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Title:
QUINOLINONE DERIVATIVES
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2012/066478
Kind Code:
A1
Abstract:
The present invention relates to compounds which are quinolinone derivatives of general formula (I) capable of modulating the activity, in particular of inducing the differentiation, of stem and progenitor cells; these compounds are of use in the treatment of disorders related to a stem differentiation defect; the invention also relates to novel compounds among these quinolinone derivatives and to pharmaceutical compositions containing the same.

Inventors:
RUAT MARTIAL (FR)
FAURE HELENE (FR)
GOROJANKINA TATIANA (FR)
MANN ANDRE (FR)
TADDEI MAURIZIO (IT)
MANETTI FABRIZIO (IT)
SOLINAS ANTONIO (IT)
Application Number:
PCT/IB2011/055096
Publication Date:
May 24, 2012
Filing Date:
November 15, 2011
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Assignee:
CENTRE NAT RECH SCIENT (FR)
RUAT MARTIAL (FR)
FAURE HELENE (FR)
GOROJANKINA TATIANA (FR)
MANN ANDRE (FR)
TADDEI MAURIZIO (IT)
MANETTI FABRIZIO (IT)
SOLINAS ANTONIO (IT)
International Classes:
A61K31/4704; A61P19/00
Domestic Patent References:
WO2000001386A12000-01-13
Foreign References:
Other References:
UKRAINETS ET AL.: "4-hydroy-2-quinolones 138", CHEMISTRY OF HETEROCYCLIC COMPOUNDS, vol. 43, no. 12, 31 December 2007 (2007-12-31), pages 1532 - 1539, XP002660338
LINNAN HE AND P.C. JURS: "Probabilistic neural network multiple classifier system for predicting the genotoxicity of quinolone and quinoline derivatives", CHEM RES TOXICOL, vol. 18, 2 August 2005 (2005-08-02), pages 428 - 440, XP002660339
CHEN J K ET AL: "Small molecule modulation of Smoothened activity", PROC NATL ACAD SCI (US), WASHINGTON, DC; US, vol. 99, no. 22, 29 October 2002 (2002-10-29), pages 14071 - 14076, XP002251705, ISSN: 0027-8424, DOI: 10.1073/PNAS.182542899
DAYAM ET AL.: "Discovery and structure-activity relation ship studies of a unique class of HIV-1 integrase inhibitors", CHEM MED CHEM, vol. 1, 20 December 2005 (2005-12-20), pages 238 - 244, XP002660340
"Remington's Pharmaceutical Sciences"
AGHALOO, T. L.; C. M. AMANTEA ET AL.: "Oxysterols enhance osteoblast differentiation in vitro and bone healing in vivo", J ORTHOP RES, vol. 25, no. 11, 2007, pages 1488 - 97
AMANTEA, C. M.; W. K. KIM ET AL.: "Oxysterol-induced osteogenic differentiation of marrow stromal cells is regulated by Dkk-1 inhibitable and PI3-kinase mediated signaling", J CELL BIOCHEM, vol. 105, no. 2, 2008, pages 424 - 36
BELOTI, M. M.; L. S. BELLESINI ET AL.: "Purmorphamine enhances osteogenic activity of human osteoblasts derived from bone marrow mesenchymal cells", CELL BIOL INT, vol. 29, no. 7, 2005, pages 537 - 41
BOONEN, S.; C. ROSEN ET AL.: "Musculoskeletal effects of the recombinant human IGF-I/IGF binding protein-3 complex in osteoporotic patients with proximal femoral fracture: a double-blind, placebo-controlled pilot study", J CLIN ENDOCRINOL METAB, vol. 87, no. 4, 2002, pages 1593 - 9
CENTRELLA, M.; M. C. HOROWITZ ET AL.: "Transforming growth factor-beta gene family members and bone", ENDOCR REV, vol. 15, no. 1, 1994, pages 27 - 39
CHEN, J. K.; J. TAIPALE ET AL.: "Small molecule modulation of Smoothened activity", PROC NATL ACAD SCI U S A, vol. 99, no. 22, 2002, pages 14071 - 6
CORCORAN, R. B.; M. P. SCOTT: "Oxysterols stimulate Sonic hedgehog signal transduction and proliferation of medulloblastoma cells", PROC NATL ACAD SCI USA, vol. 103, no. 22, 2006, pages 8408 - 13
DWYER, J. R.; N. SEVER ET AL.: "Oxysterols are novel activators of the hedgehog signaling pathway in pluripotent mesenchymal cells", J BIOL CHEM, vol. 282, no. 12, 2007, pages 8959 - 68
FRANK-KAMENETSKY, M.; X. M. ZHANG ET AL.: "Small-molecule modulators of Hedgehog signaling: identification and characterization of Smoothened agonists and antagonists", J BIOL, vol. 1, no. 2, 2002, pages 10
FROMIGUE, O.; D. MODROWSKI ET AL.: "Growth factors and bone formation in osteoporosis: roles for fibroblast growth factor and transforming growth factor beta", CURR PHARM DES, vol. 10, no. 21, 2004, pages 2593 - 603
GIUSTINA, A.; G. MAZZIOTTI ET AL.: "Growth hormone, insulin-like growth factors, and the skeleton", ENDOCR REV, vol. 29, no. 5, 2008, pages 535 - 59
GUAN, C. C.; M. YAN ET AL.: "Sonic hedgehog alleviates the inhibitory effects of high glucose on the osteoblastic differentiation of bone marrow stromal cells", BONE, vol. 45, no. 6, 2009, pages 1146 - 52
HU, H.; M. J. HILTON ET AL.: "Sequential roles of Hedgehog and Wnt signaling in osteoblast development", DEVELOPMENT, vol. 132, no. 1, 2005, pages 49 - 60
INGHAM, P. W.; A. P. MCMAHON: "Hedgehog signaling in animal development: paradigms and principles", GENES DEV, vol. 15, no. 23, 2001, pages 3059 - 87
JOHNSON, E. E.; M. R. URIST: "Human bone morphogenetic protein allografting for reconstruction of femoral nonunion", CLIN ORTHOP RELAT RES, vol. 371, 2000, pages 61 - 74
LUM, L.; P. A. BEACHY: "The Hedgehog response network: sensors, switches, and routers", SCIENCE, vol. 304, no. 5678, 2004, pages 1755 - 9
MARTI, E.; P. BOVOLENTA: "Sonic hedgehog in CNS development: one signal, multiple outputs", TRENDS NEUROSCI, vol. 25, no. 2, 2002, pages 89 - 96
MOHAMMAD, K. S.; C. G. CHEN ET AL.: "Pharmacologic inhibition of the TGF-beta type 1 receptor kinase has anabolic and anti-catabolic effects on bone", PLOS ONE, vol. 4, no. 4, 2009, pages E5275
PEPINSKY, R. B.; C. ZENG ET AL.: "Identification of a palmitic acid-modified form of human Sonic hedgehog", J BIOL CHEM, vol. 273, no. 22, 1998, pages 14037 - 45
SPINELLA-JAEGLE, S.; G. RAWADI ET AL.: "Sonic hedgehog increases the commitment of pluripotent mesenchymal cells into the osteoblastic lineage and abolishes adipocytic differentiation", J CELL SCI, vol. 114, 2001, pages 2085 - 94
VAN DER HORST, G.; H. FARIH-SIPS ET AL.: "Hedgehog stimulates only osteoblastic differentiation ofundifferentiated KS483 cells", BONE, vol. 33, no. 6, 2003, pages 899 - 910
VARJOSALO, M.; J. TAIPALE: "Hedgehog: functions and mechanisms", GENES DEV, vol. 22, no. 18, 2008, pages 2454 - 72
WECHSLER-REYA, R.; M. P. SCOTT: "The developmental biology of brain tumors", ANNU REV NEUROSCI, vol. 24, 2001, pages 385 - 428
WU, X.; J. WALKER ET AL.: "Purmorphamine induces osteogenesis by activation of the hedgehog signaling pathway", CHEM BIOL, vol. 11, no. 9, 2004, pages 1229 - 38
YAMAGUCHI, A.; T. KOMORI ET AL.: "Regulation of osteoblast differentiation mediated by bone morphogenetic proteins, hedgehogs, and Cbfal", ENDOCR REV, vol. 21, no. 4, 2000, pages 393 - 411
YU, P. B.; C. C. HONG ET AL.: "Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism", NAT CHEM BIOL, vol. 4, no. 1, 2008, pages 33 - 41
Attorney, Agent or Firm:
BERNSTEIN, Claire et al. (FR)
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Claims:
REVENDICATIONS

1. Composés de formule générale (I) :

dans laquelle :

- X, positionné en ortho, méta ou para, représente -H, -OH, -NH2, un atome d'halogène, un radical alkyle consistant en une chaîne carbonée de 1 à 10 atomes de carbones, linéaire ou ramifiée, un radical alcoxy, un cycloalkyle de 3 à 8 atomes de carbone ou un groupement aryle ;

g

- R , positionné en ortho, méta ou para, sur un carbone différent de celui qui porte le radical X, représente : -(C=0)-NH-R] , -(C=0)-0-R' OU -NH-(C=0)-R' ;

- W représente -H, -OH, -N¾ ou un atome d'halogène ;

- R , R et R identiques ou différents et indépendamment les uns des autres, représentent :

- un atome d'hydrogène ; ou

- un groupe alkyle consistant en une chaîne carbonée de 1 à 10 atomes de carbones, linéaire ou ramifiée, éventuellement insaturée par une ou plusieurs double ou triple liaisons, éventuellement substituée par un ou plusieurs hétéroatomes, par un ou plusieurs atomes d'halogènes ou par un ou plusieurs groupements aryles ou hétéroaryles ; ou

- un cycloalkyle de 3 à 8 atomes de carbones éventuellement substitué par un radical alkyle consistant en une chaîne carbonée de 1 à 10 atomes de carbone, linéaire ou ramifiée ou par un radical alcoxy ;

- R4, R5, R6 et R7 identiques ou différents et indépendamment les uns des autres, sont choisis parmi -H, -Cl, -Br, -I, -CN, -N02, un radical alkyle consistant en une chaîne carbonée de 1 à 10 atomes de carbone, linéaire ou ramifiée, un radical alcoxy ou un cycloalkyle de 3 à 8 atomes de carbone ; étant entendu que R3 et R4 peuvent être fusionnés pour former, avec les atomes de carbone et d'azote adjacent du cycle quinoline qui les porte, un cycle à 5 ou 6 chaînons ;

pour leur utilisation pour le traitement des maladies causées par le dérèglement de la fonction ou de la différenciation des ostéoblastes et/ou par le déséquilibre fonctionnel entre les ostéoblastes et les ostéoclastes, ladite utilisation permet d'induire la différenciation cellulaire de cellules souches ou pro génitrices.

2. Composés selon la revendication 1, pour le traitement de l'ostéoporose ; et des désordres tels que la fragilité du squelette et/ou raréfaction osseuse et/ou la fragilisation du tissu osseux résultant de l'ostéopénie ; l'ostéogenèse imparfaite ; l'hypercalcémie ; l'hyperparathyroïdie ; l'ostéomalacie ; l'ostéonécrose ; la maladie osseuse de Paget (ostéite déformante) ; l'arthrite rhumatoïde ; l'arthrite inflammatoire ; l'ostéomyélite; la parodontite ; les métastases osseuses.

3. Composés de formule générale (I) :

dans laquelle :

- X, positionné en ortho, méta ou para, représente -H, -OH, -N¾, un atome d'halogène, un radical alkyle consistant en une chaîne carbonée de 1 à 10 atomes de carbones, linéaire ou ramifiée, un radical alcoxy, un cycloalkyle de 3 à 8 atomes de carbone ou un groupement aryle ;

- R , positionné en ortho, méta ou para, sur un carbone différent de celui qui porte le radical X, représente : -(C=0)-NH-RI, -(C=0)-0-R' OU -NH-CC^-R1 ;

- W représente -H, -OH, -N¾ ou un atome d'halogène ;

- R1, R2 et R3 identiques ou différents et indépendamment les uns des autres, représentent :

- un atome d'hydrogène ; ou

- un groupe alkyle consistant en une chaîne carbonée de 1 à 10 atomes de carbones, linéaire ou ramifiée, éventuellement insaturée par une ou plusieurs double ou triple liaisons, éventuellement substituée par un ou plusieurs hétéroatomes, par un ou plusieurs atomes d'halogènes ou par un ou plusieurs groupements aryles ou hétéroaryles ; ou

- un cycloalkyle de 3 à 8 atomes de carbones éventuellement substitué par un radical alkyle consistant en une chaîne carbonée de 1 à 10 atomes de carbone, linéaire ou ramifiée ou par un radical alcoxy ;

- R4, R5, R6 et R7 identiques ou différents et indépendamment les uns des autres, sont choisis parmi -H, -Cl, -Br, -I, -CN, -N02, un radical alkyle consistant en une chaîne carbonée de 1 à 10 atomes de carbone, linéaire ou ramifiée, un radical alcoxy ou un cycloalkyle de 3 à 8 atomes de carbone ;

étant entendu que R3 et R4 peuvent être fusionnés pour former, avec les atomes de carbone et d'azote adjacent du cycle quinoline qui les porte, un cycle à 5 ou 6 chaînons ;

pour préparer des implants de cellules autologues différenciées en ostéoblastes pour remédier aux pertes de tissu osseux consécutives à des blessures et/ou à des opérations chirurgicales par induction de la différenciation de cellules mésenchymateuses en ostéoblastes.

4. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce le radical R3 est un radical alkyle de 3 à 8 atomes de carbones ; le radical R est un atome d'hydrogène ou un radical alkyle de 1 à 3 atomes de carbone ; que les radicaux R4, R5, R6 et R7 représentent un atome d'hydrogène ou un radical alkyle de 1 à 3 atomes de carbone.

5. Composé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisés en ce qu'il est choisi parmi :

- le propyl 4-(l -hexyl-4-hydroxy-2-oxo-l,2-dihydroquinoline-3-carboxamido)-benzoate (composé 1) ;

- Péthyle 4-(l-benzyle-4-hydroxy-2-oxo-l ,2-dihydroquinoline-3-carboxamido)-benzoate le (composé 2) ;

l'éthyle 4-(l -hexyl-4-hydroxy-2-oxo-l ,2-dihydroquinoline-3-carboxamido)-benzoate (composé 3) ;

- l'acide 4-(l-hexyl-4-hydroxy-2-oxo-l,2-dihydroquinoline-3-carboxamido)-benzoique (composé 4) ; - le butyl 4-(l-hexyl-4-hydroxy-2-oxo-l ,2-dihydroquinoline-3-carboxamido)-benzoate (composé 5) ;

- le tert-butyl 4-(l -hexyl-4-hydroxy-2-oxo-l,2-dihydroquinoline-3-carboxamido)-benzoate (composé 6);

- le benzyle 4-(l-hexyl-4-hydroxy-2-oxo-l,2-dihydroquinoline-3-carboxamido)-benzoate (composé 7);

le N-(4-(butylcarbamoyl)phényl)-l-hexyl-4-hydroxy-2-oxo-l ,2-dihydroquinoline-3- carboxamide (composé 8) ;

- isopiOpyl-4-(l-hexyl-4-hydroxy-2-oxo-l,2-dihydroquinoline-3-carboxamido)-benzoate (composé 9).

6. Procédé de préparation de cellules ostéoblastiques à partir de cellules souches adultes ou de cellules progénitrices comprenant une étape consistant à faire incuber pendant un temps suffisant lesdites cellules dans un milieu nutritif liquide permettant le développement desdites cellules, ledit milieu nutritif contenant en solution au moins un composé de formule générale (I) tel que défini dans les revendication 1 à 5.

7. Composés de formule générale (la) :

dans laquelle :

- X, positionné en ortho, méta ou para, représente -H, -OH, -NH2, un atome d'halogène, un radical alkyle consistant en une chaîne carbonée de 1 à 10 atomes de carbones, linéaire ou ramifiée, un radical alcoxy, un cycloalkyle de 3 à 8 atomes de carbone ou un groupement aryle ;

- R8, positionné en ortho, méta ou para, sur un carbone différent de celui qui porte le radical X, représente : -(C=0)-NH-R1, -(C=0)-0-R1 ou -NH-(C=0)-R' ;

- W représente -H, -OH, -NH2 ou un atome d'halogène ;

- R1 et R3, identiques ou différents, et indépendamment l'un de l'autre, représentent un groupe alkyle consistant en une chaîne carbonée de 3 à 10 atomes de carbone, linéaire ou ramifiée, éventuellement insaturée par une ou plusieurs double ou triple liaisons, éventuellement substituée par un ou plusieurs hétéroatomes, par un ou plusieurs atomes d'halogènes ou par un ou plusieurs groupements aryles ou hétéroaryles ;

- R4, R5, R6 et R7 identiques ou différents et indépendamment les uns des autres, sont choisis parmi -H, -Cl, -Br, -I, -CN, -N02, un radical alkyle consistant en une chaîne carbonée de 1 à 10 atomes de carbone, linéaire ou ramifiée, un radical alcoxy ou un cycloalkyle de 3 à 8 atomes de carbone ;

étant entendu que R3 et R4 peuvent être fusionnés pour former, avec les atomes de carbone et d'azote adjacent du cycle quinoline qui les porte, un cycle à 6 chaînons,

à l'exclusion du butyl 4-(l-propyl-4-hydroxy-2-oxo-l ,2-dihydroquinoline-3-carboxamido)- benzoate.

8. Composés de formule générale (la) selon la revendication 7 en tant que médicament.

9. Composition pharmaceutique caractérisée par le fait qu'elle comprend, à titre de principe actif, au moins un composé de formule générale (la) selon la revendication 8, et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.

Description:
Dérivés de quinolinone

La présente invention se rapporte à des composés dérivés de quinolinone capables de moduler l'activité, en particulier d'induire la différenciation, de cellules souches et progénitrices ; ces composés sont utiles pour le traitement de désordres liés à un défaut de différenciation cellulaire ; l'invention se rapporte également à de nouveaux composés parmi ces dérivés de quinolinone et à des compositions pharmaceutiques les contenant.

La réparation de tissus lésés suite à une maladie, un traumatisme ou l'âge utilise de plus en plus des cellules souches ou de progéniteurs qui conservent la capacité de se différencier vers différents types cellulaires. Ces cellules constituent un réservoir capable de renouveler les tissus afin de restaurer les fonctions biologiques. Les cellules souches mésenchymateuses, par exemple, peuvent donner des ostéoblastes, des chondrocytes, des adipocytes, ou des cellules stromales support de l'hématopoïèse.

Les techniques permettant d'orienter ces cellules vers un phénotype choisi sont généralement lourdes (transformation de cellules à l'aide de vecteurs d'expression et nécessité d'exprimer plusieurs gènes) et des solutions alternatives telles que l'utilisation de petites molécules de synthèse inductrices de différenciation constituerait une piste prometteuse.

Parmi les désordres résultant d'un défaut de la différenciation cellulaire figurent ceux liés à un dysfonctionnement de la différenciation des ostéoblastes.

L'os est continuellement renouvelé au cours de la vie par un processus complexe impliquant une résorption par les ostéoclastes et une formation par les ostéoblastes.

Les précurseurs des ostéoblastes sont des cellules pluripotentes également appelées cellules souches mésenchymateuses. Cependant, les mécanismes qui permettent la différenciation de ces cellules vers le lignage ostéoblastique sont complexes et sont d'une grande importance dans la compréhension du développement de l'os. En outre, l'identification de molécules qui induiraient la différenciation des ostéoblastes et stimuleraient leur activité ostéogénique représenterait une piste thérapeutique dans le traitement des maladies de l'os.

En effet, de nombreuses maladies ont pour cause des dérèglements de la fonction ou de la différenciation des ostéoblastes ainsi qu'à des déséquilibres fonctionnels entre les ostéoblastes et les ostéoclastes. La pathologie la plus étudiée -car elle représente un enjeu économique majeur- est l'ostéoporose ; l'ostéoporose est caractérisée par une fragilité excessive du squelette due à une diminution de la masse osseuse et à l'altération de la microarchitecture osseuse. La solidité de l'os résulte d'un équilibre entre l'action de deux types de cellules osseuses : les ostéoblastes qui solidifient l'os et les ostéoclastes (responsables de la résorption osseuse) qui les fragilisent. Une activité dominante des ostéoclastes conduit à l'ostéoporose qui peut résulter soit d'un capital osseux insuffisant en fin de la croissance, soit d'une perte osseuse excessive lors de la vieillesse. La prévention de l'ostéoporose peut se faire via la diminution d'un phénomène physiologique précurseur, l'ostéopénie (baisse de la densité osseuse) qui peut, avant l'ostéoporose peut conduire à des troubles de raréfaction osseuse et à la fragilisation du tissu osseux.

D'autres pathologies sont associées à des dysfonctionnements induisant une perte de masse osseuse, on peut citer :

- l'ostéogenèse imparfaite ; cette maladie est appelée aussi «maladie des os de verre» regroupe des maladies caractérisées par une fragilité osseuse excessive, due à un défaut congénital d'élaboration des fibres coUagènes du tissu conjonctif qui forme la trame de l'os. Tous les types se caractérisent par une extrême fragilité des os, signe le plus typique de la maladie ;

- l'hypercalcémie ;

- l'hyperparathyroïdie ;

- l'ostéomalacie ; qui correspond à une décalcification osseuse induite par un défaut de minéralisation (manque d'ions calcium et phosphate) de la trame protéique du squelette ;

- l'ostéonécrose ; qui couvre des affections définies par la mort des cellules du tissu osseux ;

- la maladie osseuse de Paget (ostéite déformante) ; ostéopathie, localisée à un ou plusieurs os, caractérisée par un remodelage osseux excessif aboutissant à une hypertrophie progressive des pièces osseuses et à d'importantes anomalies de la microarchitecture osseuse ;

- l'arthrite rhumatoïde ;

- l'arthrite inflammatoire ;

- l'ostéomyélite ; - la parodontite ;

- les métastases osseuses.

Le renouvellement du tissu osseux peut également être nécessaire dans des situations où on cherche à accélérer la réparation de l'os comme des fractures, la chirurgie plastique ou la mise en place d'implants notamment dentaires.

La différenciation ostéoblastique est influencée par de multiples voies de signalisation incluant par exemple les voies du TGF-β (transforming growth factor Bl), des protéines Hedgehog (Hh), des Wnt, du FGF (fibroblast growth factors), de l'IGFl(insulin- like growth factor 1) ou des BMPs (bone morphogenetic proteins) (Centrella et al. 1994; Yamaguchi et al. 2000; van der Horst et al. 2003; Fromigue et al. 2004; Hu et al. 2005).

Alors que les BMPs ont été employés avec succès (Johnson and Urist 2000), leur coût est important et les doses nécessaires à la conduite d'une différenciation cellulaire efficace sont bien aux dessus des seuils physiologiques acceptables. Une alternative serait l'utilisation de petites molécules qui permettent de moduler l'activité BMP in vivo (Yu et al. 2008).

Le TGF-β a également été décrit comme un acteur majeur de régulation de la balance de l'activité entre ostéoclastes et ostéoblastes. Récemment des inhibiteurs pharmacologiques de son récepteur ont montré une activité stimulante sur les ostéoblastes et inhibitrice sur les ostéoclastes (Mohammad et al. 2009).

Le rôle de l'IGFl a été bien étudié, mais l'utilisation d'IGFl humain recombinant, malgré une influence sur le métabolisme osseux présente certains inconvénients. Il ne cible pas spécifiquement le squelette et entraine des effets secondaires qui limitent son utilisation pour les maladies de l'os.

La molécule de signalisation Hedgehog joue un rôle fondamental dans la morphogenèse de nombreux tissus, y compris l'os, ainsi que dans la prolifération cellulaire, et serait impliquée dans le maintien et la réparation tissulaire chez l'adulte (voir les revues de Ingham and McMahon 2001 ; Wechsler-Reya and Scott 2001 ; Marti and Bovolenta 2002; Lum and Beachy 2004; Varjosalo and Taipale 2008).

La stimulation de la voie Hedgehog permet l'induction de l'ostéogenèse dans différents modèles. Plusieurs molécules agonistes ont été étudiées : - les protéines Hedgehog et des polypeptides dérivés qui stimulent la différenciation ostéoblastique en agissant sur la protéine Patched (Spinella-Jaegle et al. 2001; Guan et al. 2009) ;

- la purmorphamine qui permet d'activer des ostéoblastes humains en culture (Wu et al. 2004; Beloti et al. 2005) ;

- des molécules organiques de petite taille comme le SAG (Chen et al.

2002) ;

- les molécules Hh Agi .2 (Frank-Kamenetsky et al. 2002) ;

- des dérivés des oxystérols (Corcoran and Scott 2006; Amantea et al. 2008) qui induisent la différenciation ostéoblastique et la formation de l'os (Aghaloo et al. 2007; Dwyer et al. 2007; Yu et al. 2008).

Il demeure toutefois utile d'identifier de nouvelles molécules permettant de moduler la différenciation cellulaire, notamment des molécules ayant une activité ostéogénique, et permettant d'allier une bonne activité et un coût limité ; de telles molécules présenteraient un intérêt particulier pour traiter les pathologies liées à l'os.

Les Inventeurs ont identifiés des composés de formule générale (I) capables d'induire une différenciation cellulaire, en particulier ostéoblastique ; ces composés représentent donc de nouveaux agents stimulant la différenciation de cellules souches ou de cellules progénitrices vers les ostéoblastes ou d'autres types cellulaires.

On entend par cellule souche une cellule indifférenciée, embryonnaire ou adulte, capable de donner des cellules spécialisées par différenciation cellulaire et pouvant se renouveler pratiquement indéfiniment. On utilisera préférentiellement des cellules souches adultes.

Les cellules progénitrices sont des cellules adultes pluripotentes, c'est-à- dire dont la différenciation peut conduire à plusieurs types cellulaires.

Dans la présente demande, on considère que des cellules sont engagées dans une différenciation ostéoblastique -elles sont alors qualifiées de "cellules à phénotype ostéoblastique"-, lorsqu'elles produisent la phosphatase alcaline. De telles cellules sont suffisamment engagées dans la différenciation ostéoblastique pour que la poursuite de leur incubation dans le milieu nutritif et/ou leur implantation permette à au moins une partie desdites cellules d'avancer dans la différenciation, jusqu'à la différenciation terminale (avec production d'une matrice extracellulaire minéralisée). La mise en évidence des propriétés caractéristiques de ces cellules (à savoir production de phosphatase alcaline) peut être effectuée de façon classique, par exemple à l'aide des tests mentionnés dans la partie expérimentale ci-après.

En conséquence, la présente invention a pour objet les composés de formule générale (I) sui

dans laquelle :

- X, positionné en ortho, méta ou para, représente -H, -OH, -NH 2 , un atome d'halogène, de préférence, le chlore ou le brome, un radical alkyle consistant en une chaîne carbonée de 1 à 10 atomes de carbones, linéaire ou ramifiée, un radical alcoxy (de formule -O-alkyle où le groupe alkyle est tel que défini précédemment), un cycloalkyle de 3 à 8 atomes de carbone ou un groupement aryle

- R 8 , positionné en ortho, méta ou para, sur un carbone différent de celui qui porte le radical X, représente : -(C=0)-NH-R 1 , -(C=0)-0-R 1 ou -NH-(C=0)-R' ;

- W représente -H, -OH, -NH 2 ou un atome d'halogène, de préférence, le chlore ou le brome ;

- R 1 , R 2 et R 3 identiques ou différents et indépendamment les uns des autres, représentent :

- un atome d'hydrogène ; ou

- un groupe alkyle consistant en une chaîne carbonée de 1 à 10 atomes de carbones, linéaire ou ramifiée, éventuellement insaturée par une ou plusieurs double ou triple liaisons, éventuellement substituée par un ou plusieurs hétéroatomes tels que O et S, par un ou plusieurs atomes d'halogènes ou par un ou plusieurs groupements aryles ou hétéroaryles, de préférence, un groupement pyridine ; ou

- un cycloalkyle de 3 à 8 atomes de carbones éventuellement substitué par un radical alkyle consistant en une chaîne carbonée de 1 à 10 atomes de carbone, linéaire ou ramifiée ou par un radical alcoxy (de formule -O-alkyle où le groupe alkyle est tel que défini précédemment) ;

- R 4 , R 5 , R 6 et R 7 identiques ou différents et indépendamment les uns des autres, sont choisis parmi -H, -Cl, -Br, -I, -CN, -N0 2 , un radical alkyle consistant en une chaîne carbonée de 1 à 10 atomes de carbone, linéaire ou ramifiée, un radical alcoxy (de formule -O-alkyle où le groupe alkyle est tel que défini précédemment) ou un cycloalkyle de 3 à 8 atomes de carbone, par exemple un cyclopropyle, un cyclopentyle, un cyclohexyle ;

étant entendu que R 3 et R 4 peuvent être fusionnés pour former, avec les atomes de carbone et d'azote adjacent du cycle quinoline qui les porte, un cycle à 5 ou 6 chaînons ;

pour leur utilisation pour induire la différenciation cellulaire de cellules souches ou progénitrices et plus particulièrement pour leur utilisation pour le traitement des maladies causées par le dérèglement de la fonction ou de la différenciation des ostéoblastes et/ou par le déséquilibre fonctionnel entre les ostéoblastes et les ostéoclastes, ladite utilisation permet d'induire la différenciation cellulaire de cellules souches ou progénitrices.

Au sens de la présente invention, on entend par alkyle un groupement aliphatique hydrocarboné saturé, linéaire ou ramifié, ayant de 1 à 10 atomes de carbone, de préférence de 3 à 8 atomes de carbone.

Le terme "ramifié" signifie qu'au moins un groupe alkyle inférieur de 1 à 6 atomes de carbones, tel qu'un méthyle ou un éthyle, est porté par une chaîne alkyle linéaire.

Par atome d'halogène, on entend un atome de brome, de chlore, d'iode ou de fluoré ; les désignations brome et chlore étant préférées.

Par groupement aryle, on entend tout groupe fonctionnel ou substituant dérivé d'au moins un cycle aromatique ; on peut mentionner les groupes phényle, benzylcyclobutène, pentalène, naphthalène, benzylphényle, et anthracène.

Par groupement hétéroaryle, on entend tout groupe fonctionnel ou substituant dérivé d'au moins un cycle aromatique tel que défini ci-dessus et contenant au moins un hétéroatome choisi parmi P, S, O et N ; parmi les groupes hétéroaryles, on peut mentionner les groupes furane, pyridine, pyrrole, thiophène, imidazole, pyrazole, oxazole, isoxazole, thiazole, pyridine, pyrazine, pyrimidine, pyridazine, benzofurane, isobenzofurane, indole, isoindole, benzothiophène, benzo[c]thiophène, benzimidazole, indazole, benzoxazole, benzisoxazole, benzothiazole, quinoléine, isoquinoléine, quinoxaline, quinazoline, cinnoline, purine, et acridine.

De préférence, les composés de formule générale (I) sont tels que le radical R 3 est un radical alkyle de 3 à 8 atomes de carbones tel que le radical hexyle ; le radical R 2 est un atome d'hydrogène ou un radical alkyle de 1 à 3 atomes de carbone ; que les radicaux R 4 , R 5 , R 6 et R 7 représentent un atome d'hydrogène ou un radical alkyle de 1 à 3 atomes de carbone.

A titre de composés de formulé générale (I), on peut en particulier citer de façon non limitative :

le propyl 4-(l -hexyl-4-hydroxy-2-oxo-l ,2-dihydroquinoline-3- carboxamido)-benzoate (composé 1) :

Péthyle 4-(l -benzyle-4-hydroxy-2-oxo-l ,2-dihydroquinoline-3- carboxamido)-benzoate (composé 2) : Q

l'acide 4-(l-hexyl-4-hydroxy-2-oxo-l ,2-dihydroquinoline-3-

-(l-hexyl-4-hydroxy-2-oxo-l,2-dihydroquinoline-3-

- le tert-butyl 4-(l-hexyl-4-hydroxy-2-oxo-l,2-dihydroquinoline-3- carboxamido)-benzoate (composé 6) :

le benzyle 4-(l-hexyl-4-hydroxy-2-oxo-l ,2-dihydroquinoline-3- carboxamido)-benzoate (composé 7) :

le N-(4-(butylcarbamoyl)phényl)- 1 -hexyl-4-hydroxy-2-oxo- 1 ,2- dihydroquinoline-3-carboxamide (composé 8) :

l'isopropyl-4-(l-hexyl-4-hydroxy-2-oxo-l,2-dihydroquinoline- 3- carboxamido)-benzoate (composé 9) : _

Les composés de formule générale (I) conformes à l'invention peuvent être préparés selon le schéma de synthèse représenté à la Figure 1.

Conformément au schéma de synthèse de la Figure 1, dans une première étape, une aniline est condensée avec le triethyl méthane tricarboxylate sous irradiation micro-ondes pour obtenir des quinolinones carboxylates ; ensuite, les quinolones sont condensées avec la 4-tert-butyl-aniline sous irradiation micro-ondes pour donner des esters carboxamido-quinolinones ; l'étape suivante consiste à saponifier la fonction ester de ces composés pour conduire à un acide point de départ pour différentes modifications telles qu'illustré dans les exemples expérimentaux.

Les composés de formule générale (I) selon l'invention possèdent la propriété d'induire la différenciation de cellules mésenchymateuses en ostéoblastes.

A ce titre, ces composés présentent un intérêt pour la préparation d'implants obtenus à partir de cellules autologues dont on aura induit la différenciation en ostéoblates ; ces implants sont utiles pour remédier aux pertes de tissu osseux consécutives à des blessures et/ou à des opérations chirurgicales. Les composés de formule générale (I) présentent donc un intérêt particulier pour le traitement des maladies causées par le dérèglement de la fonction ou de la différenciation des ostéoblastes et/ou par le déséquilibre fonctionnel entre les ostéoblastes et les ostéoclastes.

Plus particulièrement, ces composés sont utiles pour le traitement de l'ostéoporose ; et des désordres tels que la fragilité du squelette et/ou raréfaction osseuse et/ou la fragilisation du tissu osseux résultant de l'ostéopénie ; l'ostéogenèse imparfaite ; l'hypercalcémie ; l'hyperparathyroïdie ; l'ostéomalacie ; l'ostéonécrose ; la maladie osseuse de Paget (ostéite déformante) ; l'arthrite rhumatoïde ; l'arthrite inflammatoire ; l'ostéomyélite ; la parodontite ; les métastases osseuses.

En outre, les molécules agissant de façon plus générale sur la différenciation de cellules progénitrices sont utiles dans le traitement médical ou chirurgical (chirurgie plastique ou réparatrice, greffe de tissus ou d'organes) de nombreuses pathologies aiguës, subaiguës ou chroniques, génétiques ou acquises -impliquant un dysfonctionnement tissulaire- pour induire la formation, la régénération, la réparation et/ou l'augmentation de l'activité de tissus tels que de manière non-limitative : le tissu nerveux [système nerveux central (cerveau) et périphérique (neurones sensoriels, moteurs, sympathiques], l'os, le cartilage, les testicules, le foie, la rate, l'intestin, le pancréas, les reins, les muscles lisses et squelettiques, le cœur, les poumons, la peau et le système pileux, les muqueuses, les cellules sanguines et les cellules du système immunitaire. A titre d'exemple non-limitatif de ces pathologies, on peut citer notamment les neuropathies et les maladies neuromusculaires associées, le diabète, l'alopécie, les brûlures, les ulcérations (peau et muqueuse) et les troubles de la spermatogenèse.

La présente invention se rapporte également à un procédé de préparation de cellules ostéoblastiques à partir de cellules souches ou de cellules progénitrices, telles que des cellules mésenchymateuses, comprenant l'étape consistant à faire incuber pendant un temps suffisant lesdites cellules dans un milieu nutritif liquide permettant le développement desdites cellules, ledit milieu nutritif contenant en solution au moins un composé de formule générale (I).

En pratique, on fait incuber lesdites cellules dans le milieu de culture, dans des conditions standard permettant leur développement, c'est-à-dire non seulement leur survie mais aussi leur prolifération et/ou leur différenciation. Les conditions standards de culture de cellules humaines sont connues : par exemple température de 37°C environ ; atmosphère air-COss 95 : 5 ; pH voisin de la neutralité.

Le milieu de culture utilisé est un milieu nutritif liquide classique contenant les ingrédients nécessaires au développement de cellules de mammifères. Ces ingrédients sont connus. Ce sont principalement des sels minéraux (notamment Na, K, Mg, Ca et éventuellement Cu, Fe, Zn), des acides aminés, des vitamines et des sources de carbone (par exemple glucose). On peut utiliser notamment un milieu nutritif tel que le milieu minimum essentiel MEM de EAGLE, complémenté avec du sérum de veau foetal ou, de préférence, avec du sérum humain autologue.

On peut également utiliser des milieux nutritifs plus élaborés, du type DME (milieu de EAGLE modifié par DULBECCO), éventuellement en mélange avec le milieu F12 de HAM, avec ou sans sérum, et de préférence en présence de sérum autologue.

Ces milieux de culture peuvent être additionnés de facteurs ostéoinducteurs, comme les facteurs BMP, mais, comme indiqué ci-dessus, ces facteurs ne sont pas nécessaires pour induire la différenciation ostéoblastique des cellules humaines utilisées dans le procédé de l'invention. On peut donc utiliser des milieux exempts de facteurs ostéoinducteurs.

De préférence, les milieux de culture utilisés sont additionnés de facteurs ostéopromoteurs tels que l'acide ascorbique et les bêta-glycérophosphates (par exemple de sodium ou de calcium).

La présente invention se rapporte en outre aux nouveaux composés de formule générale (la) :

dans laquelle :

- X, positionné en ortho, méta ou para, représente -H, -OH, -NH 2 , un atome d'halogène de préférence le chlore ou le brome, un radical alkyle consistant en une chaîne carbonée de 1 à 10 atomes de carbones, linéaire ou ramifiée, un radical alcoxy (de formule -O-alkyle où le groupe alkyle est tel que défini précédemment), un cycloalkyle de 3 à 8 atomes de carbone ou un groupement aryle ;

- R 8 , positionné en ortho, méta ou para, sur un carbone différent de celui qui porte le radical X, représente : -(C=0)-NH-R 1 , -(C=0)-0-R' OU -NH-(C=0)-R' ;

- W représente -H, -OH, -NH 2 ou un atome d'halogène, de préférence, le chlore ou le brome ;

- R 1 et R 3 , identiques ou différents, et indépendamment l'un de l'autre, représentent un groupe alkyle consistant en une chaîne carbonée de 3 à 10 atomes de carbone, linéaire ou ramifiée, éventuellement insaturée par une ou plusieurs double ou triple liaisons, éventuellement substituée par un ou plusieurs hétéroatomes tels que O et S, par un ou plusieurs atomes d'halogènes ou par un ou plusieurs groupements aryles ou hétéroaryles, de préférence, un groupement pyridine ;

- R 4 , R 5 , R 6 et R 7 identiques ou différents et indépendamment les uns des autres, sont choisis parmi -H, -Cl, -Br, -I, -CN, -N0 2 , un radical alkyle consistant en une chaîne carbonée de 1 à 10 atomes de carbone, linéaire ou ramifiée, un radical alcoxy (de formule -O-alkyle où le groupe alkyle est tel que défini précédemment) ou un cycloalkyle de 3 à 8 atomes de carbone, par exemple un cyclopropyle, un cyclopentyle, un cyclohexyle ;

étant entendu que R 3 et R 4 peuvent être fusionnés pour former, avec les atomes de carbone et d'azote adjacent du cycle quinoline qui les porte, un cycle à 6 chaînons ;

à l'exclusion du butyl 4-(l-propyl-4-hydroxy-2-oxo-l ,2-dihydroquinoline-3-carboxamido)- benzoate,

en tant que tels et pour leur utilisation en tant que médicaments.

Les radicaux R 5 et R 7 préférés sont choisis, indépendamment l'un de l'autre, parmi -H, -Cl, -Br, -CN, un radical alkyle ou un radical alcoxy.

La posologie utile variera en fonction de l'affection à traiter, de la voie et du rythme d'administration, ainsi que de la nature et du poids du sujet à traiter (humain ou animal).

La présente invention se rapporte en outre à des compositions pharmaceutiques caractérisées par le fait qu'elles comprennent, à titre de principe actif, au moins un composé de formule générale (la) selon l'invention, et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. Au sein des compositions pharmaceutiques conformes à l'invention, le ou les composés de formule générale (la) sont de préférence utilisés en une quantité permettant d'administrer des doses unitaires comprises entre 1 mg et 2 g environ.

L'homme du métier choisira un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables en fonction de la voie d'administration de la composition pharmaceutique. Bien entendu, l'homme de l'art veillera, à cette occasion, à ce que le ou les excipients utilisés soient compatibles avec les propriétés intrinsèques attachées à la composition conforme à la présente invention.

En outre, la forme du médicament ou de la composition pharmaceutique (par exemple, une solution, une suspension, une émulsion, des comprimés, des gélules, des suppositoires, etc...) dépendra de la voie d'administration choisie.

Ainsi, au sens de la présente invention, le médicament ou la composition pharmaceutique peut être administré par n'importe quelle voie appropriée, par exemple par la voie orale, anale, locale, systémique, intraveineuse, intramusculaire ou mucosale, ou bien en utilisant un patch, ou encore sous forme encapsulée dans, ou immobilisée sur, des liposomes, des microparticules, des microcapsules, et analogues.

On peut notamment citer, à titre d'exemples non limitatifs d'excipients appropriés pour une administration par voie orale, le talc, le lactose, l'amidon et ses dérivés, la cellulose et ses dérivés, les polyéthylèneglycols, les polymères d'acide acrylique, la gélatine, le stéarate de magnésium, des matières grasses animales, végétales ou synthétiques, les dérivés de la paraffine, les glycols, les stabilisants, les conservateurs, les anti-oxydants, les agents mouillants, les anti-agglomérants, les dispersants, les émulsionnants, les agents modifiants du goût, les agents de pénétrations, de solubilisation, etc...

Les techniques de formulation et d'administration des médicaments et compositions pharmaceutiques sont bien connues dans la technique ici considérée, l'homme du métier pouvant notamment se référer à l'ouvrage Remington's Pharmaceutical Sciences, (21 st édition).

Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de synthèse des composés de formule générale (I), à un exemple de mise en œuvre des composés de formule générale (I) selon la présente invention, ainsi qu'aux dessins annexés dans lesquels :

La Figure 1 représente le schéma de synthèse des composés de formule générale (I).

La Figure 2 illustre la détection histochimique de la phosphatase alcaline induite suite à la différenciation des cellules souches mésenchymateuses sous l'action des composés de formule générale (I). Les cellules ont été cultivées en présence de 10 μΜ des composés 1 , 4, 6 ou 8 indiqué ou du solvant (contrôle) pendant 6 jours dans le milieu de culture habituel. Les cellules ont ensuite été colorées par histochimie pour révéler la présence de la phosphatase alcaline (marquage rouge apparaissant sous forme de taches plus foncées) marqueur de l'ostéogenèse puis photographiées.

La Figure 3 illustre l'effet du composé 1 sur l'activité enzymatique de la phosphatase alcaline indicateur de l'effet de ce composé sur la différenciation des cellules souches mésenchymateuses C3H10T1/2. La différenciation induite par le composé 1 est mesurée par l'activité enzymatique de la phosphatase alcaline (DO à 415 nm) (ronds). A titre de comparaison, la différenciation des cellules obtenue dans la même expérience avec le SAG est présentée (carrés). Une courbe représentative ± SD sur 5 expériences indépendantes est présentée.

Les courbes obtenue pour les composé de 2 à 9 sont présentées sur les Figures 4 à 1 1. Tous ces composés permettent la stimulation de la différenciation avec des différences caractéristiques pour chaque composé. Le maximum d'activité est observé à 10 μΜ pour la plupart d'entre eux.

Figure 4 : Différenciation des cellules C3H10T1/2 par le composé 2. La réponse au composé 2 a été évaluée dans les mêmes conditions expérimentales que celles mises en œuvre pour le composé 1. A titre de comparaison, la différenciation des cellules obtenue dans la même expérience avec le composé 1 (10 μΜ) est indiquée par un losange. Une courbe représentative sur 2-3 expériences indépendantes.

L'effet des composés suivants a également été testé dans les mêmes conditions expérimentales que celles mises en œuvre pour le composé 1 :

Figure 5 : Différenciation des cellules C3H10T1/2 induite par le composé 3. Figure 6 : Différenciation des cellules C3H10T1/2 induite par le composé 4.

Figure 7 : Différenciation des cellules C3H10T1/2 induite par le composé 5.

Figure 8 : Différenciation des cellules C3H10T1/2 induite par le composé 6.

Figure 9 : Différenciation des cellules C3H10T1/2 induite par le composé 7.

Figure 10 : Différenciation des cellules C3H10T1/2 induite par le composé 8.

Figure 11 : Différenciation des cellules C3H10T1/2 induite par le composé 9.

EXEMPLE 1 : SYNTHÈSES DE DIFFÉRENTS COMPOSÉS DE FORMULE (I)

Préparation de Péthyl l -hexyl-4-hydroxy-2-oxo-l ,2-dihydroquinoline-3-carboxylate

Dans un ballon équipé d'un condenseur, du N-hexylaniline (355 mg, 2 mmol) est ajouté à une solution d'acide triéthylester methanetricarboxylique (1,35 ml, 6,4 mmol). Le mélange réactionnel résultant est placé dans un four à micro-ondes CEM Discovery et irradié dans le ballon ouvert puis l'éthanol formé est distillé (les paramètres sont les suivants : puissance = 250 W, température = 225°C, temps d'exécution = 5 min, temps de maintien = 15 min).

Après chauffage aux micro-ondes, le brut réactionnel est purifié sur colonne chromatographique, avec de l'éther de pétrole : acétate d'éthyle à 4: 1. Le produit cristallin obtenu est séché pour donner le composé : rendement = 430 mg (69%). 1H NMR (CDC13): d 8.16 (d, J=8Hz, 1H), 7.64 (m, 1H), 7.27-7.19 (m, 2H), 4.48 (q, J= 8Hz, 2H), 4.18 (t, J=8Hz, 2H), 1.72-0.86 (m, 14H). LA. tert-Butyl 4-(l -hexyl-4-hydroxy-2-oxo- 1 ,2-dihydroquinoline-3-

Du l-hexyl-4-hydroxy-2-oxo-l,2-dihydroquinoléine-3-carboxylate d'éthyle (159 mg, 0,5 mmol) et du tert-butyle 4-aminobenzoate (193 mg, 1 mmol) sont mis en suspension dans du toluène anhydre (4 ml) et sont chauffés au micro-onde récipient ouvert (les paramètres sont les suivants : puissance = 200 W, la température = 120°C, temps d'exécution = 7 min, temps de maintien = 10 min).

A la fin de la réaction, 2 / 3 du solvant sont évaporés sans condensateur.

Le brut réactionnel est purifié par colonne chromatographique, utilisant de l'éther de pétrole 4: 1 : acétate d'éthyle. Le produit cristallin obtenu est séché pour donner le composé du titre: rendement = 195 mg (84%). 1H NMR (DMSO): d 8.16 (d, J=8Hz, 1H), 7.90-7.75 (m, 6H), 7.38 (m, 1H), 4.25 (bs, 2H), 1.60 (bs, 2H), 1.52 (s, 9H), 1.39 (bs, 2H), 1.28 (bs, 5H), 0.84 (bs, 2H).

I.B. Acide 4-( 1 -Hexyl-4-hydroxy-2-oxo- 1 ,2-dihydroquinoline-3 - carboxamido)-benzoique (composé 4)

A une solution d'acide trifluoroacétique (TFA) refroidi à 0°C, est ajouté du tert-butyle 4-(l-hexyl-4-hydroxy-2-oxo-l,2-dihydroquinoléine-3-carboxam ido) benzoate (83 mg, 0,18 mmol) de façon fractionnée ; le mélange est laissé à réagir pendant 3 heures. Le produit brut obtenu est lavé avec de l'éther éthylique jusqu'à la formation d'un solide cristallin blanc. Le produit est séché pour donner un rendement de 61 mg (83%). 1H NMR (DMSO): d 8.16 (d, J=8Hz, IH), 7.96-7.65 (m, 6H), 7.38 (m, IH), 4.27 (bs, 1.59 (bs, 2H), 1.39 (bs, 2H), 1.28 (bs, 5H), 0.84 (bs, 2H).

I.C. Benzyle 4-(l-hexyl-4-hydroxy-2-oxo-l ,2-dihydroquinoline-3- carboxamido)-benzoate (composé 7)

Une solution d'acide 4-(l-hexyl-4-hydroxy-2-oxo-l,2- dihydroquinoléine-3-carboxamido) benzoïque (41 mg, 0,1 mmol) dans du THF est refroidie à 0°C, et de l'alcool benzylique (21 mg, 20 μΐ, 0,2 mmol) est ajouté, ainsi que de l'EDCI (19 mg, 0,1 mmol) et de la diméthylamino pyridine (3 mg, 0,02 mmol). Le mélange réactionnel est laissé sous agitation pendant une nuit. La phase organique est lavée avec de l'eau et évaporée sous pression réduite. Le produit brut est purifié par chromato graphie sur colonne, en utilisant l'éther de pétrole 4: 1 : acétate d'éthyle, avec un rendement de 30 mg (60%). IH NMR (DMSO): d 8.16 (d, J=8Hz, IH), 8.04 (d, J=8Hz, 2H), 7.83 (d, J=8Hz, 3H), 7.68 (d, J=8Hz, IH), 7.46-7.25 (m, 6H), 7.38 (m, IH), 5.30 (s, 2H), 4.28 (bs, 2H), 1.59 (bs, 2H), 1.41-1.15 (m, 6H), 0.84 (bs, 3H).

EXEMPLE II - MISE EN ÉVIDENCE DE L'EFFET DES COMPOSÉS DE FORMULE GENERALE (I) SUR L'OSTÉOGENÈSE

L'effet des composés de formule générale (I) conformes à l'invention sur la stimulation de l'ostéogenèse a été déterminé in vitro par analyse de la différenciation de la lignée de cellules mésenchymateuses pluripotentes C3H10T1/2.

IL1) Matériels et méthodes

Dissolution des composés, culture cellulaire.

Les composés de formule (I) à tester ont été dissous dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) jusqu'à une concentration de 2,5 mM, puis stockés à une température de -20°C jusqu'à utilisation.

La lignée de cellules fibroblastiques pluripotentes C3H10T1/2 (ATCC CCL 226) a été cultivée dans les conditions recommandées par l'ATCC dans le milieu de culture DMEM supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal à une température de 37°C sous atmosphère à 5 % de C0 2 . 24 heures après ensemencement, la stimulation des cellules a été réalisée pendant 6 jours en présence des composés de formule générale (I) directement dilués dans le milieu de culture. L'activation par ces composés provoque la différenciation de la lignée cellulaire vers le lignage ostéoblastique et leur permet d'exprimer la phosphatase alcaline. Celle-ci est ensuite détectée par histochimie ou dosage enzymatique.

Détection de la phosphatase alcaline par histochimie.

Pour cette expérience, les cellules sont cultivées en plaques de 6 puits contenant une lamelle en verre traitée 1H à la polyD-Lysine 0,05 mg/ml. Les cellules C3H10T1/2 sont ensemencées à une densité de 150 000 cellules par puits. Les composés ont été appliqués à une concentration de 10 μΜ. Le Kit de coloration SIGMA (85L-3R) a été utilisé en suivant le protocole décrit. Brièvement, après fixation des cellules 30 secondes par une solution de citrate/acétone (2 -3) puis rinçage à l'eau bi-distillée, la coloration est effectuée 30 min en présence d'une solution de Fast-Violet/Naphtol à l'abri de la lumière. Les lames sont ensuite rincées abondamment à l'eau bi distillée puis montée en milieu aqueux avant photographie sur un microscope DMRXA2 (Leica Microsystems). Les cellules exprimant la phosphatase alcaline sont colorées en rouge.

Dosage enzymatique de l'alcaline phosphatase en plaques 96 puits. Les cellules C3H10T1/2 ont été ensemencées sur des plaques de 96 puits à une densité de 5.10 3 cellules par puits. Les composés ont été appliqués à des concentrations croissantes allant de 10 nM à 10 μΜ. Les plaques ont ensuite été incubées pendant 6 jours puis les essais ont été réalisés en quadruplicats selon les méthodes décrites précédemment (Chen et al. 2002; Frank-Kamenetsky et al. 2002).

Les cellules ont été lavées dans du tampon phosphate froid (PBS) puis lysées par sonication à 4°C dans 50 μΐ d'une solution contenant 0,9 % de NaCI et 0,2 % de Triton X-100. La mesure de l'activité phosphatase alcaline dans les lysats ainsi obtenus a été ensuite réalisée selon la méthode décrite par Pepinsky et al. (Pepinsky et al. 1998). Après addition de 100 μΐ de tampon réactionnel (200 mM Tris-HCl ; pH 10,5 ; 0,4 M de 2- amino-2-méthyl propanol et 8 mM de MgC12) et de 50 μΐ de substrat (4 mM de p- Nitrophényl phosphate disodium), les lysats ont été incubés à 37°C pendant 60 min, puis la densité optique (DO) a été mesurée à une longueur d'onde de 415 nm. A titre comparatif, l'activité du composé SAG, activateur de l'ostéogenèse par action sur la voie hedgehog, a été testé dans les mêmes conditions. Le logiciel GraphPad Prism 4® a été utilisé pour tracer les courbes et déterminer les concentrations efficaces 50 (CE 50 ).

II.2) Résultats

II.2-1. Démonstration par histochimie de la différenciation des cellules souches mésenchymateuses par les composés de formule (I) vers le lignage ostéoblastique.

La stimulation de l'ostéogenèse dans les cellules pluripotentes C3H10T1/2 a été appréciée en observant l'induction de la phosphatase alcaline (PA). Après 6 jours de différenciation en présence de 10 μΜ de composés de formule (I), l'expression de la PA a été détectée par coloration histochimique. A titre d'exemple, une augmentation du nombre de cellules marquées est observée en présence des composés 1 , 4, 6 et 8 avec des intensités plus ou moins fortes (composé 4 > composé 1 > composé 8 > composé 6). Aucune cellule traitée avec le solvant (DMSO) n'exprime la PA à un niveau détectable par cette méthode.

II.2-2. Différenciation des cellules souches mésenchymateuses par les composés de formule (I) : dosage de l'activité de la phosphatase alcaline.

Les courbes doses réponses des composés de formule (I) ont été construites entre 10 nM et 10 μΜ et les affinités des composés vis-à-vis de l'activation de la différenciation des cellules C3H10T1/2 ont été déterminées. Sur la Figure 3 sont présentées une courbe représentative du composé 1 réalisée en parallèle avec celle de l'agoniste du récepteur smoothened SAG. Ce dernier donne une stimulation maximum inférieure au composé 1 alors que leurs affinités sont proches.

Les courbes obtenues pour les composés de 2 à 9 sont présentées sur les Figures 4 à 11. Tous ces composés permettent la stimulation de la différenciation avec des différences caractéristiques pour chaque composé. Le maximum d'activité est observé à 10 μΜ pour la plupart d'entre eux.

Les résultats de l'exploitation de ces courbes sont reportés dans le Tableau I ci-après. Les affinités des composés sont de l'ordre du micromolaire. Le composé 2 est le moins actif avec un maximum de 4% du composé 1. A l'opposé, le composé 4 est celui qui présente la meilleure activité avec une affinité de 0,6 μηι et un maximum de stimulation supérieur de 20% à celui du composé 1. Activité des composés de formule (I) sur la différenciation des cellules

C3H10T1/2 mesurée par l'activité de la phosphatase alcaline.

Maximum de stimulation,

Composé CE 50 , μΜ % de l'activation maximale du composé 1

1 1.3 100

2 >3 4

3 3.6 66

4 0.6 124

5 1.5 91

6 3.1 62

7 2 47

8 5.8 94

9 6.5 33

Tableau I : Affinité et maximum d'activation des composés de formule (I) sur la différenciation des cellules multipotentes C3H10T1/2.

La concentration efficace 50 (CE 50 ) des composés sur la différenciation est exprimé en μΜ. Le maximum de stimulation est exprimé en pourcentage de celui obtenu avec le composé 1 dans la même expérience. Les données correspondent à la moyenne de 2 à 5 expériences indépendantes.

REFERENCES

Aghaloo, T. L., C. M. Amantea, et al. (2007). "Oxysterols enhance osteoblast differentiation in vitro and bone healing in vivo." J Orthop Res 25(11): 1488-97.

Amantea, C. M., W. K. Kim, et al. (2008). "Oxysterol-induced osteogenic differentiation of marrow stromal cells is regulated by Dkk-1 inhibitable and PI3-kinase mediated signaling." J Cell Biochem 105(2): 424-36.

Beloti, M. M., L. S. Bellesini, et al. (2005). "Purmorphamine enhances osteogenic activity of human osteoblasts derived from bone marrow mesenchymal cells." Cell Biol Int 29(7): 537-41.

Boonen, S., C. Rosen, et al. (2002). "Musculoskeletal effects of the recombinant human IGF-I/IGF binding protein-3 complex in osteoporotic patients with proximal fémoral fracture: a double-blind, placebo-controlled pilot study." J Clin Endocrinol Metab 87(4): 1593-9.

Centrella, M., M. C. Horowitz, et al. (1994). "Transforming growth factor-beta gene family members and bone." Endocr Rev 15(1): 27-39. Chen, J. K., J. Taipale, et al. (2002). "Small molécule modulation of Smoothened activity."

Proc Natl Acad Sci U S A 99(22): 14071-6.

Corcoran, R. B. and M. P. Scott (2006). "Oxysterols stimulate Sonic hedgehog signal transduction and prolifération of medulloblastoma cells." Proc Natl Acad Sci U S A

103(22): 8408-13.

Dwyer, J. R., N. Sever, et al. (2007). "Oxysterols are novel activators of the hedgehog signaling pathway in pluripotent mesenchymal cells." J Biol Chem 282(12): 8959-68. Frank-Kamenetsky, M., X. M. Zhang, et al. (2002). "Small-molecule modulators of

Hedgehog signaling: identification and characterization of Smoothened agonists and antagonists." J Biol 1(2): 10.

Fromigue, O., D. Modrowski, et al. (2004). "Growth factors and bone formation in osteoporosis: rôles for fibroblast growth factor and transforming growth factor beta."

Curr Pharm Des 10(21): 2593-603.

Giustina, A., G. Mazziotti, et al. (2008). "Growth hormone, insulin-like growth factors, and the skeleton." Endocr Rev 29(5): 535-59.

Guan, C. C, M. Yan, et al. (2009). "Sonic hedgehog alleviates the inhibitory effects of high glucose on the osteoblastic differentiation of bone marrow stromal cells." Bone

45(6): 1 146-52.

Hu, H., M. J. Hilton, et al. (2005). "Sequential rôles of Hedgehog and Wnt signaling in osteoblast development." Development 132(1): 49-60.

Ingham, P. W. and A. P. McMahon (2001). "Hedgehog signaling in animal development: paradigms and principles." Gènes Dev 15(23): 3059-87.

Johnson, E. E. and M. R. Urist (2000). "Human bone morphogenetic protein allografting for reconstruction of fémoral nonunion." Clin Orthop Relat Res(371): 61-74.

Lum, L. and P. A. Beachy (2004). "The Hedgehog response network: sensors, switches, and routers." Science 304(5678): 1755-9.

Marti, E. and P. Bovolenta (2002). "Sonic hedgehog in CNS development: one signal, multiple outputs." Trends Neurosci 25(2): 89-96.

Mohammad, K. S., C. G. Chen, et al. (2009). "Pharmacologie inhibition of the TGF-beta type I receptor kinase has anabolic and anti-catabolic effects on bone." PLoS One 4(4): e5275. Pepinsky, R. B., C. Zeng, et al. (1998). "Identification of a palmitic acid-modified form of human Sonic hedgehog." J Biol Chem 273(22): 14037-45.

Spinella-Jaegle, S., G. Rawadi, et al. (2001). "Sonic hedgehog increases the commitment of pluripotent mesenchymal cells into the osteoblastic lineage and abolishes adipocytic differentiation." J Cell Sci 114(Pt 11): 2085-94.

van der Horst, G., H. Farih-Sips, et al. (2003). "Hedgehog stimulâtes only osteoblastic differentiation of undifferentiated KS483 cells." Bone 33(6): 899-910.

Varjosalo, M. and J. Taipale (2008). "Hedgehog: fonctions and mechanisms." Gènes Dev

22(18): 2454-72.

Wechsler-Reya, R. and M. P. Scott (2001). "The developmental biology of brain tumors." Annu Rev Neurosci 24: 385-428.

Wu, X., J. Walker, et al. (2004). "Purmorphamine induces osteogenesis by activation of the hedgehog signaling pathway." Chem Biol 11(9): 1229-38.

Yamaguchi, A., T. Komori, et al. (2000). "Régulation of osteoblast differentiation mediated by bone morphogenetic proteins, hedgehogs, and Cbfal ." Endocr Rev 21(4): 393-41 1.

Yu, P. B., C. C. Hong, et al. (2008). "Dorsomorphin inhibits BMP signais required for embryogenesis and iron metabolism." Nat Chem Biol 4(1): 33-41.