 pb en amont de l'ATG du gène AtFH1 et qui comprend, outre la séquence SEQ ID N°3, une séquence 5'UTR de 78 pb (soulignée dans la séquence représentée ci-après) : Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être préparées par les techniques usuelles connues de l'homme du métier telle que définie par exemple dans SAMBROOK et al., Molecular Cloning : A Laboratory

Manual, 2nd ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 ; Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1987 ; et INNIS et al., PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications, Academic Press : SanDiego, 1990, ou encore par des méthodes incluant par exemple la synthèse chimique et des méthode mixtes comme la modification chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage des banques d'ADN.

L'invention se rapporte également à une cassette d'expression recombinante, caractérisée en ce qu'elle comporte : - un promoteur constitué par un polynucléotide conforme à l'invention ; - une séquence hétérologue d'intérêt placée sous contrôle transcriptionnel dudit promoteur, ou un ou plusieurs site (s) de restriction permettant l'insertion d'une séquence d'intérêt sous contrôle transcriptionnel dudit promoteur.

Une séquence d'intérêt exprimée dans une cassette d'expression selon l'invention peut être notamment une séquence exprimant un ARN, une protéine ou un polypeptide qui protège la plante contre l'infection par les nématodes, dans le sens qui améliore la résistance de la plante à l'infection jusqu'à conférer une résistance complète et plus particulièrement un gène codant pour un composé toxique pour les nématodes ou pour les cellules des sites nourriciers.

Ce composé peut avoir pour effet direct la mort des nématodes (il s'agit par exemple de toxines nématicides, de lectines, de collagénases, d'inhibiteurs de protéases, d'anticorps...), ou avoir pour effet de rendre incapable les nématodes d'effectuer une étape importante dans leur développement ou leur reproduction, provoquant à terme leur élimination.

II existe de nombreux exemples de telles substances toxiques, par exemple l'endotoxine de Bacillus thuriengiensis (EP 0 352 052).

Les composés toxiques peuvent également être dirigés non pas vers les nématodes mais vers les cellules végétales de leurs sites nourriciers, afin de perturber la formation et/ou le fonctionnement de ces structures nourricières. Dans ce cas, les composés toxiques peuvent notamment être choisis parmi les DNAses, RNAses, les inducteurs de mort cellulaire, les associations de produits d'un gène de résistance et d'un gène d'avirulence, les ARN anti-sens. A titre d'exemple non- limitatif, on citera notamment la barnase, mentionnée ci-dessus.

Ladite séquence d'intérêt peut être également associée à d'autres éléments de régulation tels que des activateurs et des séquences de terminaison de transcription (terminateurs).

D'autres éléments tels que les introns, enhancers, séquences de polyadénylation et leurs dérivées connues de l'état de l'art peuvent également être présents dans la séquence nucléique d'intérêt pour améliorer l'expression ou le fonctionnement du gène transformant. On pourra également associer à une cassette d'expression conforme à l'invention des séquences nucléotidiques régulatrices, ne faisant pas partie du promoteur, et susceptibles de moduler l'expression de la séquence d'intérêt, en particulier : - des séquences leaders et des séquences enhancers, qui interviennent à un niveau post-transcriptionnel ou traductionnel (notamment stabilisation d'ARN et effet sur la traduction), par exemple le leader EMCV (ELROY- STEIN et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., vo1. 86 (16), p. 6126-30,1989) et le leader TMV (GALLIE eta/., Plant Cell, vol. 1 (3), p. 301-11,1989).

- des boîtes de régulation intervenant à un niveau transcriptionnel, capables de commander au moins partiellement l'activité d'un promoteur ; ces dernières boites de régulation peuvent être inductibles par un facteur physiologique ou de l'environnement de la plante.

- des terminateurs de transcription ; à titre d'exemples non limitatifs on citera notamment : Le terminateur 3'Nos, terminateur de la opaline synthase qui correspond à la région en 3'non codante du gène de la opaline synthase provenant du plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens souche à opaline (DEPICKER et a/., J. Mol. Appl. Genet., vol. 1, p. 561-573,1982), et le terminateur 3' CaMV, correspondant à la région 3'non codante de la séquence du virus à ADN bicaténaire circulaire de la mosaïque du chou-fleur produisant le transcrit 35S (FRANCK et a/., Cell, vol. 21, p. 285-294,1980 ; Gene Bank n° V 00141). De plus, le gène d'intérêt peut être placé en orientation sens ou antisens selon les besoins de l'invention.

Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, la cassette d'expression comprend également un gène codant pour un agent de sélection (également appelé gène marqueur de sélection). Parmi ceux pouvant être utilisés, on citera notamment des gènes qui confèrent une résistance à un

antibiotique (HERRERA-ESTRELLA et al, EMBO J., vol. 2, p. 987-995,1983), tel que l'hygromycine, la kanamycine, la bléomycine ou la streptomycine ou à des herbicides (EP 242 246), tels que le glufosinate, le glyphosate ou le bromoxynil.

Préférentiellement, ledit gène marqueur de sélection est choisi parmi le gène bar (WHITE et al., Nucl. Acid. Res., vol. 18, p. 1062,1990 ; Gene Bank n° X 17220) qui confère la résistance à l'herbicide Basta (D (glufosinate) et le gène NPTII qui confère la résistance à la kanamycine. Le système d'excision pour éliminer le gène codant un agent de sélection peut être un système de transposition, tel que notamment le système Ac/Ds du maïs (WO 02 101061), ou un système de recombinaison, tel que notamment le système Cre/lox du bactériophage P1, le système FLP/FRT de la levure (LYZRIK et HODGES, Nucl. Acid. Res., vol. 44, p. 123-132,1997), la recombinase Gin du phage Mu, la recombinase Pin de E. coli ou le système R/RS du plasmide pSR1. Un système de co-transformation (KOMARI et al., Plant J., vol. 10, p. 165-174,1996) peut également être utilisé.

Préférentiellement, le système utilisé sera le système Ac/Ds du maïs. Selon un mode préféré, ledit gène est compris à l'intérieur de l'élément transposable Ds (également appelé élément dissociant ou séquence mobilisable d'un transposon). Le transposon Ds utilisé est décrit dans la publication de YODER et aL (Bio/Technology, vol. 12, p. 263-292,1993).

Selon un autre aspect, l'invention concerne un vecteur recombinant, d'expression ou de clonage, comprenant au moins un polynucléotide selon l'invention. Avantageusement, ledit vecteur est un vecteur d'expression contenant une cassette d'expression selon l'invention.

A titre d'exemples non limitatifs de vecteurs pouvant être utilisés pour l'obtention de vecteurs recombinants conformes à l'invention on citera les vecteurs suivants : vecteur pBIN19 (BEVAN et al., Nucleic Acids Research, vol. 12, p. 8711- 8721,1984, commercialisé par la société CLONTECH, USA), vecteur 101 pB1221, et pBI121 (JEFFERSON, Plant molecular Biology Reporter, vol. 5, p. 387-405, 1987, commercialisé par la société CLONTECH, USA).

L'invention a également pour objet une cellule hôte transformée par un polynucléotide, une cassette d'expression ou un vecteur recombinant selon l'invention.

Les cellules hôtes préférées sont indifféremment d'origine bactérienne ou végétale. Ainsi, peuvent être notamment utilisées des cellules

bactériennes de différentes souches d'E. coli ou encore d'Agrobacterium tumefaciens ou rhizobium.

Les cellules hôtes végétales peuvent être issues en particulier de plantes dicotylédones ou monocotylédones ; à titre d'exemples non limitatifs, on citera notamment Arabidopsis, Colza, tabac, maïs, tomate, blé, orge, tournesol, pomme de terre, betterave et de riz.

L'invention concerne également les tissus ou parties de plantes, plantes, ou graines transformés par un polynucléotide, une cassette d'expression ou un vecteur recombinant selon l'invention. Le terme"tissu de plante"fait référence à n'importe quel tissu d'une plante, dans une plante ou dans une culture. Ce terme inclut des plantes entières, des cellules de plantes, des organes de plantes, des graines de plantes, des protoplastes, des cals, des cultures de cellules et toutes autres cellules de plantes organisées en tant qu'unité fonctionnelle et/ou structurelle.

Des parties de plantes régénérées telles que des fleurs, des graines, des feuilles, des tiges, des fruits, du pollen, des tubercules, bois et analogues sont également dans le cadre de l'invention.

L'invention concerne en outre une plante transgénique ou partie d'une plante transgénique contenant au moins une copie d'un transgène comprenant un polynucléotide ou une cassette d'expression selon l'invention. Lesdites plantes transgéniques ont la propriété, suite à une infection par un pathogène et notamment par un nématode, d'exprimer préférentiellement dans les sites nourriciers des racines le gène d'intérêt inséré dans ladite cassette d'expression.

Des plantes transgéniques selon l'invention peuvent notamment être générées à partir des cellules végétales transformées conformes à l'invention.

Les techniques pour cultiver et régénérer des plantes entières à partir de cellules ou tissus transformés sont connues de l'homme du métier, cf. par exemple HANSEN et WRIGHT (Trends Plant Sci., vol. 4 (6), p. 226-231, 1999) ou KOMARI etal. (Curr. Opin. Plant. Biol., vol. 1 (2), p. 161-5,1998).

Une plante transgénique selon l'invention peut être obtenue à partir de toute plante que l'on souhaite pouvoir protéger contre une infection par des nématodes. Il peut s'agir, à titre d'exemples non-limitatifs, du Colza, du blé, de l'orge, du tournesol, du tabac, du maïs, ou encore d'Arabidopsis thaliana.

L'invention englobe également tout procédé d'obtention de plantes transgéniques conformes à l'invention.

Pour la mise en oeuvre d'un procédé conforme à l'invention on peut utiliser toute technique de transgenèse végétale convenant au type de plante que l'on souhaite protéger. Généralement, on transforme des cellules de plantes (isolées, sous forme de protoplastes, ou sous forme d'un tissu ou organe végétal) par une cassette d'expression conforme à l'invention, et on régénère des plantes entières à partir des cellules transformées.

La transformation en question peut se faire soit directement, soit indirectement, au moyen d'un vecteur comprenant une cassette d'expression conforme à l'invention.

Par transformation directe, on entend toute transformation d'une cellule de plante réalisée directement par un vecteur selon les techniques connues de l'homme du métier telles qu'au moyen d'une micropipette pour assurer le transfert mécanique de l'ADN, à l'aide du polyéthylène glycol, par pénétration biolistique à haute vitesse au moyen de petites particules contenant soit à l'intérieur soit à leur surface l'acide nucléique à faire pénétrer dans la cellule de plante, par fusion de protoplastes avec d'autres entités, cellules, lysosomes, ou autre corps de surfaces lipidiques susceptible de fusionner, ou par électroporation. La transformation de cellules de plantes peut également être réalisée par l'insertion de la séquence nucléique d'intérêt au sein d'un plasmide recombinant par exemple d'origine bactérienne dans lequel a été préalablement inséré le génome d'un ADN viral tel que celui du virus de la mosaïque du chou-fleur, le plasmide résultant étant utilisé pour transformer les cellules de plantes.

Par transformation indirecte, on entend une transformation consistant par exemple à transformer un microorganisme tel qu'Agrobacterium tumefaciens au moyen de la susdite séquence nucléique, ledit microorganisme étant ensuite utilisé pour transformer les cellules de plantes.

Selon un mode de mise en oeuvre d'un procédé conforme à l'invention, il comprend les étapes suivantes : a) obtention d'une cellule végétale transformée conforme à l'invention ; b) régénération, à partir de ladite cellule, d'une plante entière contenant dans son génome au moins une copie d'une cassette d'expression conforme à l'invention.

Selon un autre mode de mise en oeuvre d'un procédé conforme à l'invention, il comprend les étapes suivantes : a) obtention d'une cellule transformée d'Agrobacterium tumefaciens conforme à l'invention, b) transformation d'une plante d'intérêt par infection avec la cellule transformée d'Agrobacterium tumefaciens obtenue à l'étape a).

Avantageusement, un procédé conforme à l'invention peut en outre comporter une étape de croisement de plantes transgéniques obtenues, et une étape de sélection, parmi les plantes issues de ce croisement, de celles qui comprennent au moins une copie d'une cassette d'expression conforme à l'invention.

L'invention a également pour objet les graines ou semences obtenues à partir d'une plante transgénique selon l'invention.

L'invention porte aussi sur l'utilisation d'au moins une cassette d'expression selon l'invention pour obtenir une plante résistante à l'infection par les nématodes.

L'invention porte également sur une méthode pour protéger une plante d'une infection par un nématode comprenant les étapes de transformation de plantes avec une cassette d'expression selon l'invention et la sélection des plantes ayant intégré la séquence nucléotidique d'intérêt.

L'invention a également trait à une méthode pour identifier un promoteur spécifique des sites nourriciers comprenant les étapes d'identification des homologues des gènes de forrnine dans les espèces autre qu'Arabidopsis thaliana comme par exemple le blé et/ou le maïs par comparaison de séquences desdites espèces avec les séquences des gènes de formine d'Arabidopsis thaliana, et l'identification des promoteurs des séquences homologues issues de cette comparaison par les techniques usuelles connues de l'homme du métier.

De plus l'invention a également pour objet un kit de transformation de plantes comprenant une cassette d'expression selon l'invention ou un vecteur de clonage et/ou d'expression selon l'invention.

Enfin l'invention concerne toute utilisation d'une séquence nucléotidique promotrice selon l'invention pour exprimer un gène dans une plante infectée par des nématodes, au niveau des sites nourriciers desdits nématodes.

La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant

l'inductibilité et le profil d'expression des promoteurs des gènes AtFH6, AtFH1 et AtFH10.

EXEMPLES Exemple 1 : Profil d'expression du gène AtFH6 chez A. thaliana Le profil d'expression de AtFH6 chez A. thaliana a été analysé par RT-PCR, à partir d'ARNm isolé de racines non infectées, de fragments non- méristématiques de racines non infectées, de plantules âgées de 5 jours, de parties aériennes et de feuilles isolées de plantes âgées de 10 jours, et de galles 7 et 14 jours après infection par M. incognita.

Des ADNc simples brins ont été préparés à partir de 500 ng d'ARN poly (A) + en utilisant la « Superscript II reverse transcriptase » (Invitrogen) avec l'amorce oligo (dT). Les réactions PCR ont été réalisées avec les amorces AtFH6 F3for (5'-AGA TCG AGC CAC TGT TTG GG-3', SEQ ID NO : 7) et AtFH6 3R avec 200 pM dNTP, 1X tampon PCR, 0,5 U Taq DNA polymerase (Qbiogene) en suivant les conditions de température suivante, 3 min dénaturation à 94°C et 35 cycles de 40 s à 94°, 40s à 55°C, 1 min à 72°C.

La Figure 1 illustre les résultats de l'analyse par RT-PCR du profil d'expression de AtFH6 chez A thaliana. Les ARNs ont été isolés de galles 7 et 14 jours après infection par M incognita (G7 and G14), racines non infectées (Ro), fragments non-méristématiques de racines non infectées (RnM), plantules âgées de 5 jours (Se), partie aérienne (Ap) et feuilles isolées (Le) de plantes âgées de 10 jours.

Exemple 2 : Construction des fusions promoteur GFP-GUS/GFP et transformation des plants d'Arabidopsis Le vecteur pKGWFS7 compatible GATEWAY (KARIMI et al., Trends Plant Sci., vol. 7 (5), p. 193-5,2002) a été utilisé pour l'analyse de la fonctionnalité des promoteurs des gènes AtFH1, AtFH6 et AtFH10 chez A. thaliana. Ce vecteur binaire porte le gène de résistance à la spectinomycine et un ADN-T qui sera transféré au génome de la plante. L'ADN-T porte le gène conférant la résistance à la kanamycine sous contrôle du promoteur constitutif et du terminateur du gène de la opaline synthase ainsi que la séquence codante du gène de l'eGFP ( « enhanced Green Fluorescent Protein » ; Clontech) fusionné au gène GUS avec le terminateur 35S du virus de la mosaïque du chou fleur (CaMV). Les promoteurs et la partie 5'UTR des gènes AtFH1, AtFH6 et AtFH10 ont été amplifiés par PCR à partir d'ADN génomique

d'A. thaliana écotype WS à l'aide des amorces spécifiques Gwp5AFH6 (5'-AAA AAG CAG GCT TCG TCT TTT GAA GTT TGG AAT TGT TGG C-3', SEQ ID NO : 8) et Gwp3AFH6 (5'-AGA AAG CTG GGT GGG CGA ATC GTG ATA AAC TAT TTT AC- 3', SEQ ID NO : 9) pour le promoteur de AtFH6 ; Gwp5AFH1 (5'-AAA AAG CAG GCT TCT GTC GGT GGT TTC CTG ATA CT-3', SEQ ID NO : 10) et Gwp3AFH1 (5'-AGA AAG CTG GGT GTG TGT TAT CTT CTT CTT TCT TCT TC-3', SEQ ID NO : 11) pour le promoteur de AtFH1 ; Gwp5AFH10 (5'-AAA AAG CAG GCT TCC CTA TAT ATG TTG CCC ACC CAC G-3', SEQ ID NO : 12) et Gwp3AFH10 (5'-AGA AAG CTG GGT GTT TTG GGG TTT TCT TGT AGA GAT TTT G-3', SEQ ID NO : 13) pour le promoteur de AtFH10. Les réactions PCR ont été réalisées avec 50 ng d'ADN génomique, 200 uM dNTP, 1X tampon PCR, 0,5 U Pwo DNA polymerase en suivant les conditions de température suivante, 3 min dénaturation à 94°C et 10 cycles de 40 s à 94°, 40s à 55°C, 1 min à 72°C. Les séquences soulignées permettent une réamplification du produit PCR et la création de l'adaptateur GATEWAY à l'aide des amorces adaptateurattB1 (5'-GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CT-3', SEQ ID NO : 14) et adaptateur attB2 (5'-GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GT-3', SEQ ID NO : 15). Ces réactions PCR ont été réalisées en suivant les conditions indiquées ci-dessus durant 20 cycles.

Les fragments PCR obtenus ont été séquences puis clonés dans le vecteur d'entrée GATEWAY pDON207 puis introduit dans le vecteur pKGWFS7 au niveau du site de recombinaison attR1-attR2 situé en amont de la fusion eGFP-GUS conformément aux indications du fabricant du système GATEWAY (InVitrogen).

Les constructions réalisées dans les vecteurs binaires ont été transférées à la souche GV3101 d'Agrobacterium tumefaciens par électroporation.

Cette souche est résistante à la rifampicine et au chloramphénicol. Les cultures d'A. tumefaciens ont été effectuées à 28°C dans un milieu LB contenant les antibiotiques appropriés.

Les plants d'Arabidopsis cultivés en chambre climatisée, âgés d'environ 4 à 6 semaines (premières siliques développées), ont été transformés par trempage des fleurs dans la suspension d'A. tumefaciens selon la méthode décrite par CLOUGH et BENT (Plant J., vol. 16 (6), p. 735-43,1998). Après traitement, les plantes (TO) ont été repiquées dans du terreau et recouvertes d'une mini-serre pendant deux à trois jours afin d'éviter la déshydratation des plants et favoriser l'enracinement. Après 4 à 6 semaines de culture, la descendance de ces plantes (T1)

a été récoltée. Les transformants ont été sélectionnés in vitro puis transférés en terre. Les semences (T2) issues de l'autofécondation des plantes T1 ont été utilisées pour les analyses histologiques.

Exemple 3 : Analyse fonctionnelle des promoteurs de AtFH6, AtFH1 et AtFH10 Expression du gène rapporteur GUS sous contrôle des promoteurs AtFH1, AtFH6et AtFH10.

Les régions promotrices (environ 1 kb en amont du +1 de transcription) des gènes AtFH6, AtFH1 et AtFH10 ont été clonées en fusion avec les gènes rapporteurs GUS et GFP, et utilisées pour réaliser des transformations stables d'A. thaliana comme décrit à l'exemple 2 ci-dessus. Les transformants sélectionnés ont été inoculés avec des larves de Meloidogyne incognita ou Heterodera schachtii.

Promoteur AtFH6 L'expression GUS a été observée dès le 3sème jour après infection, chez 3 transformants indépendants exprimant ce gène sous contrôle du promoteur AtFH6 (Figure 2).

Dans le cas de Meloidogyne incognita cette expression est localisée au niveau des galles contenant le parasite (figure 2A). La coupe d'une galle examinée en microscopie à fond noir (figure 2B) montre que l'expression GUS est limitée aux cellules géantes (*) et aux cellules entourant les cellules géantes et le nématode (n).

Dans le cas de Heterodera schachtii, l'expression GUS est également limitée au syncytium et aux cellules entourant ce syncytium.

L'expression GUS au cours du développement de la plante a également été observée chez les mêmes transformants (Figure 3).

On observe une expression faible au niveau de l'apex racinaire (A et B), ainsi qu'aux sites d'initiation des racines latérales (C et D). Dans les jeunes plantules, on observe une expression GUS (flèche) à la base des feuilles émergentes 4 jours (E) et 6 jours (F et G) après germination. Dans les jeunes plantules cultivées 7 jours à l'obscurité, l'expression GUS est observée au niveau du cylindre vasculaire (H et 1).

Promoteurs AtFH1, et AtFH10.

L'expression du gène rapporteur GUS a été observée 7 jours après infection par Meloidogyne incognita, chez 2 transformants indépendants exprimant

ce gène sous contrôle du promoteur AtFH1 et 2 transformants indépendants exprimant ce gène sous contrôle du promoteur AtFH10 (Figure 4).

L'expression GUS est observable dans les galles (figure 4A et 4D) mais également - pour AtFH1 dans le cylindre vasculaire et les bourgeons floraux (figure 4B et 4C).

- pourAtFH10 dans le cylindre vasculaire (figure 4E) Ces résultats sont en accord avec les expériences de RT-PCR indiquant, pour AtFH1 et AtFH10, l'expression au niveau des racines dans les zones non méristématiques et dans les galles.

Analyse par PCR quantitative L'activation transcriptionnelle des gènes AtFH1 AtFH6 et AtFH10 a été également étudiée par PCR quantitative.

Les résultats obtenus confirment les observations concernant l'expression du gène rapporteur GUS. L'ensemble de ces résultats est résumé dans le Tableau I ci-après.

TABLEAU I Profil d'expression Tests réalisés Après Pendant le développement de la Promoteur infection plante (sans infection par le Détection RT-PCR nématode GUS quantitative Galles Racine Système aérie Apex racinaires et sites d'initiation des vasculaire racines latérales (uniquement AtFH6 Oui dans zone de jeune plantule) Oui Oui différentiation précoce des Stipule vaisseaux AtFH1 Oui cylindre vasculaire Bourgeons Oui Oui floraux AtFH10 Oui cylindre vasculaire Non Oui Oui